CN109456970A

CN109456970A - 调控番茄侧芽发育的SlARF10基因和SlmiR160b及其应用

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Publication number: CN109456970A
Application number: CN201811392956.5A
Authority: CN
Inventors: 符勇耀; 杨利平; 李昌满; 徐文姬; 朱艺勇
Original assignee: Yangtze Normal University
Current assignee: Yangtze Normal University
Priority date: 2018-11-21
Filing date: 2018-11-21
Publication date: 2019-03-12
Anticipated expiration: 2038-11-21
Also published as: CN109456970B

Abstract

本发明公开了调控番茄侧芽发育的SlARF10基因和SlmiR160b及其应用，SlmiR160b的前体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SlARF10基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明利用过表达SlmiR160b或利用嵌合抑制子基因沉默技术(CRES‑T)抑制表达SlARF10基因，得到的转基因植物促进了侧芽的发生率且不改变侧芽的发生方式。揭示SlmiR160b和SlARF10基因是调控侧芽发育的关键靶点，且转基因植株的侧芽发生数目跟SlmiR160b的表达丰度在一定范围内成正相关关系，因此可以根据转基因株系中SlmiR160b的转录表达水平，筛选出侧芽发生大小及数目不同的植株形态。SlmiR160b和SlARF10基因的调控作用普遍适用于草本植物，为调控草本植物的侧芽发育提供了一种有效的技术手段，具有广泛的应用价值。

Description

调控番茄侧芽发育的SlARF10基因和SlmiR160b及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及调控番茄侧芽发育的SlARF10基因和SlmiR160b及其应用。

背景技术

侧枝在植物型态中是极其重要的因素，代表着植物对环境变化适应的可塑性，随着外界环境的变化，植物的外型也会相应的改变。在园艺植物造景或者蔬菜、大田作物生产上，侧枝具有不可替代的地位。如在景观园林领域，增加侧芽数目，可以增加冠幅，起到遮阴的效果。在农业生产上，作物分枝对农作物的产量具有重要影响，在实际生产中人们通过棉花、万寿菊、葡萄、茄子等打顶，果树修剪，增加水稻、小麦分蘖数等措施来去除顶端优势增加侧芽，进而达到增产的目的。基于侧枝在作物产量上的意义，如何充分利用侧枝与作物产量和品质上的协调关系也是当今育种学家所关注的问题。近几十年来，国内外研究者就侧枝的形成和发育以及调控因素等方面开展了。因此深入了解植物侧芽生长发育的机制对作物生产具有重要的意义。

植物的侧芽发育受到各种外界环境条件、遗传因素和植物激素的影响。近几年来，科学家通过遗传学，分子生物学等手段，对植物侧芽发育调控分子机制的认识不断深入，通过研究侧枝的产生与发育，相继发现了一些调控侧芽、侧枝发育的基因，如在生长素信号通路识别途径中，目前已发现，IAA3,IAA9,SlTPL1，SlTPL6，SlARF2a等与侧芽发育相关，是侧芽发育的抑制因子，通过下调其表达，可以促进侧芽的发育(Xu T et al.SlARF2a plays anegative role in mediating axillary shoot formation.Sci Rep.2016)；专利201810681789.X公开了调控番茄侧芽发育的ARF8.1和ARF8.2基因及其应用，通过温和过表达促进侧芽发育；Wang H等公开IAA9反向抑制(AS-IAA9)引起的侧芽改变(Wang H etal.The tomato Aux/IAA transcription factor IAA9is involved in fruitdevelopment and leaf morphogenesis.Plant Cell.，2005)。但上述方法虽然能改变侧芽发生率，也改变侧芽发生的方式，即从顶端发生转变为底端发生，而侧芽底端发生的植株呈上稀疏下茂盛，整形修剪困难，营造的景观局限，进而大大的限制其使用范围。

己有研究显示在番茄果实形成和发育过程中，控制生长素信号转导的生长素应答因子(ARF)和生长素/吲哚-3-乙酸(Aux/IAA)家族基因发挥着重要作用。生长素响应因子SIARF10是番茄ARF家族成员之一，对果实形成和发育过程也发挥着重要作用。最近报道在番茄中过表达SlARF10基因的表达能够抑制叶片的生长(Ben-Gera et al.Auxin-mediatedlamina growth in tomato leaves is restricted by two parallelmechanisms.Plant，2016)；梅丽华等通过在番茄植株中超表达和RNAi干扰SlARF10基因，证实SlARF10基因影响番茄果实在绿果期叶绿素的形成，进而影响多糖和淀粉的积累(“生长素响应因子基因在番茄果实发育过程中的功能研究”梅丽华,重庆大学硕士论文,2017)。

microRNA(miRNA)是一类20～24个核苷酸长度的非编码单链小RNA分子，它通过碱基配对结合靶基因的miRNA，从而引起mRNA的降解或翻译抑制。miRNA在植物生长发育过程中发挥着重要的调控作用。miR160(microRNA160)是植物体内的一类保守miRNA，它通过调控其靶基因ARF的转录水平，参与植物诸多生理生化进程，在植物生长发育过程中发挥着重要的调节作用。现已证实番茄miRNA160可调控靶基因SlARF10、SlARF16和SlARF17，参与番茄生长发育的功能。刘欣等利用35Sm∷SlARF10-6(抗miRNA160降解的形式)转基因材料探讨了miRNA160调控SlARF10对番茄叶片失水速率的影响，并明确了ARF10通过直接影响气孔发育和水通道蛋白表达而增加番茄叶片的水分导度(“miRNA160通过SlARF10对番茄叶片失水和果实发育的调控作用”刘欣，博士学位论文，2016)。但miRNA160或SlARF10基因在番茄侧芽发育过程中的作用还未有发现。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供调控番茄侧芽发育的SlARF10基因和SlmiR160b及其应用，为植物侧芽发育的调控提供了新的靶点，同时还提供了构建方法，为植物形态特征的遗传改良提供了更好的选择。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：调控番茄侧芽发育的SlmiR160b，所述SlmiR160b的前体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

调控番茄侧芽发育的SlARF10基因，所述SlARF10基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

一种重组表达载体，包括SlmiR160b的前体核苷酸序列。

这样，重组表达载体中SlmiR160b前体序列在启动子驱动下转录表达，转录后的SlmiR160b前体RNA经过一系列剪切加工获得SlmiR160b成熟体序列，进而组装形成RNA诱导的沉默复合体(RISC)，进而调控ARF的转录水平如抑制SlARF10基因转录表达水平。

一种重组表达载体，包括SlARF10的核苷酸序列经嵌合抑制子SRDX形成的融合片段SlARF10-SRDX。

这样，在重组表达载体中融合片段SlARF10-SRDX(含EAR抑制区LDLDLELRLGFA)在启动子的驱动下在转基因植株中过表达，去特异性抑制SlARF10互作因子及其作用靶标基因。

一种包含上述重组表达载体的植物细胞系或植物转化体。

SlARF10基因或SlmiR160b在促进植物侧芽发育中的应用。

一种提高植物侧芽发育的方法，包括以下步骤：构建上述重组表达载体，并将其转入植物中，使SlmiR160b编码基因或SlARF10-SRDX融合基因过表达，即得到侧芽发育提高的植物；所述植物为草本植物。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明通过构建pSlARF10启动子与GUS融合表达分析发现，pSlARF10具有驱动基因在茎中维管组织(含韧皮部和木质部)特异性表达的特性，证实SlARF10基因参与调控茎中维管的形成和发生，很可能调控侧芽发育。本发明利用过表达技术和嵌合抑制子基因沉默技术(CRES-T)分别调控SlmiR160b和SlARF10基因表达，提高了植株的侧芽发生数目，表明SlmiR160b或SlARF10基因是调控植物侧芽发育的关键靶点，不仅能提高侧芽的发生率，而且不改变侧芽发生方式，区别于其他生长素信号途径中调控侧芽发育的关键因子(番茄IAA9、ARF8.1和ARF8.2等)，为侧芽发育的遗传改造提供了不同的选择；该方法可以营造不同的景观，进而扩展其使用范围。对于植物侧芽发育调控具有重要科学意义，同时在园艺园林以及农业生产领域有潜在的应用价值。

2、本发明通过过表达SlmiR160b得到转基因植株，其中转基因植株的侧芽发生数目跟SlmiR160b的表达丰度在一定范围内成正相关关系。因此可以根据转基因株系中SlmiR160b的转录表达水平，筛选出侧芽发生大小及数目不同的植株形态，避免引起植物体内营养物质的分配异常或浪费，具有更强的实际应用价值和经济价值。

3、本发明在番茄中构建SlARF10-RNAi转基因株系，虽然该转基因植株中SlARF10基因的表达量下调，但未发现侧芽数目增加的情况，这可能是由于SlARF10基因的功能缺失会受到同源基因的功能补偿作用；通过在番茄和烟草中过表达SlARF10-SRDX，均能提高番茄和烟草的侧芽发生率，说明采用嵌合抑制子基因沉默技术能够实现SlARF10基因对侧芽发育的调控，并且本发明中生长素响应因子基因SlARF10普遍适用于草本植物，为调控草本植物的侧芽发育提供了一种有效的技术手段，具有广泛的应用价值。

附图说明

图1为pSlARF10启动子上激素响应元件分析图；

图2为构建重组表达载体pCX-pSlARF10-GUS-NOC的图谱示意图；

图3从左到右分别是启动子pSlARF10驱动GUS在番茄茎中的纵切面和横切面表达示意图；

图4为SlmiR160b的发夹结构示意图；

图5为构建重组表达载体P35S-SlmiR160b-NOC的图谱示意图；

图6为过表达SlmiR160b对番茄侧芽发育的影响分析；

图A是番茄植株的侧芽发育表型，从左到右依次是野生型番茄植株、SlmiR160b过表达的转基因植株OE-L1和OE-L2；图B是SlmiR160b前体核苷酸序列在转基因番茄不同株系中的定量表达分析；图C是SlARF10基因在过表达SlmiR160b转基因株系中的定量表达分析；图D是不同SlmiR160b过表达转基因株系的侧芽数目比较分析；

图7为构建重组表达载体P35S-SlARF10-RNAi-NOS的图谱示意图；

图8为RNAi干扰沉默SlARF10基因表达对番茄侧芽发育的影响；

图A从左到右分别是野生型番茄与SlARF10-RNAi转基因番茄植株RNAi-L1、RNAi-L2和RNAi-L3；图B是SlARF10基因在不同转基因株系中的定量表达分析；

图9为构建重组表达载体P35S-SlARF10-SRDX-NOS的图谱示意图；

图10为过表达SlARF10-SRDX对番茄侧芽发育的影响；

图A从左到右依次是野生型番茄与SlARF10-SRDX转基因番茄植株SRDX-L1和SRDX-L2；图B是SlARF10-SRDX基因在不同转基因番茄株系中的表达鉴定；

图11为烟草转化过程流程图；

从左到右依次是无菌苗培养图、愈伤诱导图、诱导芽分化图和生根培养图；

图12为过表达SlARF10-SRDX对烟草侧芽发育的影响；

图A从左到右分别是SlARF10-SRDX转基因烟草与野生型烟草植株；图B是SlARF10-SRDX基因在不同转基因烟草株系中的表达鉴定。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。实施例中所述原料如无特殊说明，即为普通市售产品。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。

实施例1番茄SlARF10启动子克隆及GUS染色分析

(1)SlARF10启动子的序列分析与克隆

利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线软件分析番茄SlARF10基因上游启动子pSlARF10约2.5kb的序列，pSlARF10启动子含有多种激素调控的响应元件，包括生长素响应元件AUX、赤霉素响应元件GA3、乙烯响应元件ERE等，结果如图1所示。

根据pSlARF10核苷酸序列(SEQ ID NO.4)，设计特异性引物pSlARF10-F和pSlARF10-R，采用CTAB法(RTG2405-01，中科泰瑞)提取番茄基因组DNA作为模板进行常规PCR扩增目的片段。

所述引物序列如下：

pSlARF10-F：5’-CAATTTACATATACAACACATGCCTCA-3’

pSlARF10-R：5’-GCTAATCCAATAGTTTTTCCCCTTC-3’

PCR扩增体系为高保真扩增酶Prime STAR HS(R010A,TaKaRa)0.25μL，5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺Plus)5μL，正向引物(10μM)0.5μL，反向引物(10μM)0.5μL，模板(DNA)1μL，dNTP(2.5mM)2μL，无菌ddH₂O补足至25μL。

反应程序：预变性95℃，3min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，2min30s，38个循环；72℃，7min。

获得PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，按照胶回收试剂盒(9672，Takara)纯化后备用。

(2)构建重组表达载体pCX-pSlARF10-GUS-NOS

用Xcm I单酶切处理pCXGUS-P载体，酶切后根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pCXGUS-P载体大片段。再利用平末端加A试剂(6019，Takara)将纯化的pSlARF10启动子片段末端加A，通过TA克隆方法将pSlARF10目的片段与pCXGUS-P大片段连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，从含有卡纳霉素(100mg/L)的LB培养板上挑取阳性克隆进行PCR检测及测序验证，得到重组表达载体pCX-pSlARF10-GUS-NOS，具体构建如图2所示。

单酶切体系：pCXGUS-P vector 5μL；Xcm I 1μL；Buffer 2μL；无菌ddH₂O补足至20μL。37℃反应3h。

加A反应体系：回收pSlARF10目的片段100ng；dATP 0.25μL；A-overhang enzyme0.25μL；10×Buffer 1μL；无菌ddH₂O补足至10μL；65℃反应40min。

连接反应体系：加A反应产物2-3μL；Linearized vector(pCXGUS-P大片段)2μL；Solution I 5μL；无菌ddH₂O补足至10μL。25℃连接反应30min。

(3)番茄遗传转化与GUS染色分析

通过冻融法将重组表达载体pCX-pSlARF10-GUS-NOS转入农杆菌菌株EHA105中，利用农杆菌介导的转化方法将其导入野生型番茄(Micro Tom)，具体步骤如下：

1)转化材料的培养

将番茄组培苗在培养温度为23-25℃、光照为16/8h(白天/黑夜)、光照强度为6000-8000lux的条件下培养30-40天后，选取长势良好的组培苗的叶片用于遗传转化。

2)转化

将含有pCX-pSlARF10-GUS-NOS载体的农杆菌，接种于含有卡纳霉素(100mg/L)的液体LB培养基中，28℃，200rpm培养至OD600约为0.8～1.0之间，然后将培养好的菌液于4000rpm，离心5min，将收集的菌体用KCMS液体培养基稀释到OD600约为0.05-0.1之间；再放入待转化番茄组培苗的叶片，其中叶片切出伤口，农杆菌侵染大约20-30min；用灭菌滤纸吸干菌液，将叶片在KCMS固体培养基中暗培养2-3天。

3)初筛培养

将番茄叶片转移到含有12.5mg/L潮霉素和相应激素的初筛培养基ZR中，使侵染后的外植体(叶片)伤口处诱导出愈伤组织，随后诱导分化不定芽。2周更换一次新培养基。

4)生根培养

将外植体细胞分化出的不定芽切下，插入含有12.5mg/L潮霉素和相应激素的生根培养基ENR，再将其放入光照培养箱培养直至生根；当不定芽生根后，将其移栽到土里继续生长，即得到T0代转基因番茄植株，观察其表型变化。

5)番茄茎组织的GUS染色分析

对转化pCX-pSlARF10-GUS-NOS的番茄茎组织进行GUS化学染色。选择转基因番茄不同株系的成年植株(开花期)，从上至下取第3或第4节，用无菌水清洗干净，用无菌刀片将其纵向和横向剖开，浸泡在含有0.2mM X-Gluc的GUS染色液中，37℃处理1h以上；然后取出，室温条件下，依次在30％、50％和75％的酒精中分别浸泡5-6h进行脱色处理；然后直接在显微镜下进行GUS组织化学染色观察。GUS染色缓冲液含有50mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)、0.2％Triton X-100、2mM亚铁氰化钾和2mM铁氰化钾。

将番茄pSlARF10连入pCXGUS-P载体，pSlARF10位于GUS报告基因上游，驱动其表达，通过对转基因植物的GUS染色，可以清楚的观察番茄SlARF10基因的时空表达特异性。

染色结果如图3所示，pSlARF10-GUS在番茄茎中能够观察到特异性表达。从茎的纵切面中可以发现，GUS在茎中维管组织特异性表达，而在表皮和髓部无表达(图3A)。从茎的横切面中可以发现，GUS主要在茎中韧皮部和木质部中特异表达(图3B)。以上结果暗示，SlARF10基因参与调控茎中维管的形成和发生，很可能调控侧芽发育。

实施例2重组表达载体P35S-SlmiR160b-NOS构建及番茄的遗传转化

(1)番茄SlmiR160b的克隆

通过生物信息学分析发现，在番茄基因组中，miR160除了已公开的SlmiR160aGenbank(NR_107984.1)或miRBase(MI0008357)，在第12号染色体(GenBank:HG975524.1)上，还存在另一个位点SlmiR160b(SEQ ID NO.1)。利用The mfold Web Server在线服务软件RNA Folding Form(version 2.3energies)分析SlmiR160b发夹结构如图4所示。

根据SlmiR160b的前体核苷酸序列(SEQ ID NO.1)，设计特异性引物SlmiR160b-F和SlmiR160b-R，采用CTAB法(RTG2405-01，中科泰瑞)提取番茄基因组DNA作为模板进行常规PCR扩增目的片段。所述引物序列为：

SlmiR160b-F：5’-CCAAGTCCAAGAAATGAAATTG-3’

SlmiR160b-R：5’-GTTGCCAATTGGTATTGATGG-3’

PCR反应程序为：预变性95℃，5min；95℃，30s；56℃，40s；72℃，10s，38个循环；72℃，5min。

(2)构建重组表达载体P35S-SlmiR160b-NOS

用Xcm I单酶切处理pCXSN载体，酶切后根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pCXSN载体大片段。再利用平末端加A试剂(6019，Takara)将纯化的SlmiR160b末端加A，通过TA克隆将SlmiR160b目的片段与pCXSN大片段相连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，从含有卡纳霉素(100mg/L)的LB培养板上挑取阳性克隆进行PCR检测及测序验证，得到重组表达载体P35S-SlmiR160b-NOS，具体构建如图5所示。

单酶切体系为：pCXSN vector 5μL；Xcm I 1μL；Buffer 2μL；无菌ddH₂O补足至20μL。37℃反应3h。

加A反应体系为：回收SlmiR160b目的片段50ng；dATP 0.25μL；A-overhang enzyme0.25μL；10×Buffer 1μL；无菌ddH₂O补足至10μL；65℃反应40min。

连接反应体系为：加A反应产物2-3μL；Linearized vector(pCXSN大片段)2μL；Solution I 5μL；无菌ddH₂O补足至10μL。16℃连接反应6h。

在重组表达载体P35S-SlmiR160b-NOS中，SlmiR160b前体序列位于组成型强启动子P35S下游，它能驱动SlmiR160b前体在植物体内高效转录；其3’端组装有NOS终止子，可以有效终止目的片段的转录。在重组表达载体上组装有HPT基因，作为转基因植物的筛选标记，可以用潮霉素进行转基因植株的筛选。在重组表达载体上组装有LB和RB序列，促使组装于其间的表达框架和筛选标记基因HPT整合至植物受体染色体上。

(3)番茄的遗传转化与SlmiR160b过表达植株的表型分析

1)农杆菌介导的番茄遗传转化

通过常规冻融法将构建的重组表达载体P35S-SlmiR160b-NOS转入农杆菌菌株EHA105中，通过PCR筛选阳性克隆，再通过农杆菌介导方法将其转入野生型番茄(MicroTom)，具体转化步骤与实施例1中番茄遗传转化相同。

2)鉴定过表达SlmiR160b的转基因番茄植株

从获得的T0代转基因番茄植株中收集到少量种子，进行播种，获得T1转基因番茄植株，收集种子继续播种，一直到T3代比较稳定的转基因株系。

对SlmiR160b的定量表达检测采用茎环法(Varkonyi-Gasic et al.,2007)，首先采用Trizol试剂(Invitrogen^TM)提取T3代番茄总RNA，利用DNase I(Invitrogen^TM)去除残余DNA，以RT primer为反转录引物，参照cDNA反转录试剂盒(Takara)说明书步骤合成第一链cDNA；以番茄Actin基因为内参，按照SYBR Premix Ex Taq TM II(Takara)操作说明书步骤进行定量PCR。对SlARF10基因的转录水平检测，采用普通定量PCR方法，首先按照cDNA反转录试剂(Takara)说明书步骤合成第一链cDNA。以番茄Actin基因为内参，参照SYBRPremix Ex Taq TM II(Takara)操作说明书步骤对其进行定量PCR检测。

RT primer序列为：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC(加粗为SlmiR160b成熟体反向互补部分序列)

检测SlmiR160b的引物为：

SlmiR160b-QF:5'-GCGGCGG-3'(加粗为SlmiR160b成熟体部分序列)

SlmiR160b-QR:5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'

检测Actin基因引物为：

Actin-QF:5'-TGTCCCTATTTACGAGGGTTATGC-3'

Actin-QR:5'-AGTTAAATCACGACCAGCAAGAT-3'

检测SlARF10基因引物为：

SlARF10-QF1:5'-GGTCCAGCAGTCCTTTCTGTTG-3'

SlARF10-QR1:5'-CTGCAACGCGCTGGAAACT-3'

结果如图6B和6C所示，与WT植株相比，含有重组表达载体P35S-SlmiR160b-NOS的3个超表达转基因株系(OE-L1、OE-L2、OE-L3)中，SlmiR160b显著上调表达，而SlARF10基因被一定程度抑制表达。

3)转基因番茄植株的表型分析

与WT植株相比，过表达SlmiR160b的转基因植株均能正常生长，表现出侧芽数目明显增加(图6A)，通过对不同表达水平的SlmiR160b株系的比较分析发现，OE-L2株系中SlmiR160b转录表达水平最高，其侧芽发生数目最多；OE-L1株系中SlmiR160b转录表达水平低于OE-L2和OE-L3株系，其侧芽发生数目也最少；表明OE株系的侧芽发生数目跟SlmiR160b的表达丰度在一定范围内成正相关关系(图6B，6D)。与WT植株相比，转基因植株中SlARF10基因的表达量均下降(图6C)。

实施例3重组表达载体P35S-SlARF10-RNAi-NOS构建及番茄的遗传转化

(1)番茄SlARF10-RNAi目标片段的克隆

取开花期Micro Tom番茄植株为材料，采用TRIzol^TM Plus RNA Purification Kit(12183555，Invitrogen^TM)，按说明书步骤提取番茄总RNA，利用DNase I(18047019，Invitrogen^TM)去除残余的微量DNA，并用分光光度计测定RNA的浓度，备用。

取约2.0μg番茄总RNA，采用PrimeScript II first-strand cDNA synthesis kit(6210A,Takara)，并按照说明书步骤合成第一链cDNA。

根据番茄SlARF10基因序列(SEQ ID NO.2)，通过同源基因序列比对，找到特异区段，设计特异性引物SlARF10-RNAi-F、SlARF10-RNAi-R。以cDNA为模板，通过PCR扩增进行SlARF10基因特异片段。

所述引物序列如下：

SlARF10-RNAi-F:5’-TAAGATTAGGGTTGTCCCAGTTGG-3’

SlARF10-RNAi-R:5’-CCT-3’(加粗部分与扩增StufferGUS前引物和后引物反向互补)

PCR反应体系：高保真扩增酶PrimeSTAR HS(R010A,TaKaRa)0.25μL，5xPrimeSTARBuffer(Mg²⁺Plus)5μL，正向引物(10μM)0.5μL，反向引物(10μM)0.5μL，模板(cDNA)1μL，dNTP(2.5mM)2μL，无菌ddH₂O补足至25μL。

PCR反应条件：预变性95℃，3min；95℃，30s；56℃，40s；72℃，15s，38个循环；72℃,5min。

获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。扩增SlARF10特异片段与预期大小相同，按照胶回收试剂盒(9672，Takara)说明书步骤回收纯化，获得SlARF10特异片段。

然后以含GUS的pCXGUS-P载体为模板，设计特异性引物StufferGUS-F和StufferGUS-R，利用PCR扩增中间构建RNAi的中间区段(StufferGUS)。

所述引物序列如下：

StufferGUS-F:5’-ATCTACCCGCTTC-3’(加粗部分序列与扩增SlARF10特异片段后引物反向互补)

StufferGUS-R:5’-TAATCGCCTGTAAG-3’(加粗部分序列与扩增SlARF10特异片段后引物反向互补)

PCR反应体系：高保真扩增酶PrimeSTAR HS(R010A,TaKaRa)0.25μL，5xPrimeSTARBuffer(Mg²⁺Plus)5μL，正向引物(10μM)0.5μL，反向引物(10μM)0.5μL，模板(pCXGUS-P)1μL，dNTP(2.5mM)2μL，无菌ddH₂O补足至25μL。

PCR反应条件：预变性95℃，3min；95℃，30s；58℃，40s；72℃，30s，35个循环；72℃,7min。

获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。扩增stufferGUS片段与预期大小相同，按照胶回收试剂盒(9672，Takara)说明书步骤回收纯化，获得stufferGUS片段。

最后，通过重叠PCR扩增获得SlARF10-RNAi目标片段，StufferGUS扩增引物加粗部分序列与SlARF10-RNAi-R中加粗部分序列反向互补，为保证重叠PCR扩增。PCR反应体系为高保真扩增酶PrimeSTAR HS(R010A,TaKaRa)0.25μL，5xPrimeSTAR Buffer(Mg²⁺Plus)5μL，正向和反向引物SlARF10-RNAi-F(10μM)1μL，模板(SlARF10特异片段50-60ng+stuffer片段30ng)，dNTP(2.5mM)2μL，无菌ddH₂O补足至25μL。

PCR反应条件：预变性95℃，5min；95℃，30s；56℃，40s；72℃，1min，35个循环；72℃,10min。

获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。扩增SlARF10-RNAi目标片段与预期相符，按照胶回收试剂盒(9672，Takara)说明书步骤回收纯化，获得SlARF10-RNAi目标片段。

(2)重组表达载体P35S-SlARF10-RNAi-NOS的构建

用Xcm I单酶切处理pCXSN表达载体，酶切后根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pCXSN载体大片段。再利用平末端加A试剂(6019，Takara)将纯化的SlARF10-RNAi目标片段末端加A，通过TA连接将其与pCXSN大片段连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，从含有卡纳霉素(100mg/L)的LB培养板上挑取阳性克隆进行PCR检测及测序验证，得到重组表达载体pCX-SlARF10-RNAi-NOS，具体构建如图7所示。

单酶切体系：pCXSN vector 5μL；Xcm I 1μL；Buffer 2μL；无菌ddH₂O补足至20μL。37℃反应3h。

加A反应体系：回收SlARF10-RNAi目的片段100ng；dATP 0.25μL；A-overhangenzyme 0.25μL；10×Buffer 1μL；无菌ddH₂O补足至10μL；65℃反应40min。

连接反应体系：加A反应产物2-3μL；Linearized vector(pCXSN大片段)2μL；Solution I 5μL；无菌ddH₂O补足至10μL。16℃连接反应6h。

如图7所示，重组表达载体中SlARF10-RNAi目的片段位于组成型强启动子P35S下游，它能使SlARF10-RNAi目的片段转录表达形成发夹结构，获得稳定的dsRNA进而诱导SlARF10基因沉默，其3’端组装有NOS终止子，可以有效终止目的基因的转录。在重组表达载体上组装有HPT基因，作为转基因植物的筛选标记，可以用潮霉素进行转基因植株的筛选。在重组表达载体上组装有LB和RB序列，促使组装于其间的表达框架和筛选标记基因HPT整合至植物受体染色体上。

(3)番茄的遗传转化与转基因SlARF10-RNAi植株的表型分析

1)农杆菌介导的番茄遗传转化

通过常规冻融法将重组表达载体P35S-SlARF10-RNAi-NOS导入农杆菌菌株EHA105中，通过PCR筛选阳性克隆，再通过农杆菌介导方法将其转入野生型番茄(Micro Tom)，具体转化步骤与实施例1中番茄遗传转化相同。

2)鉴定转基因SlARF10-RNAi番茄植株

从获得的T0代转基因番茄植株中收集种子，进行播种，获得T1转基因番茄植株，收集种子继续播种，一直到T3代比较稳定的转基因株系。

采用Trizol试剂(Invitrogen^TM)，按说明书步骤提取T3代番茄总RNA，利用DNase I(Invitrogen^TM)去除残余DNA，采用cDNA反转录试剂(Takara)并按照说明书步骤合成第一链cDNA。以番茄Actin基因为内参，根据SYBR Premix Ex Taq TM II(Takara)操作说明书进行定量RT-PCR方法分析T3代转基因株系与野生型中SlARF10基因的表达水平。

检测Actin基因引物为：

Actin-QF:5'-TGTCCCTATTTACGAGGGTTATGC-3'

Actin-QR:5'-AGTTAAATCACGACCAGCAAGAT-3'

检测SlARF10基因引物为：

SlARF10-QF2:5'-ATTCTCTGTGCCTAGATACTG-3'

SlARF10-QR2:5'-CTATAAATGTGCCTAAACTTCCA-3'

结果如图8B所示，与WT植株相比，含有重组表达载体P35S-SlARF10-RNAi-NOS的3个干扰抑制转基因株系(RNAi-L1、RNAi-L2、RNAi-L3)中SlARF10基因均表现为下调表达，且RNAi-L2株系的SlARF10基因表达水平最低，表明RNAi干扰技术诱导了SlARF10基因的下调表达。

3)转基因番茄植株的表型分析

与WT植株相比，转基因SlARF10-RNAi株系能正常生长且叶面积明显增加，然而未发现侧芽数目增加的情况(图8A)；但是在过表达SlmiR160b的转基因植株中，观察到SlARF10基因下调和侧芽数目增加，可能是由于RNAi干扰不能克服功能基因的冗余性，因而不表现出侧芽发生的表型。

实施例4重组表达载体P35S-SlARF10-SRDX-NOS构建及番茄的遗传转化

(1)SlARF10-SRDX融合基因的克隆

按实施例2中所述方法获得番茄第一链cDNA，根据番茄SlARF10基因序列(SEQ IDNO.1)，设计特异性引物SlARF10-F、SlARF10-3’SRDX-R(不含终止密码)和SRDX-R。以cDNA为模板，以SlARF10-F(正向引物)和SlARF10-3’SRDX-R(反向引物)为引物进行第一轮PCR产物扩增；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测后纯化回收，并以第一轮回收产物为模板，以SlARF10-F(正向引物)和SRDX-R(反向引物)为引物进行第二轮PCR产物扩增；将PCR产物(即SlARF10-SRDX融合片段)纯化回收备用。所述引物序列如下：

SlARF10-F：5’-ATGAAGGAGGTTTTGGAGAAGTGTG-3’；

SlARF10-3’SRDX-R：5’-TGCAAAGATGCTAAGAGGTCCTGCC-3’(加粗部分为SRDX部分序列)；

SRDX-R：TTAAGCGAAACCCAAACGGAGTT(加粗部分为引物重叠部分)

PCR反应体系：高保真扩增酶PrimeSTAR HS(R010A,TaKaRa)0.5μL，5xPrimeSTARBuffer(Mg²⁺Plus)10μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板1μL，dNTP(2.5mM)4μL，无菌ddH₂O补足至50μL。

PCR反应条件：预变性95℃，3min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，2min，35个循环；72℃，10min。

(2)构建重组表达载体P35S-SlARF10-SRDX-NOS

用Xcm I单酶切处理pCXSN表达载体，酶切后根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pCXSN载体大片段。再利用平末端加A试剂(6019，Takara)将纯化的SlARF10-SRDX融合片段末端加A，通过TA Cloning方法将其与pCXSN大片段连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，从含有卡纳霉素(100mg/L)的LB培养板上挑取阳性克隆进行PCR检测及测序验证。

酶切体系为：pCXSN vector 5μL；Xcm I 1μL；Buffer 2μL；无菌ddH₂O补足至20μL。37℃反应3h。

加A反应体系：回收SlARF10-SRDX融合片段100ng；dATP 0.25μL；A-overhangenzyme 0.25μL；10×Buffer 1μL；无菌ddH₂O补足至10μL；65℃反应40min。

重组表达载体pCX-SlARF10-SRDX-NOS的构建示意图如图9所示，目的基因SlARF10与SRDX(含EAR抑制区LDLDLELRLGFA)相融合，位于组成型强启动子P35S下游，它能使SlARF10-SRDX在植物体内高效表达；其3’端组装有NOS终止子，可以有效终止目的基因的转录。在重组表达载体上组装有HPT基因，作为转基因植物的筛选标记，可以用潮霉素进行转基因植株的筛选。在重组表达载体上组装有LB和RB序列，促使组装于其间的表达框架和筛选标记基因HPT整合至植物受体染色体上。

(3)番茄的遗传转化与转基因SlARF10-SRDX植株的表型分析

1)农杆菌介导的番茄遗传转化

通过常规冻融法将构建的重组表达载体P35S-SlARF10-SRDX-NOS转入农杆菌菌株EHA105中，通过PCR筛选阳性克隆，再通过农杆菌介导方法将其转入野生型番茄(MicroTom)，具体转化步骤与实施例1中番茄遗传转化相同。

2)鉴定转基因SlARF10-SRDX番茄植株

采用Trizol试剂(Invitrogen^TM)，按说明书步骤提取T3代番茄总RNA，利用DNase I(Invitrogen^TM)去除残余DNA，采用cDNA反转录试剂(Takara)并按照说明书步骤合成cDNA第一链。以番茄Ubi 3基因为内参，通过半定量RT-PCR方法分析T3代转基因株系与野生型中目的基因SlARF10-SRDX的表达水平。

检测Ubi 3基因引物为：

Ubi 3-F:5'-TCGTAAGGAGTGCCCTAATGCTGA-3'

Ubi 3-R:5'-CAATCGCCTCCAGCCTTGTTGTAA-3'

检测基因SlARF10-SRDX引物为：

SlARF10-3'-F:5'-CACCTCGGTTCTTACTCTTCGGTCAG-3'

Nos-SRDX-R:5'-CTCGTCGACTTAAGCGAAAC-3'

结果如图10B所示，含有重组表达载体P35S-SlARF10-SRDX-NOS的3个转基因株系(SRDX-L1、SRDX-L2、SRDX-L3)中目的基因SlARF10-SRDX均显著上调表达，而在野生型植株(WT)中检测不到SlARF10-SRDX表达，表明SlARF10-SRDX目的基因已经导入番茄基因组，并成功转录表达。

3)转基因番茄植株的表型分析

与WT植株相比，转基因SlARF10-SRDX植株均能正常生长，高度和形态与野生型植株相似。然而，转SlARF10-SRDX基因株系表现出侧芽数目明显增加，并且各转基因株系的侧芽发生率相似(图10A)。

实施例5烟草的遗传转化及转基因SlARF10-SRDX植株表型观察

(1)烟草的遗传转化

1)转化材料的培养

以烟草(Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SR1)为材料，将烟草组培苗在培养温度为(23±1)℃、相对湿度(60±2)％，光照为16/8h(白天/黑夜)、光照强度为6000-8000lux的条件下培养，选取长势良好的组培苗的叶片用于遗传转化(图11A)。

2)转化

将含有重组表达载体P35S-SlARF10-SRDX-NOS的农杆菌菌株，30～50ml含40mg/LRif和50mg/L Kan的YEP液体培养基中，28℃，200rpm培养至OD600约为0.6～0.8之间，将活化过夜的农杆菌按1：100～1：50的比例接种在相同的20-50ml YEP液体培养基中，继续培养至OD600值为0.4～0.6。将二活的农杆菌菌液加入50ml离心管中5000rpm离心7min，去上清，加入10ml MS重悬液(MS+30g/L蔗糖+100μmol/L AS)，用移液枪混匀，然后加入20～30mlMS重悬液，移入圆口瓶中，在28℃，200rpm振荡培养1～2h。取烟草无菌叶片，切成边长为0.5x0.5cm²的正方形叶盘，将切好的叶盘移入含重悬液的圆口瓶，浸染10min，期间间隔3～5min轻微振荡。然后用无菌滤纸吸去附着的菌液，将外植体接种在共培养基上(MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+100μmol/L AS+30g/L蔗糖+5.5～6.0g/L琼脂)，暗培养2d。

3)初筛培养

将共培养的外植体转移到选择培养基(MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+9mg/LHyg+400mg/L Cef+蔗糖30g/L蔗糖+5.5～6.0g/L琼脂)上(图11B)，25℃，光照培养。每隔7～10d更换培养基一次，待转化后的外植体长出大量丛生芽(图11C)。

4)生根培养

培养筛选的抗性芽长1～1.5cm时，从基部将芽切下，并转入生根培养基(1/2MS+0.1mg/L NAA+9mg/L Hyg+400mg/L Cef+蔗糖30g/L蔗糖+6.0～6.5g/L琼脂)上诱导生根，每隔7～10d更换培养基一次获得具有抗性的转基因幼苗(图11D)。将幼苗驯化后移栽到土里继续生长，即得到T0代转基因植株。

(2)转基因烟草的鉴定及T0植株表型观察

采用Trizol试剂(Invitrogen^TM)，按说明书步骤提取T0代烟草叶片总RNA，利用DNase I(Invitrogen^TM)去除残余DNA，采用cDNA反转录试剂(Takara)并按照说明书步骤合成cDNA第一链。以烟草Ubi 4基因为内参，通过半定量RT-PCR方法分析转基因株系与野生型中目的基因SlARF10-SRDX的表达情况。

检测UBQ4基因引物为：

Ubi 4-F:5'-GAATGCAGATCTTCGTGAAG-3'

Ubi 4-R:5'-TTCTGGATATTGTAGTCAGCC-3'

检测基因SlARF10-SRDX引物为：

SlARF10-3'-F:5'-CACCTCGGTTCTTACTCTTCGGTCAG-3'

Nos-SRDX-R:5'-CTCGTCGACTTAAGCGAAAC-3'

结果如图12B所示，含有重组表达载体P35S-SlARF10-SRDX-NOS的3个转基因烟草株系(SRDX-L1、SRDX-L2、SRDX-L3)中目的基因SlARF10-SRDX均上调表达，而野生型植株(WT)中检测不到SlARF10-SRDX表达，表明目的基因SlARF10-SRDX已经成功导入烟草中。与野生型烟草植株相比，转基因SlARF10-SRDX烟草均能正常生长，转基因烟草植株侧芽数目有明显增加且侧芽发生方式未变(图12A)。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 长江师范学院；

<120> 调控番茄侧芽发育的SlARF10基因和SlmiR160b及其应用

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 133

<212> DNA

<213> 番茄（Micro Tom）

<400> 1

ccaagtccaa gaaatgaaat tgttctgcct ggctccctgg atgccaacta agaacagtat 60

tgtcaaaaaa attgacactc ttcctagttg gtaccagagg agacaggcag atccatcaat 120

accaattggc aac 133

<210> 2

<211> 2100

<212> DNA

<213> 番茄（Micro Tom）

<400> 2

atgaaggagg ttttggagaa gtgtgtggat tcacagctat ggcacgcctg tgcaggagga 60

atggtgcaaa tccctccggt taactccaaa gtctactatt ttccacaagg gcatgctgag 120

catactctta tgaatgtgga tttctcagct ctaccaagaa gtcctgctct gattctatgc 180

agagtagctg ctgtgaagtt cttagcggac cctgaaacag atgaggttta tgctaagatt 240

agggttgtcc cagttgggaa caaggggaat gactttgatg atgatgatga cattttgggt 300

agtaatgagt caggaacagc tgaaaaaccc aattcatttg ccaagacatt gactcaatca 360

gatgcaaata atggtggtgg attctctgtg cctagatact gtgcagagac aatatttcct 420

aggttggatt acacggctga cccgcctgtg cagaccgtga cagccaaaga tgttcatggt 480

gaaagttgga agtttaggca catttataga ggtactccca ggaggcattt gttaacgact 540

ggttggagta gttttgtgaa tcagaagaaa cttgttgctg gagattccat tgtgtttttg 600

agggcagaaa atggtgaact ttgtgttgga attcgtaggg cgaaaagagg tggtattggt 660

gggcctgaag ccccatctgg atggaactct ggtgctggaa attatggtgg attttctgcg 720

tttttgaggg aagagatgag caaaaatgga aatttgactt ctcctactag gagcttaagg 780

ggaaagggaa gggtgaggcc tgaatcagtt gttgaagctg catatcttgc ttctagtggg 840

cagccttttg aagttgttta ttatccccgt gcaaacacac cagaattttg tgttagggca 900

tcttcagtga atgctgcaat gaggattcaa tggtgctcag gaatgaggtt caaaatggct 960

tttgaaactg aggattcttc tcgaatcagt tggttcatgg gaactatatc ctccattcaa 1020

cttgctgatc ccatccgctg gcccaattcg ccatggaggc ttcttcaggt ggcatgggat 1080

gaacctgatt tattgcaaaa cgtaaaacat gtcagcccat ggcttgtcga attggtctca 1140

aatatgccag tcattcacct ctcgcccttc tcaccgccaa gaaaaaagct gcgtctacca 1200

ccagatttct cacttgacag ccagtttcag ttaccatctt tttcaggcaa ccccctcagg 1260

tccagcagtc ctttctgttg tttatctgac aacatcactg caggcataca gggagccagg 1320

catgctcaat ttggagtacc tttattggat cttcacctta gcaacaaatt accgtcagga 1380

ctgttaccac caagtttcca gcgcgttgca gccaactcac aacttcctaa tgtcatcaat 1440

aagtgccaaa atgacagaaa tgataacatc tcttgtttgc ttacaatggg tacttcaagt 1500

aagacattgg acaaaaatga tagtgtgaat acacctcggt tcttactctt cggtcagcca 1560

attctgactg agcaacaaat ctctaatgga tgttctgtca gtgctccaca agtagtccaa 1620

acagggaaag acttaggaag gatacaaccg atcaacgaaa aacatccttc tgagcagaaa 1680

ggcagcattc aagacaatct atcaagtgca acatttttct ggaatcgagg ttatcatgca 1740

gctgaacttg gtgtactcaa tactggtcac tgcaaagtat tcctcgagtc agaagatgtt 1800

ggccgtacac ttgatctgtc agttatggga tcatatgaag aactgtacaa aagacttgca 1860

aacatgtttg gacttgaaag accagatatg ctgacccgtg tgctctatca tgatgcaaca 1920

ggtgctgtta aacacaccgg agatgaacca ttcagtgact ttgttaagag tgcaaaaaga 1980

ttgacaattc tgatgaactc aagcagcaat attaaaagga aatggttaac tggtctcgca 2040

actgctgaac gtggtctaga ttcatcaaac caggcaggac ctcttagcat ctttgcatag 2100

<210> 3

<211> 699

<212> PRT

<213> 番茄（Micro Tom）

<400> 3

MKEVLEKCVD SQLWHACAGG MVQIPPVNSK VYYFPQGHAE HTLMNVDFSA LPRSPALILC 60

RVAAVKFLAD PETDEVYAKI RVVPVGNKGN DFDDDDDILG SNESGTAEKP NSFAKTLTQS 120

DANNGGGFSV PRYCAETIFP RLDYTADPPV QTVTAKDVHG ESWKFRHIYR GTPRRHLLTT 180

GWSSFVNQKK LVAGDSIVFL RAENGELCVG IRRAKRGGIG GPEAPSGWNS GAGNYGGFSA 240

FLREEMSKNG NLTSPTRSLR GKGRVRPESV VEAAHLASSG QPFEVVYYPR ANTPEFCVRA 300

SSVNAAMRIQ WCSGMRFKMA FETEDSSRIS WFMGTISSIQ LADPIRWPNS PWRLLQVAWD 360

EPDLLQNVKH VSPWLVELVS NMPVIHLSPF SPPRKKLRLP PDFSLDSQFQ LPSFSGNPLR 420

SSSPFCCLSD NITAGIQGAR HAQFGVPLLD LHPSNKLPSG LLPPSFQRVA ANSQLPNVIN 480

KCQNDRNDNI SCLLTMGTSS KTLDKNDSVN TPRFLLFGQP ILTEQQISNG CSVSAPQVVQ 540

TGKDLGRIQP INEKHPSEQK GSIQDNLSSA TFFWNRGYHA AELGVLNTGH CKVFLESEDV 600

GRTLDLSVMG SYEELYKRLA NMFGLERPDM LTRVLYHDAT GAVKHTGDEP FSDFVKSAKR 660

LTILMNSSSN IKRKWLTGLA TAERGLDSSN QAGPLSIFA 699

<210> 4

<211> 2486

<212> DNA

<213> 番茄（Micro Tom）

<400> 4

caatttacat atacaacaca tgcctcattt atagagttaa agaaaaaact caaactaatt 60

cacgtctaat ttaaaattta ttattttttt ctcaattaaa caaatattcc gtattaggaa 120

aaaaaagtat gatatacaat aaaacctcta taaattaata aaggnnggan cangaaattt 180

tattatttta tananatatt ntttaattga taatttagta tttattaatt aaaaaataat 240

ttgaaattta gtgaaggtta gttttagata tatcaaaatc attatatctt attaatttat 300

gtatcatatt tattgatttc acattttttt aaaagtgtac ataaagtaca acgaatacat 360

caaaatcatt gtatcttact aactccaacc tcgtgatgtt gggataataa gaactttcaa 420

gatgtattat cgaacatatt ttatttagga tattagaaga ttatgaagtg ggagaaacta 480

atcctagaaa gattattggt ttggttgcta ttgattttgc aatccctgtt tgtataacaa 540

atatatctaa agacgatagg aagttatttt cgatattata taattcattt gggatgtaat 600

ctcaaagaat ttaaatgaat ctacttgtga aaatgttatt catgaacttg aggttattga 660

cgaataatat cgaatactaa aataaaatgg atgtcaatta tccgggtgaa agtgatacat 720

gttcagaggt ccagagctta aaagaaattg cgaatatcat cggaaaaatc aatgttaatg 780

atgaagttgg agatgatact atatcttggg anccaattac gcataaggaa acacttatcg 840

catttagggc tcttcacgtt ttatggtgca attnggaaag acaacactac agctcttgga 900

tgcaataaaa acagttagag atgagcttca actacattta aattttaaga gaaaacagaa 960

cactataana tcgcatttca ctaaattatc ttaaatatag tttgtacttt taaagaatta 1020

ttaatttatc atattagcaa gaccatatat ttatataagg gtcttctgaa aatanannna 1080

cntattatct tatcaaaatt gaatgatttt ttccattgat caaagtcgga attggaagaa 1140

aatattatnn nnnaaanann attantttat cgaatattaa tttacaaaag ttttactata 1200

atctgattat tttaaatttt acgatccaaa tttataatct atatatcaca cgaagataaa 1260

gacattaata tatatatgta tcgaaaattg gttatgccga aaaccatgtc gtttcttctg 1320

atgtctcatc ttaaaattaa cttgctatac ttggcagtat aataagtact acgtcttcta 1380

gtagtgaagt tcacattttt tttattttgt cgccaagcaa aacggcaccg gcgacggaga 1440

cggcgacggt aacggtgact gatgagttaa aggagtgaga ttgtactgcc ggattgtgag 1500

aactaactag tgtatattcc gtcaactaat aacgccggcc gaccggcgat tcatttactg 1560

atctcgtact tgtagaggat gttgctaacg tcattaactt gcaacgatcc aagtttccgg 1620

tgttgttttg tgtgaatcat ctcgttttgg cttcgatcgg agaagaaact gtacggatat 1680

tgacattcac tttaatgcat ttatgttaaa tatatatagg tagtactcgc tctgtaaatg 1740

tgnttttttg aagctgaaaa gcctgtaatc ggaagttttt ctttcgactt ttttcttttt 1800

gcggatattg attgattgat ataagtagaa agaaggaagt cagaagctac tgctttccgt 1860

tttaggattt gattgaagag gagagtattg atgattagtt tttttttttc aatttttgag 1920

gtttaatatc agttttcata atcggaaatt ttcagtttca ttttgaaaat cggtactaat 1980

cttcatcaga tccatatttt gcttgcctgt aaatgtgttt cactattagt ttttctgttc 2040

tctgaaccta ttaataggat ttttttggtt gaaatttcta gtttctgtgc tttttatcct 2100

catttctgga ccttttgatt gaacttgttg agcgtagttt tctccattgt tgttcagctt 2160

caaaaatagt gtatatttgg tgaatcggtc aacgatttcg gagagtctga gcaagatgga 2220

tttgctctgc tgcttgtaat tgttgttgaa atttactggt ttttgacttt ttgtagttat 2280

tttctaattt tttttgtacc ttctacttgt atatcttgtc taaatttatt ggtttctgca 2340

cgtgttttct cattattgga tctttttact ttgaatttat tactgaaatt tgtttcattt 2400

gtggtacaca gcttttaagc ttttctggaa ttgctgttct gtaattgttt tcaactaagg 2460

agaaggggaa aaactattgg attagc 2486

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caatttacat atacaacaca tgcctca 27

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctaatccaa tagtttttcc ccttc 25

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccaagtccaa gaaatgaaat tg 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gttgccaatt ggtattgatg g 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcggcggtgc ctggctccct gg 22

<210> 10

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtgcagggtc cgaggt 16

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgtccctatt tacgagggtt atgc 24

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agttaaatca cgaccagcaa gat 23

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggtccagcag tcctttctgt tg 22

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ctgcaacgcg ctggaaact 19

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

taagattagg gttgtcccag ttgg 24

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gtcagccgtg taatccaacc t 21

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ttggattaca cggctgacat ctacccgctt c 31

<210> 18

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ttggattaca cggctgacta atcgcctgta ag 32

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

attctctgtg cctagatact g 21

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ctataaatgt gcctaaactt cca 23

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

atgaaggagg ttttggagaa gtgtg 25

<210> 22

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ctagatccag atcaagtgca aagatgctaa gaggtcctgc c 41

<210> 23

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ttaagcgaaa cccaaacgga gttctagatc cagatcaag 39

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tcgtaaggag tgccctaatg ctga 24

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

caatcgcctc cagccttgtt gtaa 24

<210> 26

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cacctcggtt cttactcttc ggtcag 26

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ctcgtcgact taagcgaaac 20

Claims

1.调控番茄侧芽发育的SlmiR160b，其特征在于，所述SlmiR160b的前体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.调控番茄侧芽发育的SlARF10基因，其特征在于，所述SlARF10基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求2所述调控番茄侧芽发育的SlARF10基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述的SlmiR160b的前体核苷酸序列。

5.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求2所述的SlARF10的核苷酸序列经嵌合抑制子SRDX形成的融合片段SlARF10-SRDX。

6.一种包含权利要求4或5所述重组表达载体的植物细胞系或植物转化体。

7.如权利要求1或2所述遗传因子在促进植物侧芽发育中的应用。

8.一种提高植物侧芽发育的方法，其特征在于，包括以下步骤：构建如权利要求4或5所述的重组表达载体，并将其转入植物中，使SlmiR160b编码基因或SlARF10-SRDX融合基因过表达，即得到侧芽发育提高的植物。

9.根据权利要求8所述提高植物侧芽发育的方法，其特征在于，所述植物为草本植物。

10.根据权利要求9所述提高植物侧芽发育的方法，其特征在于，所述草本植物为拟南芥、番茄或烟草。