CN113372419A

CN113372419A - Tgal11蛋白及其编码基因在调控植物对白叶枯病的抗性中的应用

Info

Publication number: CN113372419A
Application number: CN202010106663.7A
Authority: CN
Inventors: 江光怀; 翟文学; 尹德东; 石岳; 朱立煌
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2020-02-21
Filing date: 2020-02-21
Publication date: 2021-09-10
Anticipated expiration: 2040-02-21
Also published as: CN113372419B

Abstract

本发明公开了TGAL11蛋白及其编码基因在调控植物对白叶枯病的抗性中的应用。本发明通过酵母双杂交实验筛选到了与OsNPR3.3蛋白互作的TGAL11蛋白，并通过对TGAL11突变体和TGAL11过表达植株接种菲律宾白叶枯病菌生理小种PXO86进行白叶枯抗病性鉴定。实验结果表明：TGAL11基因可调控植物对白叶枯病的抗性。本发明对改良植物抗病性、培育抗病品种尤其是抗白叶枯病植物品种具有重要价值。

Description

TGAL11蛋白及其编码基因在调控植物对白叶枯病的抗性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及TGAL11蛋白及其编码基因在调控植物对白叶枯病的抗性中的应用。

背景技术

随着世界人口的快速增长，粮食供应正成为一个越来越严重的全球性问题。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是我国主要的粮食之一。全世界一半以上的人口以稻米为主要食物。但全球每年因水稻白叶枯病造成的水稻减产达15％～30％，严重时减产达50％以上，甚至颗粒无收。

水稻白叶枯病是由黄单胞杆菌引起的一种重要的细菌性病害，发病范围遍及世界各稻区，在亚洲地区尤为严重，在我国华南稻区危害较为严重。一般认为水稻抗病品种的应用是防治水稻白叶枯病最为经济有效的办法。目前，已从水稻中至少鉴定了40个白叶枯病抗性基因，其中有显性基因，也有隐性基因。但目前已鉴定的白叶枯病抗性基因大部分表现出抗谱较窄或者难以利用的问题，仅Xa3、Xa4、Xa21和Xa23等基因在生产中得以广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供TGAL11蛋白质在调控植物对白叶枯病的抗性中的应用。

为了实现上述目的，本发明首先提供了TGAL11蛋白质的新用途。

本发明提供了TGAL11蛋白质在调控植物对白叶枯病的抗性中的应用；

所述TGAL11蛋白质是如下a)或b)或c)或d)所示的蛋白质：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；

d)与a)-c)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。

其中，序列表中序列2由489个氨基酸残基组成。

所述标签具体如表1所示。

表1标签的序列

上述a)-d)任一所示的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

为了实现上述目的，本发明还提供了与TGAL11蛋白质相关的生物材料的新用途。

本发明提供了与TGAL11蛋白质相关的生物材料在调控植物对白叶枯病的抗性中的应用；

所述生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码TGAL11蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述应用中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述TGAL11蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述TGAL11蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，序列表中序列1由1470个核苷酸组成。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码TGAL11蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码TGAL11蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码TGAL11蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。在本发明的一个具体实施例中，所述载体为pEZR-LN。

所述重组载体是将上述核酸分子插入表达载体中，得到表达上述蛋白质的重组载体。使用所述核酸分子构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用所述核酸分子构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。在本发明的一个具体实施例中，所述重组表达载体为pEZR-LN-TGAL11。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。在本发明的一个具体实施例中，所述农杆菌为根癌农杆菌EHA105。

上述应用中，所述调控植物对白叶枯病的抗性为提高或降低植物对白叶枯病的抗性，具体体现在：当植物中的TGAL11蛋白质的含量和/或活性降低时，所述植物对白叶枯病的抗性降低；当植物中的TGAL11蛋白质的含量和/或活性提高时，所述植物对白叶枯病的抗性提高。

本发明还提供了上述TGAL11蛋白质或上述生物材料在培育白叶枯病抗性提高的转基因植物中的应用。

本发明还提供了上述TGAL11蛋白质或上述生物材料在培育白叶枯病抗性降低的转基因植物中的应用。

本发明还提供了上述TGAL11蛋白质或上述生物材料在植物育种中的应用。

所述育种的目的为培育抗白叶枯病植物品种。

为了实现上述目的，本发明还提供了一种培育白叶枯病抗性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育白叶枯病抗性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中TGAL11蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物对白叶枯病的抗性高于所述受体植物。

所述转基因植物对白叶枯病的抗性高于所述受体植物具体体现为所述转基因植物的病斑长度小于所述受体植物。

进一步的，所述提高受体植物中TGAL11蛋白质的含量和/或活性的方法为在受体植物中过表达TGAL11蛋白质。

更进一步的，所述过表达的方法为将TGAL11蛋白质的编码基因导入受体植物。所述TGAL11蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

在本发明的一个具体实施例中，所述TGAL11蛋白质的编码基因通过pEZR-LN-TGAL11过表达载体导入受体植物。所述pEZR-LN-TGAL11过表达载体为将pEZR-LN载体的KpnI和BamHI酶切位点间的DNA片段替换为序列1所示的TGAL11完整CDS序列，且保持pEZR-LN载体的其他序列不变后得到的载体。

为了实现上述目的，本发明最后还提供了一种培育白叶枯病抗性降低的转基因植物的方法。

本发明提供的培育白叶枯病抗性降低的转基因植物的方法包括降低受体植物中TGAL11蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物对白叶枯病的抗性低于所述受体植物。

所述转基因植物对白叶枯病的抗性低于所述受体植物具体体现为所述转基因植物的病斑长度大于所述受体植物。

进一步的，所述降低受体植物中TGAL11蛋白质的含量和/或活性的方法可通过对所述受体植物中TGAL11蛋白质的编码基因进行敲除或抑制或沉默来实现。

更进一步的，所述对所述受体植物中TGAL11蛋白质的编码基因进行敲除或抑制或沉默的方法为使所述受体植物中TGAL11蛋白质的编码基因发生突变(如插入突变或缺失突变或碱基替换)。

所述TGAL11蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

上述任一所述应用或方法中，所述对白叶枯病的抗性具体可为对水稻白叶枯病原菌的抗性。所述水稻白叶枯病原菌具体可为菲律宾白叶枯病菌生理小种PXO86。

上述任一所述应用或方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。进一步的，所述单子叶植物为禾本科植物。更进一步的，所述禾本科植物为水稻(如水稻品种日本晴或水稻品种IR24)。

本发明通过酵母双杂交实验筛选到了与OsNPR3.3蛋白互作的TGAL11蛋白，并通过对TGAL11突变体和TGAL11过表达植株接种菲律宾白叶枯病菌生理小种PXO86进行白叶枯抗病性鉴定。实验结果表明：TGAL11基因可调控植物对白叶枯病的抗性。本发明对改良植物抗病性、培育抗病品种尤其是抗白叶枯病植物品种具有重要价值。

附图说明

图1为酵母双杂交结果显示TGALL11与OsNPR3.3强烈互作。

图2为TGAL11在IRBB5接种PXO86 24小时后表达明显上调。

图3为TGAL11的TOS17插入突变体接种PXO86两周后的抗病情况。(A)TGAL11的TOS17插入突变体的抗病表型；(B)TGAL11的TOS17插入突变体的病斑长度统计分析。Nipponbare是野生型水稻品种日本晴；ND5035是日本晴背景的TGAL11的TOS17插入突变体；B5tgal11是IRBB5背景的TGAL11的TOS17插入突变体；IRBB5是野生型抗白叶枯病的水稻品种IRBB5。

图4为过表达TGAL11基因的T₂代转基因植株接种PXO86两周后的抗病情况。(A)IR24V和TGAL11OX的抗病表型；(B)IR24V和TGAL11OX的病斑长度统计分析。IR24V是转pEZR-LN空载体的转基因植株；TGAL11OX是转pEZR-LN-TGAL11的转基因植株。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中涉及的水稻材料：抗白叶枯病水稻品种IRBB5(含纯合xa5基因)及其近等基因系IR24(感白叶枯病水稻品种)均记载于文献“Jiang GH,Xia ZH,Zhou YL,Wan J,Li DY,Chen RS,Zhai WX and Zhu LH.Testifying the rice bacterial blightresistance gene xa5 in its function and further analyzing xa5(Xa5)bycomparing with it’s homolog TFIIAγ1.Mol Gen Genomics.2006,275(4):354-366.”中，公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中涉及的日本晴背景的TGAL11的TOS17插入突变体购自日本水稻基因组资源中心(Rice Genome Resource Center,https://tos.nias.affrc.go.jp/～miyao/pub/tos17/)，编号为ND5035，将其记作ND5035突变体。

下述实施例中涉及的pEZR-LN载体记载于文献“Yang,C.et al.OsMYB103L,anR2R3-MYB transcription factor,influences leaf rolling and mechanical strengthin rice(Oryza sativa L.).BMC Plant Biology 14,158,doi:1471-2229-14-158[pii]10.1186/1471-2229-14-158[doi](2014)”中，公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、酵母双杂交实验验证OsNPR3.3与TGAL11互作

将OsNPR3.3完整的CDS序列插入到BD(pGBK-T7)载体中，并将其作为诱饵载体通过酵母双杂交实验筛选与OsNPR3.3蛋白相互作用的TGA类转录因子，结果发现：TGAL11蛋白与OsNPR3.3蛋白互作。具体步骤如下：

一、载体的构建

1、将序列表中序列3所示的OsNPR3.3完整的CDS序列分别插入到BD(pGBK-T7)和AD(pGAD-T7)载体中，构建得到BD-OsNPR3.3融合质粒和AD-OsNPR3.3融合质粒。

2、将如下8个水稻TGA类基因：rTGA2.1(LOC_Os07g48820.1)、rTGA2.2(LOC_Os03g20310.1)、rTGA2.3(LOC_Os01g17260.1)、rLG2(LOC_Os01g64020.1)、TGAL1(LOC_Os01g59350.1)、TGAL2(LOC_Os01g59350.2)、TGAL4(LOC_Os11g05480.1)和TGAL11(LOC_Os12g05680.1)的完整CDS序列分别插入到BD(pGBK-T7)载体中，分别得到BD-rTGA2.1融合质粒、BD-rTGA2.2融合质粒、BD-rTGA2.3融合质粒、BD-rLG2融合质粒、BD-TGAL1融合质粒、BD-TGAL2融合质粒、BD-TGAL4融合质粒和BD-TGAL11融合质粒。

二、酵母双杂交实验

酵母双杂交的具体实验步骤参考Clontech公司的酵母双杂交手册(MATCHMAKERGold Yeast Two-Hybrid System)(http://www.clontech.com)，具体步骤如下：

1、利用PEG/LiAc方法将BD-OsNPR3.3融合质粒转化到酵母菌株Y2HGold中检测OsNPR3.3的自激活活性。

2、将BD-TGA融合质粒(BD-rTGA2.1融合质粒、BD-rTGA2.2融合质粒、BD-rTGA2.3融合质粒、BD-rLG2融合质粒、BD-TGAL1融合质粒、BD-TGAL2融合质粒、BD-TGAL4融合质粒和BD-TGAL11融合质粒)分别与AD-OsNPR3.3融合质粒共同转入Y2HGold，再分别涂布于二缺培养基(SDO)SD/-Trp/-Leu和四缺培养基(QDO/A/X)SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/ABA/X-α-Gal平板上，30℃培养3-5天后进行观察。

结果如图1所示。结果表明：AD-OsNPR3.3融合质粒和BD-TGAL11融合质粒共同转化酵母后可以在四缺培养基上生长，说明OsNPR3.3与TGAL11存在互作关系。

实施例2、水稻IRBB5和IR24接种白叶枯病原菌PXO86后的TGAL11表达水平检测

1、采用人工剪叶接种法，将水稻白叶枯病原菌PXO86(菲律宾白叶枯病菌生理小种PXO86)接种至分蘖期的水稻植株(水稻IR24或水稻IRBB5)。

2、分别于接种0h、4h、8h、24h取叶片，提取总mRNA。

3、将总mRNA进行反转录，得到cDNA。

4、以cDNA为模板，通过定量的real-time qPCR检测TGAL11基因的相对表达水平。以Actin基因作为内参基因。

TGAL11基因的引物对序列如下：

TGAL11-qF：5'-gaaggctttgtcatacagg-3'；

TGAL11-qR：5'-tgccaccaatatctctcgg-3'。

Actin基因的引物对序列如下：

ActinF：5′-GAGCTACGAGCTTCCTGATGG-3′；

ActinR：5′-AATGCCAGGGAACATAGTGG-3′。

结果如图2所示。结果表明：在抗白叶枯病的水稻品种IRBB5接种24h后，TGAL11相对表达量显著上调；而在感白叶枯病的水稻品种IR24接种8h后，TGAL11相对表达量稍微上调，但在接种24h后，TGAL11相对表达量显著下调。

实施例3、IRBB5背景TGAL11的TOS17插入突变体B5tgal11的获得及其白叶枯抗病性鉴定

一、IRBB5背景的TGAL11的TOS17插入突变体B5tgal11的获得

将日本晴背景的TGAL11的TOS17插入突变体ND5035与IRBB5杂交和自交，选取IRBB5背景的TGAL11的TOS17插入纯合突变体B5tgall1。具体步骤如下：

1、将日本晴背景的TGAL11的TOS17插入突变体ND5035作为父本，IRBB5(含xa5基因)作为母本进行杂交，得到杂交F₁代；然后将杂交F₁代进行自交，得到F₂代植株。

2、从F₂代植株中选择含有xa5基因的TGAL11的TOS17插入纯合突变体，即为IRBB5背景的TGAL11的TOS17插入纯合突变体，将其记作B5tgall1突变体。

按照文献“Jiang GH,Xia ZH,Zhou YL,Wan J,Li DY,Chen RS,Zhai WX and ZhuLH.Testifying the rice bacterial blight resistance gene xa5 in its functionand further analyzing xa5(Xa5)by comparing with it’s homolog TFIIAγ1.Mol GenGenomics.2006,275(4):354-366.”中的方法利用特异鉴别标记S5/NcoI鉴定待测植株是否含有xa5基因：采用特异鉴别标记S5(S5F：5’-CTCTCTACTTTTGTCTGG-3’和S5R：5’-CCAAACACAGATGAGCAG-3’)对待测植株进行PCR扩增，得到大小为1022bp的PCR产物，用限制性内切酶NcoI酶切PCR产物(含xa5基因的PCR产物不能被NcoI酶切，不含Xa5基因的PCR产物能被切成大小为181bp和841bp的片段)，若PCR产物不能被酶切，则待测植株含有xa5基因，若PCR产物被切成大小为181bp和841bp的片段，则待测植株不含有xa5基因。

采用引物Os17-3F(5’-GAGAGCATCATCGGTTACATCTTCTC-3’)和TGAL11-R(5’-CATTTCTTGATCTCCTCCTC-3’)鉴定待测植株是否发生TOS17插入纯合突变，具体步骤如下：采用Os17-3F和TGAL11-R引物对待测植株进行PCR扩增，得到PCR产物，若PCR产物仅含有大小为239bp的片段，则待测植株发生TOS17插入纯合突变，否则待测植株没有发生TOS17插入纯合突变。

二、B5tgall1突变体的白叶枯抗病性鉴定

以步骤一中获得的B5tgall1突变体为供试材料，接种水稻白叶枯病原菌PXO86(菲律宾白叶枯病菌生理小种PXO86)，2周后进行白叶枯抗病表型调查。同时以野生型水稻日本晴Nipponbare、日本晴背景的TGAL11的TOS17插入突变体ND5035和抗白叶枯病水稻品种IRBB5作为对照。具体检测方法如下：

将菲律宾白叶枯病菌生理小种PXO86在PSA培养基上于28℃培养72h，接菌前用纯净水调节菌体浓度至10⁸CFU/mL。在水稻分蘖盛期，通过剪叶法对充分伸展的叶片接种菲律宾白叶枯病菌生理小种PXO86，每株水稻病原菌的接种量均相同。接种14天左右(根据天气状况而有所不同)，当病斑长度明显而稳定时进行调查，调查时，每株水稻接种病原菌的时间相同。每一植株测量三片叶，求其平均值作为抗性指标对其抗病情况进行调查。

结果如图3所示。结果显示：野生型水稻日本晴Nipponbare、日本晴背景的TGAL11的TOS17插入突变体ND5035、抗白叶枯病水稻品种IRBB5和B5tgall1突变体的病斑平均长度分别为12.2cm、15.1cm、3.17cm和5.33cm。与对照IRBB5相比，B5tgall1突变体对水稻白叶枯病原菌的抗性明显减弱。说明抑制TGAL11基因表达可降低植物对白叶枯病的抗性。

实施例4、转TGAL11水稻的获得及其白叶枯抗病性鉴定

一、转TGAL11水稻的获得

1、TGAL11基因的扩增

以抗白叶枯病水稻品种IRBB5的基因组DNA为模板，采用TGAL11-OXF和TGAL11-OXR引物进行PCR扩增，得到TGAL11基因片段。引物序列如下：

TGAL11-OXF：5'-AGGTACCATGGGAGAGGCTAGGAGAGG-3'(下划线所示序列为KpnI识别位点)；

TGAL11-OXR：5'-GGATCCTCAGAAAGCTGAAAATTGG-3'(下划线所示序列为BamHI识别位点)。

2、重组载体的构建

用限制性内切酶KpnI和BamHI分别对pEZR-LN载体和TGAL11基因片段进行双酶切，回收载体骨架和TGAL11基因片段，连接，得到pEZR-LN-TGAL11过表达载体。

pEZR-LN-TGAL11过表达载体为将pEZR-LN载体的KpnI和BamHI酶切位点间的DNA片段替换为序列1所示的TGAL11完整CDS序列，且保持pEZR-LN载体的其他序列不变后得到的载体。

3、T₀代植株的获得

利用农杆菌介导的转化方法将pEZR-LN-TGAL11过表达载体转入感白叶枯病水稻品种IR24，获得T₀代植株。具体步骤如下：

1)将pEZR-LN-TGAL11过表达载体通过电击转化的方法导入到根癌农杆菌EHA105中，得到重组农杆菌。

2)用含150μM乙酰丁香酮的悬浮培养液将步骤1)中的重组农杆菌稀释至OD₆₀₀在0.1-0.2之间，得到侵染液。

3)挑选淡黄色、形状规则、颗粒状的预培养的IR24的愈伤组织于50mL无菌的三角瓶中，加入步骤2)中的侵染液浸泡15-20min，倒出侵染液并用无菌滤纸吸干残余菌液，然后愈伤组织转移到共培养培养基上，23℃黑暗条件下共培养48h。

4)挑选步骤3)中无菌、颜色鲜亮的颗粒状愈伤组织，将其放置于筛选培养基中，30℃黑暗培养2-3周。将长出的新的愈伤颗粒放置于新的筛选培养基上，继续培养2-3周，进行第二次筛选。

5)经过两次筛选的抗性愈伤会产生新的愈伤颗粒，从每个独立的胚性愈伤中挑选3颗到分化培养基上，每皿放置5个区域；30℃光照条件下(16h光照/8h黑暗)，培养3-4周至幼苗长出。

6)将步骤5)中的幼苗转移到生根培养基中，30℃光照培养(16h光照/8h黑暗)3-4周，得到转pEZR-LN-TGAL11载体的T₀代植株幼苗。

按照上述方法，将pEZR-LN-TGAL11过表达载体替换为pEZR-LN载体，且保持其他步骤不变，得到转pEZR-LN空载体的T₀代植株幼苗。

4、T₀代植株的鉴定

分别提取上述转pEZR-LN-TGAL11载体的T₀代植株幼苗和转pEZR-LN空载体的T₀代植株幼苗的基因组DNA，采用NPTII-F(5’-GCATTGCATCAGCCATGATG-3’)和NPTII-R(5’-GAGCTTTCGCAGATCTGTCG-3’)引物对进行PCR鉴定，结果有19株转pEZR-LN-TGAL11载体的T₀代植株幼苗中得到大小为391bp的目的条带，PCR鉴定中扩增得到目的条带的植株即为阳性转基因植株。转pEZR-LN空载体的T₀代植株幼苗中没有扩增得到目的条带。

收获T₀代阳性转基因植株种子，即为T₁代种子。将T₁代种子培育为植株，即为T₁代植株，T₁代植株自交，得到T₂代种子。将T₂代种子培育为植株，即获得T₂代稳定纯合的转TGAL11水稻株系。选取T₂代稳定纯合的转TGAL11水稻株系TGAL11OX-1、TGAL11OX-2、TGAL11OX-3、TGAL11OX-4用于下述白叶枯抗病性鉴定。

二、转TGAL11水稻的白叶枯抗病性鉴定

以步骤一中获得的T₂代稳定纯合的转TGAL11水稻株系TGAL11OX-1、TGAL11OX-2、TGAL11OX-3、TGAL11OX-4为供试材料，接种水稻白叶枯病原菌PXO86(菲律宾白叶枯病菌生理小种PXO86)，2周后进行白叶枯抗病表型调查。同时以转pEZR-LN空载体的转基因植株(IR24V)和感白叶枯病水稻品种IR24作为对照。

具体检测方法如下：

将菲律宾白叶枯病菌生理小种PXO86在PSA培养基上于28℃培养72h，接菌前用纯净水调节菌体浓度至10⁸CFU/mL。在水稻分蘖盛期，通过剪叶法对充分伸展的叶片接种菲律宾白叶枯病菌生理小种PXO86，每株水稻病原菌的接种量均相同。接种18-25天左右(根据天气状况而有所不同)，当病斑长度明显而稳定时进行调查，调查时，每株水稻接种病原菌的时间相同。每一植株测量三片叶，求其平均值作为抗性指标对其抗病情况进行调查。

结果如图4所示，T₂代稳定纯合的转TGAL11水稻株系TGAL11OX-1、TGAL11OX-2、TGAL11OX-3、TGAL11OX-4及转空载体植株的病斑平均长度分别为4cm、4.5cm、5cm、4.5cm和11cm，感白叶枯病水稻品种IR24的病斑平均长度与转空载体植株的病斑平均长度无显著性差异。与转空载体的转基因植株相比，过表达TGAL11的转基因植株对白叶枯病原菌的抗性显著提高。说明过表达TGAL11基因可以提高植物对白叶枯病的抗性。

综上所述，TGAL11基因具有调控植物对白叶枯病的抗性的功能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>TGAL11蛋白及其编码基因在调控植物对白叶枯病的抗性中的应用

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1470

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>1

atgggagagg ctaggagagg gcagaatcct catcatgttc ttggctatgg cttccatggc 60

accaccttgc ccaactccat ggcttctgca aacctcttcg agcaaggagg aggaggagga 120

ggtggcgctg cctattttgg agagctagaa gaagctcttg ttcatcaggt tgccacactc 180

aggaggaggg ctcaacaaac tgcaaccacc accacctctc accatggaca caccactccc 240

ttctccactg ctgctgctgc agctacagca acagcaacag ctaggcctcc tgctacactg 300

gacatcttcc catcctggcc tatgaggagg agctctcttc caacaccgaa ggatggatgt 360

tcaaatgtaa cggcagacac aacggactcc gagagcagca gcaagaacaa cggcgatcag 420

ggtgcagcag cagccgacat ggcgagccag tttgatcaga tcccacagca gcagcagaag 480

cagcacaaga agatggcagc aagttccact cacagtgacc acaggatgac aaagacactt 540

gatccaaaga taatgagaag gttagcccag aaccgagagg cagcacgcaa gagccggctg 600

cgaaagaagg cttacatcca gcagcttgag agcagcaagt tgaggctggc tcagatggag 660

caggatctcg agagagctcg ttcccagggc ctcttgctgg gaggatcacc aggtggaaac 720

accagcgcag gagcggcgat gttcgacgcc gagtacgggc ggtggctgga ggacggcggg 780

cggcggatgg cggagctgca cggcgggcta cacgcgcacc tgccggacgg cgacctgagg 840

gcgatcgtcg acgacgccct ggcccactac gacgagctct tccgcctgag ggcagccgcc 900

gccaaggccg acgtgttcca cctcatcact ggcacgtggg ccacccccgc cgagcgctgc 960

ttcctctgga tgggcggttt ccaaccgtcc gatctgctca agacagtggc accccagcta 1020

gaccctctga ctgaacagca agtggttggc atctgcagcc ttcagcaatc atcgcagcag 1080

gcagaggaag ctctctccca gggcctggag cagctgcatc agtcactagc tgagaccgtc 1140

gccaatggcg gctccgtggt caacgaagcc agccttggga gcttcatggg ttacatggcc 1200

cttgccctgg gcaagctgtc caaccttgaa ggctttgtca tacaggctga taacttgagg 1260

caacagactc ttcatcagat gcacagaatt ctgacaatta ggcaggcagc tcgatgtttc 1320

ttggcaattg gcgagtacca taatcgcctc cgtgccctca gctccctctg ggcttctcgt 1380

ccccgagaga tattggtggc agatgaaggc aactgtggag agctaagcat agcagcacaa 1440

ccatctgaaa gccaattttc agctttctga 1470

<210>2

<211>489

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>2

Met Gly Glu Ala Arg Arg Gly Gln Asn Pro His His Val Leu Gly Tyr

1 5 10 15

Gly Phe His Gly Thr Thr Leu Pro Asn Ser Met Ala Ser Ala Asn Leu

20 25 30

Phe Glu Gln Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Tyr Phe Gly Glu

35 40 45

Leu Glu Glu Ala Leu Val His Gln Val Ala Thr Leu Arg Arg Arg Ala

50 55 60

Gln Gln Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ser His His Gly His Thr Thr Pro

65 70 75 80

Phe Ser Thr Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ala Arg Pro

85 90 95

Pro Ala Thr Leu Asp Ile Phe Pro Ser Trp Pro Met Arg Arg Ser Ser

100 105 110

Leu Pro Thr Pro Lys Asp Gly Cys Ser Asn Val Thr Ala Asp Thr Thr

115 120 125

Asp Ser Glu Ser Ser Ser Lys Asn Asn Gly Asp Gln Gly Ala Ala Ala

130 135 140

Ala Asp Met Ala Ser Gln Phe Asp Gln Ile Pro Gln Gln Gln Gln Lys

145 150 155 160

Gln His Lys Lys Met Ala Ala Ser Ser Thr His Ser Asp His Arg Met

165 170 175

Thr Lys Thr Leu Asp Pro Lys Ile Met Arg Arg Leu Ala Gln Asn Arg

180 185 190

Glu Ala Ala Arg Lys Ser Arg Leu Arg Lys Lys Ala Tyr Ile Gln Gln

195 200 205

Leu Glu Ser Ser Lys Leu Arg Leu Ala Gln Met Glu Gln Asp Leu Glu

210 215 220

Arg Ala Arg Ser Gln Gly Leu Leu Leu Gly Gly Ser Pro Gly Gly Asn

225 230 235 240

Thr Ser Ala Gly Ala Ala Met Phe Asp Ala Glu Tyr Gly Arg Trp Leu

245 250 255

Glu Asp Gly Gly Arg Arg Met Ala Glu Leu His Gly Gly Leu His Ala

260 265 270

His Leu Pro Asp Gly Asp Leu Arg Ala Ile Val Asp Asp Ala Leu Ala

275 280 285

His Tyr Asp Glu Leu Phe Arg Leu Arg Ala Ala Ala Ala Lys Ala Asp

290 295 300

Val Phe His Leu Ile Thr Gly Thr Trp Ala Thr Pro Ala Glu Arg Cys

305 310 315 320

Phe Leu Trp Met Gly Gly Phe Gln Pro Ser Asp Leu Leu Lys Thr Val

325 330 335

Ala Pro Gln Leu Asp Pro Leu Thr Glu Gln Gln Val Val Gly Ile Cys

340 345 350

Ser Leu Gln Gln Ser Ser Gln Gln Ala Glu Glu Ala Leu Ser Gln Gly

355 360 365

Leu Glu Gln Leu His Gln Ser Leu Ala Glu Thr Val Ala Asn Gly Gly

370 375 380

Ser Val Val Asn Glu Ala Ser Leu Gly Ser Phe Met Gly Tyr Met Ala

385 390 395 400

Leu Ala Leu Gly Lys Leu Ser Asn Leu Glu Gly Phe Val Ile Gln Ala

405 410 415

Asp Asn Leu Arg Gln Gln Thr Leu His Gln Met His Arg Ile Leu Thr

420 425 430

Ile Arg Gln Ala Ala Arg Cys Phe Leu Ala Ile Gly Glu Tyr His Asn

435 440 445

Arg Leu Arg Ala Leu Ser Ser Leu Trp Ala Ser Arg Pro Arg Glu Ile

450 455 460

Leu Val Ala Asp Glu Gly Asn Cys Gly Glu Leu Ser Ile Ala Ala Gln

465 470 475 480

Pro Ser Glu Ser Gln Phe Ser Ala Phe

485

<210>3

<211>1722

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>3

atggagacgt ccaccataag cttctcctcc tcgtcgccgc cgtcccctcc gccgccgcag 60

ccggctccgg gcgacatcga cgccgtcagc ctcggccgcc tcagcaggaa cctcgagaac 120

ctcctcgacc ccgcctttct caactgcgcc gacgccgaga tcgtcctcgc ctccggaggc 180

ggcgaccccg gcggcggcgc cgtcgtgggc gtccaccgct gcatcctcgc cgccaggagc 240

cgcttcttct acgaccactt ctcctccgcc cccgcccccg cccccgccac cgccggcgac 300

aagccgcagc tggacctcga cgggctggtc cccggcgggc gccacatcgg ccgagacgcc 360

ctcgtcgccg ttctcagcta cctgtacacc ggccgcctca ggtcggcgcc ccccgaggcc 420

gccgcctgcc tggacgacgg ctgcagccac gacgcgtgcc gcccggcgat cgacttcgtc 480

gtcgagtcca cgtacgccgc ctccggcttc cagatctccg agctcgtctc cctcttccag 540

cgccgattat ctgattttgt gaacaaagct ttggctgagg acatactgcc aattcttgtg 600

gttgcctcca cctgccatct tccagagctg ctaaatcaat gtatccagag ggttgccaac 660

tcgaacctgg acaatcgtta cctcgagaag cggcttccgg atgatctgta cgccaagctg 720

aaggagtttc gcgtgcctga tgaaccacac agtggcattc ttgaccctga gcatgagaag 780

agggtcagaa acatccacaa ggccttggat tccgatgatg tcgatcttgt tggcatgctt 840

ctgaaggagt ccccggtcac cttggatgat gcattcgcca tacactacgc tgcggcctac 900

tgtgagccaa aagtgttagc agaattgctg aaactggaat ctgcaaatgt gaacctgaag 960

aactcaagtg gatacacgcc gctccacatg gcttgcatga ggcgagaacc ggatatcatt 1020

gtttcgctta tagaaaaggg ggcctctgtt ctggaaagga cacaggatgg acgtgatgct 1080

cttaccatct gcaagagatt aacaagggag aaagaccgca acgagaaatc agaaaaatgc 1140

aaggagagaa gcaaggctta cttgtgcatt ggcgtcttac agcaagaaat aaagaggaga 1200

ccacaaattt tggaggacca gatgtctgca gaggagtcaa ttgctacacc tctgctggtt 1260

gataattttc acatgaggct actaaacttg gagaatagag ttgcctttgc aagaatattt 1320

ttcccttcgg aagccaaact tgtgatgcgc atagcacaag ctgactcaac tcaagagttt 1380

gctggtctca catctgctaa tttcagtaaa cttaaggagg ttgacctaaa tgagaccccc 1440

acaatgcaaa acaggaggtt gcgagaacgc cttgatgctt tgacaaaaac agttgaactc 1500

ggacgacgat acttcccaca ttgttcagaa gttctcgaca agttcctgaa tgaagaatcc 1560

accgatttga tcttgcttga aagtggcaca gcagaggacc agcaaaccaa gaggatgcgc 1620

ttttctgaac tcagagagga tgtacggaag gcctttacca aagataaggc agccggcgct 1680

gcaatatctt cctcaacatc tgcgtcttca tcaccaagtt ga 1722

Claims

1.TGAL11蛋白质在调控植物对白叶枯病的抗性中的应用；

所述TGAL11蛋白质是如下a)或b)或c)或d)所示的蛋白质：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.与TGAL11蛋白质相关的生物材料在调控植物对白叶枯病的抗性中的应用；

所述生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码TGAL11蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述的TGAL11蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述的TGAL11蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述调控植物对白叶枯病的抗性为提高或降低植物对白叶枯病的抗性。

5.权利要求1中所述的TGAL11蛋白质或权利要求2或3中所述的生物材料在培育白叶枯病抗性提高的转基因植物中的应用；

或，权利要求1中所述的TGAL11蛋白质或权利要求2或3中所述的生物材料在培育白叶枯病抗性降低的转基因植物中的应用；

或，权利要求1中所述的TGAL11蛋白质或权利要求2或3中所述的生物材料在植物育种中的应用。

6.一种培育白叶枯病抗性提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1中所述的TGAL11蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物对白叶枯病的抗性高于所述受体植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中权利要求1所述的TGAL11蛋白质的含量和/或活性的方法为在受体植物中过表达权利要求1中所述的TGAL11蛋白质；

或，所述过表达的方法为将权利要求1中所述的TGAL11蛋白质的编码基因导入受体植物；

或，所述TGAL11蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

8.一种培育白叶枯病抗性降低的转基因植物的方法，包括降低受体植物中权利要求1中所述的TGAL11蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物对白叶枯病的抗性低于所述受体植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述降低受体植物中权利要求1中所述的TGAL11蛋白质的含量和/或活性的方法通过对所述受体植物中权利要求1中所述的TGAL11蛋白质的编码基因进行敲除或抑制或沉默来实现；

10.根据权利要求1-5任一所述的应用或权利要求6-9任一所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

或，所述单子叶植物为禾本科植物；

或，所述禾本科植物为水稻。