CN104762314A - 可删除筛选标记基因的植物表达载体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及可删除筛选标记基因的植物表达载体及其用途。本发明要解决的技术问题是获得无选择标记转基因柑橘的周期长、工作量大。本发明提供了可删除筛选标记基因的植物表达载体，该载体包括目标基因表达元件和Cre/Loxp系统；所述Cre/Loxp系统为在2个loxP位点间构建ipt基因表达原件和Cre重组酶表达原件。本发明还提供了快速获得无选择标记转基因柑橘的方法，包括遗传转化和嫁接2个步骤。本发明植物表达载体可用于转基因植物的获得，并能快速有效的删除筛选标记基因。本发明方法可用于多年生木本植物，快速获得无筛选标记的转基因植株。

Description

可删除筛选标记基因的植物表达载体及其用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及可删除筛选标记基因的植物表达载体及其用途。

背景技术

目前柑橘遗传转化通常用的载体一般含有筛选标记基因，如报告基因gus，抗Kan，抗除草剂Bar等筛选标记基因，这些基因对生物安全性构成严重威胁。其存在的不足是：再生率低，再生时间长，不定芽成活率低，加有报告基因，进入田间抗性分析时间长等。如Kan作为柑橘遗传转化中常用的筛选标记基因，但由于再生芽上残存的农杆菌与邻近的阳性转化细胞提供的抗性。Kan并不能完全抑制非阳性芽的生长，尤其是多年生木本植物Kan筛选率更低，如通过根癌农杆菌介导Cry1Ac基因转化‘雪青’梨，从转化抗性再生芽中仅获得约10％的PCR阳性芽；双如冰糖橙转化后获得Kan抗性芽有105个，经GUS染色，阳性芽为24个，进一步PCR检测仅得到15株阳性芽，约14％PCR阳性芽；纽荷尔脐橙外植体转化后获得Kan抗性芽13个，PCR检测抗性芽仅2株为阳性；红江橙转化后获得12株Kan抗性芽，经GUS染色，阳性芽仅2株；且最终都要通过对大量转化再生芽进行PCR检测，才能初步获得转基因阳性植株。

目前，即无Kan筛选基因，也无报告基因如GUS等新型转基因载体以获得无选择标记基因转基因材料成为基因工程育种的趋势，因此，利用这类植物表达载体进行柑橘遗传转化，如在Cre/Loxp系统删除作用下不仅获得目的功能基因的转基因植株，还避开抗生素、抗除草剂等标记基因对生物学安全性影响的风险，为转基因血橙将来进行安全性评价提供分子证据，使之快速进入生产应用提供有利保障。

目前，通过转座途径、染色体内同源重组、目标基因与标记基因共转化、位点专一性重组等措施来剔除标记基因，最通用最广泛的是位点专一重组途径，首先构建含有位点专一重组系统Cre/LoxP的标记基因删除植物表达载体，通过根癌农杆菌介导法将删除系统整合到柑橘基因组中，随后诱导表达控制重组系统Cre基因表达来删除筛选标记基因，最终获得只含外源目的功能基因的无标记转基因柑橘再生芽。

现有的删除转基因柑橘中筛选标记基因的操作如下：

首先采用1个结合化学诱导系统XVE和位点专一性重组系统Cre/LoxP的标记基因删除载体，通过农杆菌介导法对柑橘上胚轴茎段进行无选择标记遗传转化，对侵染后茎段接种在MS+3mg/L6-BA培养基上，共培养3天后转移到筛选培养基(MS+75mg/L卡那霉素+500mg/L头孢霉素)中，筛选培养21天后可观察到抗性芽萌发，切下带1～2mm外植体的抗性芽，转移至含有雌二醇的化学诱导培养基(MS+3mg/L6-BA+500mg/L头孢霉素+2μmol/L雌二醇)上诱导，15d后用荧光显微镜观察，成功观测到绿色荧光.继续诱导培养30天后，进行试管嫁接，30天后，提取接穗基因组DNA进行PCR扩增，检测到DNA的切除现象，获得无选择标记转基因植株。目前对这种再生芽继续培养成植株的方法通常是采用茎尖试管嫁接获得再生植株，详细步骤如下：以14天试管无菌实生苗为嫁接砧木，嫁接时，将无菌砧木苗切去下胚轴端部保留约4～6cm长，切去上胚轴顶部留约2～4cm长，顶端劈口。切取再生生长了45天长约0.3～0.5cm的再生芽，基部斜切，插入砧木的劈口处，对齐形成层。置于包含滤纸桥的液体嫁接培养基中培养，30天后嫁接苗伸长约2cm时，称取100mg叶片(大约一片叶)常规法微量提取DNA，进行PCR检测后才能嫁接至温室中进行后期转基因安全性评价。

采用上述方法存在以下缺陷：

缺陷1：再生培养基中需要添加75mg/L kan，诱导培养中需要添加2μmol/L雌二醇，这些外源化学物质的添加影响了再生芽的萌发及生长，从上胚轴茎段农杆菌侵染后，需要21天才能萌芽，这些芽转入添加2μmol/L雌二醇的诱导培养基中，诱导培养45天后，总共要花66天后再生芽才能进行试管嫁接，从而延缓转基因再生苗的获得。

缺陷2：再生芽嫁接成苗生长过程中需多次对砧木抹芽，工作量大，且容易污染时，从而延缓转基因再生苗的获得。而且茎尖嫁接操作复杂：嫁接3天后，从砧木切口处会长出很多再生芽，与接穗芽愈合生长产生竞争，如果不及时抹去从砧木上长出的再生芽，接穗芽一般竞争不过从砧木上长出的再生芽，几天后接穗芽就会萎黄枯死，而且，抹过一次的砧木再生芽还会继续萌发二，三，四次至多次再生芽，需要反复抹3～4次砧木芽，直至接穗芽长出3～4片叶(约2cm)可用于PCR检测，当面对几百上千个转化再生芽时需要进行茎尖嫁接，其工作量大，操作复杂，且容易污染。

发明内容

本发明要解决的技术问题是获得无选择标记转基因柑橘的周期长、工作量大。

本发明提供了可删除筛选标记基因的植物表达载体，载体包括Cre/Loxp系统；该Cre/Loxp系统为在2个loxP位点间构建ipt基因表达元件和Cre重组酶表达元件。

优选的，所述的载体还包括目标基因表达元件，该表达元件从5’至3’方向依次包括启动子、目标基因和终止子。

具体的，所述ipt基因具有如SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。

优选的，Cre重组酶的编码基因中加入了枳早期结瘤素样基因PtBCP1的内含子，具有如SEQ ID No.2所述的核苷酸序列。

具体的，所述的Cre/Loxp系统具有如SEQ ID No.3所述的核苷酸序列。

本发明还提供了含有所述植物表达载体的宿主细胞。

具体的，所述的宿主细胞为农杆菌。

本发明还提供了所述植物表达载体在获得无筛选标记基因的转基因植物中的用途。

本发明还提供了所述宿主细胞在获得无筛选标记基因的转基因植物中的用途。

本发明还提供了快速获得无选择标记转基因柑橘的方法，包括如下步骤：

a、遗传转化：将构建好的可删除标记基因的植物表达载体转化农杆菌，采用农杆菌介导法对1cm～1.5cm柑橘上胚轴茎段进行侵染，侵染后茎段接种在MS+2mg/L BA+0.5mg/LIAA+1mg/L 2,4-D+0.1mmol/L AS共培养基上，共培养2～3天后转移到含500mg/L Carb的MS再生培养基中继续培养；

b、嫁接：在MS培养基中培养10～20天后可观察到再生芽的萌发，25～35天后再生芽可长至0.5～1cm，进行试管茎尖嫁接，嫁接苗继续培养10～20天后可长至2cm，提取嫁接苗叶片DNA，进行PCR检测，获得无选择标记转基因植株。

具体的，步骤b中所述的试管茎尖嫁接操作如下：将封口用的石蜡带封口膜切成0.1～0.2cm宽、拉成2～3cm长的带状，于纯酒精中浸泡过夜，嫁接前，从酒精中捞出平铺在灭菌培养皿于超净台上吹干酒精备用；把再生芽插入砧木的劈口处后，用准备好的石蜡带将砧木切口与接芽接处的地方包缠2圈，继续置于试管MS培养基上培养。

本发明中，BA即6-苄基腺嘌呤；IAA即3-吲哚乙酸；2,4-D即2,4-二氯苯氧乙酸；AS即乙酰丁香酮。

本发明中，Cre/Loxp系统是在大肠杆菌噬菌体P1中发现的位点特异性重组系统，由Cre重组酶和loxP位点2部分组成，Cre重组酶是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，loxP是一种典型的回文序列结构，长34bp，由2个13bp的反向重复序列和8bp的非对称间隔序列构成，Cre重组酶可不借助任何辅助因子专一性地识别loxP位点，使loxP位点间的基因序列被删除或重组，基工作原理简述如下：Cre重组酶先和DNA结合，但开始结合力较弱，当遇到loxP位点时结合力大大增强。其C-末端保守的酪氨酸(Tyr-324)与DNA分子的3′-PO4共价结合形成3′-磷酸酪氨酸，导致DNA链的切割，切割后产生的5′-OH既可与同一断裂部位的3′-PO4结合恢复为原来的构型，也可与另一切割部位的3′-PO4结合，发生链的交换，形成一个名为“Holliday结构”的中间产物，继而产生结构的异构化，这时第一次切割的2个Cre酶不再起切割作用，而是由另外2个Cre酶进行第二次链的切割和交换，去掉中间产物发生重组。

由35S启动子调控的ipt基因插入到loxP位点(含有Cre重组酶基因)之间，含上述片段的外源T-DNA经农杆菌介导法整合到植物(柑橘等)基因组中，ipt基因表达促使转化细胞成优势生长，当Cre重组酶基因在转化细胞中表达，形成的Cre重组酶专一性地识别loxP位点，从而使loxP位点间的ipt基因序列被删除。最终获得无筛选标记基因ipt，只含目的基因的转基因植物(柑橘等)。

本发明中，利用无毒副作用来源于农杆菌的ipt基因选择性抑制非转化细胞，促使转化细胞处于优势生长，ipt基因编码异戊烯基转移酶(isopentenyl transferase)，该酶是细胞分裂素生物合成步骤中的一个关键限速酶，它促使5’-AMP和异戊烯基焦磷酸合成异戊烯基-5’腺苷磷酸，这是所有细胞分裂素合成的前体，细胞分裂素促进植物组织的分化和生长，是诱导植物不定芽分化的关键激素。研究表明，使用ipt基因作为选择标记基因，可以使转基因组织能在没有细胞分裂素的培养基上完成分化，当植物组织表达外源ipt基因时，不定芽的诱导频率得到了提高，促进了不定芽再生能力，从而提高了遗传转化效率。采用ipt基因进行筛选，培养基中无需添加Kan(卡那霉素)及雌二醇等外源化学物质，只在Cre/Loxp系统删除作用下，就能获得无选择标记转基因再生芽(只含需要的功能基因)。

本发明中，Cre/Loxp系统的Cre编码基因(如SEQ ID No.2所示，其中433bp～886bp为PtBCP1基因的内含子序列)中加入了枳(柑橘)早期结瘤素样基因PtBCP1的内含子，以干扰Cre基因在细菌中的自动表达，避免ipt基因在细菌中被删除，以此为植物表达载体的遗传转化受体材料只要是植物就能满足改造后的含有内含子的Cre基因得到正常表达。

本发明中，通过包緾石蜡带法不需要抹芽(现有技术中，每株试管嫁接苗对砧木抹芽平均需3次以上，当面对1千株嫁接试管苗，可以减少抹芽工作达3000次以上)，可降低工作量。且采用本发明方法，嫁接苗培养10天后就能长出3～4片叶，而现有嫁接技术需要培养30天后才能长出3～4片叶。

本发明的有益效果：本发明植物表达载体可用于转基因植物的获得，并能快速有效的删除筛选标记基因，有助于提高转基因植物的安全性；同时使用该载体进行遗传转化时安全性高，周期短。本发明从利用无选择标记转化载体转化柑橘上胚轴、再生芽快速成苗进行优化，由原来平均获得再生芽需要66天以上缩短至30天就能获得再生芽。嫁接过程无需抹芽，嫁接苗培养10天后就能长出3～4片叶。采用本发明方法，从遗传转化到获得转基因试管嫁接苗，只需要大约45天，而现有技术需要96天，缩短了近1倍时间。形成了一套适用于柑橘基因工程育种高通量快速早期获得转基因植株方法，可作为其它多年生、难以获得无筛选标记转基因材料的木本植物(例如果树类)提供规模化实用化技术借鉴。

附图说明

图1表达载体图

loxP:Cre重组酶识别位点；nos:胭脂碱合成酶基因的终止子；nosP:胭脂碱合成酶基因的启动子；mCre：Cre重组酶基因；T3A:T3A转录终止子；ipt:异戊烯基转移酶基因；35S：花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子；LB:T-DNA左边界；RB:T-DNA右边界；CB:抗菌肽CecropinB基因

图2再生芽

图3再生芽

图4茎尖嫁接苗

图5 pLIC载体构建流程

图6 pLICaMV35S::CB载体的构建流程

图7 PCR检测电泳图，M：DNA marker；CK-:野生型对照；1～22：转化再生植株；CK+：阳性质粒；其中泳道“4”，“13”，“20”为PCR阳性。

具体实施方式

实施例 无选择标记转35S启动子调控CB抗菌肽基因血橙的快速获得

为获得无选择标记转基因血橙，利用植物表达载体pLICaMV35S::CB，以血橙上胚轴为转化受体材料，采用试管内微芽嫁接快速成苗，经PCR检测，获得转基因血橙阳性植株，为抗病基因工程育种创造柑橘新种质。

本实施例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售,材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。

具体实验操作步骤如下：

1 pLICaMV35S::CB载体的构建

各载体构建流程见图5、图6，包括中间载体的构建过程，其中pGEM和pMD中间载体分别购自Promega公司、Takara公司，限制性内切酶购自Roche公司，按照使用说明书操作。具体操作步骤如下：

1.1 pLIC载体的构建

首先人工合成loxP-ipt-mCre-loxP序列，其序列如SEQ ID No.3所示，1～34bp、3841～3874bp为loxP位点序列；35～570bp为35S启动子；571～1293bp为ipt基因；1294～1763bp为T3A终止子；1764～2100bp为nos启动子；2101～3586bp为mCre基因；3587～3840bp为nos终止子。在loxP-ipt-mCre-loxP两端引入Xba Ⅰ和HindⅢ位点，在该序列中，正向筛选标记基因ipt由35S启动子控制，重组酶基因mCre由nosP启动子控制，上述两个基因均置于loxP识别位点之间(图5pGEM-loxP-ipt-cre-lox载体所示)。然后用Nhe Ⅰ/HindⅢ酶切PBIN19(GenBank No.U09365.1)，用Spe Ⅰ/HindⅢ酶切pGEM-loxP-ipt-cre-lox载体，形成具有多克隆位点的pLIC载体(图5)。

1.2 pLICB载体的构建

用BamH Ⅰ/Sal Ⅰ分别酶切pLIC、pMD-CB质粒，回收获得的CB基因片段(其序列如SEQ ID No.4所示)插入到pLIC相应酶切位点上，构建成pLICB载体(载体结构如图6)。

1.3 pLICaMV35S::CB载体的构建

用Hind Ⅲ/BamH Ⅰ酶切pMD-CaMV35S，回收获得的35S启动子片段(其序列如SEQ IDNo.5所示)插入pLICB相应酶切位点上，最终构成pLICaMV35S::CB植物表达载体(载体结构如图6)。

2遗传转化

采用根癌农杆菌介导的方法进行柑桔的遗传转化，即用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌EHA105。参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将构建的载体pLICaMV35S::CB通过电激转化法导入农杆菌EHA105。将上述的表达载体通过农杆菌介导上胚轴的方法导入血橙，其中用到的培养基见表1。

表1根癌农杆菌介导的柑桔遗传转化用培养基

上表中MS：Murashige&Skoog,1962；Sucrose：蔗糖；Gelrite：琼脂(Sigma,货号:G1910)；BA：6-苄基腺嘌呤；IAA：3-吲哚乙酸；2,4-D：2,4-二氯苯氧乙酸；AS：乙酰丁香酮；Carb：羧苄青霉素。

具体实验操作方法如下：

2.1血橙实生苗上胚轴的获得

取新鲜血橙洗净，用70％酒精表面消毒，在无菌的条件下取出种子，剥掉种皮，在MS固体培养基上发芽。两周后，血橙幼苗见光培养7d，取幼苗上胚轴切成1～2cm左右的茎段，用于农杆菌介导的遗传转化。

2.2农杆菌菌液的活化与工程菌液的制备

从-70℃超低温冰箱中取出所构建pLICaMV35S::CB载体冻存的菌液，挑取少量菌液，在YEB+100mg/L kan的固体培养基上划线，然后28℃的恒温培养箱中倒置暗培2d；待长出单菌落后，挑取单菌落于YEB+100mg/L kan液体培养基中，28℃振荡培养过夜；第二天，把过夜培养的农杆菌稀释于新鲜的含有kan的YEB液体培养基，震荡培养3～4h后，待菌液的OD₆₀₀达到0.5左右时，于5000r/min离心10min，弃上清，将农杆菌沉淀溶解于ph为5.4的MS液体培养基中用于转染。

2.3血橙上胚轴茎段的转化

将已切成1cm左右的血橙上胚轴茎段在制备好的农杆菌中浸泡10～12min，然后用无菌的滤纸将上胚轴表面的菌液吸干；将外植体转移到MS+2mg/L BA+0.5mg/L IAA+1mg/L2,4-D+0.1mmol/L AS共培养基中26℃暗培养；2d后，将上胚轴转移到加500mg/L carb的MS再生培养基中28℃暗培养，7d后将外植体于28℃见光培养，每两周继代一次。待再生芽(图2和图3)长到0.5cm左右时，将带芽外植体转移到加250mg/L carb(氨苄青霉素)的MS培养基中进行培养。

3再生芽嫁接

待再生芽长到1cm以上时，将其嫁接到血橙实生苗上，具体操作步骤如下：将实验室封口用的封口膜切成0.1～0.2cm宽、拉成2～3cm长的带状，于纯酒精中浸泡过夜，嫁接前，从酒精中捞出平铺在灭菌培养皿于超净台上吹干酒精备用；以14天试管血橙无菌实生苗为嫁接砧木，嫁接时，将无菌砧木苗切去下胚轴端部保留约4～6cm长，切去上胚轴顶部留约2～4cm长，顶端劈口；切取再生生长了的再生芽，基部斜切，插入砧木的劈口处，对齐形成层，用准备好的石蜡带将砧木切口与接芽接处的地方包缠2圈，继续置于试管MS培养基中进行培养；待嫁接苗长出2～3片叶时，提取叶片DNA用于PCR检测。

4 PCR检测

按照植物基因组DNA快速提取试剂盒DN15(北京艾德来生物科技有限公司)说明书提取试管嫁接苗(图4)叶片DNA，在NCBI上的在线软件primer BLast设计CB抗菌肽基因PCR引物对35S-5/CB-3(序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示)；PCR反应体系：lμL模板DNA，2.5μL 10xPCR buffer，2μL 25mmol/L MgCl₂，1μL 2.5mmol/L dNTP，20μmol/L 35S-5和CB-3引物各2μL，0.8U rTag DNA聚合酶，加双蒸水至25μL；PCR反应程序：95℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。扩增反应在德国Biometra公司生产的TI Thermocycler型PCR扩增仪上进行，以野生型植株为对照。取5μL PCR产物上样于1％琼脂糖凝胶电泳分离，采用EB染色后，记录及照相(见图7)。PCR检测结果表明，利用本载体进行柑橘遗传转化，再生芽嫁接成活后进行外源基因检测，其PCR检测阳性率达到15％，与用常规含筛选标记基因植物表达载体进行遗传转化的PCR检测阳性率相当(图7)。

Claims (10)

1.可删除筛选标记基因的植物表达载体，其特征在于：该载体包括Cre/Loxp系统；该Cre/Loxp系统为在2个loxP位点间构建ipt基因表达元件和Cre重组酶表达元件。

2.如权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于：所述的载体还包括目标基因表达元件，该表达元件从5’至3’方向依次包括启动子、目标基因和终止子。

3.如权利要求1或2所述的植物表达载体，其特征在于：所述ipt基因具有如SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。

4.如权利要求1～3任一项所述的植物表达载体，其特征在于：Cre重组酶的编码基因中加入了枳早期结瘤素样基因PtBCP1的内含子，具有如SEQ ID No.2所述的核苷酸序列。

5.如权利要求1～4任一项所述的植物表达载体，其特征在于：所述的Cre/Loxp系统具有如SEQ ID No.3所述的核苷酸序列。

6.含有权利要求1～4任一项所述植物表达载体的宿主细胞。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞为农杆菌。

8.权利要求1～5任一项所述植物表达载体或权利要求6～7任一项所述宿主细胞在制备无筛选标记基因的转基因植物中的用途。

9.快速获得无选择标记转基因柑橘的方法，包括如下步骤：

a、遗传转化：将构建好的可删除标记基因的植物表达载体转化农杆菌，采用农杆菌介导法对1～1.5cm柑橘上胚轴茎段进行侵染，侵染后茎段接种在MS+2mg/L BA+0.5mg/LIAA+1mg/L 2,4-D+0.1mmol/L AS共培养基上，共培养2～3天后转移到含500mg/L carb的MS再生培养基中继续培养；

b、嫁接：在MS培养基中培养10～20天后可观察到再生芽的萌发，25～35天后再生芽可长至0.5～1cm，进行试管茎尖嫁接，嫁接苗继续培养10～20天后可长至2cm，提取嫁接苗叶片DNA，进行PCR检测，获得无选择标记转基因植株。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤b中所述的试管茎尖嫁接操作如下：将封口用的石蜡带封口膜切成0.1～0.2cm宽、拉成2～3cm长的带状，于纯酒精中浸泡过夜，嫁接前，从酒精中捞出平铺在灭菌培养皿于超净台上吹干酒精备用；把再生芽插入砧木的劈口处后，用准备好的石蜡带将砧木切口与接芽接处的地方包缠2圈，继续置于MS培养基上培养。