CN108409845B

CN108409845B - 蛋白质TaNRT2.5在调控植物对氮肥利用效率中的应用

Info

Publication number: CN108409845B
Application number: CN201810469217.5A
Authority: CN
Inventors: 童依平; 李文静; 何雪; 赵学强; 滕婉; 马文英
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2018-05-16
Filing date: 2018-05-16
Publication date: 2021-03-19
Anticipated expiration: 2038-05-16
Also published as: CN108409845A

Abstract

本发明公开了蛋白质TaNRT2.5在调控植物对氮肥利用效率中应用。本发明提供了TaNRT2.5蛋白或其相关生物材料在调控植物对氮肥利用效率中的应用；所述相关生物材料为能够表达所述TaNRT2.5蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。本发明所提供的蛋白质TaNRT2.5能够增加对氮肥利用效率并提高籽粒总蛋白含量。因此，可以利用蛋白质TaNRT2.5调控植物对氮肥利用效率以及总蛋白含量。本发明对选育高品种植物新材料的具有重要应用价值。

Description

蛋白质TaNRT2.5在调控植物对氮肥利用效率中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及蛋白质TaNRT2.5在调控植物对氮肥利用效率中应用。

背景技术

氮素是植物生长发育所必需的大量营养元素，缺氮是制约着农作物产量的重要因素。我国的人口数量约占了世界人口的五分之一，且仍在逐年增加；但农业可耕种面积只有世界的7％，呈逐年减少的趋势。为了用不断减少的土地养活不断增加的人口，我国大量使用化肥以增加单位面积粮食产量。多年的研究表明化肥确实能够实现大范围的增产，但是化肥的过量使用不仅直接导致了化肥利用效率的降低，也导致了严重的环境问题和资源浪费。我国水稻、小麦和玉米的氮肥农学效率分别为10.4kg/kg、8.0kg/kg和9.8kg/kg，氮肥利用率分别为28.3％、28.2％和26.1％，远低于国际水平，与20世纪80年代相比呈下降趋势。面临巨大的资源环境压力，粮食增产不能单纯依靠增加肥料用量来实现。

减少化肥投入，通过基因工程等生物手段选育养分高效农作物新品种将具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种蛋白质TaNRT2.5在调控植物对氮肥利用效率中应用。

第一方面，本发明要求保护TaNRT2.5蛋白或其相关生物材料在调控植物对氮肥利用效率(如提高植物对氮肥利用效率)中的应用；

所述相关生物材料可为能够表达所述TaNRT2.5蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

进一步地，在所述应用中，所述TaNRT2.5蛋白或其编码基因在所述植物中的表达量和/或活性增加，所述植物对氮肥利用效率增加；所述TaNRT2.5蛋白或其编码基因在所述植物中的表达量和/或活性降低，所述植物对氮肥利用效率降低。

其中，所述植物对氮肥利用效率可体现为如下中至少一种：

(a1)植物对培养基质中硝酸根的净吸收率；

(a2)植物单株籽粒含氮量(mg/株)；

(a3)植物单株秸秆含氮量(mg/株)；

(a4)植物单株地上部含氮量(mg/株)；

(a5)植物的氮素收获指数(％)；

(a6)植物籽粒总蛋白含量(或称为籽粒氨基酸含量)(g/株)。

所述氮素收获指数(％)为所述单株籽粒含氮量(mg/株)与所述单株地上部含氮量(mg/株)的比值。

其中，所述植物籽粒总蛋白含量(或称为籽粒氨基酸含量)＝植物籽粒含氮量(mg/株)×6.25÷1000。

籽粒含氮量、秸秆含氮量和地上部含氮量(单位：mg/株)，指的是一株小麦全部籽粒、秸秆或者地上部分中氮元素的质量有多少mg。籽粒总蛋白含量(单位：g/株)，指的是一株小麦全部籽粒中蛋白质的含量有多少g。

第二方面，本发明要求保护一种培育对氮肥利用效率提高的植物品种的方法。

本发明所提供的培育对氮肥利用效率提高的植物品种的方法，可包括使受体植物中TaNRT2.5蛋白的表达量和/或活性提高的步骤。其中，所述对氮肥利用效率提高可体现为对培养基质中硝酸根的净吸收率提高和/或单株籽粒含氮量(mg/株)提高和/或单株秸秆含氮量(mg/株)提高和/或单株地上部含氮量(mg/株)提高和/或氮素收获指数(％)提高和/或植物籽粒总蛋白含量(g/株)提高。

进一步地，本发明提供了一种培育对氮肥利用效率提高的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育对氮肥利用效率提高的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达TaNRT2.5蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对氮肥利用效率提高。其中，所述对氮肥利用效率提高可体现为对培养基质中硝酸根的净吸收率提高和/或单株籽粒含氮量(mg/株)提高和/或单株秸秆含氮量(mg/株)提高和/或单株地上部含氮量(mg/株)提高和/或氮素收获指数(％)提高和/或植物籽粒总蛋白含量(g/株)提高。

第三方面，本发明要求保护一种培育对氮肥利用效率降低的植物品种的方法。

本发明所提供的培育对氮肥利用效率降低的植物品种的方法，可包括使受体植物中TaNRT2.5蛋白的表达量和/或活性降低的步骤。其中，所述对氮肥利用效率降低可体现为对培养基质中硝酸根的净吸收率降低和/或单株籽粒含氮量(mg/株)降低和/或单株秸秆含氮量(mg/株)降低和/或单株地上部含氮量(mg/株)降低和/或氮素收获指数(％)降低和/或植物籽粒总蛋白含量(g/株)降低。

进一步地，本发明提供了一种培育对氮肥利用效率降低的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育对氮肥利用效率降低的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：对受体植物中TaNRT2.5蛋白的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对氮肥利用效率降低。其中，所述对氮肥利用效率降低可体现为对培养基质中硝酸根的净吸收率降低和/或单株籽粒含氮量(mg/株)降低和/或单株秸秆含氮量(mg/株)降低和/或单株地上部含氮量(mg/株)降低和/或氮素收获指数(％)降低和/或植物籽粒总蛋白含量(g/株)降低提高。

在第二方面中，所述“向受体植物中导入能够表达所述TaNRT2.5蛋白的核酸分子”具体可通过向所述受体植物中导入含有所述TaNRT2.5蛋白的编码基因的重组表达载体实现。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA-1300-221、pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，所述重组载体中启动所述TaNRT2.5蛋白的编码基因转录的启动子为Ubiquitin启动子。

更加具体的，所述重组表达载体为将所述TaNRT2.5蛋白的编码基因插入到pUbi-163载体的多克隆位点处(BamHⅠ和KpnI)所得的重组质粒。

在第三方面中，所述“对受体植物中TaNRT2.5蛋白的编码基因进行抑制表达”具体可通过向所述受体植物中导入含有如式(I)所示的DNA片段的干扰载体实现；

SEQ_正向-X-SEQ_反向 (I)

所述SEQ_正向的序列为SEQ ID No.3的第1-229位；

所述SEQ_反向的序列与所述SEQ_正向的序列反向互补(具体为SEQ ID No.3的第411-639位)；

所述X是所述SEQ_正向与所述SEQ_反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ_正向及所述SEQ_反向均不互补。

在本发明中，式(I)中所述X具体如SEQ ID No.3的第236-404位所示。

更加具体的，式(I)所示的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

在本发明中，所述干扰载体具体为将所述如式(I)所示的DNA片段插入到pUbi-163载体的多克隆位点处(BamHⅠ和KpnI)所得的重组质粒。

在上述方法中，将携带有所述TaNRT2.5蛋白的编码基因的所述重组表达载体或者携带有所述如式(I)所示的DNA片段的所述的干扰载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

在第一方面、第二方面和第三方面中，所述TaNRT2.5蛋白均可为TaNRT2.5-3B蛋白(即位于小麦B染色体组上的TaNRT2.5蛋白)。更进一步，所述TaNRT2.5-3B蛋白具体可为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

在本发明的具体实施方式中，所述TaNRT2.5-3B蛋白具体为将SEQ ID No.2所示核苷酸序列编码所得的蛋白质(即在SEQ ID No.1所示氨基酸序列的C端增加HHHHHH)。

相应的，在第一方面、第二方面和第三方面中，所述“能够表达所述TaNRT2.5蛋白的核酸分子”均可为所述TaNRT2.5-3B蛋白的编码基因。更进一步，所述TaNRT2.5-3B蛋白的编码基因具体可如下任一所述的DNA分子：

(B1)SEQ ID No.2的第1-1542位所示的DNA分子；

(B2)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(B3)在严格条件下与(B1)或(B2)限定的DNA分子杂交且编码所述TaNRT2.5蛋白的DNA分子；

(B4)与(B1)-(B3)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述TaNRT2.5蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

在第一方面、第二方面和第三方面中，所述植物均可为单子叶植物，也可为双子叶植物。

在第一方面、第二方面和第三方面中，所述培养基质可为植物营养液；具体可为含2mM硝酸根的植物营养液(高氮)或0.2mM硝酸根的植物营养液(低氮)。

进一步地，所述单子叶植物可为禾本科植物。

更进一步地，所述禾本科植物可为小麦。

在本发明的具体实施方式中，所述植物具体为小麦品种陇春23号。

实验证明，本发明所提供的蛋白质TaNRT2.5能够增加氮肥利用效率：与野生型植物相比，TaNRT2.5-3B超量表达转基因植物的对培养基质中硝酸根的净吸收率/单株籽粒含氮量(mg/株)/单株秸秆含氮量(mg/株)/单株地上部含氮量(mg/株)/氮素收获指数(％)/籽粒总蛋白含量(g/株)均显著增加；TaNRT2.5减量表达转基因植物的单株籽粒含氮量(mg/株)/单株秸秆含氮量(mg/株)/单株地上部含氮量(mg/株)/氮素收获指数(％)/籽粒总蛋白含量(g/株)均显著降低。因此，可以利用蛋白质TaNRT2.5调控植物对氮肥利用效率。本发明对选育高品种植物新材料的具有重要应用价值。

附图说明

图1为pUbi-TaNRT2.5-3B和pUbi-TaNRT2.5-RNAi载体示意图。A为pUbi-TaNRT2.5-3B；B为pUbi-TaNRT2.5-RNAi。

图2为TaNRT2.5转基因系DNA水平鉴定。A为TaNRT2.5-3B超表达系DNA鉴定图，PC代表载体质粒(阳性对照)，WT代表野生型陇春23号(阴性对照)；B为TaNRT2.5减量表达系DNA鉴定图，PC代表载体质粒(阳性对照)，WT代表野生型陇春23号(阴性对照)。箭头所指为目的条带位置。

图3为TaNRT2.5转基因系RNA水平鉴定。A为TaNRT2.5-3B超表达系RNA鉴定结果；B为TaNRT2.5减量表达系RNA鉴定结果。WT代表野生型陇春23号。TaActin作为内参基因，图中数值为平均值±S.E.(n＝4)，星号代表TaNRT2.5转基因系和野生型表达量的显著性分析，P<0.01(**)水平。

图4为超表达TaNRT2.5-3B提高苗期硝酸根吸收硝酸根净吸收率。小麦幼苗分别移至含2mM ¹⁵NO₃ ^-和0.2mM ¹⁵NO₃ ^-营养液中处理12h，测定¹⁵N含量，计算硝酸根吸收速率。每组从左到右依次为野生型陇春23号、TaNRT2.5-3B超表达系OE102-6和TaNRT2.5-3B超表达系OE103-1。图中数值为平均值±S.E.(n＝4)，不同字母代表TaNRT2.5-3B超表达系和野生型在P<0.05水平上的差别。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

小麦品种陇春23号在文献“袁俊秀，杨文雄，丰产广适优质春小麦新品种-陇春23号，麦类作物学报,2009,29(4):740”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

pUbi-163载体：记载于“Shao,A.,Ma,W.Y.,Zhao,X.Q.,Hu,M.Y.,He,X.,Teng,W.,Li,H.,and Tong,Y.P.(2017).The auxin biosynthetic TRYPTOPHAN AMINOTRANSFERASERELATED TaTAR2.1-3A increases grain yield of wheat.Plant Physiol.174,2274-2288.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

实施例1、转TaNRT2.5基因小麦的构建

一、转TaNRT2.5基因植株的制备

(一)TaNRT2.5基因的获得

1、提取小麦品种陇春23号的总RNA，反转录得到其基因组cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，以如下引物为引物进行PCR扩增构建超量表达TaNRT2.5-3B转基因系小麦所需序列：

TaNRT2.5-OE-F：5’-GGATCCATGGAGGGGGAGTCGAAGCC-3’(下划线所示序列为BamHⅠ酶切识别位点)；

TaNRT2.5-OE-R：5’-GGTACCTCAATGGTGATGGTGATGATGCACGTCGGCCGG CGACC-3’(下划线所示序列为KpnⅠ酶切识别位点)。

以如下引物为引物进行PCR扩增构建减量表达TaNRT2.5转基因系小麦所需序列：

TaNRT2.5-RNAi-F1：5’-GGATCCGCTTCGACGTGAACCTCCACACG-3’(下划线所示序列为BamHⅠ酶切识别位点)；

TaNRT2.5-RNAi-R1：5’-GAATTCAGTATCATGACGGCCACCGACG-3’(下划线所示序列为EcoRⅠ酶切识别位点)；

TaNRT2.5-RNAi-F2：5’-GGTACCGCTTCGACGTGAACCTCCACACG-3’(下划线所示序列为KpnI酶切识别位点)；

TaNRT2.5-RNAi-R2：5’-AAGCTTAGTATCATGACGGCCACCGACG-3’(下划线所示序列为HindIII酶切识别位点)。

PCR体系(40μl)：模板cDNA 4μl，KOD plus DNA聚合酶1μl，10×PCR buffer forKOD plus 4μl，dNTPs(2mM each)4μl，25mM的MgSO₄ 2μl，上下游引物各20mM，再用双蒸水将反应体系补足至40μl。

PCR反应程序：98℃2min；98℃30sec，58℃30sec，68℃45sec，35个循环。

用于超量表达TaNRT2.5-3B基因的PCR产物(记为PCR产物1)的核苷酸序列为“5’-GGATCC+SEQ ID No.2+GGTACC-3’”。其中，SEQ ID No.2的第1-1542位为TaNRT2.5基因的cDNA序列(编码SEQ ID No.1所示的TaNRT2.5-3B蛋白)，第1543-1563位为人为加入的纯化标签。

减量表达TaNRT2.5基因的PCR产物有两种，其一记为PCR产物2，另一记为PCR产物3；其中PCR产物2的核苷酸序列为“5’-GGATCC+SEQ ID No.2的第869-1097位+GAATTC-3’”，PCR产物3的核苷酸序列为“5’-GGTACC+SEQ ID No.2的第869-1097位+AAGCTT-3’”。

(二)TaNRT2.5基因克隆载体的构建

用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切上述PCR产物1，得到基因片段；BamHⅠ和KpnI双酶切pUbi-163载体，得到载体大片段，将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pUbi-TaNRT2.5-3B，将重组质粒送测序，结果正确。pUbi-TaNRT2.5-3B中TaNRT2.5-3B基因由Ubiquitin启动子启动，如图1中A所示。pUbi-TaNRT2.5-3B载体的结构描述：将SEQ IDNo.2所示DNA片段替换pUbi-163载体的酶切位点BamHⅠ和KpnI之间的小片段后所得的重组质粒。

用BamHI和EcoRI双酶切上述PCR产物2，得到基因片段S1，用HindIII和KpnI双酶切上述PCR产物3，得到基因片段S2，用EcoRI和HindIII酶切pUbi-163载体回收载体内含子片段S3，用BamHI和KpnI酶切pUbi-163载体回收载体骨架V1。然后将V1、S3分别与S1、S2连接构建成小麦pUbi-TaNRT2.5-RNAi载体。测序并酶切验证。如图1中B所示。

pUbi-TaNRT2.5-RNAi载体的结构描述：将SEQ ID No.3所示DNA片段替换pUbi-163载体的酶切位点BamHⅠ和KpnI之间的小片段后所得的重组质粒。

(三)转基因小麦的获得

将pUbi-TaNRT2.5-3B载体和pUbi-TaNRT2.5-RNAi载体用基因枪的方法分别转入野生型小麦陇春23号中，得到T0代TaNRT2.5-3B超量表达和减量表达转基因小麦。提取T0代TaNRT2.5-3B超量表达和减量表达转基因小麦叶片的基因组DNA，以其作为模板，用各自的上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到550bp和450bp左右的片段，即为阳性T0代TaNRT2.5-3B超量表达和减量表达转基因小麦。

用于鉴定TaNRT2.5-3B超量表达转基因小麦的引物：

上游引物T-OE pF：5’-TTAGCCCTGCCTTCATACGCT-3’(载体序列)；

下游引物T-OE pR：5’-GGCGACGAGAACATGGAGCT-3’。

用于鉴定TaNRT2.5减量表达转基因小麦的引物：

上游引物T-RNAi pF：5'-AAGCACGCCTACTAGTTCAAG-3'(内含子)；

下游引物T-RNAi pR：5'-ACCCATCTCATAAATAACGTCATGCG-3'(载体序列)。

将上述鉴定为阳性的T0代转TaNRT2.5-3B超量表达和减量表达转基因小麦培养至T3代，T1-T3代按照T0代的鉴定方法进行鉴定，筛选T3代TaNRT2.5-3B超量表达和减量表达转基因小麦纯合系(即T2代的种子收获后PCR鉴定下一代植株全部是TaNRT2.5-3B超量表达和减量表达转基因小麦认定为纯合系)，收获种子，后续实验均采用该T3代TaNRT2.5-3B超量表达和减量表达转基因纯合系小麦(以下简称T3代TaNRT2.5-3B超量表达和减量表达转基因纯合系小麦)。

实验同时设置向野生型小麦陇春23号中导入pUbi-163载体的空载对照(下文简称空载对照植株)。

二、转基因植株的检测

(一)DNA水平检测

分别提取T3代TaNRT2.5-3B超量表达小麦、TaNRT2.5减量表达小麦以及野生型小麦陇春23号的叶片的DNA，分别以其为模板，以T-OE pF和T-OE pR(具体序列同上)为引物鉴定TaNRT2.5-3B超量表达系，以T-RNAi pF和T-RNAi pR为引物(具体序列同上)鉴定TaNRT2.5减量表达系，同时以各自的载体为阳性对照(PC)，以野生型陇春23号作为阴性对照(WT)。

PCR反应体系(20μl)：DNA模板(约20ng/μl)2μl；正向引物(10μM)0.5μl；反向引物(10μM)0.5μl；10×PCR扩增缓冲液2μl；dNTP Mixture 1μl；TaqDNA聚合酶0.2μl；ddH₂O补足至20μl。

PCR反应程序：94℃，3min；94℃30s，60℃30s，72℃40s，40个循环；72℃5min。

TaNRT2.5-3B超量表达小麦的目的PCR扩增条带为550bp左右，TaNRT2.5减量表达小麦的目的PCR扩增条带为450bp左右，结果如图2所示。

图2中，PC：载体质粒阳性对照；WT：野生型小麦陇春23号；OE102-6和OE103-1分别是两个T3代TaNRT2.5-3B超量表达小麦株系；R100-1和R109-2分别是两个T3代TaNRT2.5减量表达小麦株系。

图2表明，野生型小麦陇春23号没有目的条带，两个T3代TaNRT2.5-3B超量表达小麦株系和减量表达小麦株系经初步鉴定为阳性小麦。

(二)RNA水平检测

1、分别提取T3代TaNRT2.5-3B超量表达小麦、TaNRT2.5减量表达小麦以及野生型小麦陇春23号灌浆期种子的总RNA，并反转录成cDNA。

2、分别以步骤1得到的cDNA为模板，以TaNRT2.5RT pF和TaNRT2.5RT pR为引物进行RT-PCR，扩增TaNRT2.5基因，同时以TaActin pF和TaActin pR为引物进行RT-PCR，扩增内参基因TaActin。

引物如下：

上游引物TaNRT2.5RT pF：5’-CGGGAAGTAGATGAGCGTGAT-3’；

下游引物TaNRT2.5RT pR：5’-GGTGGCCGTCATGATACTCT-3’；

上游引物TaActin pF：5'-ACCTTCAGTTGCCCAGCAAT-3'；

下游引物TaActin pR：5'-CAGAGTCGAGCACAATACCAGTTG-3'。

PCR体系：DNA模板(约20ng/μl)2μl；上游引物(10μM)0.4μl；下游引物(10μM)0.4μl；2×mixture(light Cycler SYBR Green I master,Roche)10μl；ddH₂O补足至20μl。

PCR程序：94℃，5min；94℃20s，60℃20s，72℃15s，45个循环。

定量分析：采用Roche LightCycler 480Ⅱrealtime PCR仪分析其CT值。以TaActin基因为内参，T3代TaNRT2.5转基因小麦和野生型小麦陇春23号中的TaNRT2.5基因用2-^Δct进行相对定量。

OE102-6和OE103-1两个T3代TaNRT2.5-3B超量表达小麦以及R100-1和R109-2两个TaNRT2.5减量表达小麦中TaNRT2.5基因的检测结果如图3所示。

图3中，WT代表野生型小麦陇春23号，OE102-6和OE103-1代表TaNRT2.5-3B超量表达小麦，R100-1和R109-2代表TaNRT2.5减量表达小麦。

图3表明，与野生型小麦陇春23号相比，OE102-6和OE103-1两个T3代TaNRT2.5-3B超量表达小麦中TaNRT2.5基因的表达量分别增加了372.15和1665.64倍。而R100-1和R109-2两个TaNRT2.5减量表达小麦中TaNRT2.5基因的表达量分别降低7.42和16.69倍。

经过步骤(一)的DNA水平检测和步骤(二)的RNA水平检测确定OE102-6和OE103-1两个T3代TaNRT2.5-3B超量表达小麦以及R100-1和R109-2两个TaNRT2.5减量表达小麦构建成功。

实施例2、TaNRT2.5转基因小麦的对氮肥利用效率以及籽粒蛋白质含量检测

一、对硝酸根净吸收率的测定

供试小麦：两个T3代TaNRT2.5-3B超量表达小麦OE102-6和OE103-1，野生型小麦陇春23号，以及空载对照植株。

将各供试小麦的种子于23℃培养箱中萌发(自来水培养)7天后，去掉胚后分别转入高氮营养液或低氮营养液中培养。植株培养7天后，小麦幼苗分别移至含2mM¹⁵NO₃-和0.2mM ¹⁵NO₃-营养液中处理12h，测定¹⁵N含量，计算硝酸根净吸收率，。

硝酸根净吸收率＝整株¹⁵N积累量(mg)/处理时间(h)/根系干重(g)

结果如图4所示。图4中，Low-N代表低氮营养液中培养结果，High-N代表高氮营养液中培养结果。

图4表明，低氮条件下野生型小麦陇春23号的硝酸根净吸收率为82.18μmol¹⁵N h^- ¹g^-1RDW，OE102-6为104.02μmol ¹⁵N h^-1g^-1RDW，OE103-1为101.16μmol ¹⁵N h^-1g^-1RDW；高氮条件下野生型小麦陇春23号的硝酸根净吸收率为204.78μmol ¹⁵N h^-1g^-1RDW，OE102-6为213.15μmol ¹⁵N h^-1g^-1RDW，OE103-1为216.06μmol ¹⁵N h^-1g^-1RDW。而空载对照株系与同条件野生型植株相比，硝酸根净吸收率无显著差异。

图4表明，水培条件下，无论高氮还是低氮培养TaNRT2.5-3B超量表达系小麦根系的硝酸根净吸收率都显著略高于野生型小麦陇春23号。

二、含氮量的测定

供试小麦：两个T3代TaNRT2.5-3B超量表达小麦OE102-6和OE103-1，两个TaNRT2.5减量表达小麦R100-1和R109-2，野生型小麦陇春23号，以及空载对照植株。

测定是在大田条件下，种植地为河北省农林科学院堤上试验站，具体步骤如下：

在每个小区中将各供试小麦的种子分别播种2行，4个重复，行长2m，株距5cm的种植条件下，得到小麦整个生育期108天后的籽粒以及地上部分。

1、氮素收获指数、籽粒总蛋白含量等的测定

氮素收获指数是衡量植物氮素利用效率的重要生理指标，其中氮素收获指数＝籽粒含氮量(mg/株)/地上部含氮量(mg/株)，氮素收获指数高表明其氮素的利用效率高，有利于节约肥料，提高经济效益，减少环境污染。

将各供试小麦整个生育期108天后的籽粒、秸秆和地上部，分别进行含氮量(mg/株)的测定，用万分之一天平称取样品(旋风磨粉碎)0.3～0.5g装入100mL开氏瓶或消煮管的底部，加浓H₂SO₄ 5mL，摇匀(最好放置过夜)，在电炉或消煮炉上先小火加热，待H₂SO₄发白烟后再升高温度，当溶液呈均匀的棕黑色时取下。稍冷后加10滴30％的H₂O₂，再加热至微沸，消煮约7～l0min，稍冷后重复加30％的H₂O₂，再消煮。如此重复数次，每次添加的H₂O₂应逐次减少，消煮至溶液呈无色或清亮后，再加热约10min，除去剩余的H₂O₂。取下冷却至室温后定容。氮含量的测定采用Novozamsky等的靛酚兰比色的方法，具体参考文献“Novozamsky I,Eck R van,Schouwenburg J C van,et al.Total nitrogen determination in plantmaterial by means of the indophenol-blue method[J].Netherlands Journal ofAgricultural Science,1974,22(1):3-5”进行氮含量的测定。籽粒总蛋白含量(g/株)＝籽粒含氮量(mg/株)×6.25÷1000。

表1 TaNRT2.5转基因小麦的氮含量检测结果

注：表中的*表示与WT组相应数据相比，在P<0.05水平上差异显著。其中，籽粒含氮量、秸秆含氮量和地上部含氮量的单位mg/株，指的是一株小麦所结全部籽粒、秸秆或者地上部分中氮元素的质量有多少mg，籽粒总蛋白含量的单位g/株，指的是一株小麦所结全部籽粒中蛋白质的质量有多少g。

结果如表1所示。表1中，WT代表野生型小麦陇春23号，OE102-6和OE103-1代表TaNRT2.5-3B超量表达系，R100-1和R109-2代表TaNRT2.5减量表达系。

(1)由表1可见，大田条件下野生型小麦陇春23号的籽粒含氮量为255.3mg/株，籽粒总蛋白含量为1.60g/株；OE102-6和OE103-1的籽粒氮含量为316.3和308.8mg/株，籽粒总蛋白含量为1.98和1.93g/株；而R100-1和R109-2的籽粒含氮量为218.5和210.5mg/株，籽粒总蛋白含量为1.37和1.32g/株。

结果表明，TaNRT2.5-3B超量表达小麦的籽粒含氮量(mg/株)和籽粒总蛋白含量(g/株)均显著高于野生型小麦陇春23号；而TaNRT2.5减量表达系小麦的的籽粒含氮量(mg/株)和籽粒总蛋白含量(g/株)均显著低于野生型小麦陇春23号。

(2)由表1可见，大田条件下野生型小麦陇春23号的氮素收获指数为62.8％；OE102-6和OE103-1的氮素收获指数为64.18％和64.52％；而R100-1和R109-2的氮素收获指数为60.91％和60.81％。而空载对照株系与野生型植株相比，所检测的氮素收获指数等相关数据均无显著差异。

结果表明，TaNRT2.5-3B超量表达系小麦的氮素收获指数(％)、籽粒含氮量(mg/株)、秸秆含氮量(mg/株)、地上部含氮量(mg/株)均明显高于野生型小麦陇春23号，而TaNRT2.5减量表达系小麦的氮素收获指数(％)、籽粒含氮量(mg/株)、秸秆含氮量(mg/株)、地上部含氮量(mg/株)指数明显降低。

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 蛋白质TaNRT2.5在调控植物对氮肥利用效率中的应用

<130> GNCLN181001

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 514

<212> PRT

<213> Triticum aestivum L.

<400> 1

Met Glu Gly Glu Ser Lys Pro Ala Ala Met Gly Val Gln Ala Ala Pro

1 5 10 15

Lys Gly Lys Phe Arg Ile Pro Val Asp Ser Asp Asn Lys Ala Thr Glu

20 25 30

Phe Trp Leu Phe Ser Phe Ala Arg Pro His Met Ser Ala Phe His Leu

35 40 45

Ser Trp Phe Ser Phe Phe Cys Cys Phe Val Ser Thr Phe Ala Ala Pro

50 55 60

Pro Leu Leu Pro Leu Ile Arg Asp Asn Leu Gly Leu Thr Gly Lys Asp

65 70 75 80

Ile Gly Asn Ala Gly Ile Ala Ser Val Ser Gly Ala Val Phe Ala Arg

85 90 95

Leu Ala Met Gly Thr Ala Cys Asp Leu Val Gly Pro Arg Leu Ala Ser

100 105 110

Ala Ala Ile Ile Leu Leu Thr Thr Pro Ala Val Tyr Cys Ser Ala Ile

115 120 125

Ile Asp Ser Ala Ser Ser Phe Leu Leu Val Arg Phe Phe Thr Gly Phe

130 135 140

Ser Leu Ala Ser Phe Val Ser Thr Gln Phe Trp Met Ser Ser Met Phe

145 150 155 160

Ser Ser Pro Lys Val Gly Leu Ala Asn Gly Val Ala Gly Gly Trp Gly

165 170 175

Asn Leu Gly Gly Gly Ala Val Gln Phe Ile Met Pro Leu Val Phe Glu

180 185 190

Val Val Arg Lys Ile Gly Ser Thr Asp Phe Val Ala Trp Arg Val Ala

195 200 205

Phe Phe Ile Pro Gly Ile Met Gln Thr Phe Ser Ala Ile Ala Val Leu

210 215 220

Ala Phe Gly Gln Asp Met Pro Asp Gly Asn Tyr Arg Lys Leu His Lys

225 230 235 240

Ser Gly Glu Met His Lys Asp Ser Phe Gly Asn Val Leu Arg His Ala

245 250 255

Val Thr Asn Tyr Arg Ala Trp Ile Leu Ala Leu Thr Tyr Gly Tyr Cys

260 265 270

Phe Gly Val Glu Leu Ala Val Asp Asn Ile Val Ala Gln Tyr Phe Tyr

275 280 285

Asp Arg Phe Asp Val Asn Leu His Thr Ala Gly Leu Ile Ala Ala Ser

290 295 300

Phe Gly Met Ala Asn Ile Ile Ser Arg Pro Gly Gly Gly Leu Met Ser

305 310 315 320

Asp Trp Leu Ser Asp Arg Phe Gly Met Arg Gly Arg Leu Trp Gly Leu

325 330 335

Trp Ile Val Gln Thr Ile Gly Gly Ile Leu Cys Val Val Leu Gly Val

340 345 350

Val Asp Tyr Ser Phe Gly Ala Ser Val Ala Val Met Ile Leu Phe Ser

355 360 365

Phe Phe Val Gln Ala Ala Cys Gly Leu Thr Phe Gly Ile Val Pro Phe

370 375 380

Val Ser Arg Arg Ser Leu Gly Leu Ile Ser Gly Met Thr Gly Gly Gly

385 390 395 400

Gly Asn Val Gly Ala Val Leu Thr Gln Val Ile Phe Phe Arg Gly Thr

405 410 415

Thr Tyr Lys Thr Glu Thr Gly Ile Met Tyr Met Gly Leu Met Ile Leu

420 425 430

Ala Cys Thr Leu Pro Ile Thr Leu Ile Tyr Phe Pro Gln Trp Gly Gly

435 440 445

Met Phe Ala Gly Pro Arg Lys Gly Ala Thr Ala Glu Glu Tyr Tyr Ser

450 455 460

Gln Glu Trp Thr Glu Glu Glu Arg Ala Lys Gly Tyr Ser Ala Ala Thr

465 470 475 480

Glu Arg Phe Ala Glu Asn Ser Val Arg Glu Gly Gly Arg Arg Ala Ala

485 490 495

Ser Gly Ser Gln Ser Arg His Thr Val Pro Val Asp Gly Ser Pro Ala

500 505 510

Asp Val

<210> 2

<211> 1563

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

atggaggggg agtcgaagcc ggcggcgatg ggggtgcagg cggcgcccaa gggcaagttc 60

aggatcccgg tggactccga caacaaggcc accgagttct ggctcttctc gttcgcgagg 120

ccgcacatga gcgctttcca cctctcgtgg ttctccttct tctgctgctt cgtctccacc 180

ttcgccgcgc cgccgctcct gccgctcatc cgggacaacc tcggcctcac gggcaaggac 240

atcggcaacg ccgggatcgc gtccgtgtcg ggagccgtgt tcgcgcgtct cgccatgggc 300

acggcctgcg acctggtcgg gccccgcctg gcgtccgcgg ccatcatact gctcaccacc 360

cccgcggtgt actgctccgc catcatcgac tccgcgtcgt cgttcctgct cgtgcgcttc 420

ttcacgggct tctcgctcgc ctccttcgtg tccacgcagt tctggatgag ctccatgttc 480

tcgtcgccca aggtggggct ggccaacggc gtcgccggcg gctggggcaa cctcggcggg 540

ggcgccgtgc agttcatcat gccgctcgtg ttcgaggtcg tccgcaagat cggcagcacg 600

gacttcgtcg cgtggcgcgt cgccttcttc atcccgggca tcatgcagac gttctcggcc 660

atcgccgtgc tggcgttcgg gcaggacatg ccggacggca actaccgtaa gctgcacaag 720

agcggggaga tgcacaagga cagcttcggc aacgtgctgc gccacgcggt caccaactac 780

cgggcctgga tcctggcgct cacctacggc tactgcttcg gcgtcgagct cgccgtcgac 840

aacatcgtgg cgcagtactt ctacgaccgc ttcgacgtga acctccacac ggccggactc 900

atcgccgcca gcttcgggat ggccaacatc atctcccgcc ccggcggcgg gctcatgtcc 960

gactggctct ccgaccggtt cggcatgcgc ggcaggctgt ggggactgtg gatcgtgcag 1020

accatcggcg gcatcctctg cgtggtgctc ggcgtcgtcg actactcgtt cggcgcgtcg 1080

gtggccgtca tgatactctt ctccttcttc gtgcaggccg cgtgcgggct caccttcggc 1140

atcgtgccgt tcgtctcgcg gcggtcgctg gggctcatct ccggaatgac cggcgggggc 1200

ggcaacgtgg gggccgtgct gacgcaggtc atcttcttcc gcggcaccac gtacaagacg 1260

gagacgggga tcatgtacat ggggctgatg atcctggcgt gcacgctgcc catcacgctc 1320

atctacttcc cgcagtgggg cggcatgttc gccgggccgc ggaagggggc gacggcggag 1380

gagtactaca gccaggagtg gaccgaggag gagcgggcca aggggtacag cgccgcgacc 1440

gagcgtttcg cggagaacag cgtgcgcgag ggcggtcgga gggcggcgtc gggcagccag 1500

tcaaggcaca ccgtccccgt cgacgggtcg ccggccgacg tgcatcatca ccatcaccat 1560

tga 1563

<210> 3

<211> 639

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

gcttcgacgt gaacctccac acggccggac tcatcgccgc cagcttcggg atggccaaca 60

tcatctcccg ccccggcggc gggctcatgt ccgactggct ctccgaccgg ttcggcatgc 120

gcggcaggct gtggggactg tggatcgtgc agaccatcgg cggcatcctc tgcgtggtgc 180

tcggcgtcgt cgactactcg ttcggcgcgt cggtggccgt catgatactg aattcaagct 240

tacgtcctcc cctgcgcggc gcgcaacaag ggacgacgac ggcacccaga tacaaaaaaa 300

aatggtgatc atccagctct ctcaagaaaa tatcaagttc ttcagagttc agattacaca 360

cactctagct tgaactagta ggcgtgcttg atcttgatct taccaagctt agtatcatga 420

cggccaccga cgcgccgaac gagtagtcga cgacgccgag caccacgcag aggatgccgc 480

cgatggtctg cacgatccac agtccccaca gcctgccgcg catgccgaac cggtcggaga 540

gccagtcgga catgagcccg ccgccggggc gggagatgat gttggccatc ccgaagctgg 600

cggcgatgag tccggccgtg tggaggttca cgtcgaagc 639

Claims

1.TaNRT2.5蛋白或其相关生物材料在调控植物对氮肥利用效率中的应用；

所述植物对氮肥利用效率体现为如下中至少一种：

(a1)植物单株籽粒含氮量；

(a2)植物单株秸秆含氮量；

(a3)植物单株地上部含氮量；

(a4)植物的氮素收获指数；

(a5)植物籽粒总蛋白含量；

所述相关生物材料为能够表达所述TaNRT2.5蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述TaNRT2.5蛋白为TaNRT2.5-3B蛋白；所述TaNRT2.5-3B蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

(A2)在(A1)所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述TaNRT2.5蛋白或其编码基因在所述植物中的表达量和/或活性增加，所述植物对氮肥利用效率增加；所述TaNRT2.5蛋白或其编码基因在所述植物中的表达量和/或活性降低，所述植物对氮肥利用效率降低。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：权利要求1中所述的核酸分子和权利要求2中所述的编码基因是如下任一所述的DNA分子：

(B1)SEQ ID No.2的第1-1542位所示的DNA分子；

(B2)SEQ ID No.2所示的DNA分子。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述禾本科植物为小麦。

7.一种培育对氮肥利用效率提高的植物品种的方法，包括使受体植物中TaNRT2.5蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；

所述对氮肥利用效率提高体现为单株籽粒含氮量提高和/或单株秸秆含氮量提高和/或单株地上部含氮量提高和/或氮素收获指数提高和/或籽粒总蛋白含量提高；

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

8.一种培育对氮肥利用效率提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达TaNRT2.5蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对氮肥利用效率提高；

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

9.一种培育对氮肥利用效率降低的植物品种的方法，包括使受体植物中TaNRT2.5蛋白的表达量和/或活性降低的步骤；

所述对氮肥利用效率降低体现为单株籽粒含氮量降低和/或单株秸秆含氮量降低和/或单株地上部含氮量降低和/或氮素收获指数降低和/或籽粒总蛋白含量降低；

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

10.一种培育对氮肥利用效率降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中TaNRT2.5蛋白的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对氮肥利用效率降低；

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述“向受体植物中导入能够表达所述TaNRT2.5蛋白的核酸分子”是通过向所述受体植物中导入含有所述TaNRT2.5蛋白的编码基因的重组表达载体实现的。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述“对受体植物中TaNRT2.5蛋白的编码基因进行抑制表达”是通过向所述受体植物中导入含有如式(I)所示的DNA片段的干扰载体实现的；

SEQ_正向-X-SEQ_反向 (I)

所述SEQ_正向的序列为SEQ ID No.3；

所述SEQ_反向的序列与所述SEQ_正向的序列反向互补；

13.根据权利要求8或10所述的方法，其特征在于：权利要求8中所述的核酸分子和权利要求10中所述的编码基因是如下任一所述的DNA分子：

(B1)SEQ ID No.2的第1-1542位所示的DNA分子；

(B2)SEQ ID No.2所示的DNA分子。

14.根据权利要求7-10中任一所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述禾本科植物为小麦。