CN104975029A - 一种调控杨树不定根发育的生长素响应因子基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种调控杨树不定根发育的生长素响应因子基因PtARF3.1及其应用，属于生物基因工程技术领域。PtARF3.1的核苷酸序列如序列表中的序列1所示；PtARF3.1的表达蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示；PtARF3.1的载体PMDC32-PtARF3.1的核苷酸序列如序列表中的序列3所示。本发明通过将PtARF3.1基因转入杨树，过量表达PtARF3.1的转基因杨树与野生型比较生根明显提早，且不定根数量显著增多，说明杨树生长素响应因子基因PtARF3.1是控制杨树不定根发生发育的关键调节因子，在林木基因工程和无性系林业领域有重要应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及调控不定根发育的生长素基因及其应用，尤其涉及一种调控杨树不定根发育的生长素响应因子基因PtARF3.1及其应用，属于生物基因工程技术领域，杨树不定根生长素响应因子基因。
背景技术
随着近年来遗传学、基因组学和分子生物学技术的发展，杨树成为了一种研究木材形成、多年生植物季节变化规律、生长发育、开花、性别决定以及生物互作的模式植物。杨树本身是一种在全球广泛分布的经济树种，具有早期速生、适应性强、分布广、品种多、易杂交、易改良遗传性、易繁殖等特点，因而广泛用于集约栽培。杨树栽培多通过无性繁殖，硬枝扦插最为普遍，但是目前许多优良杨树无性系尤其是白杨派树种扦插生根非常困难。因此加强木本植物扦插生根机理研究，利用分子生物学和基因工程技术，提高杨树扦插生根能力具有重要理论意义和应用价值。
不定根是植物非根组织上发育的根，一般在下胚轴、茎和叶上发生，其生长发育受外在环境和内源激素的协同作用。生长素对植物不定根发育过程起到至关重要的作用，通过生物合成、代谢、极性运输、信号转导等多个途径调控不定根起始、发生、生长等生物学过程。在生理水平上，可以调节或影响植物不同的生理反应，如根的发生、向性运动和顶端优势等；在细胞水平上，它可以促进细胞的延伸、分裂和分化等。因此，分离生长素调控不定根发育相关的关键基因，鉴定其生物学功能，通过遗传改良促进难生根植物生根，是林木分子育种重要研究内容，不仅对林木根系发育生物学研究有重要理论意义，而且在林木良种无性系繁殖生产中具有潜在的应用价值。生长素与受体蛋白结合后，通过泛素化途径降解Aux/IAA转录抑制因子，激活生长素响应因子(Auxin response factor,ARF)蛋白，进而调控生长素响应基因的表达。因此ARF转录因子在是生长素信号转导系统的关键基因，能够特异地与生长素响应基因启动子区域的生长素响应元件(AuxREs)TGTCTC结合，激活或抑制基因的表达，调控生长素诱导的生物学过程。近年来，人们在多种草本植物中研究发现不同ARF基因通过调控不同的基因表达影响根系的生长发育，说明ARF基因对植物根系发育具有重要的作用。
目前，在木本植物中生长素响应因子调控不定根发育的机制鲜有报道，另外，木本植物因为在进化过程中存在与草本植物不同的基因组复制事件，部分基因家族发生了扩张或丢失，部分基因功能发生了分化。如ARF基因家族，在拟南芥中有23个成员，在杨树中有39个成员，其基因家族进行了扩张，部分同源基因的表达模式发生分化，因此，利用木本植物为研究对象，结合分子生物学和基因工程技术，解析ARFs调控杨树不定根发育分子机制，对于了解木本植物根系发育的分子基础，以及通过分子育种改良难生根林木，加快林木繁育具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的主要目的是提供一种调控杨树不定根系的生长素响应因子基因PtARF3.1，以及杨树生长素响应因子基因PtARF3.1的载体，本发明的另一目的是提供一种调控杨树不定根系的生长素响应因子基因PtARF3.1的应用。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种调控杨树不定根发育的生长素响应因子基因PtARF3.1，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示。
一种调控杨树不定根发育的生长素响应因子基因PtARF3.1的表达蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。
一种含有调控杨树不定根发育的生长素响应因子基因PtARF3.1的载体PMDC32-PtARF3.1，其核苷酸序列如序列表中的序列3，所述载体在PtARF3.1基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S；在PtARF3.1基因的3’端组装有强终止子NOS。
一种由上述载体组装的HPT基因可作为转基因杨树的筛选标记，用潮霉素进行转基因杨树的筛选。所述的载体上组装有LB序列和RB序列，LB序列和RB序列能促使组装于其间的PtARF3.1基因整合至杨树受体细胞染色体中。
所述的杨树生长素响应因子基因PtARF3.1在调控杨树生长发育过程中的应用。
本发明的优点：本发明以84k银腺杨为材料，克隆了PtARF3.1基因。同时，构建过量表达载体PMDC32-PtARF3.1，该基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，PtARF3.1可在杨树体内高效表达，从而调控杨树不定根的发育。其中，PtARF3.1基因是调控杨树不定根发育的关键基因。
与现有技术相比，本发明通过将PtARF3.1基因转入杨树，过量表达PtARF3.1的转基因杨树与野生型比较，明显提早生根，且不定根数量明显增多，说明PtARF3.1基因是调控杨树不定根发育的关键调节因子，在林木基因工程领域和无性系林业领域有重要应用价值。
附图说明
图1是植物表达载体PMDC32-PtARF3.1的结构示意图。
图2-1和图2-2是过量表达PtARF3.1的转基因杨树与未转基因杨树根系比较图；图2-1为未转基因杨树，图2-2为转基因杨树。
图3是过量表达PtARF3.1的转基因杨树的转录水平定量检测图，图中柱形图显示PtARF3.1基因分别在野生型(84k)和转基因杨树(lineB、lineD、lineF)中的表达量。
图4-1至图4-4是过量表达PtARF3.1的转基因杨树与未转基因杨树，不定根发生第5天根系比较图；图4-1和图4-2为未转基因杨树，图4-3和图4-4为转基因杨树。
图5是过量表达PtARF3.1的转基因杨树与未转基因杨树，不定根发生第5天生根率比较图；图中柱形图显示不定根诱导第5天野生型(84k)与转基因杨树(lineB、lineD、lineF)的生根率。
图6是采用生长素处理PtARF3.1的转基因株系叶片的方式检测PtARF3.1异位表达促进不定根的形成是依赖生长素途径的。
图7是比较野生型和PtARF3.1的转基因株系，分别在0mg/L IAA,1mg/L IAA,1mg/L IAA+10μM NPA处理过程中的生根率统计。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，以下实施例中未进行详细说明的操作可参照分子克隆，相关试剂盒使用说明的操作实现。
实施例1克隆PtARF3.1基因
以84K(P.alba X P.glandulosa)银腺杨为材料，使用RNeasy Plant Mini试剂盒和RNase-free DNase I试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)提取组培苗84K的总RNA。每个样品取大约2.0μg RNA通过使用SuperScript III first-strand synthesissystem(Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)合成cDNA第一链。参考已发表毛果杨基因组序列，使用Primer3软件设计引物(扩增子包含起始密码子及终止密码子)，进行基因全长扩增(引物中引入GATEWAY接头)。
其中，PtARF3.1ORF正向引物为(如序列表中序列4)：
GGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGGAATGATAGATCTTAACACAAC，
PtARF3.1ORF反向引物为(如序列表中序列5)：
GGCGGCCGCACAACTTTGTACAAGAAAGTTGGGTACTAAAAGCACACGATGCCAC；
高保真PCR反应体系如下：TaKaRa高保真扩增酶PrimeSTAR 12.5μl，正向引物(10μM)1μl，反向引物(10μM)1μl，模板(84K杨cDNA)1μl，无菌ddH2O补足至25μl。反应程序：预变性98℃，5min；98℃，30s；56℃，30s；72℃，3min，10个循环；98℃，30s；60℃，30s；72℃，3min，25个循环；72℃10min。
最终获得基因全长cDNA序列为2652bp，命名为PtARF3.1基因，序列如序列表中序列1所示，其所编译表达蛋白序列如序列表中序列2所示。
实施例2PtARF3.1基因植物表达载体构建
利用通路克隆技术构建PtARF3.1基因的过量表达载体，使用特异PCR引物(实施例1的PtARF3.1ORF引物)，以84K cDNA为模板，进行PCR扩增，将PtARF3.1基因ORF构建到入门载体。入门载体为PDNOR222.1，序列如序列表中序列6所示。反应体系为Fresh PCR product 80ng；PDNOR222.1vector 0.4μl；BP ClonaseⅡ enzymemix 0.6μl；无菌ddH2O补足至5μl。反应程序为：25℃反应5h。
从筛选培养板上挑取阳性克隆进行PCR检测及测序验证，带PtARF3.1基因的入门载体通过mlu I限制性内切酶线性化后，与植物表达载体PMDC32，序列如序列表中序列7所示，进行LR反应。反应体系为：Linearized entry clone 50ng；purifieddestination vector 75ng；LR ClonaseⅡ enzyme mix 0.6μl；TE buffer(pH 8.0)补足5μl。反应条件：25℃反应5h。经LR反应后，PtARF3.1基因导入植物表达载体PMDC32中，在PtARF3.1基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S，它能使PtARF3.1基因在杨树体内高效表达；在PtARF3.1基因的3’端组装有强终止子NOS，可有效终止PtARF3.1基因的转录，如图1所示为得到的植物表达载体PMDC32-PtARF3.1的结构。
在载体质粒上组装潮霉素磷酸转移酶HPT，作为转基因杨树的筛选标记，可以用潮霉素进行转基因杨树的筛选。在载体质粒组装LB和RB序列，促使组装于其间的PtARF3.1基因表达框架和筛选标记基因HPT整合至杨树受体染色体中。通过PCR检测及测序验证，确认过量表达载体构建成功，命名为PMDC32-PtARF3.1(序列3)。该基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，PtARF3.1基因可在杨树体内高效表达。
实施例3PtARF3.1基因的遗传转化
通过电击法将所构建的PMDC32-PtARF3.1过量表达载体转入农杆菌GV3101中，通过农杆菌介导将PtARF3.1基因转入杨树，转化步骤如下：用于遗传转化的杂交杨克隆84K组培苗在培养温度为23-25℃、光照为16/8h(白天/黑夜)、光照强度为50μM m-2s-1的条件下培养。含有PMDC32-PtARF3.1表达载体的农杆菌在OD600＝0.6～0.8时侵染84K叶盘。感染后的叶盘在不定芽诱导培养基(SIM，Murashige-Skoog(MS)基本培养基添加0.5mg/l 6-benzyl aminopurine(6-BA)和0.05mg/l naphthaleneacetic acid(NAA))上，在温度为22±2℃的黑暗条件下共培养3天。共培养后的叶盘转移至含有3mg/L hygromycin B和200mg/L Timentin的SIM上，在培养温度为23-25℃、光照为16/8h(白天/黑夜)、光照强度为50μM m-2s-1的条件下诱导和筛选抗性不定芽。经过约30天的诱导培养，将抗性不定芽转移至含有3mg/L hygromycin B和200mg/LTimentin的生根培养基中(RIM，1/2MS基本培养基添加0.05mg/L IBA和0.02mg/L NAA)，直至诱导出不定根。提取已生根植株叶片DNA，PCR验证。
实施例4PtARF3.1基因通过增强生长素信号促进不定根形成
采用生长素处理PtARF3.1的转基因株系叶片的方式检测PtARF3.1异位表达促进不定根的形成。取野生型(84k)和转PtARF3.1基因的杨树叶片，去除叶柄，留取约1/3大小的叶片插入培养基中，分别在三种培养基中(0mg/L IAA,1mg/L IAA,1mg/L IAA+10uM NPA)做生根实验。2周后，观察生根情况。
实验结果如图2-1至图7所示，图2-1和图2-2为过量表达PtARF3.1的野生型与转基因杨树根部比较，其中，图2-1为野生型，图2-2为转基因杨树；图3为过量表达PtARF3.1的转基因杨树的定量PCR检测，图中柱形图显示PtARF3.1基因分别在野生型(84k)和转基因杨树(lineB、lineD、lineF)中的表达量。
图4-1至图4-4为过量表达PtARF3.1的野生型与转基因杨树生根早晚比较，图中，图4-1和图4-2为野生型，图4-3和图4-4为转基因杨树，为不定根发生第5天根系比较；图5是过量表达PtARF3.1的转基因杨树与未转基因杨树，不定根发生第5天生根率(roated cuttings，％)比较图，图中柱形图显示不定根诱导第5天野生型(84k)与转基因杨树(lineB、lineD、lineF)的生根率；野生型与转基因植株不同克隆至少统计20株苗，试验重复3次。图6是采用生长素处理PtARF3.1的转基因株系叶片的方式检测PtARF3.1异位表达促进不定根的形成是依赖生长素途径的。图7是比较野生型和PtARF3.1的转基因株系，分别在0mg/L IAA,1mg/L IAA,1mg/LIAA+10μM NPA处理过程中的生根率统计(ARs frequency，％)。
从结果可以看出，过量表达PtARF3.1的转基因杨树与野生型比较生根明显提早，且不定根数量显著增多，说明杨树生长素响应因子基因PtARF3.1是控制杨树不定根发生发育的关键调节因子，在林木基因工程和无性系林业领域有重要应用价值。
Claims (7)
1.一种调控杨树不定根发育的生长素响应因子基因PtARF3.1，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中的序列1所示。
2.一种调控杨树不定根发育的生长素响应因子基因PtARF3.1的表达蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如序列表中序列2所示。
3.一种含有调控杨树不定根发育的生长素响应因子基因PtARF3.1的载体PMDC32-PtARF3.1，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中的序列3所示。
4.根据权利要求3所述的含有调控杨树不定根发育的生长素响应因子基因PtARF3.1的载体PMDC32-PtARF3.1，其特征在于：所述载体在PtARF3.1基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S；3’端组装有强终止子NOS。
5.一种由权利要求3或4所述的载体组装的HPT基因，其特征在于：所述的载体上组装有LB序列和RB序列。
6.根据权利要求5所述的载体组装的HPT基因在作为转基因杨树的筛选标记上的应用。
7.权利要求1所述的调控杨树不定根发育的生长素响应因子基因PtARF3.1在调控杨树生长发育过程中的应用。
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