CN116768992A - 一种调控杨树叶片表皮毛发育的基因及其应用 - Google Patents
一种调控杨树叶片表皮毛发育的基因及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116768992A CN116768992A CN202310364711.6A CN202310364711A CN116768992A CN 116768992 A CN116768992 A CN 116768992A CN 202310364711 A CN202310364711 A CN 202310364711A CN 116768992 A CN116768992 A CN 116768992A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- poplar
- arf10
- gene
- pagarf10
- regulating
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000219000 Populus Species 0.000 title claims abstract description 78
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- 238000011161 development Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims abstract description 6
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 claims description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 101150036581 ARF10 gene Proteins 0.000 abstract description 52
- 101100163183 Oryza sativa subsp. japonica ARF18 gene Proteins 0.000 abstract description 52
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 30
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 abstract description 23
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 abstract description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 19
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 9
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 3
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 2
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 2
- 241000168036 Populus alba Species 0.000 description 2
- 241000095443 Populus glandulosa Species 0.000 description 2
- 241000183024 Populus tremula Species 0.000 description 2
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 2
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000012214 genetic breeding Methods 0.000 description 2
- 244000038280 herbivores Species 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 2
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 2
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 2
- 239000012883 rooting culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000005068 transpiration Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100023818 ADP-ribosylation factor 3 Human genes 0.000 description 1
- 241001633583 Adenophora Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001619326 Cephalosporium Species 0.000 description 1
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 101000684275 Homo sapiens ADP-ribosylation factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000003803 hair density Effects 0.000 description 1
- 235000008216 herbs Nutrition 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000011890 leaf development Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000004537 pulping Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了一种调控杨树叶片表皮毛发育的基因及其应用，属于植物基因工程技术领域。本发明通过农杆菌介导的侵染杨树叶片愈伤的遗传转化方法，成功获得了PagARF10‑RNAi转基因杨树ARF10i‑1、ARF10i‑2、ARF10i‑3三个株系，本发明提供的转基因杨树ARF10i‑1、ARF10i‑2、ARF10i‑3相比于未转基因杨树(WT)显著提高了杨树叶片表皮毛的数量，说明PagARF10基因是调控杨树叶片表皮毛发育的关键调节基因，可作为利用分子设计育种进行林木重要性状改良的一个重要基因资源，对培育高抗虫或抗旱等杨树新品种具有较强的潜在应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种调控杨树叶片表皮毛发育的基因及其应用。
背景技术
杨树作为我国种植面积较广的速生树种，具有很强的适应性，被广泛应用于防护林改造、制浆造纸等。银腺杨是一种韩国选育的白杨派杂交无性系，于1984年被引入中国，又叫84K杨。84K杨是一种适合在干旱和半干旱地区种植的树种，其广泛分布于中国的北方地区和西北地区，例如陕西、内蒙古、甘肃等地。在这些地区，由于其强大的适应性，84K杨成为了一种非常重要的经济林木。它不仅可以用于人工造林和防护林建设，还可以用于木材、造纸等方面的生产，对于当地的经济和生态环境都有非常重要的意义。除此之外，84K杨的生长速度极快，只需短短的几年时间便能够长成高大的树木，因此它也被广泛应用于城市绿化和园林景观设计中。在城市中种植84K杨，不仅能够美化环境，还能够起到净化空气、防护风沙等作用。总之，84K杨是一种适应性强、生长快速的树种，对于中国的生态建设和经济发展都有着重要的作用。
叶片表皮毛是植物叶片表面的一类特化结构，是在叶片发育早期由多能表皮细胞发育而成的毛发状器官。叶片表皮毛可以保护植物免受高温、过度蒸腾、紫外线、辐射、病原体的伤害以及食草动物的攻击。在林木中，叶表皮毛也与落叶树木的防御、蒸腾和光合作用密切相关，但表皮毛在林木生长和发育各方面(包括生长速度)的多效性影响尚未在树木中得到广泛研究，其对树木的影响可能是重大的，因为杨树等寿命较长的乔木物种在其一生中经常面临虫害、病原体和干旱等的多重挑战，已有研究表明增加杨树表皮毛密度可有助于其生长，同时提高其对草食动物的抗性。
杨树叶片不仅能通过光合作用积累养分促进木材产生，而且在“碳中和”中起重要作用。目前虽然在草本植物中对叶表皮毛形成机制有了一定了解，但表皮毛的细胞命运决定和发育的调控机制仍不清楚，尤其在林木(杨树)中研究甚少。
杨树的生长和发育离不开许多激素的作用，尤其是生长素。生长素介导的转录调控是由AUXIN RESPONSE FACTORS(ARFs)执行的，它以生长素依赖且以二聚体的形式结合到下游基因启动子中的auxin-response elements(AuxRE)上，ARFs既可以作为转录激活因子，又可以作为转录抑制因子影响生长素响应基因的表达。一些草本植物如拟南芥、番茄等的研究表明ARF在生长素依赖的表皮毛形成的转录调控中发挥重要作用，如拟南芥ARF3与叶背面表皮毛的产生时间相关，SlARF3的下调可诱导番茄叶片表皮层细胞数量的减少，以及叶片表皮毛I、V、VI类型细胞密度的降低等。但生长素响应因子ARF，包括ARF10，调控叶片表皮毛形成的研究在林木中还未见报道。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明的目的在于提供一种调控杨树叶片表皮毛发育的基因及其应用。
为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
第一方面，提供一种调控杨树叶片表皮毛发育的基因PagARF10，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
第二方面，提供一种调控杨树叶片表皮毛发育的基因PagARF10编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
第三方面，提供一种含有调控杨树叶片表皮毛发育的基因的载体或重组菌。
进一步地，载体为PagARF10-RNAi。
第四方面，提供一种调控杨树叶片表皮毛发育的基因在培育耐旱、抗虫杨树新品种中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明通过农杆菌介导的侵染杨树叶片愈伤的遗传转化方法，成功获得了PagARF10-RNAi转基因杨树ARF10i-1、ARF10i-2、ARF10i-3三个株系，本发明提供的转基因杨树ARF10i-1、ARF10i-2、ARF10i-3相比于未转基因杨树(WT)显著提高了杨树叶片表皮毛的数量，说明PagARF10基因是调控杨树叶片表皮毛发育的关键调节基因，在利用分子设计育种进行林木遗传育种领域有重要应用价值，对培育高抗虫或抗旱等杨树新品种具有较强的潜在应用价值。
附图说明
图1为本发明构建的PagARF10-RNAi载体结构示意图；
图2为本发明PagARF10蛋白结构域分析示意图；
图3为本发明PagARF10-RNAi转基因杨树的转录水平实时定量检测图；
图4为本发明未转基因杨树(WT)与转基因杨树ARF10i-1、ARF10i-2、ARF10i-3第一片展开叶的正反面比较图；比例尺为1mm；
图5为本发明转基因杨树ARF10i-1、ARF10i-2、ARF10i-3的叶片面积与未转基因杨树(WT)的测量统计图；其中，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001采用One-way Anova进行显著性分析；
图6为本发明未转基因杨树(WT)与转基因杨树ARF10i-1、ARF10i-2、ARF10i-3第一片展开叶的正反面表皮毛的扫描图；比例尺为60μm；
图7为本发明未转基因杨树(WT)与转基因杨树ARF10i-1、ARF10i-2、ARF10i-3第一片展开叶的正反面表皮毛的数目统计图；其中，图A为叶腹面表皮毛数目；图B为叶背面表皮毛数目；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001采用One-way Anova进行显著性分析。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1、调控杨树表皮毛发育的基因PagARF10 RNA干扰(RNA interference，RNAi)序列的克隆
在本实施例中，根据84K(Populus alba×Populus glandulosa)银腺杨基因组克隆得到一种调控杨树叶片表皮毛发育的基因，命名为PagARF10。其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
具体地说，本实施例提供一种构建调控杨树表皮毛发育的基因PagARF10的RNAi载体正向片段(PagARF10-S)和反向互补片段(PagARF10-AS)的克隆方法，具体包括如下步骤：
(1)以84K(P.alba×P.glandulosa)银腺杨为材料，使用RNeasy Plant Mini试剂盒和RNase-free DNase I试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)提取RNA；使用PrimeScriptTMRT reahent Kit with gDNA Eraser合成cDNA。
(2)选取PagARF10的300bp序列为模板，借助在线网站艾科瑞生物(http://agbio.com.cn/soft/tmcal.html)计算Tm值，利用DNAClub进行反向互补，设计出符合GC含量在40％-60％的高质量的引物。PagARF10-S和PagARF10-AS引物见下表1：
表1 PagARF10-S和PagARF10-AS引物序列
| PagARF10-S正向引物 | ATCGACTAGTGAGCTTGGATCCACAACTATGGC |
| PagARF10-S反向引物 | AGTCGAGCTCGGGCAGCTGTCACTGTCGTTCCC |
| PagARF10-AS正向引物 | GACTGTCGACGAGCTTGGATCCACAACTATGGC |
| PagARF10-AS反向引物 | ACGCGGATCCGGGCAGCTGTCACTGTCGTTCCC |
(3)以84K杨cDNA稀释10倍后为模板，利用诺唯赞高保真酶Pfu、dNTP、2×buffer进行PCR扩增。
总共容积为60μl，将PCR管放入Bio-Rad PCR仪。设置程序如下，经过预变性95℃，3-5min；变性95℃，30sec；退火56℃，30sec及延伸72℃，2min(根据片段长度可调节)等过程，进行PCR扩增。将PCR产物经上样后跑琼脂糖凝胶电泳，看电泳条带大小是否和目标条带一致，另外亮度(即浓度)是否可以满足后续试验。若浓度不够，可重新扩增；若满足需求，则可利用胶回收试剂盒(康为世纪，CW2302M)将产物分别进行回收。
实施例2、调控杨树表皮毛发育的PagARF10-RNAi载体的构建
(1)将实施例1获得的PCR扩增产物PagARF10-AS利用酶切、连接，并利用大肠杆菌转化的方法构建到pCR2.1-CCRi载体中，形成pCR2.1-ARF10AS载体。
具体地说，pCR2.1-ARF10AS载体的构建步骤如下：
1)载体酶切体系
pCR2.1-CCR2i载体用BamHI和SalI进行双酶切。
37℃金属浴进行酶切1小时(h)。期间每隔15min混匀一次。经过跑琼脂糖凝胶之后，进行胶回收，获得单一片段化的载体。最后，对其进行浓度测定。
2)PCR产物与载体连接：
16℃，连接过夜。
3)大肠杆菌转化
将大肠杆菌感受态从超低温冰箱中取出并融化，取200μl分装至四个1.5ml离心管中。
将连接好的DNA产物加入到大肠感受态中，轻弹使其混匀，并置入冰中转化30min。
将水浴锅提前设置为42℃。把离心管放入水浴锅热激90s。放置冰上静置2min。
将700μl不含抗生素的LB培养基加入到离心管中，并放入摇床孵育45min。
最大速度离心15sec，倒掉部分上清，吸打混匀，吸取100μl菌液涂抗性板。
把板封好，并标记菌名及载体名、日期等，放置37℃培养箱培养过夜。
待阳性克隆长出后，挑取阳性克隆进行PCR和测序验证。
利用康为世纪的高纯度质粒小提试剂盒(货号：CW0500M)对测序正确的pCR2.1-ARF10AS载体质粒进行提取。
(2)载体pCR2.1-ARF10AS经过SpeI和SacI双酶切之后，通过T4连接酶将扩增出的PagARF10-S片段进行连接，转化大肠杆菌。最后，利用PagARF10-AS反向引物和PagARF10-S反向引物(表1)进行阳性克隆筛选，并将其送测序，获得正确序列的阳性菌株并提取质粒，该载体命名为pCR2.1-ARF10i。
(3)将载体pCR2.1-ARF10i和载体pBI121-GUS分别用XbaI和SacI进行双酶切，将从载体pCR2.1-ARF10i酶切下来的PagARF10-AS-GUS linker-PagARF10-S片段连接到pBI121上获得最终载体，命名为PagARF10-RNAi(结构如图1所示)。
(4)PagARF10-RNAi载体转化大肠杆菌，经PCR检测和测序，鉴定出测序正确的阳性克隆，然后提取质粒。
实施例3、调控杨树表皮毛发育的转基因杨树的遗传转化
1)将质粒PagARF10-RNAi转入农杆菌GV3101中，获得阳性克隆，将菌株在5ml LB液体培养基中(含50mg/L利福平和50mg/L的卡那霉素)，小摇过夜，至OD值为1.0。
2)用移液枪取2ml菌液加入到100ml新的LB液体培养基中(含50mg/L利福平和50mg/L的卡那霉素)，大摇5-6h，OD值为0.4-0.6。
3)在超净工作台中，用无菌剪刀剪取一月生的野生型84K杨树苗(在培养温度为23℃、光照为16/8h(白天/黑夜)的条件下培养)的第三、四、五片相对厚实且嫩绿的叶片，用无菌手术刀轻轻划出伤痕，去除叶柄及叶尖端，放置到愈伤培养基上。23℃，黑暗培养一个月，产生白色透亮并且棉絮状的愈伤团。
4)将愈伤掰下，放入愈伤培养基上，继代培养两周，待愈伤长大些，侵染愈伤。
5)将愈伤放入装有农杆菌的组培瓶中，大约侵染15min，期间轻轻晃动菌液。
6)将愈伤在超净滤纸上晾干后，放入愈伤分选培养基上，23℃，黑暗培养三天。
7)将愈伤转移至愈伤选择培养基上，光照气候室(23℃、16/8h(白天/黑夜))培养2-3周。期间会发现愈伤由白色变黄色后来变红，最后由绿色小芽出现。
8)待小芽长大后，继代到愈伤生根培养基上，等待阳性苗鉴定。
其中，愈伤培养基、愈伤分选培养基、愈伤选择培养基及愈伤生根培养基的配方如下：
愈伤培养基(1L)：2.3g WPM，0.5g EMS，20g蔗糖，1.0mg/L 2,4-D，0.1mg/LKT，5g琼脂粉，PH＝5.9。121℃，灭菌20min。培养基之前加入1ml 200mg/ml的头孢、300μl 50mg/ml的Kan、1ml 200mg/ml的Tim。
愈伤分选培养基(1L)：2.3g WPM，0.5g EMS，20g蔗糖，100μM AS，5g琼脂粉，PH＝5.9。121℃，灭菌20min。
愈伤选择培养基(1L)：2.3g WPM，0.5g EMS，20g蔗糖，5g琼脂粉，PH＝5.9。121℃，灭菌20min。培养基之前加入0.05mg/L的NAA，0.5mg/L的6-BA，1ml200mg/ml的头孢、300μl50mg/ml的Kan、1ml 200mg/ml的Tim。
愈伤生根培养基(1L)：2.3g WPM，0.5g EMS，20g蔗糖，5g琼脂粉，PH＝5.9。121℃，灭菌20min。培养基之前加入1ml 200mg/ml的头孢、300μl 50mg/ml的Kan、1ml 200mg/ml的Tim。
实施例4、调控表皮毛发育的转基因杨树的性状分析
如图2所示，用NCBI(National Center for Biotechnology Information/nih.gov)分析了PagARF10的保守功能域，其含有的B3 DNA binding domain和Auxinresponse factor结构域是生长素响应因子家族之一。如图3所示，借助农杆菌侵染杨树愈伤的转化方法，PagARF10在转基因杨树中的表达量相对于未转化杨树(WT)明显降低，说明本发明成功获得三株PagARF10-RNAi(即PagARF10基因的表达量在转基因杨树中明显降低)的转基因杨树，分别命名为ARF10i-1、ARF10i-2、ARF10i-3。如图4所示，借助体视镜观察一月生的PagARF10-RNAi转基因杨树叶片，发现相对于未转化的杨树(WT)，转基因ARF10i-1、ARF10i-2、ARF10i-3的叶片明显变大，背面(Abaxial)和腹面(Adaxial)表皮毛明显增多。如图5所示，借助imageJ软件对转基因ARF10i-1、ARF10i-2、ARF10i-3和未转化杨树(WT)进行了叶片面积统计，发现转基因ARF10i-1、ARF10i-2、ARF10i-3的叶片面积明显比WT的大。如图6所示，通过冷冻传输扫描电子显微镜观察转基因及未转化杨树的第一片展开叶片，发现与WT相比，转基因ARF10i-1、ARF10i-2、ARF10i-3的叶腹面和叶背面表皮毛数目明显增多。如图7所示，对转基因和WT每平方厘米内的表皮毛数目进行了统计，发现转基因ARF10i-1、ARF10i-2、ARF10i-3的正反面表皮毛数目比WT的都明显增多。综上所示，相比于未转化的杨树，转基因ARF10i-1、ARF10i-2、ARF10i-3的叶片面积更大且表皮毛密度增加，对于外界环境可能具有更高的适应性，具有潜在的应用前景。
本发明通过农杆菌介导的侵染杨树叶片愈伤的遗产转化方法，成功获得了PagARF10-RNAi转基因杨树ARF10i-1、ARF10i-2、ARF10i-3三个株系，本发明提供的转基因杨树ARF10i-1、ARF10i-2、ARF10i-3相比于未转基因杨树(WT)显著提高了杨树叶片表皮毛的数量，说明PagARF10基因是调控杨树叶片表皮毛发育的关键调节基因，在利用分子设计育种进行林木遗传育种领域有重要应用价值，对培育高抗虫或抗旱等杨树新品种具有较强的潜在应用价值。
于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (5)
1.一种调控杨树叶片表皮毛发育的基因，其特征在于，所述基因为PagARF10基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种权利要求1所述的调控杨树叶片表皮毛发育的基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种含有权利要求1所述的调控杨树叶片表皮毛发育的基因的载体或重组菌。
4.根据权利要求3所述的调控杨树叶片表皮毛发育的基因的载体，其特征在于，所述载体为PagARF10-RNAi。
5.权利要求1所述的调控杨树叶片表皮毛发育的基因在培育耐旱、抗虫杨树新品种中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310364711.6A CN116768992B (zh) | 2023-04-07 | 2023-04-07 | 一种调控杨树叶片表皮毛发育的基因及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310364711.6A CN116768992B (zh) | 2023-04-07 | 2023-04-07 | 一种调控杨树叶片表皮毛发育的基因及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116768992A true CN116768992A (zh) | 2023-09-19 |
| CN116768992B CN116768992B (zh) | 2024-02-06 |
Family
ID=87988465
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310364711.6A Active CN116768992B (zh) | 2023-04-07 | 2023-04-07 | 一种调控杨树叶片表皮毛发育的基因及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116768992B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103865952A (zh) * | 2014-02-27 | 2014-06-18 | 南京林业大学 | 一种调控杨树生长发育的生长素响应因子基因PeARF17.1及其应用 |
| CN104975029A (zh) * | 2015-07-06 | 2015-10-14 | 中国林业科学研究院林业研究所 | 一种调控杨树不定根发育的生长素响应因子基因及其应用 |
| CN109295089A (zh) * | 2018-11-12 | 2019-02-01 | 长江师范学院 | 一种有规则裂纹且色泽鲜艳的无籽番茄及其培育方法 |
| CN109456970A (zh) * | 2018-11-21 | 2019-03-12 | 长江师范学院 | 调控番茄侧芽发育的SlARF10基因和SlmiR160b及其应用 |
| CN112358534A (zh) * | 2020-10-27 | 2021-02-12 | 中国林业科学研究院林业研究所 | 一种调控杨树纤维长度的生长素响应因子基因及其应用 |
-
2023
- 2023-04-07 CN CN202310364711.6A patent/CN116768992B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103865952A (zh) * | 2014-02-27 | 2014-06-18 | 南京林业大学 | 一种调控杨树生长发育的生长素响应因子基因PeARF17.1及其应用 |
| CN104975029A (zh) * | 2015-07-06 | 2015-10-14 | 中国林业科学研究院林业研究所 | 一种调控杨树不定根发育的生长素响应因子基因及其应用 |
| CN109295089A (zh) * | 2018-11-12 | 2019-02-01 | 长江师范学院 | 一种有规则裂纹且色泽鲜艳的无籽番茄及其培育方法 |
| CN109456970A (zh) * | 2018-11-21 | 2019-03-12 | 长江师范学院 | 调控番茄侧芽发育的SlARF10基因和SlmiR160b及其应用 |
| CN112358534A (zh) * | 2020-10-27 | 2021-02-12 | 中国林业科学研究院林业研究所 | 一种调控杨树纤维长度的生长素响应因子基因及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YONGYAO FU等: "PtrARF2.1 Is Involved in Regulation of Leaf Development and Lignin Biosynthesis in Poplar Trees", INTERNATIONAL JOURNAL O F MOLECULAR SCIENCES, vol. 20 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116768992B (zh) | 2024-02-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kiyokawa et al. | Genetic transformation of Begonia tuberhybrida by Ri rol genes | |
| WO2017076305A1 (zh) | 利用球孢白僵菌BbP4-ATPase基因提高植物对黄萎病抗性的方法 | |
| WO2022135246A1 (zh) | 一种控制大豆-根瘤菌匹配性的r基因及其蛋白质和应用 | |
| WO2017076306A1 (zh) | 利用黄萎病菌VdP4-ATPase基因提高植物对黄萎病抗性的方法 | |
| CN111424022A (zh) | 大丽轮枝菌VdEG抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用 | |
| CN105624188A (zh) | 一种spl18基因在提高植物产量中的应用 | |
| CN101358190A (zh) | 一种人工合成的对鳞翅目害虫表达高毒力蛋白的基因序列及其应用 | |
| CN110358772B (zh) | 提高水稻非生物胁迫抗性的OsEBP89基因及制备方法与应用 | |
| CN116694652B (zh) | 大丽轮枝菌VdNRPS4基因抗病原菌靶基因片段及干扰载体和应用 | |
| CN101503690A (zh) | 用rdl1基因促进植物种子增大和棉纤维增长的方法 | |
| CN116768992B (zh) | 一种调控杨树叶片表皮毛发育的基因及其应用 | |
| CN105175519B (zh) | 蛋白srl2在培育叶卷曲水稻中的应用 | |
| JP5164093B2 (ja) | イネの病原菌に対する抵抗性を高める方法及び病原菌耐性イネ形質転換体 | |
| CN108484742B (zh) | 杜梨抗寒转录因子PbrMYB5及其应用 | |
| CN106480069B (zh) | 黄瓜CsERF025基因及其在促进黄瓜果实顺直发育中的应用 | |
| CN106244595B (zh) | 杉木植物磺肽素clpsk1基因及其应用 | |
| CN115807010B (zh) | 忍冬叶片腺毛发育基因及其应用 | |
| CN112725353B (zh) | 重组载体、转化体、用于扩增AtNAC58基因的引物及其制备方法和应用 | |
| CN113584055B (zh) | 胡椒pnpal3基因及其在胡椒抗瘟病中的应用 | |
| CN116926088B (zh) | 大丽轮枝菌VdNRPS6基因抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用 | |
| CN113403326B (zh) | 茶树CsERF3基因及其应用 | |
| Franche et al. | Genetic transformation of trees in the Casuarinaceae family | |
| CN116731139B (zh) | 毛白杨PtoERF15基因在调控杨树抗旱上的应用 | |
| CN112409466B (zh) | 蛋白质hda703在调控水稻产量中的应用 | |
| CN117431262A (zh) | BjuPP2C52基因在茎瘤芥抗性育种中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |