CN108588115A

CN108588115A - 异戊烯转移酶基因作为筛选标记基因在培育转基因拟南芥植株中的应用

Info

Publication number: CN108588115A
Application number: CN201810440441.1A
Authority: CN
Inventors: 翟立红; 腾峰; 杜邓襄; 孙伟; 韩鹏; 肖娟
Original assignee: Hubei University of Arts and Science
Current assignee: Hubei University of Arts and Science
Priority date: 2018-05-09
Filing date: 2018-05-09
Publication date: 2018-09-28

Abstract

本发明公开了异戊烯转移酶基因作为筛选标记基因在培育转基因拟南芥植株中的应用，涉及植物基因工程技术领域。该应用以异戊烯转移酶基因作为筛选标记基因，扩展了拟南芥转基因筛选标记的范围，首次实现了异戊烯转移酶基因ipt在拟南芥遗传转化中的筛选应用，且可使得筛选过程进行可视化，简化了筛选步骤，提高了筛选工作的效率，缩短了筛选周期。

Description

异戊烯转移酶基因作为筛选标记基因在培育转基因拟南芥植株中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体而言，涉及异戊烯转移酶基因作为筛选标记基因在培育转基因拟南芥植株中的应用。

背景技术

在植物的遗传转化过程中，必须经过筛选，才能获得所需要的转化成功的植株。筛选的完成，一般是通过将目的基因与一个选择标记基因连在同一载体上，然后根据选择标记基因表达引起的植株的一些变化来进行的。现在的选择标记基因主要是抗除草剂基因或抗生素抗性基因，这类负选择标记基因存在着诸多的问题，首先其筛选需要有相应筛选试剂的加入，如加入除草剂或相应的抗生素才能完成筛选，这些试剂本身对植物生长是有害的。另外，还存在筛选耗时长，假阳性多等问题。另一方面，在选择标记基因完成筛选过程后，残留在转化株中，会有一些潜在的危害，引发人们对转基因食品安全性的担忧。

选择标记基因在植物遗传转化中扮演着重要的角色，其分类也是多样的。传统的筛选主要是通过负选择标记基因来进行的，例如抗生素抗性基因和抗除草剂基因。通过这些负选择标记基因，转化成功的外植体能够在含有相应抗生素或除草剂的培养基上生长，而未转化成功的外植体由于没有相关的抗性基因则会死亡，从而完成筛选。但是这类负选择标记基因的筛选过程必须有相应的筛选试剂的加入，这些添加物可能对植物生长造成危害。

因此，开发更加高效安全的正选择标记基因及相关体系，成了植物遗传转化的研究热点。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供异戊烯转移酶基因作为筛选标记基因在培育转基因拟南芥植株中的应用。该应用以异戊烯转移酶基因作为筛选标记基因，扩展了拟南芥转基因筛选标记的范围，首次实现了异戊烯转移酶基因ipt在拟南芥遗传转化中的筛选应用，且可使得筛选过程进行可视化，简化了筛选步骤，提高了筛选工作的效率，缩短了筛选周期。

本发明的另一目的在于提供一种用于培育转基因拟南芥植株的载体，该载体以异戊烯转移酶基因作为筛选标记基因。使用该载体进行遗传转化，具有筛选过程可视化，筛选步骤简单，筛选工作效率高，筛选周期短等特点。

本发明是这样实现的：

异戊烯转移酶基因作为筛选标记基因在培育转基因拟南芥植株中的应用，所述异戊烯转移酶基因编码异戊烯基转移酶，所述异戊烯转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

异戊烯转移酶(isopentenyl transferases，ipt)基因，编码异戊烯基转移酶，由Akiyoshi等首先从根癌农杆菌中分离得到，是细胞分裂素合成途径中的关键限速酶。

ipt基因多与组成型启动子连接，虽然明显延缓了叶片的衰老，但是同时也会使得植株矮化丛生，叶片小而圆，顶端优势丧失，根系无法形成，植物异常发育。ipt基因在组成型表达时，引起转化株内细胞分裂素水平的提高，可以延缓叶片的衰老，利用这一特性，ipt基因被广泛的应用在延缓作物叶片衰老的研究中。Gan等利用SAG12的启动子与ipt基因形成PSAG12-ipt融合基因来转化植株，发现叶片衰老明显延缓，花数和生物量也有所增加。该系统最大优点在于，SAG12启动子会随衰老程度自动调节ipt基因表达，有效的控制了CK不断积累对植物生长的影响。目前，该系统在很多植物中均获得了较好的效果，如烟草、水稻、番茄、青菜、小麦、矮牵牛,都获得了延缓叶片衰老正常生长的转基因植株。

研究发现，拟南芥的根在不同细胞分裂素(CK)浓度下根生长分化情况不同。实验结果表明拟南芥的根只有在含有细胞分裂素的培养基CIM上生长7天后再转至含有生长素的培养基SIM上生长，才会分化为形态正常的芽。转至SIM上培养，在短暂的时间内就可以观察到分化出的芽。因此，当ipt基因在植物细胞中过量表达时，能显著提高细胞分裂素的含量。利用其这一特性，本发明将ipt基因做筛选标记，将拟南芥根于CIM上培养7d，然后农杆菌转化根后继续在CIM上培养。转化成功的拟南芥根由于ipt基因表达，细胞内CK浓度升高，根上愈伤分化状态会和在高浓度CK培养基SIM上愈伤分化情况相似，正常分化为芽。而转化不成功的，一直保持愈伤状态。

根据这一原理，在拟南芥遗传转化的过程中，可以是否出芽作为可视化的选择筛选标记，选择并培养诱导分化出的芽，即可得到转基因拟南芥植株。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述异戊烯转移酶基因的碱基序列如SEQID NO.2所示。

对合成CK起到主要作用的物质是异戊烯转移酶，而根据密码子的简并性，编码出异戊烯转移酶的碱基序列有多种，本领域技术人员根据SEQ ID NO.2所示的异戊烯转移酶基因序列可以设计出多种可编码异戊烯转移酶的序列，其均可以作为筛选标记基因，均属于本发明的保护范围。

SEQ ID NO.2所示的异戊烯转移酶基因克隆自玉米自交系X14I(由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室提供)。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述应用包括：

将经农杆菌侵染后的外植体置于愈伤组织诱导培养基上进行分化培养，以诱导出愈伤组织且分化出芽；所述外植体为拟南芥的根；

选取并培养所述芽，得到转基因拟南芥植株；

其中，所述农杆菌含有载体，所述载体含有第一筛选标记基因，所述第一筛选标记基因为所述异戊烯转移酶基因。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述愈伤组织诱导培养基含有：4-5g/LMS、19-21g/L葡萄糖、0.4-0.6mg/L 2,4-D以及0.04-0.06mg/L KT。

愈伤组织诱导培养基的细胞分裂素浓度对是否能够诱导愈伤组织分化出芽具有重要影响。过高的细胞分裂素浓度不能起到筛选的作用，容易导致所有的愈伤组织出芽，而过低的细胞分裂素浓度又不足以是外植体即拟南芥的根诱导出愈伤组织。将2,4-D和KT的浓度控制在0.4-0.6mg/L和0.04-0.06mg/L可以较好地实现筛选目的。也可以使外植体诱导分化出愈伤组织，并使成功转化有异戊烯转移酶基因基因的愈伤组织分化出芽。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述分化培养包括：先将外植体置于黑暗条件下培养直至形成愈伤组织，然后转到光照条件下培养16-20d，以诱导分化出芽。

一直在黑暗条件下或一直在光照条件下培养的外植体，均无法分化出芽，只形成愈伤组织，且一直保持愈伤状态。而先将外植体置于黑暗条件下培养直至形成愈伤组织，然后转到光照条件下培养16-20d，可以诱导分化出芽。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述载体还含有第二筛选标记基因，所述第二筛选标记基因为EGFP基因。

通过EGFP基因和ipt基因的融合筛选标记，可同时进行正向的筛选，克服了现有筛选标记假阳性高的缺点，获得了100％的转基因植株阳性率，为大范围开展拟南芥转基因工作提供了理论和应用基础。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述载体的骨架为pEGAD载体。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述第一筛选标记基因插入在所述pEGAD载体的EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点之间。

一种用于培育转基因拟南芥植株的载体，该载体含有筛选标记基因，所述载体为异戊烯转移酶基因，所述异戊烯转移酶基因编码异戊烯基转移酶，所述异戊烯转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述载体还含有EGFP基因。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述载体的骨架为pEGAD载体，异戊烯转移酶基因插入在所述pEGAD载体的EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点之间。

本发明具有以下有益效果：

本发明将异戊烯转移酶基因作为筛选标记基因在培育转基因拟南芥植株中的应用，首次实现了异戊烯转移酶基因在拟南芥遗传转化中的筛选应用，结合精确筛选和转化细胞快速扩繁能力，可以快速、准确地分离转化细胞，提高筛选效率，最终获得最大的转化效率和最多的转化愈伤组织得率；

此外，以异戊烯转移酶基因作为筛选标记基因，可以进行可视化的筛选，简化了筛选步骤，提高了筛选工作的效率，缩短了筛选周期。在常规转化流程的基础上，可准确地分离转化细胞，提高筛选效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为转基因载体pEGAD-ipt的结构示意图构建；图中：a：转基因载体pEGAD-ipt构建的模式图；使用pEGAD载体为骨架，PCR扩增得到的952bp的产物为目的基因，利用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后连接在pEGAD骨架上CaMV35S启动子和EGFP基因之间，构成转基因载体pEGAD-ipt；b：pEGAD-ipt质粒酶切验证电泳图；M1：DL2000Marker；M2：λ/HindⅢMaker；1：酶切的pEGAD-ipt载体；2：pEGAD空载体；

图2为本发明实施例中的培养7天时愈伤组织表型；图中：a：培养7天后，D1组愈伤组织表型，愈伤组织颜色为淡绿色；b：培养7天后，D2组愈伤组织表型，愈伤组织颜色为白色；c：培养7天后，D3组愈伤组织表型，大部分愈伤组织颜色为白色，部分愈伤组织表现为浅绿色；

图3为本发明实施例中的培养18天时愈伤组织表型和荧光表型；图中：a：培养18天后，D1组愈伤组织表型，愈伤组织颜色为淡绿色；b：培养18天后，D2组愈伤组织表型，愈伤组织颜色为白色；c：培养18天后，D3组愈伤组织表型，大部分愈伤组织颜色为白色，部分愈伤组织表现为浅绿色；d：培养18天后，D1组愈伤组织在倒置荧光显微镜下观察不到绿色荧光；e：培养18天后，D2组愈伤组织在倒置荧光显微镜下观察不到绿色荧光；f：培养18天后，D3组愈伤组织中绿色部位在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光，而白色愈伤组织在倒置荧光显微镜下观察不到绿色荧光；

图4为本发明实施例3提供的转化异戊烯转移酶基因拟南芥植株叶片DNA的PCR检测电泳图；图中：M：DL2000Marker；1：阳性对照；2：表达载体质粒为底物扩增带；3：阴性对照。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

构建转基因载体pEGAD-ipt

步骤如下：

1根据玉米参考基因组中的异戊烯转移酶iptII基因(SEQ ID NO.1)的序列设计PCR引物ipt2-F：5'-CTGAATTCGAGCACGGTGCCGTCGCC-3'和ipt2-R：5'-CGAAGCTTATGCATCAGCCACGGCGGTG-3'。

2以玉米自交系X14I(由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室提供)的DNA为模板，利用高保真酶扩增出iptII基因片段。PCR体系为：

2×buffer	25μl
		2mM dNTPs	10μl
引物：ipt2-F(10μM)	2μl
		引物：ipt2-R(10μM)	2μl
DNA模板：X41I	2.5ng
		KODFX	1μl

3将上述PCR体系按照以下程序进行扩增：①94℃预变性4min；②94℃变性30s；③60℃退火30s；④72℃延伸1min，重复步骤②～④35次；⑤72℃延伸5min，当扩增完毕后，取5μl扩增产物使用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

4PCR产物进行测序。

测序结果正确，进行后续步骤。

5iptII基因TA克隆：

使用琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒回收得到iptII基因片段，使用TOYOBO公司的TArget CloneTM-Plus-试剂盒，配制20μl连接体系(灭菌蒸馏水，(3-x)μl；2×LigationBuffer，5μl；pTA2Vector(50ng/μl)，1μl；PCR产物(克隆的对象)，xμl；T4DNA Ligase；1μl)将iptII插入到pTA2Vector上。

6使用热激法将连接得到的pTA2质粒转入大肠杆菌：

①将感受态细胞100μl于冰浴中融解。

②加入10μl连接液，轻轻混匀后置于冰浴30分钟。

③42℃，45秒热休克后，冰浴冷却2分钟。

④加SOC培养基900μl，于37℃振动培养1小时。

⑤取适量涂于LB/AP/IPTG/X-gal板上，于37℃过夜培养。通过蓝白判定挑出白色重组菌落。

7将iptII基因插入pEGAD载体EcoRⅠ和HindⅢ位点之间，构建转基因载体pEGAD-ipt：

①配制双酶切体系(10×buffer(两种酶共用buffer)，10μl；限制性内切酶EcoRⅠ，3μl；限制性内切酶HindⅢ，3μl；质粒DNA，5～10μg；ddH2O Up to 100μL)进行酶切处理。

②配制连接体系(载体pEGAD，50～100ng；待插入片段iptII，约载体摩尔数的3倍；10×Ligation Buffer，2μl；T4DNA ligase，0.2～0.5μl；ddH2O，Up to 20μl)于16℃温育4～16小时。

新型转基因载体pEGAD-ipt的结构如图1a所示，CaMV35S启动子的控制下的绿色荧光蛋白基因EGFP和异戊烯转移酶iptII的融合基因作为选择标记。

8对载体pEGAD-ipt用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定。图1b所示的电泳结果表明iptII基因成功整合在pEGAD载体上的目标区域。

实施例2

农杆菌介导的拟南芥转基因，具体步骤如下。

(1)含表达载体农杆菌工程菌的制备：

使用小提中量试剂盒提取pEGAD-ipt的质粒，浓度调至1μg/μl，使用电转化法制备农杆菌EHA105工程菌。挑取单菌落接种于浓度为100μg/ml抗生素Kan和50μg/ml利福平的50ml，LB液体培养液中，28℃，200rpm摇菌培养。

(2)转化受体拟南芥根的获得：

①取一定量的拟南芥种子进行表面灭菌：

a)取拟南芥种子于1.5mlEP管中，加入75％乙醇，缓慢振荡洗涤5～10min。

b)弃去75％乙醇，加入5％次氯酸钠，缓慢振荡洗涤15～20min。

c)弃去次氯酸钠，加入灭菌的ddH₂O清洗种子，1～2min。

d)用ddH₂O清洗种子5次。

e)清洗完成后，加入ddH₂O，用1ml移液器吸打，使种子在水中均匀悬浮。

f)用1ml移液器吸取种子，打放在GM培养平皿上。

g)向皿中加入一定的ddH₂O，轻轻晃动平皿，使种子在培养基上均匀铺开。

h)吸去多余的水，封好平皿。

②灭菌后的拟南芥种子置于GM培养基(4.3gMS(vitamins)+20g Glucose)上培养4～7天，至种子长成芽。

③然后将拟南芥的芽转至0.5/0.05培养基(4.3gMS(vitamins)+20g Glucose+0.5mg 2,4-D+0.05mg Kinetin)上培养两天。切取拟南芥的根，摆放在0.5/0.05上培养3～5天。

(3)农杆菌介导的遗传转化：

①取10μl转入pEGAD-ipt质粒的EHA105农杆菌于含25μg/ml Kan和50μg/ml Rif抗生素的50mlLB培养液中，28℃摇床培养，至OD600值在0.8～1.2之间。

②将菌液分装于1.5ml EP管中，每管1ml菌液。

③12000rpm离心5min，收集菌体。弃去上清液，加浸染液，振荡混匀菌体。

④取培养好的拟南芥的根，浸入含有菌体的浸染液中，轻轻振荡10～15min。

⑤弃去浸染液，浸染拟南芥的根。浸染10min后，用滤纸吸干浸染液。

⑥将拟南芥的根摆放在0.5/0.05培养基上，于19℃暗条件恢复培养2～3d。恢复培养后，将根转至筛选培养基上培养。

实施例3

异戊烯转移酶基因的筛选鉴定，其步骤如下：

(1)转化愈伤组织的筛选：

设置两组个对照组。对照组D1，即未侵染的根摆放在含高浓度CK培养基0.15/5(4.3g/L MS(vitamins)+20g/L葡萄糖+0.15mg/L2,4-D+5mg/L激动素)上培养。对照组D2，即未侵染的根摆放在含极低浓度CK培养基0.5/0.05(4.3g/L MS(vitamins)+20g/L葡萄糖+0.5mg/L 2,4-D+0.05mg/L激动素)上培养。

同时将侵染的根段放置在含有低浓度CK的培养基0.5/0.05(4.3g/L MS(vitamins)+20g/L葡萄糖+0.5mg/L 2,4-D+0.05mg/L激动素)上，作为转化组，即为D3。

培养条件均为26℃光周期14h。期间观察愈伤生长情况，每2d观察一次筛选培养基上根诱导出的愈伤生长情况，同时观察对照组上愈伤组织是否有绿色。

第7d时，结果如图2所示，图中D1根段两端首先出现愈伤组织，颜色为淡绿色(图2a)，D2中愈伤组织生长均匀，且为白色(图2b)。同时在D3上也生长出愈伤组织(图2c)，大部分愈伤组织表现为白色且生长均匀，部分愈伤组织表现出绿色，即为阳性愈伤组织。

18d后，再次对D1、D2和D3中不同愈伤组织进行颜色和荧光观察，得到和7天时相同的结果(图3)。挑取诱导得到的愈伤组织在倒置荧光显微镜下观察，可以发现只能在D3中表现出绿色的愈伤组织部位表现出绿色荧光，而未转化组愈伤组织不论能不能表现出绿色都没有绿色荧光表达，同样的转化组(D3)中表现为白色的愈伤组织也没有荧光(图3d)但是相对于7天时的表型，18天时愈伤组织颜色更显著，对应的愈伤组织状态也更好，可以直接进行分化获得转基因植株。通过愈伤组织表型变化和绿色荧光，双重筛选出转化成功的愈伤组织。

(2)转化频率统计：

每一组侵染360个根，三组转化后根据绿色根段出现的次数统计转化频率分别得到81.2％，78.6％和83.9％的转化频率。

(3)转化植株的再生和分子鉴定：

①转基因植株的再生：

将转化的拟南芥根先在暗条件下诱导出愈伤，转至光下，培养7-10天后挑取出绿色愈伤组织在分化培养基上(4.3g/L MS(vitamins)+20g/L葡萄糖+0.1mg/L NAA+5mg/L激动素)，28℃，16/8h光周期进行分化，得到再生芽转移至生根培养基(4.3g/L MS(vitamins)+20g/L葡萄糖+2mg/L NAA)，28℃，16/8h光周期培养，得到完整植株后进行炼苗移栽，即为转基因拟南芥植株。

②转基因植株的叶片DNA抽提(CTAB法)：

a)将新鲜叶片放入预冷的研钵中，加入液氮研磨成粉末状，转入1.5mlEP管中。

b)加入700μl 65℃预热的CTAB提取缓冲液，混匀后，放入65℃水浴30～60min。

c)取出EP管，冷却至室温。加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，将试管置于摇床上，缓慢摇动30min左右，至有机相由无色变为深绿色为止。

d)5000rpm离心10～15min,吸取上清液至新的EP管。

e)加入两倍体积预冷的无水乙醇，温和的混匀，直至出现白色絮状沉淀。

f)将白色絮状沉淀勾出，用75％乙醇洗涤沉淀2次。

g)室温干燥至乙醇挥发完全，加入30～50μLddH2O溶解，于-20℃保存。

③转基因植株的PCR检测：

设计一对引物ipt-test-F(5'-CGACAGGGAAGTCGAAGCTC-3')和ipt-test-R(5'-CTTATGCATCAGCCACGGCG-3')。

配制20微升PCR反应体系进行PCR反应。

通过PCR检测，以提取出的DNA为模板扩增，电泳图见图4(图中：M：DL2000Marker；1：阳性对照；2：表达载体质粒为底物扩增带；3：阴性对照)。可以清晰的看到扩增出912bp的条带。说明，所构建的表达载体pEGAD-ipt成功转入了拟南芥根部。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北文理学院

<120> 异戊烯转移酶基因作为筛选标记基因在培育转基因拟南芥植株中的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 360

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Pro Ser Arg Ser Thr Val Ser Ile Ser Leu Ile Ser Asn Ser Gln Tyr

1 5 10 15

Ser Glu Phe Glu His Gly Ala Val Ala Gly Lys Pro Lys Val Val Phe

20 25 30

Val Leu Gly Ala Thr Ala Thr Gly Lys Ser Lys Leu Ala Ile Ala Leu

35 40 45

Ala Glu Arg Phe Asn Gly Glu Val Ile Asn Ala Asp Lys Ile Gln Val

50 55 60

His Asp Gly Val Pro Ile Ile Thr Asn Lys Val Thr Glu Glu Glu Gln

65 70 75 80

Gly Gly Val Pro His His Leu Leu Ser Val Arg His Pro Asp Ala Asp

85 90 95

Phe Thr Ala Glu Glu Phe Arg Arg Glu Ala Ala Ser Ala Val Ala Arg

100 105 110

Val Leu Ser Ala Gly Arg Leu Pro Val Val Ala Gly Gly Ser Asn Thr

115 120 125

Tyr Ile Glu Ala Leu Val Glu Gly Asp Gly Ala Ala Phe Arg Ala Ala

130 135 140

His Asp Leu Leu Phe Val Trp Val Asp Ala Glu Gln Glu Leu Leu Glu

145 150 155 160

Trp Tyr Ala Ala Leu Arg Val Asp Glu Met Val Ala Arg Gly Leu Val

165 170 175

Ser Glu Ala Arg Ala Ala Phe Gly Gly Ala Gly Val Asp Tyr Asn His

180 185 190

Gly Val Arg Arg Ala Ile Gly Leu Pro Glu Met His Ala Tyr Leu Val

195 200 205

Ala Glu Arg Glu Gly Val Ala Gly Glu Ala Glu Leu Ala Ala Met Leu

210 215 220

Glu Arg Ala Val Arg Glu Ile Lys Asp Asn Thr Phe Arg Leu Ala Arg

225 230 235 240

Thr Gln Ala Glu Lys Ile Arg Arg Leu Ser Thr Leu Asp Gly Trp Asp

245 250 255

Val Arg Arg Ile Asp Val Thr Pro Val Phe Ala Arg Lys Ala Asp Gly

260 265 270

Thr Glu Cys His Glu Leu Thr Trp Lys Lys Gln Val Trp Glu Pro Cys

275 280 285

Glu Glu Met Val Arg Ala Phe Leu Glu Pro Ser Leu Thr Ala Val Pro

290 295 300

Gly Val Ala Val Thr Glu Glu Gly Asn Ala Gly Val Val Ala Thr Ala

305 310 315 320

Ala Pro Ala Gly Asp Val Val Val Pro Thr Gly Asp Val Val Thr Ala

325 330 335

Val Ala Asp Ala Ala Ser Ser Ile Gly Asn Ser Cys Ser Pro Gly Asp

340 345 350

Pro Leu Val Leu Glu Arg Pro Pro

355 360

<210> 2

<211> 1083

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccctcgaggt cgacggtatc gataagcttg atatcgaatt cccaatactc tgaattcgag 60

cacggtgccg tcgccgggaa gcccaaggtg gtgttcgtgc tcggcgccac agcgacaggg 120

aagtcgaagc tcgccatcgc cctcgccgag cgcttcaacg gtgaggttat caacgctgac 180

aaaatccagg tccacgatgg cgtgcccatc atcacgaaca aggtcacaga ggaagagcag 240

ggcggggtgc cccaccacct gctcagcgtc cgccacccgg acgccgactt cactgcggag 300

gagttccgac gtgaggcggc cagcgccgtg gcccgcgtgc tctcggcggg ccgcctcccc 360

gtcgtggcag gcgggtccaa cacctacatc gaggcactgg tggaaggcga cggcgccgcc 420

ttccgcgcgg cgcacgacct cctcttcgtc tgggtggacg cggagcagga gctgctggag 480

tggtacgccg cgctgcgcgt ggacgagatg gtggcccgcg ggctggtgag cgaggctcgc 540

gcggcgttcg gcggcgccgg ggttgactac aaccatggcg tgcgccgcgc catcggcctg 600

ccggagatgc acgcctacct ggtggcggag cgcgagggcg tcgccgggga ggccgagctc 660

gcggccatgc tggaacgcgc ggtgcgcgag atcaaggaca acaccttccg cctcgcgcgc 720

acgcaggcgg agaagatccg gcgcctcagc acgctcgacg gctgggacgt ccgccgcatc 780

gacgtgaccc ccgtgttcgc gcgcaaggcc gatggcactg agtgccacga gctgacttgg 840

aagaagcagg tgtgggagcc gtgcgaggag atggtgaggg ctttcctcga gccgtccctg 900

actgccgttc caggtgttgc agtaactgaa gaagggaacg ccggcgtcgt cgctactgct 960

gcacccgctg gtgatgtcgt cgtcccaact ggcgatgtcg tcaccgccgt ggctgatgca 1020

taagcttcga gtattgggaa ttcctgcagc ccgggggatc cactagttct agagcggccg 1080

cca 1083

Claims

1.异戊烯转移酶基因作为筛选标记基因在培育转基因拟南芥植株中的应用，其特征在于，所述异戊烯转移酶基因编码异戊烯基转移酶，所述异戊烯转移酶的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述异戊烯转移酶基因的碱基序列如SEQID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用包括：

将经农杆菌侵染后的外植体置于愈伤组织诱导培养基上进行组织培养，以诱导出愈伤组织且分化出芽；所述外植体为拟南芥的根；

选取并培养所述芽，得到转基因拟南芥植株；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基含有：4-5g/LMS、19-21g/L葡萄糖、0.4-0.6mg/L 2,4-D以及0.04-0.06mg/L KT。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述载体还含有第二筛选标记基因，所述第二筛选标记基因为EGFP基因。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述载体的骨架为pEGAD载体。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述第一筛选标记基因插入在所述pEGAD载体的EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点之间。

8.一种用于培育转基因拟南芥植株的载体，其特征在于，该载体含有筛选标记基因，所述载体为异戊烯转移酶基因，所述异戊烯转移酶基因编码异戊烯基转移酶，所述异戊烯转移酶的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

9.根据权利要求8所述的载体，其特征在于，所述异戊烯转移酶基因的碱基序列如SEQID NO.2所示。

10.根据权利要求9所述的载体，其特征在于，所述载体还含有EGFP基因。