CN116731140A - 水稻OsERF103蛋白及其编码基因在提高植物干旱耐受性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了水稻OsERF103蛋白及其编码基因在提高植物干旱耐受性中的应用，涉及植物基因工程技术领域。水稻OsERF103蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明首次明确了水稻OsERF103基因受干旱诱导表达，其转录表达量随着干旱处理的过程逐渐升高，随着复水的过程逐渐降低；耐旱性分析表明，OsERF103超表达水稻植株具有抗旱表型，存活率高，而Oserf103突变体均表现出干旱敏感表型，存活率显著低于野生型，表明OsERF103是水稻响应干旱的正调控因子，水稻OsERF103蛋白及其编码基因可用于提高植物干旱耐受性，对于干旱胁迫的分子机制研究以及抗旱新品种的培育具有重要意义。

Description

水稻OsERF103蛋白及其编码基因在提高植物干旱耐受性中的 应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体而言，涉及一种水稻OsERF103蛋白及其编码基因在提高植物干旱耐受性中的应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界三大农作物之一，作为主食养活了世界一半以上的人口。同时水稻也是我国的主要粮食作物之一。干旱是限制水稻生长、影响水稻发育及水稻产量的主要因素，作为重要的粮食作物，水稻全生育期消耗水分高达8884.5m³/hm²(张鸿等，2012)。随着温室效应加剧，全球干旱区域的面积在不断增加，部分地区出现了极端干旱缺水的情况。因此，在传统淹灌栽培方式下要想维持水稻正常生产，就需要提供充足的水分。然而，目前存在水资源匮乏以及降水区域分布不均等问题，这使得农业生产与水资源短缺的矛盾日益突出，并且持续的重度干旱还会导致作物的大面积减产甚至绝收，严重威胁粮食安全(Lesk等，2016；Lobell等，2011)。因此，深入开展水稻响应干旱胁迫的遗传基础和分子机制研究，挖掘抗旱相关基因，可以为培育和改良抗旱水稻新品种提供理论依据，同时也对保障粮食安全，实现农业可持续性发展具有重要的理论价值和现实意义。

水稻在面对各种生物和非生物胁迫的逆境时，为了生存繁衍，水稻进化出了一系列适应逆境的机制。其中，通过转录因子调控胁迫响应基因的表达来提高水稻的适应能力是其中最重要的组成部分之一。目前已知的参与干旱胁迫响应的转录因子有ZFP类、bZIP类、ERF/AP2类、MYB/MYC类和NAC类等。AP2/ERF是水稻中最大的转录因子家族之一，广泛参与水稻生长发育和胁迫应答等多种生物学进程。当逆境来临时，水稻AP2/ERF转录因子可通过结合逆境相关基因启动子区的顺式作用元件如GCAC(A/G)N(A/T)TCCC(A/G)ANG(C/T)、GCC-box(AGCCGCC)、DRE/CRT(A/GCCGAC)等调控靶基因的表达，以提高水稻对各种胁迫的适应性(Shoji和Yuan，2021)。Rashid等(2012)将170个水稻AP2/ERF转录因子家族基因分为AP2(APETALA2)、RAV(related to ABI3/VP1)、DREB(dehydration-responsiveelementbindingprotein)、ERF(ethylene responsive factor)和soloist 5个亚家族。其中，ERF和DREB亚家族在水稻响应逆境过程中扮演着十分重要的角色。目前为止有关ERF和DREB亚家族成员在水稻抗逆方面的报道主要集中在抗病、抗旱、抗盐等领域。例如，过表达OsEREBP1(ethylene responsive elementbindingprotein 1)可以提高JA和ABA含量，增强水稻对白叶枯病菌的抗性(Jisha等，2015)；OsERF83与GCC-box结合调控下游基因表达，提高稻瘟病抗性(Tezuka等，2019)；OsERF3是类受体激酶GUDK(growth under droughtkinase)的磷酸化底物。过表达GUDK和OsERF3均会导致水稻耐旱性降低，OsDERF1(drought-responsive ERF genes)和OsERF109可直接与OsERF3启动子中的GCC-box或DRE元件结合，激活其表达，负调控抗旱能力(Wan等，2011；Zhang等，2013)。在盐胁迫研究方面，OsSERF1(saltresponsive ERF1)是响应盐胁迫中一个核心的正调控因子，当水稻遭遇盐胁迫后，MAP3K6-MKK4-MAPK5通路被激活，OsSERF1蛋白第105位Ser残基被MAPK5磷酸化，增强其转录激活活性，提高耐盐能力。同时，OsSERF1受盐胁迫诱导表达，OsSERF1识别并结合MAP3K6和MAPK5的A/GCCGAC基序直接激活靶基因及其自身的表达，形成一个反馈调节机制(Schmidt等，2013)。OsERF922过表达使水稻中Na⁺/K⁺比值增加，导致水稻对盐胁迫的耐受性变弱(Liu等，2012)。然而，有关OsERF103在水稻响应干旱中的功能和应用还未见报道。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供水稻OsERF103蛋白及其编码基因在提高植物干旱耐受性中的应用以及提供一种培育耐受干旱胁迫的转基因植物的方法，为植物抗旱分子机制研究以及培育抗旱新品种提供理论基础。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

在一个方面，本发明提供了水稻OsERF103蛋白及其编码基因在提高植物干旱耐受性中的应用，所述水稻OsERF103蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

本发明构建了水稻OsERF103的超表达载体和OsERF103基因突变体，并通过农杆菌侵染水稻愈伤组织的方法来获得过表达阳性植株以及突变体阳性植株，获得4个突变体转基因株系以及6个表达倍数有不同程度上调的过表达转基因株系，通过对其进行功能鉴定，发现OsERF103的转录表达量随着干旱处理的过程逐渐升高，随着复水的过程逐渐降低，说明OsERF103在转录水平响应干旱胁迫。对转基因株系进行耐旱性分析，表明Oserf103突变体均表现出干旱敏感表型，存活率显著低于野生型；而超表达植株均表现出抗旱的表型，且存活率与OsERF103转录本的上调水平呈正相关，说明OsERF103是水稻响应干旱的正调控因子。

本发明中“水稻OsERF103蛋白”涵盖在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质以及将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

在一个实施方案中，所述水稻OsERF103蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

本发明涵盖与SEQ ID No.1所示核苷酸序列具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上相似度且具有相同功能的序列。本发明也涵盖与SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列具有一个或几个碱基的取代、替换、缺失和/或添加且具有相同功能的序列。

在另一个方面，本发明包含水稻OsERF103蛋白的编码基因的生物材料在提高植物干旱耐受性中的应用，其中，所述生物材料包括：

(A)含有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的核酸分子的表达盒；

(B)含有(A)中所述表达盒的重组载体；

(C)含有(A)中所述表达盒或含有(B)中所述重组载体的重组微生物；

(D)含有(A)中所述表达盒或含有(B)中所述重组载体的重组细胞。

在一个实施方案中，本发明包含水稻OsERF103蛋白的编码基因的转基因植物。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。所述转基因植物不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。

在一个实施方案中，所述重组载体为重组表达载体，优选为目的基因(水稻OsERF103基因)的过表达载体。

在一个实施方案中，重组表达载体包含启动目的基因转录的转录子。为了获得目的基因过表达，重组表达载体所包含的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。

在一个优选的实施方案中，所述过表达载体含有Ubiquitin启动子或CaMV 35S启动子；所述目的基因的核酸分子可操作地连接至启动子。

在一个实施方案中，重组表达载体包含合适的转录终止子，所述终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子等。

在一个实施方案中，所述重组载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，例如包括但不限于pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb等载体。

在一个实施方案中，所述重组载体还包括便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的基因)。

在一个实施方案中，所述微生物为农杆菌，优选地，所述微生物为农杆菌EHA105。

在一个实施方案中，所述重组载体为Ubi-XX-3FLAG。

在一个实施方案中，所述重组细胞包括水稻OsERF103基因的过表达载体或水稻OsERF103基因的过表达突变体。

在一个实施方案中，所述应用为使水稻OsERF103蛋白或其编码基因过量表达来提高植物的干旱耐受性。

在另一个方面，本发明提供了一种培育耐受干旱胁迫的转基因植物的方法，通过基因工程的方法提高所述植物中OsERF103基因的表达水平或OsERF103蛋白的活性，得到干旱耐受性提高的转基因植物。

在一个实施方案中，提高所述植物中OsERF103基因的表达水平的方法包括将OsERF103蛋白的编码基因导入植物组织或植物细胞中。

本发明也提供了一种提高植物干旱胁迫耐受性的方法，包括1)构建含有水稻OsERF103基因的表达载体；2)将所构建的表达载体转化到植物或植物细胞中；3)培育获得转基因植物的植株。

在本发明中，表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体，直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞；例如通过浸染愈伤组织导入水稻。

在一个实施方案中，含有所述目的基因的重组表达载体侵染目的植物后，筛选阳性植株，获得与正常植物相比抗旱性能增强的转基因植物。

在具体的实施方案中，所述转基因植物(导入OsERF103基因)的抗旱性提高表现为：转基因植物的抗旱性高于非转基因植物(野生型植物)或转入不含目的基因的空载体的植物；特别地，转基因植物的耐旱性水平更高，并且其在干旱胁迫下，OsERF103基因的表达量也更高，转基因植物的存活率也比野生型更高。

在一个实施方案中，重组表达载体转化宿主包括多种植物。

在一个实施方案中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于拟南芥、水稻、油菜等。

在一个优选的方案中，所述植物为水稻，优选为野生型水稻(日本晴)。

本发明的有益效果：

本发明明确了OsERF103基因为水稻耐旱性的重要基因，该基因可响应干旱胁迫，在水稻抗旱中发挥正调节功能。水稻基因OsERF103或其编码蛋白可应用于提高植物的抗逆性(抗旱性)。

本发明提供了通过提高OsERF103基因的表达增强或提升植物干旱耐受性方面的应用，从而可获得抗旱性提高的植物，具有较高的应用价值，为培育具有耐旱性的转基因植物的研究奠定基础。通过使水稻OsERF103蛋白或其编码基因过量表达来培育耐受干旱胁迫的转基因植物可以提高植物在干旱胁迫环境下的存活率，有利于保障粮食安全，实现农业可持续性发展。

附图说明

图1为OsERF103基因编码的蛋白与OsERF48基因编码蛋白的氨基酸序列对比结果；

图2为OsERF103基因编码的蛋白与OsERF71基因编码蛋白的氨基酸序列对比结果；

图3为OsERF103基因编码的蛋白与OsERF101基因编码蛋白的氨基酸序列对比结果；

图4为水稻OsERF103基因四个突变体突变位点示意图；

图5为水稻OsERF103在野生型和不同过表达转基因株系中的转录水平；

图6为水稻在干旱处理过程和复水过程中，OsERF103的转录水平；

图7为水稻Oserf103突变体降低水稻的抗旱能力及存活率分析结果；

图8为水稻OsERF103基因超表达提高水稻植株对干旱的抗性及存活率分析结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

以下提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在一个实施方式中，本发明提供了水稻OsERF103蛋白或其编码基因在提高植物干旱耐受性中的应用，所述水稻OsERF103蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示(SEQ IDNo.2：MVPRVERGGGGFHLPNSEREDSLFIRALISVVSGDTTVPTLLPEPTMATVVAGAATCARCGVDGCIGVDCEVVVLAAAAGSSCSDEEDEGECTTGAVASGGVTGGVGKRRPRRRSGGEGSRYRGVRRRPWGKWAAEIRDPRRAVCKWLGTFDTAEDAARAYDVAALEFRGQRAKLNFPASTAAQQPRPLLHHNLRENCGSNASSPVHAPEHARTAAAAKDQEIWDGLREIMMLDDGSFWSMP)；所述水稻OsERF103蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示(SEQ ID No.1：ATGGTGCCGAGGGTGGAGCGCGGCGGCGGCGGGTTCCATCTCCCCAACAGCGAGCGGGAGGACTCGCTGTTCATCCGCGCGCTCATCTCCGTCGTGTCCGGTGACACCACGGTGCCGACGCTGCTGCCGGAGCCGACGATGGCGACCGTGGTTGCCGGTGCGGCTACGTGCGCCAGGTGCGGGGTGGACGGGTGCATCGGCGTGGACTGCGAGGTGGTGGTGTTGGCGGCGGCGGCTGGCTCGAGCTGCAGCGACGAGGAGGATGAGGGGGAGTGCACCACGGGCGCGGTGGCCAGCGGCGGCGTGACGGGCGGCGTGGGCAAGAGGAGGCCGCGGAGGCGGAGCGGCGGCGAGGGGAGCAGGTACAGGGGCGTGCGGCGTCGGCCGTGGGGGAAGTGGGCGGCGGAGATCCGCGACCCGCGCCGCGCCGTCTGCAAGTGGCTCGGCACGTTCGACACCGCCGAGGACGCCGCGCGCGCCTACGACGTCGCCGCGCTCGAGTTCCGCGGCCAGCGCGCCAAGCTCAACTTCCCGGCGTCCACGGCCGCGCAGCAGCCACGTCCACTCCTCCATCACAACCTCCGTGAGAACTGCGGCTCGAACGCGTCGTCGCCGGTGCACGCGCCAGAGCACGCGAGGACGGCGGCGGCGGCGAAGGACCAGGAGATCTGGGACGGCCTACGGGAGATCATGATGCTCGACGACGGCAGCTTCTGGTCCATGCCATGA)。

ERF可以与GCC-box和/或DRE/CRT元件特异结合，ERF正是通过调节相关基因的表达参与植物的抗盐、抗旱、抗冷等相关生物和非生物胁迫过程中。植物的逆境响应受多条信号途径所调节，多种信号途径之间可能是相互促进，也可能是相互拮抗，从而实现逆境防卫反应。目前，水稻中还有很多的ERF基因的功能未知，ERF类转录在水稻抗旱过程中作用的研究文章很少。此外，植物的抗旱性涉及非常多的基因参与，发现和验证更多参与植物抗旱的基因对于研究和培育农作物耐旱品种有重要意义。OsERF103蛋白或其编码基因在调控水稻抗旱方面的功能尚未有任何文献报道。与植物抗旱能力相关的OsERF基因包括例如OsERF48、OsERF71、OsERF101，本发明提供的OsERF103基因编码的蛋白质与上述基因编码蛋白质的同源性分别为21.48％，15.45％，14.18％，而如图1～3所示，,可以看出，本发明提供的OsERF103基因编码的蛋白与目前已见报道的基因编码的蛋白同源性极低。本发明提出OsERF103基因可提高水稻在干旱条件下的生长状态，因此，可以用于培育耐受干旱胁迫的转基因植物。

对于受到干旱胁迫诱导表达的基因，其是否具有转录激活的活性以及在在干旱胁迫响应中发挥何种作用是未知的，需要通过具体的实验来阐明基因的功能。本发明利用基因工程手段研究了该基因的表达特征和突变体株系的表型变化；分析了该基因表达变化与作物表型以及存活率之间的关系，发现超表达OsERF103基因后水稻植株明显比野生型对照具有更强的耐旱性。

在另一个实施方式中，本发明提供了一种培育耐受干旱胁迫的转基因植物的方法，通过基因工程的方法提高所述植物中OsERF103基因的表达水平或OsERF103蛋白的活性，得到干旱耐受性提高的转基因植物。

逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。由于植物的耐逆性是由多基因调控的复杂性状，因此阐明抗逆过程中重要的基因对于耐旱机制和培育耐旱作物具有重要意义。本发明阐明OsERF103基因上调表达提高了转基因水稻对干旱的耐受性，OsERF103表达缺失降低了水稻耐旱性，OsERF103蛋白及其编码基因能增强植物对逆境的耐性，表明该基因在作物抗旱性改造及稳产上具有应用价值。本发明为改良、增强水稻抗逆性，加速抗逆分子育种进程具有重要的理论和实际意义。

本发明所涉及到的术语定义

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。

术语“转录因子”是能够与真核生物基因启动子区域中顺式作用元件特异性结合，从而激活或抑制下游基因在特定时间和空间转录与表达的一类DNA结合蛋白。

在本发明中，术语“同一性”或“相似度”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性或相似度可借助计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

在本发明中，术语“表达”或“基因表达”意指某个特定基因或多个特定基因或特定基因构建体的转录成结构性RNA(rRNA，tRNA)或mRNA，而所述RNA随后翻译或不翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。

在本发明中，术语“提高的表达/过量表达”意指相对于原有野生型表达水平为提高的任何形式的表达。在本领域内已经记载了用于提高基因或基因产物表达的方法并且这些方法包括例如由适宜启动子驱动的过量表达、使用转录增强子或翻译增强子。

在本发明中，术语“提高”、“改善”或“增强”是相互可交换的并且在应用含义上应当意指与如本文中定义的对照植物相比较，至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选至少15％或20％、更优选地25％、30％、35％或40％更多的产量和/或生长和/或变化。

在本发明中，术语转化”：将异源性DNA序列或含有DNA序列的载体引入到宿主细胞或有机体的方法。

在本发明中，术语“重组表达载体”：一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。

在本发明中，术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

在本发明中，术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞株”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

实施例1.克隆OsERF103基因核苷酸序列

使用Omega公司的植物提取试剂盒，从水稻中提取RNA。然后以1μg的RNA做模板，按照cDNA合成试剂盒(Yeasen)操作说明合成第一链cDNA。

根据(http://rice.plantbiology.msu.edu/expression.shtml)网站得到OsERF103的完整ORF，设计特异引物：5’端正向引物为ATGGTGCCGAGGGTGG(5’-3’方向，SEQID No.3)；3’端反向引物为TCATGGCATGGACCAGAA(5’-3’方向，SEQ ID No.4)进行PCR扩增反应。

PCR反应体系为：2×Phanta Max Master Mix 25μL，正/反向引物10μM各1μL，模板(cDNA)5μL，灭菌水补齐至50μL。

PCR反应程序如下：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，36个循环，72℃延伸5min。最终扩增得到OsERF103的729bp全长cDNA序列(如SEQ ID No.1所示)，编码243个氨基酸(如SEQ ID No.2所示)。

实施例2.OsERF103基因突变体及超表达载体的构建

利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统对野生型水稻(日本晴)中OsERF103基因进行编辑来获得突变体植株。

(1)利用CRISPR-GE网站(http://skl.scau.edu.cn/)对目标基因OsERF103的外显子序列进行分析，挑选出两个特异性靶点序列，分别为靶位点1(Cas9-1)CGATGGCGACCGTGGTTGCCGG(SEQ ID No.5)和靶位点2(Cas9-2)GGCGAGGGGAGCAGGTACAGGG(SEQ ID No.6)。

(2)合成特异性sgRNA-1(CGATGGCGACCGTGGTTGC)和sgRNA-2(GGCGAGGGGAGCAGGTACA)，将基因编辑载体psgR-CAS9-Os用BsaI酶切。

(3)先将引物退火，退火反应体系为：

靶位点1，10μL F(5’-TGTGTGCGATGGCGACCGTGGTTGC-3’)+10μLR(5’-AAACGCAACCACGGTCGCCATCGCA-3’)+80μL ddH₂O混匀；

靶位点2，10μL F(5'-TGTGTGGGCGAGGGGAGCAGGTACA-3')+10μLR(5'-AAACTGTACCTGCTCCCCTCGCCCA-3')+80μLddH₂O混匀。

反应体系混匀后，95℃退火10min；

再与酶切好后的载体psgR-CAS9-Os进行连接，连接体系如下：2μL退火产物(含sgRNA)+2μL回收酶切载体+0.5μL 10x T4 buffer+0.5μLT4 ligase室温连接15min，获得含有OsERF103特异性靶点的psgR-CAS9-OsERF103载体。

将含有OsERF103特异性靶点的psgR-CAS9-OsERF103载体转化入大肠杆菌感受态DH5α，转化体系如下：连接产物5μL加入大肠杆菌感受态中，冰上30min，42℃热激90s，冰上2min，加入400μL无抗LB，37℃复苏1h，5000rpm离心1min，吸掉大部分上清，留100μL液体混匀，涂在LB平板(50mg/LKan)培养，37℃过夜培养。

将阳性克隆提取质粒后，送至公司进行测序，选择结果正确的psgR-CAS9-OsERF103质粒通过农杆菌侵染水稻愈伤组织的方法来获得突变体植株。

为了构建Ubi:OsERF103-3FLAG，先将扩增得到全长的不含终止密码子的目的基因PCR产物(726bp)，按照Omega胶回收试剂盒操作进行纯化。将回收产物和HindIII酶切后的载体Ubi-XX-3FLAG用同源重组的方法进行连接，反应体系如下：线性化载体2μL，插入片段3μL，5×Cell buffer4μL，Exnase II 2μL，灭菌水补齐至20μL；反应条件：37℃，30min。连接产物转化DH5α感受态细胞，37℃(卡那霉素抗性)培养过夜。第二天挑取阳性单克隆送测序。

实施例3.OsERF103基因突变体及超表达植株的构建

用农杆菌转化野生型日本晴的愈伤组织。

将实施例2得到的OsERF103的基因突变体载体和植物过表达载体分别转化农杆菌EHA105。农杆菌介导的水稻遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法(参见Agrobacterium-mediated transformation ofrice using immature embryos or calliinduce from mature seed，2008，Nature protocol.Doi:10.1038/nprot.2008.46)基础上进行。

通过潮霉素筛选和qRT-PCR检测目的基因在野生型和转基因植株中的表达情况，初步筛选过表达阳性植株；而对于突变体阳性植株，则需要提取T0代植株的gDNA，PCR鉴定并测序。

Oserf103突变体的鉴定：提取T0代转基因植株叶片基因组DNA并以此为模板，根据OsERF103靶点信息，设计特异引物F(GATAGCGCGCCAACTTTT；SEQ ID No.7)和引物R(CGGAGGTTGTGATGGAGG；SEQ ID No.8)进行PCR扩增，将目的条带单一且清晰的扩增产物进行回收(阳性植株PCR扩增产物大小为645bp)，并送至公司进行测序，筛选发生突变的株系。T0代连续自交得到T2代。对T2代植株再次进行潮霉素筛选和PCR鉴定，筛选出不含载体且纯合突变的独立株系。

如图4所示，最终得到了四个突变体株系，分别命名为Oserf103-1，Oserf103-2，Oserf103-3和Oserf103-4。其中靶序列1处发生了两种突变，增加1个碱基(+T)的株系为Oserf103-1，缺失1个碱基(-T)的株系为Oserf103-2，；靶序列2处也发生了两种突变，增加1个碱基(+A)的株系为Oserf103-3，缺失1个碱基(-C)的株系为Oserf103-4，以上四个突变体均导致编码蛋白发生移码突变。

OsERF103超表达植株的鉴定：RNA提取参照易思得公司RNA植物提取试剂盒说明书进行，提取14d的野生型和转基因水稻幼苗的RNA，以1μg的RNA做模板，按照cDNA合成试剂盒(Yeasen)操作说明合成第一链cDNA。以OsERF103基因cDNA设计特异定量PCR引物(F为5’-ACGTCCACTCCTCCATCACAAC-3’，SEQ ID No.9；R为5’-AGCATCATGATCTCCCGTAGGC-3’，SEQ IDNo.10)，通过qRT-PCR检测OsERF103基因在野生型和过表达转基因株系中的表达情况，挑选了表达倍数均上调且具有不同的上调倍数的#1、#6、#13、#17、#23和#29进行接下来的实验。如图5所示，横坐标代表挑选出来的转基因株系#1、#6、#13、#17、#23和#29，纵坐标代表OsERF103的表达量。

实施例4.OsERF103突变体和过表达植株的功能鉴定

1、qPCR技术分析水稻干旱过程中OsERF103在mRNA水平的表达

使用实施例3中的OsERF103基因定量PCR引物检测4周大小的植物在干旱处理不同天数和恢复后不同天数的转录表达量。图6结果表明，OsERF103的转录表达量随着干旱处理的过程逐渐升高，随着复水的过程逐渐降低，说明OsERF103在转录水平响应干旱胁迫。

2、OsERF103突变体和过表达植株耐旱性分析

将野生型(日本晴)，Oserf103突变体和Ubi:OsERF103种子在37℃黑暗浸种萌发后，每种植株分别种植于营养土中，然后放置于同一个塑料盆中培养以保证供水一致。待植株生长4周左右，进行干旱处理10～14天(根据叶片卷曲及萎蔫程度而定)后复水，观察表型并统计存活率。结果表明，Oserf103突变体均表现出干旱敏感表型，存活率显著低于野生型(图7)；而超表达植株均表现出抗旱的表型，且存活率与OsERF103转录本的上调水平呈正相关(图8)。这些结果表明OsERF103是水稻响应干旱的正调控因子。

最后应说明的是：本发明的保护范围并非仅限于此以上各实施例，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，这些修改与替换均将落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.水稻OsERF103蛋白及其编码基因在提高植物干旱耐受性中的应用，其特征在于，所述水稻OsERF103蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水稻OsERF103蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.包含水稻OsERF103蛋白的编码基因的生物材料在提高植物干旱耐受性中的应用，其中，所述生物材料包括：

(A)含有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的核酸分子的表达盒；

(B)含有(A)中所述表达盒的重组载体；

(C)含有(A)中所述表达盒或含有(B)中所述重组载体的重组微生物；

(D)含有(A)中所述表达盒或含有(B)中所述重组载体的重组细胞。

4.根据权利要求3所述的应用，所述重组载体为水稻OsERF103基因的过表达载体。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述过表达载体含有Ubiquitin启动子或CaMV35S启动子。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组细胞包括水稻OsERF103基因的过表达载体或水稻OsERF103基因的过表达突变体。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用为使水稻OsERF103蛋白或其编码基因过量表达来提高植物的干旱耐受性。

8.一种培育耐受干旱胁迫的转基因植物的方法，其特征在于，通过基因工程的方法提高所述植物中OsERF103基因的表达水平或OsERF103蛋白的活性，得到干旱耐受性提高的转基因植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，提高所述植物中OsERF103基因的表达水平的方法包括将OsERF103蛋白的编码基因导入植物组织或植物细胞中。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述植物为水稻。