CN1568141A - Tyra基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物遗传学和生物化学领域。更准确地讲，本发明涉及与生育酚生物合成途径相关的基因。本发明提供并包括与所述生育酚生物合成途径的基因相关的核酸分子、蛋白和抗体。本发明也提供将所述因子用于例如基因分离、基因分析和产生转基因植物的方法。此外，本发明包括经改良以表达与生育酚途径相关的蛋白的转基因植物。另外，本发明包括从所述生育酚生物合成途径产生各种产物的方法。

Description

TYRA基因及其应用
                       发明领域
本发明涉及植物遗传学和生物化学领域。更准确地讲，本发明涉及与生育酚生物合成途径相关的基因。本发明提供并包括与所述生育酚生物合成途径的基因相关的核酸分子、蛋白和抗体。本发明也提供将所述因子用于例如基因分离、基因分析和产生转基因植物的方法。此外，本发明包括经改良以表达与生育酚途径相关的蛋白的转基因植物。另外，本发明包括从所述生育酚生物合成途径产生各种产物的方法。
                       发明背景
生育酚是哺乳动物膳食中的一种基本成分。流行病学证据表明，补充生育酚可使心血管疾病和癌症的危险性降低，可提高免疫功能并且与预防或阻止人类各种各样的变性性疾病过程相关(Traber和Sies，Annu.Rev.Nutr.16：321-347(1996))。生育酚功能部分在于稳定生物膜的脂双层(Skrypin和Kagan，Biochim.Biophys.Acta 815：209(1995)；Kagan，N.Y.Acad.Sci.第121页，(1989)；Gomez-Femandez等，Ann.N.Y.Acad.Sci.第109页(1989))、还原由脂质氧化产生的多不饱和脂肪酸(PUFA)自由基(Fukuzawa等，Lipids 17：511-513(1982))和清除氧自由基、脂质过氧自由基和各种单线态氧(Diplock等Ann.N Y Acad.Sci.570：72(1989)；Fryer，Plant Cell Environ.15(4)：381-392(1992))。
α-生育酚，通常被称为维生素E，属于脂溶性抗氧化剂类，包括α、β、γ和δ-生育酚以及α、β、γ和δ-三烯生育酚。虽然α、β、γ和δ-生育酚以及α、β、γ和δ-三烯生育酚有时被统称为“维生素E”，但是维生素E在化学上更适宜定义为α-生育酚。α-生育酚对于人体健康具有重大意义，部分原因在于α-生育酚容易被机体吸收和保持，并且其生物活性程度比其它种类的生育酚高(Traber和Sies，Annu.Rev.Nutr.16：321-347(1996))。然而，其它生育酚例如β、γ和δ-生育酚也具有重要的健康和营养益处。
生育酚主要仅由植物和包括蓝细菌在内的某些其它光合生物合成。结果，哺乳动物膳食生育酚几乎全部从这些来源中获得。植物组织在总生育酚含量和生育酚组成方面变化相当大，其中α-生育酚是在绿色光合植物组织中存在的主要α-生育酚种类。叶片组织可以含有10-15μg总生育酚/克鲜重，但大多数世界主要粮食作物(例如水稻、玉米、小麦、马铃薯)含有低水平至极低水平的总生育酚，而且仅小部分为α-生育酚(Hess，Vitamin E，α-tocopherol，载于 Antioxidants in Higher Plants，R.Alscher和J.Hess编著，CRC Press，Boca Raton.第111-134页(1993))。油料种子作物一般含有较高水平的总生育酚，但α-生育酚却作为较少组分存在(Taylor和Barnes，Chemy Ind.，Oct.：722-726(1981))。
根据美国平均膳食，建议的15-30mg维生素E的膳食日摄取量相当难以达到。例如，将需要摄入超过750克菠菜叶(在菠菜叶中，α-生育酚占总生育酚的60％)或200-400克大豆油，才满足这种建议的维生素E日摄取量。尽管可以用补充剂强化食品，但是在这些补充剂中大多数主要含有具有6种立体异构体的合成维生素E，而天然维生素E主要仅由一种异构体组成。此外，补充剂往往比较贵，而且普通人在正常状况下不愿意服用维生素类补充剂。因此，本领域需要或者增加总生育酚产生或者增加由植物产生的α-生育酚占大百分比的组合物和方法。
除生育酚的健康益处外，作物中α-生育酚水平增加也与植物产物稳定性增加和贮藏期限延长相关(Peterson，Cereal-Chem.72(1)：21-24(1995)；Ball，Fat-soluble vitamin assays in food analysis.Acomprehensive review，London，Elsevier Science Publishers Ltd.(1988))。此外，已经表明，由于生育酚阻止后处理脂质氧化，脂质氧化是造成不想要的香味组分的原因，因此，在猪、牛和家禽饲料中添加生育酚显著提高肉品质量并且延长加工后肉制品的贮藏期限(Sante和Lacourt，J.Sci.FoodAgric.65(4)：503-507(1994)；Buckley等，J.of Animal Science 73：3122-3130(1995))。
生育酚生物合成
高等植物的质体存在相互关联的生物化学途径，产生次级代谢物，包括生育酚。高等植物的生育酚生物合成途径包括尿黑酸和植基焦磷酸的缩合，形成2-甲基-6植基质体醌醇(Fiedler等，Planta 155：511-515(1982)；Soll等，Arch.Biochem.Biophys.204：544-550(1980)；Marshall等，Phytochem.24：1705-1711(1985))。这种植物生育酚途径可分为4个部分：1)尿黑酸的合成，尿黑酸构成生育酚的芳环；2)植基焦磷酸的合成，植基焦磷酸构成生育酚的侧链；3)环化，环化在维生素E家族的手性和色原烷醇亚结构方面起作用；和4)芳环的S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基化，该甲基化影响每种生育酚的相对丰度。
尿黑酸的合成
尿黑酸是生育酚和质体醌的共同前体。据报道，至少在某些细菌中，尿黑酸的合成通过双功能预苯酸脱氢酶将分支酸转变为预苯酸，然后转变为对羟基苯基-丙酮酸而产生。双功能细菌预苯酸脱氢酶的实例包括由草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)和大肠杆菌(Escherichia coli)的tyrA基因编码的蛋白。所述tyrA基因产物催化从分支酸产生预苯酸，以及随后将预苯酸脱氢，形成尿黑酸的瞬间前体对羟基苯基丙酮酸(p-HPP)。然后通过羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)，将p-HPP转变为尿黑酸。相比之下，人们认为植物缺乏预苯酸脱氢酶活性，而且一般认为从分支酸合成尿黑酸通过是中间体前酪氨酸的合成和转变而发生。由于参与尿黑酸合成的途径也负责形成酪氨酸，因此这些途径中的任何改变也可能引起酪氨酸合成和其它芳族氨基酸合成的改变。
植基焦磷酸的合成
生育酚是被称为类异戊二烯的化合物类的一员。其它类异戊二烯包括类胡萝卜素、赤霉素、萜类、叶绿素和脱落酸。产生类异戊二烯的中心中间体是异戊烯二磷酸(IPP)。产生IPP、基于细胞质和质体的途径已有报道。基于细胞质的途径包括乙酰乙酰辅酶A硫解酶、HMGCoA合酶、HMGCoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶。
最近，根据Rohmer和Arigoni研究小组的研究，实验证据表明存在替代的、基于质体的类异戊二烯生物合成途径(Eisenreich等，Chem.Bio.，5：R221-R233(1998)；Rohmer，Prog.Drug.Res.，50：135-154(1998)；Rohmer，Comprehensive Natural Products Chemistry，第2卷，第45-68页，Barton和Nakanishi(编著)，Pergamon Press，Oxford，England(1999))，他们发现根据甲羟戊酸途径并不能解释在对某些真细菌和植物类萜的研究中所观察到的同位素标记模式。Arigoni及其同事随后表明，1-脱氧木酮糖或其衍生物用作目前称为MEP途径的新途径的中间体(Rohmer等，Biochem.J.，295：517-524(1993)；Schwarz，博士论文，Eidgenssiche Technische Hochschule，Zurich，瑞士(1994))。最近的研究表明，通过由dxs基因编码的酶(Lois等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：2105-2111(1997)；和Lange等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：2100-2104(1998))由一分子甘油醛3-磷酸(Rohmer，ComprehensiveNatural Products Chemistry，第2卷，第45-68页，Barton和Nakanishi编著，Pergamon Press，Oxford，England(1999))和一分子丙酮酸(Eisenreich等，Chem.Biol.，5：R223-R233(1998)；Schwarz，参见上文；Rohmer等，J.Am.Chem.Soc.，118：2564-2566(1996)和Sprenger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：12857-12862(1997))，形成1-脱氧木酮糖5-磷酸(Broers，博士论文(Eidgenssiche Technische Hochschule，Zurich，瑞士)(1994))。1-脱氧木酮糖5-磷酸可以通过由dxr基因催化的还原异构酶(Bouvier等，Plant Physiol，117：1421-1431(1998)和Rohdich等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：11758-11763(1999))进一步转变为2-C-甲基赤藓醇4-磷酸(Arigoni等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：10600-10605(1997))。
所述MEP途径中的报道基因也包括ygbP和ygbB，其中ygbP催化2-C-甲基赤藓醇4-磷酸转变为其相应的胞苷酰焦磷酸衍生物，而ygbB催化4-磷酸胞苷酰-2C-甲基-D-赤藓醇转变为2C-甲基-D-赤藓醇，3，4-环磷酸。这些基因在大肠杆菌基因组上紧密连锁(Herz等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97(6)：2485-2490(2000))。
一旦通过所述MEP途径形成IPP，则它通过GGDP合酶转变为GGDP，然后转变为植基焦磷酸，而植基焦磷酸是生育酚侧链的中心结构。
化合和环化
尿黑酸通过植基/异戊烯基转移酶或者与植基-焦磷酸或者与茄基-焦磷酸化合，分别形成2-甲基-6-植基质体醌醇或2-甲基-6-茄基质体醌醇。2-甲基-6-茄基质体醌醇是生物合成质体醌的前体，而2-甲基-6-植基质体醌醇最终转变为生育酚。
芳环的甲基化
每种生育酚亚型间的主要结构差异为苯环周围甲基的位置。2-甲基-6-植基质体醌醇和2-甲基-6-茄基质体醌醇均作为2-甲基-6-植基质体醌醇/2-甲基-6-茄基质体醌醇-9甲基转移酶(甲基转移酶1或MT1)的底物，MT1通过对7位甲基化，分别催化形成质体醌醇-9和γ-生育酚。随后，通过γ-甲基转移酶在γ-生育酚的5位甲基化，产生生物活性α-生育酚。生育酚甲基转移酶2(TMT2)显示与MT1相似的活性。
本领域需要编码参与生育酚生物合成的酶的核酸分子以及用于增加或改变植物中生育酚产量的相关酶和抗体。还需要用于表达参与生育酚生物合成的那些核酸分子的转基因生物，所述转基因生物能够提高各种来源的食品和饲料的营养价值。
基因标识符     酶名称
tyrA           预苯酸脱氢酶
slr1736        植基异戊烯基转移酶，得自集胞藻属(Synechocystis)
ATPT2          植基异戊烯基转移酶，得自拟南芥(Arabidopsis thaliana)
DXS            1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶
DXR            1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶
GGPPS          香叶基香叶基焦磷酸合酶
HPPD           对羟基苯基丙酮酸双加氧酶
AANT1          腺苷酸转运蛋白
slr1737        生育酚环化酶
IDI            异戊烯二磷酸异构酶
GGH            香叶基香叶基还原酶
MT1            甲基转移酶1
tMT2           生育酚甲基转移酶2
GMT            γ甲基转移酶
本文所用的尿黑酸植基转移酶(HPT)、植基异戊烯基转移酶(PPT)、sk1736和ATPT2分别表示具有相同酶活性的蛋白或蛋白编码基因。
                      发明概述
本发明包括并提供一种基本纯化的核酸分子，所述核酸分子包含以下的有效连接组分：(A)一个启动子区，所述启动子区在植物细胞中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；(B)一种异源核酸分子，所述异源核酸分子编码具有分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶活性的酶或该酶的至少20个连续氨基酸。
本发明包括并提供一种基本纯化的核酸分子，所述核酸分子包含以下的有效连接组分：(A)一个启动子区，所述启动子区在植物细胞中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；(B)一种异源核酸分子，所述异源核酸分子编码选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4以及它们的至少20个连续氨基酸的片段的氨基酸序列。
本发明包括并提供一种核酸分子，所述核酸分子包含以下的有效连接组分：(A)一个启动子区，所述启动子区在植物细胞中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；(B)一种异源核酸分子，所述异源核酸分子具有转录链和非转录链，其中所述转录链与编码具有分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶活性的蛋白的核酸分子互补。
本发明包括并提供一种核酸分子，所述核酸分子包含以下的有效连接组分：(A)一个启动子区，所述启动子区在植物细胞中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；(B)一种异源核酸分子，所述异源核酸分子具有转录链和非转录链，其中所述转录链与编码选自SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：4的氨基酸序列的蛋白的核酸分子互补。
本发明包括并提供一种转化植物，所述转化植物具有包含以下有效连接组分的核酸分子：(A)一个启动子区，所述启动子区在植物细胞中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；(B)一种外源核酸分子或其片段，所述外源核酸分子编码包含选自SEQ ID NO：2和4的氨基酸序列的蛋白，而所述片段编码至少20个连续氨基酸；和(C)一种3′非翻译序列，所述3′非翻译序列在所述植物细胞中发挥作用，从而导致转录终止并且将聚腺苷酸核糖核苷酸添加到所述mRNA分子3′末端。
本发明包括并提供一种转化植物，所述转化植物具有包含以下有效连接组分的核酸分子：(A)一个外源启动子区，所述外源启动子区在植物细胞中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；(B)一种具有转录链和非转录链的转录核酸分子，其中所述外源启动子区连接于所述转录核酸分子，所述转录链与编码包含选自：SEQ ID NO：2、SEQID NO：4以及它们的包含至少20个连续氨基酸的片段的氨基酸序列的蛋白的核酸分子互补。
本发明包括并提供一种产生生育酚水平增加的植物的方法，所述方法包括：(A)用一种核酸分子转化所述植物，其中所述核酸分子包含一个启动子区，其中所述启动子区与编码具有选自SEQ ID NO：2和4的氨基酸序列的蛋白的核酸序列连接；和(B)培育所述植物。
本发明包括并提供一种降低植物生育酚水平的方法，所述方法包括：(A)用一种核酸分子转化所述植物，其中所述核酸分子包含作为有效连接组分的一个在植物细胞中发挥作用从而导致产生mRNA分子的外源启动子区、一种具有转录链和非转录链的转录核酸分子，其中所述转录链与具有选自SEQ ID NO：1和3的核酸序列的核酸分子互补；并且其中所述转录核酸分子与在所述植物细胞中发挥作用从而导致转录终止并且将聚腺苷酸核糖核苷酸添加到所述mRNA序列3′末端的3′非翻译序列连接；和(B)培育所述转化植物。
本发明包括并提供一种用于筛选植物中生育酚水平增加的方法，所述方法包括探测基因组DNA中与具有选自SEQ ID NO：1和3以及它们的互补序列的核酸序列的核酸分子特异性杂交的标记分子的存在或不存在；并且检测所述标记的所述存在或不存在。
本发明包括并提供一种用于测定预期生育酚水平增加的植物中基因组多态性的方法，所述方法包括下述步骤：(A)将标记核酸分子和从所述植物中获得的互补核酸分子在允许核酸杂交的条件下温育，其中所述标记核酸分子与具有选自SEQ ID NO：1和3以及它们的互补序列的核酸序列的核酸分子特异性杂交；和(B)允许所述标记核酸分子和从所述植物中获得的所述互补核酸分子之间发生杂交；和(C)检测所述多态性的存在情况。
本发明包括并提供一种用于测定植物细胞或植物组织中蛋白表达的水平或模式的方法，所述方法包括：(A)在允许核酸杂交的条件下将标记核酸分子与从植物细胞或植物组织中获得的互补核酸分子一起温育，所述标记核酸分子具有选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的核酸序列、或所述两种序列中的任一核酸序列的互补序列或包含所述序列的至少约20个核苷酸的片段；和(B)允许所述标记核酸分子和从所述植物细胞或植物组织中获得的所述互补核酸分子之间发生杂交；和(C)测定所述互补核酸的所述水平或模式，其中所述互补核酸的检测是预测所述蛋白的所述表达的所述水平或模式。
本发明包括并提供一种用于测定所评价的植物细胞或植物组织中蛋白表达的水平或模式的方法，所述方法包括：测定需要评价的植物细胞或植物组织中指示分子的浓度，其中所述指示分子的所述浓度取决于基因的表达，并且其中所述基因与具有选自SEQ ID NO：1和3以及它们的互补序列的核酸序列的核酸分子特异性杂交；并且将所述指示分子的所述浓度与具有所述蛋白表达的已知水平或模式的植物细胞或植物组织中存在的所述指示分子的已知浓度进行比较。
本发明包括并提供一种细胞，所述细胞包含以下有效连接组分的核酸分子：(A)一个启动子区，所述启动子区在植物细胞中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；(B)一种异源核酸分子，其中所述异源核酸分子编码一种具有分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶活性的酶，或者所述核酸分子编码至少20个连续氨基酸的片段。
本发明包括并提供一种从转化植物种子获得的油，所述转化植物具有包含以下作为有效连接组分的核酸分子：(A)一个外源启动子区，所述启动子区在植物细胞中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；(B)一种外源核酸分子，所述外源核酸分子编码一种包含选自SEQID NO：2和4的氨基酸序列的蛋白；和(C)一种3′非翻译序列，所述3′非翻译序列在所述植物细胞中发挥作用，从而导致转录终止并且将聚腺苷酸核糖核苷酸添加到所述mRNA分子3′末端。
本发明包括并提供一种制备生育酚的方法，所述方法包括：用包含以下有效连接组分的核酸分子转化植物：(A)一个启动子区，所述启动子区在植物细胞中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；(B)一种外源核酸分子，所述外源核酸分子编码一种包含选自SEQ ID NO：2和4的氨基酸序列的蛋白；和(C)一种3′非翻译序列，所述3′非翻译序列在所述植物细胞中发挥作用，从而导致转录终止并且将聚腺苷酸核糖核苷酸添加到所述mRNA分子3′末端；并且培育所述植物。
本发明包括并提供一种制备尿黑酸的方法，所述方法包括用包含以下有效连接组分的核酸转化植物：(A)一个启动子区，所述启动子区在植物细胞中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；(B)一种外源核酸分子，所述外源核酸分子编码一种包含选自SEQ ID NO：2和4的氨基酸序列的蛋白；和(C)一种3′非翻译序列，所述3′非翻译序列在所述植物细胞中发挥作用，从而导致转录终止并且将聚腺苷酸核糖核苷酸添加到所述mRNA分子3′末端。
本发明包括并提供一种制备质体醌的方法，所述方法包括用包含以下有效连接组分的核酸转化植物：(A)一个启动子区，所述启动子区在植物细胞中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；(B)一种外源核酸分子，所述外源核酸分子编码一种包含选自SEQ ID NO：2和4的氨基酸序列的蛋白；和(C)一种3′非翻译序列，所述3′非翻译序列在所述植物细胞中发挥作用，从而导致转录终止并且将聚腺苷酸核糖核苷酸添加到所述mRNA分子3′末端。
本发明包括并提供包含转化植物或其部分的原料，其中所述转化植物具有包含选自SEQ ID NO：1和3的序列的外源核酸分子。
本发明包括并提供包含从转化植物生产的植物材料的食品，其中所述转化植物具有包含选自SEQ ID NO：1和3的序列的外源核酸分子。
本发明包括并提供具有外源核酸分子的转化植物，所述外源核酸分子包含编码具有SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列的蛋白的核酸序列。
本发明包括并提供具有外源核酸分子的转化植物，所述外源核酸分子包含SEQ ID NO：1或3的核酸序列。
本发明包括并提供一种产生种子生育酚水平增加的植物的方法，所述方法包括：(A)用一种编码一种具有分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶活性的蛋白的核酸分子转化所述植物；和(B)培育所述转化植物。
本发明包括并提供一种产生种子生育酚水平增加的植物的方法，所述方法包括：(A)用一种包含编码一种具有SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列的蛋白的核酸序列的核酸分子转化所述植物；和(B)培育所述转化植物。
本发明包括并提供一种从转化植物获得的种子，所述转化植物具有编码一种具有分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶活性的蛋白的外源核酸分子，其中所述种子相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物的种子生育酚水平增加。
本发明包括并提供一种从转化植物获得的种子，所述转化植物具有包含编码一种具有SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列的蛋白的核酸序列的外源核酸分子，其中所述转化植物的种子相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物的种子生育酚水平增加。
本发明包括并提供一种从转化植物种子获得的油，所述转化植物具有编码一种具有分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶活性的蛋白的外源核酸分子，其中所述转化植物的种子相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物的种子生育酚水平增加。
本发明包括并提供一种从转化植物种子获得的油，所述转化植物具有包含编码一种具有SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列的蛋白的核酸序列的外源核酸分子，其中所述转化植物的种子相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物的种子生育酚水平增加。
本发明包括并提供包含转化植物或其部分的原料，其中所述转化植物具有编码一种具有分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶活性的蛋白的外源核酸分子，其中所述转化植物的种子相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物的种子生育酚水平增加。
本发明包括并提供包含转化植物或其部分的原料，所述转化植物具有包含编码一种具有SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列的蛋白的核酸序列的外源核酸分子，其中所述转化植物的种子相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物的种子生育酚水平增加。
本发明包括并提供包含转化植物或其部分的原料，其中所述转化植物具有编码一种具有分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶活性的蛋白的外源核酸分子，其中所述转化植物的种子相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物的种子生育酚水平增加。
本发明包括并提供一种包含从转化植物生产的植物材料的食品，所述转化植物具有编码一种具有分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶活性的蛋白的外源核酸分子，其中所述转化植物的种子相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物的种子生育酚水平增加。
本发明包括并提供一种包含从转化植物生产的植物材料的食品，所述转化植物具有包含编码一种具有SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列的蛋白的核酸序列的外源核酸分子，其中所述转化植物的种子相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物的种子生育酚水平增加。
本发明包括并提供一种包含从转化植物生产的植物材料的食品，所述转化植物具有编码一种具有分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶活性的蛋白的外源核酸分子，其中所述转化植物的种子相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物的种子生育酚水平增加。
本发明包括并提供一种包含从转化植物生产的植物材料的食品，所述转化植物具有包含编码一种具有SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列的蛋白的核酸序列的外源核酸分子，其中所述转化植物的种子相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物的种子生育酚水平增加。
本发明包括并提供核酸构建体、以及含有所述构建体的植物和生物，所述核酸构建体具有参与生育酚和三烯生育酚生物合成的两个或两个以上基因的组合。优选以下基因与tyrA的任何组合：slr1736、ATPT2、dxs、dxr、GGH、GGPPS、HPPD、MT1、TMT2、GMT、AANT1、slr 1737和尿黑酸双加氧酶的反义构建体。在一个特别优选的实施方案中，将tyrA与HPPD以及或者slr1736或者ATPT2组合。
             核酸序列和氨基酸序列的描述
SEQ ID NO：1是编码草生欧文氏菌双功能预苯酸脱氢酶的DNA分子的核酸序列。
SEQ ID NO：2是草生欧文氏菌双功能预苯酸脱氢酶的衍生氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是编码大肠杆菌双功能预苯酸脱氢酶的DNA分子的核酸序列。
SEQ ID NO：4是大肠杆菌双功能预苯酸脱氢酶的衍生氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是用于扩增草生欧文氏菌tyrA序列的5’引物。
SEQ ID NO：6是用于扩增草生欧文氏菌tyrA序列的3’引物。
SEQ ID NO：7是用于扩增大肠杆菌tyrA序列的5’引物。
SEQ ID NO：8是用于扩增大肠杆菌tyrA序列的3’引物。
SEQ ID NO：9是引物序列。
SEQ ID NO：10是引物序列。
SEQ ID NO：11是引物序列。
SEQ ID NO：12是引物序列。
                    附图简述
图1是一幅比较带有草生欧文氏菌tyrA表达构建体和质体导向序列的拟南芥品系、野生型植物和具有载体对照的植物中的种子总生育酚水平的图。
图2是构建体pMON26588的示意图。
图3是构建体pMON26589的示意图。
图4是构建体pMON26591的示意图。
图5是构建体pMON26590的示意图。
图6是构建体pMON36510的示意图。
图7是构建体pMON36512的示意图。
图8是构建体pMON36511的示意图。
图9是构建体pMON36520的示意图。
图10是构建体pCGN10822的示意图。
图11是构建体pMON36528的示意图。
图12是构建体pMON69907的示意图。
图13是构建体pMON69909的示意图。
图14描绘了野生型植物和用质粒载体pMON69907转化的若干植物品系的拟南芥属(Arabidopsis)种子中的总生育酚和三烯生育酚含量。
图15描绘了野生型植物和用质粒载体pMON69907转化的若干植物品系的拟南芥属种子中的总生育酚含量。
图16描绘了野生型植物和分别用质粒载体pCGN10822、pMON36528、pMON69907和pMON69909转化的若干植物品系的拟南芥属种子中的总生育酚和三烯生育酚含量。
图17描绘了用载体pMON69909转化的植物品系的拟南芥种子相对于野生型植物种子生育酚和三烯生育酚含量的详细分析。
图18a和图18b显示用于转化到植物中的示例性构建体。
图19是pMON36582的图示构建体。
图20是带有拟南芥属尿黑酸植基转移酶(HPT)的表达盒作为Bsp120I/Not I盒的穿梭载体(pMON36586)的一个实例。将napin启动子和napin终止子分别与5’端和3’端融合，以驱动种子特异性表达。
图21代表穿梭载体(A)或双元载体(B)中所示的各种基因表达盒。
图22是构建体pMON36596的示意图。
图23是构建体pMON36597的示意图。
图24是构建体pMON77601的示意图。
图25是构建体pMON77602的示意图。
图26是构建体pMON66657的示意图。
图27是构建体pMON66659的示意图。
图28是构建体pMON26541的示意图。
图29是构建体pMON26543的示意图。
图30是构建体pMON36176的示意图。
图31是LC/MS标准图。
图32是LC/MS图。
图33是HPLC色谱图。
图34是HPLC色谱图。
图35是构建体pMON69915的示意图。
图36是构建体pMON69919的示意图。
图37是构建体pMON10098的示意图。
图38是构建体pMON36520的示意图。
图39是构建体pMON43853的示意图。
图40是构建体pMON36525的示意图。
图41是构建体pMON43861的示意图。
图42是构建体pCGN7770的示意图。
图43是构建体pMON69911的示意图。
图44是构建体pCGN11301的示意图。
图45是构建体pCGN3223的示意图。
图46是构建体pMON36575的示意图。
图47是构建体pMON38207R的示意图。
图48是构建体pMON36571的示意图。
图49是构建体pMON36576的示意图。
图50是构建体pMON69924的示意图。
图51是构建体pMON69943的示意图。
图52是构建体pMON69929的示意图。
图53是构建体pMON69936的示意图。
图54是构建体pMON36592的示意图。
图55是构建体pMON69945的示意图。
图56是构建体pMON16602的示意图。
图57是构建体pMON36525的示意图。
图58是构建体pMON58171的示意图。
图59是构建体pMON58172的示意图。
图60是构建体pMON58170的示意图。
图61是构建体pMON36591的示意图。
图62是构建体pMON36588的示意图。
图63是构建体pMON36592的示意图。
图64是构建体pMON58182的示意图。
图65是构建体pMON58176的示意图。
图66是构建体pMON58183的示意图。
图67是构建体pMON58185的示意图。
图68是构建体pMON36593的示意图。
图69是构建体pMON36589的示意图。
图70是构建体pMON36590的示意图。
图71是构建体pMON67162的示意图。
图72是构建体pMON58178的示意图。
图73是构建体pMON58186的示意图。
图74是构建体pMON58188的示意图。
图75显示所选品系中的生育酚和三烯生育酚以及HGA水平。
图76显示所选品系中的三烯生育酚和2M6PPQ水平。
                      详细描述
本文所公开的任何核酸分子都可以在各种生物例如植物中表达增加或过量表达，从而可以在这类生物中产生较高水平的生育酚前体如尿黑酸(HGA)，并且最终导致生育酚水平增加。另外，本文中所述的蛋白表达增加或者过量表达也可以导致产生水平增加的质体醌。此外，本发明提供许多因子，例如与生育酚产量相关的核酸分子和蛋白，并且提供所述因子的用途。
本发明包括并提供在最好是产生产量增加的尿黑酸、质体醌或生育酚的生物中表达双功能预苯酸脱氢酶的核酸构建体。这样的核酸构建体可以用于需要预苯酸脱氢酶活性水平增加的生物中。本发明也包括并提供在最好是产生产量增加的质体醌或生育酚的生物中表达植基异戊烯基转移酶的核酸构建体，以及产生针对植基异戊烯基转移酶的反义核酸的构建体在最好是产生产量增加的尿黑酸的生物中的应用。
因子
本发明的因子就其任一结构属性而论最好具有“生物活性”，性例如一种核酸分子与另一种核酸分子杂交的能力，或者蛋白被抗体结合的能力(或者与另一分子竞争这种结合的能力)。或者，这种属性可以是催化属性，因而涉及所述因子介导化学反应或应答的能力。所述因子最好是“基本纯化(的)”。本文所用的术语“基本纯化(的)”是指一种分子与其在其天然状态下正常结合的几乎所有其它分子分离开来。更优选基本纯化的分子是制品中存在的主要分子。基本纯化的分子不含天然混合物中存在的其它分子(溶剂除外)，其含量60％以上，优选75％以上，更优选90％以上，最优选95％以上。术语“基本纯化(的)”不包括其天然状态中存在的分子。
本发明的因子也可以是重组体。本文所用的术语重组体是指任何因子(例如DNA、肽等)，人工操作核酸分子直接或间接获得的因子。
人们知道，本发明的因子可以用便于检测出所述因子的试剂(例如荧光标记，Prober等，Science 238：336-340(1987)；Albarella等，EP144914；化学标记，Sheldon等，美国专利4,582,789；Albarella等，美国专利4,563,417；修饰碱基，Miyoshi等，EP 119448)进行标记。
核酸分子
本发明的因子包括编码既具有分支酸变位酶活性又具有预苯酸脱氢酶活性的双功能预苯酸脱氢酶的核酸分子。在本发明的一个优选方面，所述核酸分子包含编码双功能预苯酸脱氢酶的细菌同源物的核酸序列。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子包含具有SEQID NO：1或3的核酸序列。在另一个优选的实施方案中，所述核酸分子是本文所公开的编码具有预苯酸脱氢酶活性的氨基酸序列的任何核酸序列的片段。
在本发明的另一个优选方面，所述核酸分子包含选自SEQ ID NO：1和3的核酸序列、其互补序列以及任一核酸序列的片段。在本发明的再一方面，所述核酸分子包含编码选自SEQ ID NO：2和4的氨基酸序列的核酸序列及其片段。
在本发明的另一个优选方面，核酸分子既包含编码双功能预苯酸脱氢酶的核酸序列又包含用于表达植基异戊烯基转移酶的表达盒。在本发明的再一方面，可以使用分别编码双功能预苯酸脱氢酶和植基异戊烯基转移酶的核酸构建体。
在本发明的另一个优选方面，核酸分子包含与编码本发明的蛋白或片段的核酸分子有效融合的、编码质体转运肽的核酸序列。
人们知道，在本发明核酸序列的再一方面，所述核酸可以编码不同于任一所述蛋白的蛋白，其中一个或多个氨基酸已被缺失、取代或添加但并不改变所述功能。例如，人们知道，能够编码这样的保守氨基酸取代的密码子是本领域已知的。
本发明核酸分子的一个亚组是片段核酸分子。片段核酸分子可以由本发明核酸分子的重要部分即事实上为大部分(例如具体公开的那些部分)组成。另一方面，所述片段可以包含较小的寡核苷酸(具有约15个至约400个核苷酸残基、更优选约15个至约30个核苷酸残基、或者约50个至约100个核苷酸残基、或者约100个至约200个核苷酸残基、或者约200个至约400个核苷酸残基、或者约275个至约350个核苷酸残基)。
本发明的一种或多种核酸分子的片段可以是探针，准确地说是PCR探针。PCR探针是能够起始聚合酶活性同时与另一种核酸形成双链结构的核酸分子。用于测定PCR探针的结构的各种方法和PCR技术是本领域的现有技术。为了鉴定潜在的PCR引物，可以运用如Primer3(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)、STSPipeline(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/www-STS_Pipeline)或GeneUp(Pesole等，BioTechniques 25：112-123(1998))等程序，用计算机进行搜索。
本发明核酸分子的另一个亚组包括编码蛋白或其片段的核酸分子。
本发明的核酸分子或其片段能够与其它核酸分子在某种情况下特异性杂交。本发明的核酸分子包括与具有选自SEQ ID NO：1和3以及它们的互补序列的核酸序列的核酸分子特异性杂交的那些核酸分子。本发明的核酸分子也包括与编码选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4的氨基酸序列的核酸分子、其互补序列以及任一序列的片段特异性杂交的那些核酸分子。
本文所用的两种核酸分子如果所述两种分子能够形成反平行双链核酸结构则一般认为是能够相互特异性杂交。
一种核酸分子与另一种核酸分子如果它们表现出完全互补性则一般认为是“互补的”。本文所用的分子当一种分子的每个核苷酸与另一种分子的核苷酸互补则一般认为表现出“完全互补性”。两种分子如果它们可以相互杂交并且具有足够稳定性以允许其在至少常规“低严格性”条件下保持相互退火则一般认为是“基本互补的”。同样，所述分子如果它们可以相互杂交并且具有足够稳定性以允许其在常规“高严格性”条件下保持相互退火则一般认为是“互补的”。常规严格性条件描述于Sambrook等，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1989)和Haymes等，Nucleic Acid Hybridization，A PracticalApproach，IRL Press，Washington，DC(1985)。因此，与完全互补性有一定偏离是容许的，只要这种偏离不完全妨碍所述分子形成双链结构的能力。因而，为了将核酸分子用作引物或探针，仅要求在所用的特定溶剂和盐浓度下能够形成稳定双链结构的序列互补性。
启动DNA杂交的合适严格性条件例如是先在6.0X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)溶液中45℃下洗涤，然后在2.0XSSC溶液中20-25℃下洗涤，这些是本领域技术人员已知的，或者可以在Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。例如，所述洗涤步骤中的盐浓度可以选自约2.0XSSC 50℃的低严格性至约0.2XSSC 65℃的高严格性。另外，所述洗涤步骤中的温度可以从低严格性条件室温(约22℃)提高至高严格性条件约65℃。温度和盐浓度均可以变动，或者温度或盐浓度可以保持恒定，而改变另一个变量。
在一个优选的实施方案中，本发明的核酸分子将与SEQ ID NO：1和3中所示的一种或多种核酸分子及其互补序列在中等严格性条件下例如约2.0XSSC和约65℃下特异性杂交。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的核酸将包括与SEQ IDNO：1和3中所示的一种或多种核酸分子及其互补序列在高严格性条件下例如约0.2XSSC和约65℃下特异性杂交的那些核酸分子。
在本发明的一方面，本发明的核酸分子具有SEQ ID NO：1和3中所示的一种或多种核酸序列及其互补序列。在本发明的另一方面，本发明的一种或多种核酸分子与SEQ ID NO：1和3中所示的一种或多种核酸序列及其互补序列以及任一序列的片段共享100％-90％序列同一性。在本发明的再一方面，本发明的一种或多种核酸分子与SEQID NO：1和3中所示的一种或多种核酸序列、其互补序列以及任一序列的片段共享100％-95％序列同一性。在本发明一个更优选的方面，本发明的一种或多种核酸分子与SEQ ID NO：1和3中所示的一种或多种核酸序列、其互补序列以及任一序列的片段共享100％-98％序列同一性。在本发明一个甚至更优选的方面，本发明的一种或多种核酸分子与SEQ ID NO：1和3中所示的一种或多种序列、其互补序列以及任一序列的片段共享100％-99％序列同一性。
在一个优选的实施方案中，运用LASERGENE生物信息学计算机程序集的Megalign程序(缺省参数，DNASTAR Inc.，Madison，Wisconsin)，进行所述同一性百分率的计算。
本发明的核酸分子也可以编码同系物蛋白。本文所用的同系物蛋白分子或其片段是第二个物种中的对应物蛋白分子或其片段(例如玉米核酮糖-1，5-二磷酸羧化酸/加氧酶小亚基是拟南芥核酮糖-1，5-二磷酸羧化酸/加氧酶小亚基的同系物)。同系物也可以通过分子进化或DNA改组技术产生，致使所述分子保留原始蛋白的至少一种功能或结构特征(参见例如美国专利5,811,238)。
在另一个实施方案中，所述同系物选自苜蓿、拟南芥属、大麦、油菜(Brasstca campestris)、欧洲油菜(Brassica napus)、青花椰菜、卷心菜、双低油菜(canola)、柑桔、棉花、大蒜、燕麦、洋葱、亚麻、观赏植物、花生、胡椒、马铃薯、水稻、黑麦、高粱、草莓、甘蔗、甜菜、番茄、小麦、杨树、松树、冷杉、桉树、苹果、莴苣、兵豆、葡萄、香蕉、茶树、草坪草、向日葵、大豆、玉米、菜豆属(Phaseolus)、两节荠、芥末、蓖麻籽、芝麻、棉籽、亚麻籽、红花和油棕。更具体地讲，优选的同系物选自双低油菜、玉米、拟南芥属、油菜、欧洲油菜、大豆、两节荠、芥末、蓖麻籽、花生、芝麻、棉籽、亚麻籽、红花、油棕、亚麻和向日葵。在一个甚至更优选的实施方案中，所述同系物选自双低油菜、玉米、拟南芥属、油菜、欧洲油菜、大豆、向日葵、红花、油棕和花生。在一个优选的实施方案中，所述同系物是大豆。在一个优选的实施方案中，所述同系物是双低油菜。在一个优选的实施方案中，所述同系物是欧洲油菜。
在一个优选的实施方案中，可以使用具有SEQ ID NO：1和3的核酸分子、其互补序列以及任一序列的片段、或者更优选具有SEQ IDNO：1和3的核酸分子及其互补序列来获得这样的同系物。
在本发明的另一方面，本发明的核酸分子可以包含由于蛋白可能具有一个或多个保守氨基酸改变而不同于编码SEQ ID NO：2和4的蛋白或其片段的序列，编码所述蛋白的核酸序列因此可能具有序列差异性。人们知道，能够编码这样的保守氨基酸取代的密码子是本领域已知的。
本领域众所周知的是，天然序列中的一个或多个氨基酸可以被其它氨基酸取代，所述其它氨基酸的电荷和极性与所述天然氨基酸的电荷和极性相似，即保守氨基酸取代。天然多肽序列内氨基酸的保守取代可以选自所述氨基酸所属类别的其它成员。可以将氨基酸分为以下4组：(1)酸性氨基酸，(2)碱性氨基酸，(3)中性极性氨基酸，和(4)中性非极性氨基酸。这些不同组中的代表性氨基酸包括但不限于(1)酸性(带负电)氨基酸，例如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性(带正电)氨基酸，例如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸，例如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；和(4)中性非极性(疏水性)氨基酸，例如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
天然多肽序列内的保守氨基酸取代可以可以通过这些组中一个组内的一个氨基酸被同一组内的另一氨基酸取代来进行。在一个优选的方面，本发明的蛋白或其片段的生物功能等同物可以具有10个或10个以下的保守氨基酸改变，更优选7个或7个以下的保守氨基酸改变，最优选5个或5个以下的保守氨基酸改变。因此，所述编码核苷酸序列将具有相应的碱基取代，使其编码本发明蛋白或其片段的生物功能等同物。
人们知道，蛋白结构内某些氨基酸可以被其它氨基酸取代而不会使与各种结构的互作结合能力明显丧失，所述结构如抗体的抗原结合区或底物分子结合部位等。正是因为互作能力和性质限定蛋白的生物功能活性，所以某些氨基酸序列取代可以在蛋白质序列内进行，当然，在其DNA编码序列上也可以实施，然而，仍可以获得具有同样性质的蛋白。因此，本发明人考虑了在本发明蛋白或其片段的肽序列内或者在编码所述肽的相应DNA序列内可以进行各种改变，而并不明显损失其生物用途或活性。人们知道，能够编码这类氨基酸改变的密码子是本领域已知的。
在进行这样的改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白相互作用性生物功能方面的重要性是本领域普遍了解的(Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.157，105-132(1982))。普遍认为，所述氨基酸的相对亲水特性对所产生的蛋白的二级结构产生影响，所述二级结构进而又限定了该蛋白与其它分子的相互作用，所述其它分子例如为酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等。
根据氨基酸的疏水性和电荷特性，已经确定了每种氨基酸的亲水指数(Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.157：105-132(1982))，它们是：异亮氨酸(+4.5)，缬氨酸(+4.2)，亮氨酸(+3.8)，苯丙氨酸(+2.8)，半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)，甲硫氨酸(+1.9)，丙氨酸(+1.8)，甘氨酸(-0.4)，苏氨酸(-0.7)，丝氨酸(-0.8)，色氨酸(-0.9)，酪氨酸(-1.3)，脯氨酸(-1.6)，组氨酸(-3.2)，谷氨酸(-3.5)，谷氨酰胺(-3.5)，天冬氨酸(-3.5)，天冬酰胺(-3.5)，赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
在进行这样的改变时，优选亲水指数在±2以内的氨基酸取代，特别优选亲水指数在±1以内的氨基酸的取代，甚至更特别优选亲水指数在±0.5以内的氨基酸的取代。
本领域也知道，根据亲水性可以有效地进行相似氨基酸的取代。美国专利4,554,101叙述了取决于其相邻氨基酸亲水性的蛋白的最大局部平均亲水性与所述蛋白的生物特性相关。
如美国专利4,554,101中详细描述的，已经确定了氨基酸残基的以下亲水性值：精氨酸(+3.0)，赖氨酸(+3.0)，天冬氨酸(+3.0±1)，谷氨酸(+3.0±1)，丝氨酸(+0.3)，天冬酰胺(+0.2)，谷氨酰胺(+0.2)，甘氨酸(0)，苏氨酸(-0.4)，脯氨酸(-0.5±1)，丙氨酸(-0.5)，组氨酸(-0.5)，半胱氨酸(-1.0)，甲硫氨酸(-1.3)，缬氨酸(-1.5)，亮氨酸(-1.8)，异亮氨酸(-1.8)，酪氨酸(-2.3)，苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。
在进行这样的改变时，优选亲水性值在±2以内的氨基酸取代，特别优选亲水性值在±1以内的氨基酸取代，甚至更特别优选亲水性值在±0.5以内的氨基酸取代。
在本发明的再一方面，本发明的一种或多种核酸分子不同于本文中提供的特定序列的核酸序列，因为一个或多个密码子已经被编码保守取代的原始编码的氨基酸的密码子所取代。
本发明的因子包括编码本发明蛋白的至少约连续10个氨基酸区、更优选本发明蛋白的至少约连续25个、40个、50个、100个或125个氨基酸区的核酸分子。
在一个优选的实施方案中，本发明的任何核酸分子可以与在植物细胞中发挥作用从而导致产生mRNA分子的启动子区有效连接，其中与所述启动子连接的核酸分子相对于该启动子而言是异源的。本文所用的“异源的”是指非天然存在在一起的。
蛋白和肽分子
一类因子包括本发明的核酸因子编码的一种或多种蛋白或其片段或肽分子。一类特别优选的蛋白是具有选自SEQ ID NO：2和4的氨基酸序列的蛋白及其片段。蛋白或肽因子可以具有C端或N端氨基酸序列延伸。一个优选实施方案中所用的一类N端延伸是质体转运肽。使用时，可以将质体转运肽与所述N端序列有效连接，从而允许所述因子肽或蛋白定位于质体。在一个优选的实施方案中，所述质体导向序列是CTP1序列。在另一个实施方案中，所述序列是CTP2序列。
本文所用的术语“蛋白”或“肽分子”包括含5个或5个以上的氨基酸的任何分子。本领域众所周知的是，蛋白可以经过修饰，包括翻译后修饰，例如但不限于二硫键形成、糖基化、磷酸化或寡聚化。因此，本文所用的术语“蛋白”或“肽分子”包括通过任何生物过程或非生物过程修饰的任何蛋白。术语“氨基酸(amino acid)”和“氨基酸类(amino acids)”是指所有天然存在的L-氨基酸。该定义意指包括正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸和高丝氨酸。
一种或多种蛋白或其片段或肽分子可以通过化学合成、或者更优选通过在合适细菌或真核宿主中表达来产生。合适的表达方法描述于Sambrook等，载于：Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)或相似的文本。
“蛋白片段”是其氨基酸序列包含该蛋白的氨基酸序列的一个亚组的肽或多肽分子。包含并不衍生自该蛋白的一个或多个额外肽区的蛋白或其片段是一种“融合”蛋白。可以将这样的分子衍生化，以含有糖或其它部分(例如匙孔戚血蓝蛋白)。本发明的融合蛋白或肽分子优选通过重组方法产生。
另一类因子包含含SEQ ID NO：2和4以及它们的片段的蛋白或肽分子或其片段或融合体，其中已添加、取代或缺失保守非必需或非相关的氨基酸残基。用于设计对蛋白结构进行修饰的计算机方法是本领域已知的(Dahiyat和Mayo，Science 278：82-87(1997))。
本发明的蛋白也可是一种同系物蛋白。本文所用的同系物蛋白或其片段是第二个品种中的对应物蛋白或其片段。同系物也可以通过分子进化或DNA改组技术产生，致使所述分子保留原始蛋白的至少一种功能或结构特征(参见例如美国专利5,811,238)。
在另一个实施方案中，所述同系物选自苜蓿、拟南芥属、大麦、青花椰菜、卷心菜、双低油菜、柑桔、棉花、大蒜、燕麦、洋葱、亚麻、观赏植物、花生、胡椒、马铃薯、水稻、黑麦、高粱、草莓、甘蔗、甜菜、番茄、小麦、杨树、松树、冷杉、桉树、苹果、莴苣、兵豆、葡萄、香蕉、茶树、草坪草、向日葵、大豆、玉米和菜豆属。更具体地讲，优选的同系物选自双低油菜、玉米、拟南芥属、油菜、欧洲油菜、大豆、两节荠、芥末、蓖麻籽、花生、芝麻、棉籽、亚麻籽、红花、油棕、亚麻和向日葵。在一个甚至更优选的实施方案中，所述同系物选自双低油菜、玉米、拟南芥属、油菜、欧洲油菜、大豆、向日葵、红花、油棕和花生。在一个优选的实施方案中，所述同系物是大豆。在一个优选的实施方案中，所述同系物是双低油菜。在一个优选的实施方案中，所述同系物是欧洲油菜。
在一个优选的实施方案中，可以使用本发明的核酸分子或任一序列的互补序列以及片段来获得这样的同系物。
本发明的因子包括含本发明蛋白的至少约10个连续氨基酸区、优选含至少约20个连续氨基酸区、甚至更优选含至少约25个、35个、50个、75个或100个连续氨基酸区蛋白及其片段。在另一个优选的实施方案中，本发明的蛋白包括约10个至约25个连续氨基酸区、更优选约20个至约50个连续氨基酸区、甚至更优选约40个至约80个连续氨基酸区。
植物构建体和植物转化体
本发明的一种或多种核酸分子可以用于植物转化或转染。可以将外源遗传材料转移到植物细胞中，然后让所述植物细胞再生为能育或不育全株。外源遗传材料是来自能够插入到任何生物体中的任何来源的任何遗传材料，无论是天然存在的还是非天然存在的。在一个优选的实施方案中，所述外源遗传材料编码双功能预苯酸脱氢酶或其片段，更优选来自原核生物的双功能预苯酸脱氢酶，甚至更优选来自草生欧文氏菌或大肠杆菌的双功能预苯酸脱氢酶。在一个优选的实施方案中，所述外源遗传材料包括本发明的核酸分子，优选具有选自SEQ ID NO：1和3的序列的核酸分子、其互补序列以及任一序列的片段。在另一个实施方案中，所述外源遗传材料包括本发明的核酸分子，优选编码具有植基异戊烯基转移酶活性的蛋白或其片段的核酸。
在本发明的一个实施方案中，将包含TyrA同系物或其片段的外源遗传材料导入具有一种或多种额外基因的植物中。在一个实施方案中，各种优选组合的基因包括以下基因中两个或两个以上的基因：tyrA、slrl736、ATPT2、dxs、dxr、GGH、GGPPS、HPPD、MTl、TMT2、GMT、AANTl、slr 1737和尿黑酸双加氧酶的反义构建体(Krindl等，SeedSci.Res.1：209-219(1991)；Keegstra，Cell 56(2)：247-53(1989)；Nawrath等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：12760-12764(1994)；Xia等，J.Gen.Microbiol.138：1309-1311(1992)；参见万维网的Cyanobase：www.kazusa.or.jp/cyanobase；Lois等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(5)：2105-2110(1998)；Takahashi等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(17)，9879-9884(1998)；Norris等，Plant Physiol.，117：1317-1323(1998)；Bartley和Scolnik，Plant Physiol.，104：1469-1470(1994)；Smith等，Plant J.11：83-92(1997)；WO 00/32757；WO 00/10380；Saint Guily等，Plant Physiol.，100(2)：1069-1071(1992)；Sato等，J.DNA Res.7(1)：31-63(2000)。在一个优选的组合中，一种或多种核酸构建体除编码tyrA外，也编码HPPD以及或者slr1736或者ATPT2。
在这样的组合中，通过利用质体导向序列可以将一种或多种基因产物定位于质体。或者，一种或多种基因产物可以定位于细胞质。这样的基因可以例如与一种构建体上的TyrA同系物或其片段一起导入、在不同的构建体上但在同一转化事件中导入或者导入不同的植物中，然后通过一次或多次杂交，产生各种基因的所需组合。在这样的组合中，优选的启动子是napin启动子，优选的质体导向序列是CTP1序列。
可以将这样的遗传材料转移到单子叶植物或双子叶植物中，所述单子叶植物和双子叶植物包括但不限于双低油菜、玉米、大豆、拟南芥属、菜豆、花生、苜蓿、小麦、水稻、燕麦、高粱、黑麦、小大麦、小米、狐茅、黑麦草、甘蔗、酸果、番木瓜、香蕉、红花、油棕、亚麻、香甜瓜、苹果、黄瓜、石斛、唐菖蒲、菊花、百合、棉花、桉树、向日葵、油菜、欧洲油菜、草坪草、甜菜、咖啡和薯蓣(Christou，载于：Particle Bombardment for Genetic Engineering ofPlants，Biotechnology Intelligence Unit.Academic Press，San Diego，California(1996))，其中优选双低油菜、玉米、拟南芥属、油菜、欧洲油菜、大豆、两节荠、芥末、蓖麻籽、花生、芝麻、棉籽、亚麻籽、红花、油棕、亚麻和向日葵，更优选双低油菜、玉米、拟南芥属、油菜、欧洲油菜、大豆、向日葵、红花、油棕和花生。在一个更优选的实施方案中，将所述遗传材料转移到双低油菜中。在另一个更优选的实施方案中，将所述遗传材料转移到欧洲油菜中。在另一个更优选的实施方案中，将所述遗传材料转移到大豆中。
转移编码蛋白的核酸可以导致该蛋白在转化细胞或转基因植物中表达或过量表达。由本发明核酸分子编码的一种或多种蛋白或其片段可以在转化细胞或转基因植物中过量表达。这样的表达或过量表达可以是外源遗传材料瞬时或稳定转移的结果。
在一个优选的实施方案中，本发明蛋白或其片段在植物中的表达或过量表达使得该植物相对于具有相似遗传背景的未转化植物三烯生育酚水平增加。
在一个优选的实施方案中，本发明蛋白或其片段在植物中的表达或过量表达使得该植物相对于具有相似遗传背景的未转化植物生育酚水平增加。
在一个优选的实施方案中，本发明蛋白或其片段在植物中的过量表达使得该植物相对于具有相似遗传背景的未转化植物α-生育酚水平增加。
在一个优选的实施方案中，本发明蛋白或其片段在植物中的过量表达使得该植物相对于具有相似遗传背景的未转化植物γ-生育酚水平增加。
在一个优选的实施方案中，本发明蛋白或其片段在植物中的过量表达使得该植物相对于具有相似遗传背景的未转化植物尿黑酸水平增加。
在一个优选的实施方案中，本发明蛋白或其片段在植物中的过量表达使得该植物相对于具有相似遗传背景的未转化植物质体醌醇或质体醌水平增加。
在某些实施方案中，生育酚生物合成途径中包括三烯生育酚、生育酚、α-生育酚、γ-生育酚、质体醌醇、质体醌或尿黑酸中任一种或多种在内的一种或多种产物的水平增加10％、或者更优选25％、50％、100％、200％、250％、1,000％、2,000％或2,500％。各种产物的水平增加可以是诸如植物的整个生物性升高，或者增高局限于所述生物的一种或多种特定器官或组织。例如，可以使产物的水平在一种或多种植物组织和器官中增加，所述植物组织和器官包括但不限于根、块茎、茎、叶、梗、果实、浆果、坚果、树皮、荚果、种子和花。
在另一个实施方案中，本发明蛋白或其片段在植物中的过量表达使得该植物或该植物的组织相对于具有相似遗传背景的未转化植物或植物组织预苯酸脱氢酶蛋白水平增加。
在另一个优选的实施方案中，本发明蛋白或其片段在转化植物中的过量表达可以提供对各种各样胁迫的耐受性，例如对氧或臭氧等的氧化胁迫耐受性、UV耐受性、低温耐受性或真菌/微生物病原体耐受性。
本文在一个优选的方面所用的当由于逆境例如低温攻击使植物比没有这种逆境耐受性或抗逆性的植物相比产量更高时，通过测定植物的效能来测定逆境耐受性或抗逆性。在本发明一个特别优选的方面，将具有相似遗传背景的植物与所述耐受性或抗性植物相比，测量逆境耐受性或抗逆性，只要所述耐受性或抗性植物表达或过量表达本发明的蛋白或片段。
可以通过使用为此目的设计的DNA载体或构建体，将外源遗传材料转移到宿主细胞中。这种载体的设计是本领域技术人员普遍了解的(参见Plant Molecular Biology：A Laboratory Manual，Clark(编著)，Springer，New York(1997))。在本发明的某些实施方案中，可以将一种选自tyrA、slrl736、ATPT2、dxs、dxr、GGH、GGPPS、HPPD、MT1、TMT2、GMT、AANT1、slr 1737和尿黑酸双加氧酶的反义构建体的基因序列转移到所需的目标植物中。在一个优选的组合中，一种或多种核酸构建体除编码tyrA外，也编码HPPD以及或者slr1736或者ATPT2。从所转移的基因序列表达所需活性的目标植物可以与已经用一种或多种其它选自tyrA、slr1736、ATPT2、dxs、dxr、GGH、GGPPS、HPPD、MTl、TMT2、GMT、AANTl、slr 1737和尿黑酸双加氧酶的反义构建体的基因序列转化的植物经过一次或多次杂交，以便获得从所述转移的基因序列表达两种或两种以上的所需活性的植物。在一个优选的组合中，一种或多种核酸构建体除编码tyrA外，也编码HPPD以及或者slr1736或者ATPT2。在另一个实施方案中，DNA载体构建体可以是包含两种或两种以上的选自tyrA、slr1736、ATPT2、dxs、dxr、GGH、GGPPS、HPPD、MT1、TMT2、GMT、AANT1、slr 1737和尿黑酸双加氧酶的反义构建体的基因序列的多基因构建体，致使用一种DNA载体构建体转化将导致所述两种或两种以上的基因序列的表达。在一个优选的组合中，一种或多种核酸构建体除编码tyrA外，也编码HPPD以及或者slr1736或者ATPT2。
构建体或载体可以包括表达所选蛋白或其蛋白片段的植物启动子。在一个优选的实施方案中，可以将本文所述的任何核酸分子与在植物细胞中发挥作用从而导致产生mRNA分子的启动子区有效连接。例如，可以使用在植物细胞中发挥作用从而导致产生mRNA分子的任何启动子，例如本文所述的那些启动子，但并不限此。在一个优选的实施方案中，所述启动子是植物启动子。
许多在植物细胞中有活性的启动子在文献中已有描述。这些启动子包括胭脂碱合酶(NOS)启动子(Ebert等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)84：5745-5749(1987))、章鱼碱合酶(OCS)启动子(它在根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的根瘤诱导质粒上携带)、花椰菜花叶病毒启动子例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等，Plant Mol.Biol.9：315-324(1987))和CaMV 35S启动子(Odell等，Nature313：810-812(1985))、玄参花叶病毒35S启动子、来自核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基(ssRUBISCO)的光诱导型启动子、Adh启动子(Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)84：6624-6628(1987))、蔗糖合酶启动子(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)87：4144-4148(1990))、R基因复合体启动子(Chandler等，The Plant Cell 1：1175-1183(1989))和叶绿素a/b结合蛋白基因启动子等。这些启动子均已经用来产生各种类型的DNA构建体，所述DNA构建体已经在植物中表达(参见例如PCR公布号WO 84/02913)。优选所述CaMV 35S启动子供各种植物使用。本发明可以使用已知或发现引起DNA在植物细胞中转录的启动子。
为了在植物源性组织例如叶、种子、根或茎中表达，优选所用的启动子在这些特定组织中以比较高的水平表达。本发明蛋白的组织特异性表达是一个特别优选的实施方案。为此，人们可以从许多具有组织或细胞特异性表达或表达增强的基因的启动子中进行选择。在文献中已有报道的这类启动子的实例包括来自豌豆的叶绿体谷氨酰胺合成酶GS2启动子(Edwards等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)87：3459-3463(1990))、来自小麦的叶绿体果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)启动子(Lloyd等，Mol.Gen.Genet.225：209-216(1991))、来自马铃薯的核光合ST-LS1启动子(Stockhaus等，EMBO J.8：2445-2451(1989))、来自拟南芥的丝氨酸/苏氨酸激酶(PAL)启动子和葡糖淀粉酶(CHS)启动子。另据报道，在光合组织中有活性的启动子是来自东部落叶松(北美落叶松(Larix laricina))的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RbcS)启动子、来自松树的cab基因cab6的启动子(Yamamoto等，Plant Cell Physiol.35：773-778(1994))、来自小麦的Cab-1基因的启动子(Fejes等，PlantMol.Biol.15：921-932(1990))、来自菠菜的CAB-1基因的启动子(Lubberstedt等，Plant Physiol.104：997-1006(1994))、来自水稻的cab1R基因的启动子(Luah等，Plant Cell 4：971-981(1992))、来自玉米的丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)启动子(Matsuoka等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)90：9586-9590(1993))、烟草Lhcb1*2基因的启动子(Cerdan等，Plant Mol.Biol.33：245-255(1997)、拟南芥SUC2蔗糖-H+同向转运蛋白启动子(Truernit等，Planta.196：564-570(1995))和来自菠菜的类囊体膜蛋白的启动子(psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbcS)。本发明也可以使用叶绿素a/b结合蛋白的其它启动子，例如来自白芥(Sinapis alba)的LhcB基因和PsbP基因的启动子(Kretsch等，Plant Mol.Biol.28：219-229(1995))。
为了在植物的沉积组织(sink tissues)例如马铃薯植物的块茎、番茄果实或者玉米、小麦、水稻和大麦的种子中表达，优选本发明所用的启动子在这些特定组织中以比较高的水平表达。许多具有块茎特异性表达或块茎表达增强的基因的启动子是已知的，包括I类patatin启动子(Bevan等，EMBO J.8：1899-1906(1986)；Jefferson等，Plant Mol.Biol.14：995-1006(1990))、马铃薯块茎ADPGPP基因的大亚基和小亚基的启动子、蔗糖合酶启动子(Salanoubat和Belliard，Gene 60：47-56(1987)，Salanoubat和Belliard，Gene 84：181-185(1989))、包括22kd蛋白复合体和蛋白酶抑制剂的主要块茎蛋白的启动子(Hannapel等，PlantPhysiol.101：703-704(1993))、颗粒结合淀粉合酶基因(GBSS)的启动子(Visser等，Plant Mol.Biol.17：691-699(1991))和其它I类patatin启动子和II类patatin启动子(Koster-Topfer等，Mol.Gen.Genet.219：390-396(1989)；Mignery等，Gene.62：27-44(1988))。
也可以用其它启动子来表达特定组织例如种子或果实中的蛋白或其片段。事实上，在一个优选的实施方案中，所用的启动子是种子特异性启动子。这类启动子的实例包括如napin(Krindl等，Seed Sci.Res.1：209-219(1991))、菜豆蛋白(Bustos等，Plant Cell 1(9)：839-853(1989))、大豆胰蛋白酶抑制剂(Riggs等，Plant Cell 1(6)：609-621(1989))、ACP(Baerson等，Plant Mol.Biol.22(2)：255-267(1993))、硬脂酰-ACP去饱和酶(Slocombe等，Plant Physiol.104(4)：167-176(1994))、大豆b-conglycinin的a′亚基(大豆7s，(Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.，83：8560-8564(1986)))和油质蛋白(参见例如Hong等，Plant Mol.Biol.34(3)：549-555(1997))等基因的5′调节区。其它实例包括β-conglycinin的启动子(Chem等，Dev.Genet.10：112-122(1989))。还包括玉米醇溶蛋白，该蛋白是玉米胚乳中存在的一组贮藏蛋白。玉米醇溶蛋白基因的基因组克隆已经分离出来(Pedersen等，Cell 29：1015-1026(1982)和Russell等，Transgenic Res.6(2)：157-168)，并且也可以使用来自这些克隆的启动子和基因，所述启动子包括15kD、16kD、19kD、22kD、27kD。已知例如在玉米中起作用的其它启动子包括以下基因的启动子：waxy、Brittle、Shrunken 2、分支酶I和II、淀粉合酶、脱支酶、油质蛋白、谷蛋白和蔗糖合酶。用于玉米胚乳表达的一个特别优选的启动子是来自水稻的谷蛋白基因的启动子，更优选Osgt-1启动子(Zheng等，Mol.Cell.Biol.13：5829-5842(1993))。适于在小麦中表达的启动子的实例包括ADPglucose pyrosynthase(ADP葡萄糖热合酶)(ADPGPP)亚基、颗粒结合和其它淀粉合酶、分支酶和脱支酶、胚发生丰富的蛋白、麦醇溶蛋白和谷蛋白的那些启动子。对于水稻，这类启动子的实例包括ADPGPP亚基、颗粒结合和其它淀粉合酶、分支酶、脱支酶、蔗糖合酶和谷蛋白的那些启动子。一种特别优选的启动子是水稻谷蛋白Osgt-1启动子。对于大麦，这类启动子的实例包括ADPGPP亚基、颗粒结合和其它淀粉合酶、分支酶、脱支酶、蔗糖合酶、大麦醇溶蛋白、种胚球蛋白和糊粉特异性蛋白的启动子。用于在种子中表达的一种优选启动子是napin启动子
也可以使用根特异性启动子。这种启动子的一个实例是酸性壳多糖酶基因的启动子(Samac等，Plant Mol.Biol.25：587-596(1994))。在根组织中表达也可以通过利用已鉴定出的CaMV35S启动子的根特异性亚结构域来完成(Lam等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86：7890-7894(1989))。其它根细胞特异性启动子包括Conkling等报道的那些启动子(Conkling等，Plant Physiol.93：1203-1211(1990))。
可以使用的其它启动子描述于例如美国专利号5,378,619、5,391,725、5,428,147、5,447,858、5,608,144、5,608,144、5,614,399、5,633,441、5,633,435和4,633,436。另外，可以使用组织特异性增强子(Fromm等，The Plant Cell 1：977-984(1989))。
构建体或载体也可以包括目标编码区以及全部或部分用于终止该编码区转录的核酸序列。许多这样的序列已被分离出来，包括Tr7 3′序列和NOS 3′序列(Ingelbrecht等，The Plant Cell 1：671-680(1989)；Bevan等，Nucleic Acids Res.11：369-385(1983))。在本发明的植物表达构建体中也可以提供调节转录的终止区。可以由编码目标基因的DNA序列或者从不同来源的基因获得的常规转录终止区，例如与所述转录物起始区天然结合的转录物终止区，提供转录物终止区。技术人员将会认识到，本发明的构建体中可以使用能够在植物细胞中终止转录的任何常规转录物终止区。
载体或构建体也可以包括调节元件。这类调节元件的实例包括Adh内含子1(Callis等，Genes and Develop.1：1183-1200(1987))、蔗糖合酶内含子(Vasil等，Plant Physiol.91：1575-1579(1989))和TMVω元件(Gallie等，The Plant Cell 1：301-311(1989))。适当时可以包括这些和其它调节元件。
载体或构建体也可以包括选择标记。也可以用各种选择标记来选择含有所述外源遗传材料的植物或植物细胞。这类选择标记的实例包括但不限于：neo基因(Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199：183-188(1985))，该基因编码卡那霉素抗性并且可以根据使用卡那霉素、RptII、G418、hpt等进行选择；bar基因，该基因编码bialqphos抗性；突变EPSP合酶基因(Hinchee等，Bio/Technology 6：915-922(1988)；Reynaerts等，Selectable and Screenable Markers(选择标记和筛选标记).载于Gelvin and Schilperoot.plant Molecular Biology Manual，Kluwer，Dordrecht(1988)；Reynaerts等，Selectable and screenable markers(选择标记和筛选标记).载于Gelvin and Schilperoot.Plant MolecularBiology Manual，Kluwer，Dordrecht(1988))；aadA(Jones等，Mol.Gen.Genet.(1987)))，该基因编码草甘膦抗性；腈水解酶基因，该基因赋予对溴苯腈的抗性(Stalker等，J.Biol.Chem.263：6310-6314(1988))；突变乙酰乳酸合酶基因(ALS)，该基因赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性(欧洲专利申请154,204(1985年9月11日))；ALS(D′Halluin等，Bio/Technology 10：309-314(1992)和甲氨蝶呤抗性DHFR基因(Thillet等，J.Biol.Chem.263：12500-12508(1988))。载体或构建体也可以包括转运肽。
也可以使用掺入合适的叶绿体转运肽(欧洲专利申请公布号0218571)。也可将翻译增强子作为所述载体DNA的一部分掺入。DNA构建体可以含有一个或多个可以用来增强从所产生的mRNA转录物表达所述基因产物的5′非翻译前导序列。这样的序列可以来源于选择用以表达所述基因的启动子或者可以进行特异性修饰以增加mRNA的翻译。这样的区也可以得自病毒RNA、合适真核基因或合成基因序列。有关优化转基因表达的综述，参见Koziel等，Plant Mol.Biol.32：393-405(1996)。一种优选的转运肽是CTP1。在另一个实施方案中，所述转运肽是CTP2序列。
载体或构建体也可以包括筛选标记。可以用筛选标记来监测表达。示例性的筛选标记包括：β-葡糖醛酸酶或uidA基因(GUS)，该基因编码各种显色底物为已知的酶(Jefferson，Plant Mol.Biol.Rep.5：387-405(1987)；Jefferson等，EMBO J.6：3901-3907(1987))；R-基因座基因，该基因编码调节植物组织中花色素苷色素(红色)产生的产物(Dellaporta等，Stadler Symposium 11：263-282(1988))；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)75：3737-3741(1978))，该基因是一种编码各种显色底物为已知的酶的基因(例如PADAC，显色头孢菌素)；荧光素酶基因(Ow等，Science 234：856-859(1986))；xylE基因(Zukowsky等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)80：1101-1105(1983))，该基因编码可以转变显色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶；α-淀粉酶基因(Ikatu等，Bio/Technol.8：241-242(1990))；酪氨酸酶基因(Katz等，J.Gen.Microbiol.129：2703-2714(1983))，该基因编码能够将酪氨酸氧化为DOPA和多巴醌的酶，DOPA和多巴醌进而缩合为黑素；α-半乳糖苷酶，该酶将转变显色α-半乳糖底物。
术语“选择标记基因或筛选标记基因”也包括编码分泌标记的基因，分泌标记的分泌可以通过对转化细胞的鉴定或选择进行检测。实例包括编码可以通过抗体相互作用鉴定的分泌性抗原的标记或者甚至可以用催化方法检测的分泌性酶。分泌性蛋白分为许多类别，包括可检测(例如通过ELISA)的小的扩散蛋白、可在胞外溶液中检测到的小的活性酶(α-淀粉酶、β-内酰胺酶、膦丝菌素转移酶)或在细胞壁中插入或捕获的蛋白(例如包括在延伸表达单位或烟草PR-S中存在的前导序列的蛋白)。其它可能的选择标记基因和/或筛选标记基因对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
有许多将转化核酸分子导入植物细胞中的方法。一般认为合适的方法实际上包括可以将核酸分子导入细胞中的任何方法，例如通过土壤杆菌感染或者直接传递核酸分子，例如通过PEG介导的转化，电穿孔或加速DNA包被粒子等(Potrykus等，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.42：205-225(1991)；Vasil等，Plant Mol.Biol.25：925-937(1994))。例如，已经用电穿孔来转化玉米原生质体(Fromm等，Nature312：791-793(1986))。
适于将转化DNA导入宿主植物细胞的其它载体系统包括但不限于双元人工染色体(BIBAC)载体(Hamilton等，Gene 200：107-116(1997))；和用RNA病毒载体转染(Della-Cioppa等，Ann.N.Y.Acad.Sci.(1996)，792(Engineering Plants for Commercial Products andApplications)，57-61)。另外的载体系统也包括植物选择性YAC载体，例如描述于以下文献的那些载体：Mullen等，Molecular breeding4：449-457(1988)。
将DNA导入细胞中的技术是本领域技术人员熟知的。已经描述了用于将基因传递至细胞中的4种常用方法：(1)化学方法(Graham和van der Eb，Virology 54：536-539(1973))；(2)物理方法，例如微注射(Capecchi，Cell 22：479-488(1980))、电穿孔(Wong和Neumann，Biochem.Biophys.Res.Commun.107：584-587(1982)；Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)82：5824-5828(1985)；美国专利第5,384,253号)、基因枪(Johnston和Tang，Methods Cell Biol.43：353-365(1994))和真空过滤(Bechtold等，C.R.Acad.Sci.Paris，Life Sci.316：1194-1199(1993))；(3)病毒载体(Clapp，Clin.Perinatol.20：155-168(1993)；Lu等，J.Exp.Med.178：2089-2096(1993)；Eglitis和Anderson，Biotechniques 6：608-614(1988))；和(4)受体介导的机制(Curiel等，Hum.Gen.Ther.3：147-154(1992)；Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)89：6099-6103(1992))。
可以使用的加速方法包括例如微弹轰击等。将转化核酸分子传递至植物细胞的一种方法的实例是微弹轰击。有关该方法的综述参见Yang和christou(编著)，Particle Bombardment Technology for GeneTransfer，Oxford Press，Osford，England(1994)。在该方法中，可以用核酸包被非生物粒子(微弹)，然后通过推进力将其传递至细胞中。典型的粒子包括由钨、金、铂等构成的粒子。
微弹轰击除了是可再现的转化单子叶植物的有效方法外，其一个特殊优点是既不需要分离原生质体(Cristou等，Plant Physiol.87：671-674(1988))，又不需要对土壤杆菌感染的敏感性。用于通过加速将DNA传递至玉米细胞中的方法的一个说明性实施方案是基因枪(biolistics)α-粒子传递系统，它可以用来将包有DNA的粒子通过筛网，例如不锈钢筛网或Nytex筛网，推进到覆盖有悬浮培养的玉米细胞的滤膜表面上。Gordon-Kamm等介绍了用DNA包被钨粒子的基本程序(Gordon-Kamm等，Plant Cell 2：603-618(1990))。所述筛网分散钨核酸酸粒子，使得它们不会以大聚集物传递至受体细胞。适用于本发明的粒子传递系统是氦加速PDS-1000/He枪，可得自Bio-RadLaboratories(Bio-Rad，Hercules，California)(Sanford等，Technique 3：3-16(1991))。
关于所述轰击，可以将悬浮细胞在滤膜上浓缩。含有待轰击的细胞的滤膜位于微弹(microprojectile)阻止板之下适当的距离处。如有需要，还可以在所述枪和待轰击细胞之间放置一个或多个筛网。
另一方面，可以将未成熟胚或其它靶细胞放置在固体培养基上。待轰击细胞位于微弹阻止板之下适当的距离处。如有需要，还可以在加速装置和待轰击细胞之间放置一个或多个筛网。通过利用本文叙述的技术，人们可以获得1000个或更多的瞬时表达标记基因的细胞转化灶。在轰击后48小时转化灶中表达所述外源基因产物的细胞数范围通常为1-10个，平均1-3个。
在轰击转化中，人们可以优化轰击前培养条件和轰击参数，以产生最大数目的稳定转化体。轰击的物理参数和生物学参数在该技术中均是重要的。物理因素是涉及操作所述DNA/微弹沉淀或影响宏弹(macroprojectile)或微弹射程和速度的因素。生物学因素包括涉及在轰击之前以及紧随轰击后的细胞操作的所有步骤，有助于减轻与轰击相关创伤的靶细胞的渗透调节以及转化DNA的性质，例如线性化DNA或完整的超螺旋质粒。人们认为轰击前操作对于成功转化未成熟胚尤为重要。
在另一个替代的实施方案中，可以稳定地转化质体。在高等植物中质体转化所公开的方法包括含有选择标记的DNA的粒子枪传递并且通过同源重组将所述DNA靶向质体基因组(Svab等，Proc.Natl.Acad Sci.(U.S.A.)87：8526-8530(1990)；Svab和Maliga等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)90：913-917(1993)；Staub和Maliga等，EMBO J.12：601-606(1993)；美国专利5,451,513和5,545,818)。
因此，设想了人们可能需要在小规模研究中调节各种轰击参数，以全面优化所述条件。人们可能特别希望调节诸如间隙距离、飞行距离、组织距离和氦气压之类的物理参数。人们也可以通过修改影响受体细胞生理状态和可能因此影响转化和整合效率的条件，使创伤减少因素最小化。例如，可以调节渗透状态、组织水合作用和受体细胞的传代培养阶段或细胞周期，以使转化最佳。根据本说明书，其它常规调节的实施是本领域技术人员已知的。
土壤杆菌介导的转移是将基因导入植物细胞中的广泛适用的系统，因为可以将所述DNA导入全部植物组织中，由此绕过由原生质体再生完整植株的需要。应用土壤杆菌介导的植物整合型载体将DNA导入植物细胞是本领域熟知的。参见例如已描述的方法(Fraley等，Bio/Technology 3：629-635(1985)；和Rogers等，Methods Enzymol.153：253-277(1987))。此外，Ti-DNA的整合是一种比较精确的方法，几乎不导致重排。转移的DNA区由边界(border)序列限定，通常将间插DNA插入植物基因组中，如已描述的(Spielmann等，Mol.Gen.Genet.205：34(1986))。
现代土壤杆菌转化载体能够在大肠杆菌以及土壤杆菌中复制，提供方便的操作，如已描述的(Klee等，载于：Plant DNA InfectiousAgents，Honh和Schell(编著)，Springer-Verlag，New York，第179-203页，(1985))。此外，近来在用于土壤杆菌介导的基因转移的载体方面的技术进展已经改进了所述载体中基因和限制位点的布置，以便于构建能够表达各种多肽编码基因的载体。已描述的载体具有方便的多接头区，多接头区侧翼为用于指导所插入多肽编码基因表达的启动子和聚腺苷酸化位点，这些载体适用于本发明目的(Rogers等，Methods Enzymol.153：253-277(1987))。另外，含有致瘤性和非致瘤性Ti基因的土壤杆菌可以用于转化。在土壤杆菌介导的转化有效的那些植物品种中，所述基因转移由于其易得和明确特性而成为优先选择的方法。
采用土壤杆菌转化法产生的转基因植物通常在一条染色体上含有一个基因。这样的转基因植物也可称为所加入基因的杂合型植物。更优选对加入的结构基因为纯合的转基因植物；即含有两个所加入基因的转基因植物，一对染色体的每条染色体上的同一基因座都有一个基因。纯合转基因植物可以通过使含有一种所加入基因的独立分离转基因植物进行有性交配(自交)来获得，使所产生的某些种子萌发，并分析目标基因所产生的植株。
人们也知道，也可以使两种不同的转基因植物交配，以产生含有两个独立分离的外源基因的后代。使合适的子代自交可以产生两个所加入的编码目的多肽的外源基因均纯合的植物。也设想了与亲本植株回交和与非转基因植株远交(out-crossing)，无性繁殖也是如此。
采用基于磷酸钙沉淀法、聚乙二醇处理、电穿孔和这些处理的组合的方法，可以完成植物原生质体转化(参见例如Potrykus等，Mol.Gen.Genet.205：193-200(1986)；Lorz等，Mol.Gen.Genet.199：178(1985)；Fromm等，Nature 319：791(1986)；Uchimiya等，Mol.Gen.Genet.204：204(1986)；Marcotte等，Nature 335：454-457(1988))。
这些系统对不同植物品种的应用取决于由原生质体再生该特定植物品种的能力。描述了用于由原生质体再生谷类作物的说明性方法(Fujimura等，Plant Tissue Culture Letters 2：74(1985)；Toriyama等，Theor.Appl.Genet.205：34(1986)；Yamada等，Plant Cell Rep.4：85(1986)；Abdullah等，Biotechnology 4：1087(1986))。
为了转化不能由原生质体成功再生的植物品种，可以利用将DNA导入完整细胞或组织的其它方法。例如，如已描述的方法，可以实现由未成熟胚或外植体再生谷类作物(Vasil，Biotechnology 6：397(1988))。另外，可以使用“粒子枪”或高速微弹技术(Vasil，Bio/Technology 10：667(1992))。
采用后一技术，如已描述的方法，可以将DNA通过细胞壁导入到金属微粒表面的细胞质中(Klein等，Nature 328：70(1987)；Klein等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)87：8502-8505(1988)；McCabe等，Bio/Technology 6：923(1988))。金属粒子穿过几层细胞，因而使组织外植体内的细胞转化。
也可以使用细胞转化的其它方法，包括但不限于通过直接DNA转移入花粉，将DNA导入植物中(Hess等，Intern Rev.Cytol.107：367(1987)；Luo等，Plant Mol Biol.Reporter 6：165(1988))，通过将DNA直接注射到植物的繁殖器官(Pena等，Nature 325：274(1987))或将DNA直接注射到未成熟胚的细胞中，然后让干燥胚再吸水(Neuhaus等，Theor.Appl.Genet.75：30(1987))。
由单一植物原生质体转化体或各种转化外植体再生、发育和栽培植株是本领域熟知的(Weissbach和Weissbach，载于：Methods forPlant Molecular Biology，Academic Press，San Diego，CA，(1988))。这种再生和生长过程通常包括下述步骤：选择转化细胞、将那些个体化细胞培养至通常的胚发育阶段至生根的小植株阶段。转基因胚和种子的再生是相似的。此后将所产生的转基因生根苗种植在合适的植物生长介质例如土壤中。
含有编码目标蛋白的外来外源基因的植株的发育或再生是本领域熟知的。优选让所述再生植株自花授粉，以提供纯合的转基因植物。或者，使从再生植株获得的花粉与农学上重要品系的种子繁育植株杂交。相反，用来自这些重要品系植株的花粉给再生植株传粉。采用本领域技术人员熟知的方法，培育本发明的含有所需多肽的转基因植物。
有许多由植物组织再生植株的方法。具体的再生方法取决于原始植物组织和需要再生的具体植物种。
已经发表了主要利用根癌土壤杆菌的、用于棉花(美国专利第5,004,863号；美国专利第5,159,135号；美国专利第5,518,908号)、大豆(美国专利第5,569,834号；美国专利第5,416,011号；McCabe等，Biotechnology 6：923(1988)；Christou等，Plant Physiol.87：671-674(1988))、芸苔属(Brassica)(美国专利第5,463,174号)、花生(Cheng等，Plant Cell Rep.15：653-657(1996)；McKently等，Plant Cell Rep.14：699-703(1995))、番木瓜、豌豆(Grant等，Plant Cell Rep.15：254-258(1995))和拟南芥(Bechtold等，C.R.Acad.Sci.Paris，Life Sci.316：1194-1199(1993))的转化双子叶植物并获得转基因植物的方法。用于转化拟南芥的后一方法通常称为“浸渍(dipping)”或真空浸润或种质转化。
也已经报道了利用电穿孔、微粒轰击和土壤杆菌转化单子叶植物。在天门冬(Bytebier等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)84：5354(1987))、大麦(Wan和Lemaux，Plant Physiol.104：37(1994))、玉米(Rhodes等，Science 240：204(1988)；Gordon-Kamm等，Plant Cell 2：603-618(1990)；Fromm等，Bio/Technology 8：833(1990)；Koziel等，Bio/Technology 11：194(1993)；Armstrong等，Crop Science 35：550-557(1995))、燕麦(Somers等，Bio/Technology 10：1589(1992))、鸭茅(Horn等，Plant Cell Rep.7：469(1988))、水稻(Toriyama等，Theor Appl.Genet.205：34(1986)；Part等，Plant Mol.Biol.32：1135-1148(1996)；Abedinia等，Aust.J.Plant Physiol.24：133-141(1997)；Zhang和Wu，Theor.Appl.Genet.76：835(1988)；Zhang等，Plant Cell Rep.7：379(1988)；Battraw和Hall，Plant Sci.86：191-202(1992)；Christou等，Bio/Technology 9：957(1991))、黑麦(De La Pena等，Nature 325：274(1987))、甘蔗(Bower和Birch，Plant J.2：409(1992))、苇状羊茅(Wang等，Bio/Technology 10：691(1992))和小麦(Vasil等，Bio/Technology 10：667(1992)；美国专利第5,631,152)中已经达到转化和植株再生。
通过聚乙二醇处理、电穿孔或微粒轰击，将克隆核酸构建体导入植物细胞中，已经开发出根据所述核酸分子的瞬时表达来测定基因表达(Marcotte等，Nature 335：454-457(1988))；Marcotte等，Plant Cell1：523-532(1989)；McCarty等，Cell 66：895-905(1991)；Hattori等，GenesDev.6：609-618(1992)；Goff等，EMBO J.9：2517-2522(1990))。瞬时表达系统可以用来在功能上分析基因构建体(一般参见Mailga等，Methods in Plant Molecular Biology，Cold Spring Harbor Press(1995))。
可以将本发明的任何核酸分子与其它遗传元件例如载体、启动子、增强子等一起以永久性或瞬时方式导入植物细胞中。此外，可以将本发明的任何核酸分子以允许由所述核酸分子编码的蛋白或其片段表达或过量表达的方式导入植物细胞中。
共抑制是降低特定内源基因或基因家族的表达水平、通常是在RNA水平上降低其表达水平，由于能够转录与内源基因的转录物相同的链的mRNA的同源有义构建体的表达所致(Napoli等，Plant Cell2：279-289(1990)；van der Krol等，Plant Cell 2：291-299(1990))。共抑制可以由于用与所述细胞中存在的核酸序列同源的单拷贝核酸分子稳定转化所引起(Prolls和Meyer，Plant J.2：465-475(1992))或者用与所述细胞中存在的核酸序列同源的多拷贝核酸分子稳定转化所引起(Mittlesten等，Mol.Gen.Genet.244：325-330(1994))。即使是与同源启动子连接的不同基因也可以导致连锁基因的共抑制(Vaucheret，C.R.Acad.Sci.III 316：1471-1483(1993)；Flavell，Proc.Natl.Acad Sci.(U.S.A.)91：3490-3496(1994)；van Blokland等，Plant J.6：861-877(1994)；Jorgensen，Trends Biotechnol.8：340-344(1990)；Meins和Kunz，载于：Gene Inactivation and Homologous Recombination in Plants，Paszkowski(编著)，第335-348页，Kluwer Academic，荷兰(1994))。
人们知道，可以将本发明的一种或多种核酸导入植物细胞中，使用合适的启动子进行转录，其中所述转录导致内源蛋白的共抑制。
反义方法是一种通过靶向遗传材料防止或降低基因功能的方法(Mol等，FEBS Lett.368：427-430(1990))。反义方法的目的是利用与靶基因互补的序列阻断其表达并且产生一种所选蛋白水平选择性降低或消除的突变细胞系或生物体。反义技术有几个优于其它“反遗传”方法的优点。失活位点及其发育效应可以通过选择反义基因的启动子进行操作，或者通过定时外部施用或微注射进行操作。反义可以通过选择靶基因的独特区或与其它相关基因共享同源性的区来控制其特异性(Hiatt等，载于：Genetic Engineering，Setlow(编著)，第11卷，New York：Plenum 49-63(1989))。
反义RNA技术涉及将与靶mRNA互补的RNA导入细胞中，产生通过在反义底物和靶mRNA之间的碱基配对所形成的特异性RNA：RNA双链体(Green等，Annu.Rev.Biochem.55：569-597)。在一个实施方案下，所述方法涉及反义基因序列的导入和表达。这样的序列是其中将正常基因序列的部分或全部置于处于反向启动子的控制之下致使“错误”或互补链被转录为与所述靶mRNA杂交并干扰其表达的非编码反义RNA的序列(Takayama和Inouye，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.25：155-184(1990))。通过标准方法构建反义载体，并将其通过转化、转染、电穿孔、微注射、感染等方法导入细胞中。转化的类型和载体的选择将决定表达是瞬时的还是稳定的。反义基因所用的启动子可以影响反义抑制的水平、定时、组织、特异性或诱导性。
人们知道，蛋白在植物细胞中的活性可以通过培育含有其非转录链编码蛋白或其片段的核酸分子的转化植物细胞而降低或抑制。
转录后基因沉默(PTGS)可以导致植物中的病毒免疫或基因沉默。PTGS为dsRNA所诱导并且为RNA依赖性RNA聚合酶所介导，所述聚合酶存在于细胞质中，需要dsRNA模板。通过使互补转基因mRNA或同一转录物的互补区的杂交，形成dsRNA。通过利用来自植物基因组中位于同一位点上的一个有义基因和一个反义基因的转录物、一种具有自交互补性的转录物或者来自通过杂交连在一起的基因的有义和反义转录物，可以完成双链体的形成。所述dsRNA依赖性RNA聚合酶从转基因mRNA形成互补链，并且RNAse分子与该互补链(cRNA)连接。这些cRNA和RNA酶分子与内基因(endogene)mRNA杂交并且切割与该杂交体相邻的单链RNA。所述经切割的单链RNA被其它宿主RNA酶进一步降解，因为经切割的单链RNA的一个末端缺乏加帽的5′端，而另一个末端缺乏poly(A)尾(Waterhouse等，PNAS 95：13959-13964(1998))。
人们知道，可以将本发明的一种或多种核酸导入植物细胞中，并且利用合适的启动子转录，其中这样的转录导致内源转录物的转录后基因沉默。
各种抗体在植物中已得到表达(Hiatt等，Nature 342：76-78(1989)；Conrad和Fielder，Plant Mol.Biol.26：1023-1030(1994))。据报道svFv(单链Fv抗体)的胞质表达延迟菊芋斑驳皱缩病毒的感染。表达针对内源蛋白的抗体的转基因植物可以表现出生理效应(Philips等，EMBOJ.16：4489-4496(1997)；Marion-Poll，Trends in Plant Science 2：447-448(1997))。例如，据报道已表达抗脱落酸抗体导致种子发育的一般微扰(Philips等，EMBO J.16：4489-4496(1997))。
催化性抗体也可以在植物中得到表达(抗体酶)。抗体酶的原理在于由于抗体可以针对许多分子而产生，因此可以控制这种识别能力产生结合过渡态的抗体，迫使化学反应向前(Persidas，NatureBiotechnology 15：1313-1315(1997)；Baca等，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.16：461-493(1997))。定点诱变可以增强抗体酶的催化能力。抗体酶的实例在例如以下专利中有介绍：美国专利第5,658,753号、美国专利第5,632,990号、美国专利第5,631,137号、美国专利5,602,015、美国专利第5,559,538号、美国专利第5,576,174号、美国专利第5,500,358号、美国专利第5,318,897号、美国专利第5,298,409号、美国专利第5,258,289号和美国专利第5,194,585号。
人们知道，本发明的任何抗体都可以在植物中得到表达并且这样的表达可以产生生理效应。人们也知道，任何已表达抗体都可以是催化性的。
本发明植物表型的改变是相对于具有相似的遗传背景但缺乏所导入的目标核酸的植物的。在一个优选的方面，相似的遗传背景是其中所比较的生物共享其核遗传材料的50％或50％以上的背景。在一个更优选的方面，相似的遗传背景是其中所比较的生物共享其核遗传材料的75％或75％以上、甚至更优选90％或90％以上的背景。在另一个甚至更优选的方面，相似的遗传背景是其中所比较的生物是植物并且所述植物为等基因植物的背景，只是采用植物转化技术最初导入的任何遗传材料例外。
本发明也提供本发明植物的部分，特别是繁殖部分或贮藏部分。植物部分包括但不限于种子、胚乳、胚珠和花粉。在本发明一个特别优选的实施方案中，所述植物部分是种子。在一个实施方案中，所述种子是动物饲料的成分。
在另一个实施方案中，所述植物部分是果实，更优选贮藏期限延长的果实。在另一个优选的实施方案中，所述果实的生育酚水平增加。
本发明也提供装有超过10,000粒种子、更优选20,000粒种子、甚至更优选40,000粒种子的容器，其中所述种子的10％以上、更优选25％、更优选50％、甚至于更优选75％或90％是从本发明植物获得的种子。
本发明也提供装有超过10kg种子、更优选25kg种子、甚至更优选50kg粒种子的容器，其中所述种子的10％以上、更优选25％、更优选50％、甚至于更优选75％或90％是从本发明植物获得的种子。
可以对本发明的任何植物或其部分进行加工，以生产饲料、食品、蛋白制剂或油制品。对于该目的一个特别优选的植物部分是种子。在一个优选的实施方案中，所述饲料、食品、蛋白制剂或油制品为反刍动物所设计。饲料、食品、蛋白制剂或油制品的生产方法是本领域已知的。参见例如美国专利4,957,748、5,100,697、5,219,596、5,936,069、6,005,076、6,146,669和6,156,227。在一个优选的实施方案中，所述蛋白制剂为高蛋白制剂。这样的高蛋白制剂的蛋白含量优选高于5％w/v，更优选高于10％w/v，甚至更优选高于15％w/v。在一种优选的油制品中，所述油制品是高油制品，其中从本发明植物或其部分获得的油含量高于5％w/v，更优选高于10％w/v，甚至更优选高于15％w/v。在一个优选的实施方案中，所述油制品为液体并且其体积超过1升、5升、10升或50升。本发明提供用本发明植物生产的或者用本发明方法生产的油。这样的油可以是任何所得产品的次要成分或主要成分。此外，可以将这样的油与与其它油混合。在一个优选的实施方案中，用本发明植物生产的或者用本发明方法生产的油以体积或重量计占任何产品中油类成分的0.5％以上、1％以上、5％以上、10％以上、15％以上、50％以上、75％以上或90％以上。在另一个实施方案中，可以将所述油制品混合，并且可以以体积计占所述混合物的10％以上、25％以上、35％以上、50％以上或75％以上。可以将用本发明植物生产的油与一种或多种有机溶剂或石油馏出物混合。
本发明的植物可以是育种程序的一部分或者由其产生。育种法的选择取决于植物繁殖的模式、改良性状的遗传力和商业上所用栽培品种的类型(例如F1杂种栽培品种、纯系栽培品种等)。本发明植物的所选非限制性育种法如下所述。可以采用任种杂交后代的标记辅助选择改进育种程序。人们还知道，在育种程序中可以使用任何商业和非商业栽培品种。各种因素如出苗势、营养势、逆境耐受性、抗病性、分枝、开花、结籽、籽粒大小、种子容重、抗倒伏能力和脱粒能力等一般决定所述选择。
对于高遗传性状，对单一地点评价的优良单株进行选择将是有效的，而对于遗传力低的性状，根据相关植株家系的重复评价所获得的平均值进行选择。普及选择方法通常包括谱系选择、改良谱系选择、混合选择和轮回选择。在一个优选的实施方案中，进行回交或轮回育种程序。
遗传的复杂性影响育种法的选择。回交育种可以用来将一个或几个对高遗传性状有利的基因转移到所需的栽培品种中。该方法已广泛用来培育抗病栽培品种。各种轮回选择技术用来改良由多基因控制的数量遗传性状。轮回选择在自花授粉作物中的应用取决于授粉的容易程度、每次授粉的成功杂种的频率和来自每次成功杂交的杂种后代的数目。
可以对育种系进行测试并将其与两代或两代以上的商业目标区代表性环境中的合适标准品进行比较。最佳品系为新商业栽培品种的候选品系；性状上仍有缺陷的那些品系可以用作亲本，产生新群体，可供进一步选择。
一种鉴定优良植株的方法是观察其与其它实验植株和大范围生长的标准栽培品种相比的性能。如果一次观察没有结论，则重复观察可以达到对其遗传值的更好估计。育种人员可以选择两个或两个以上的亲本系并使其杂交，然后重复自交并进行选择，以产生许多新的遗传组合。
新栽培品种的开发要求对品种进行开发和选择，使这些品种进行杂交和选择优良杂种杂交。可以通过在所选雄性能育亲本间进行人工杂交或者采用雄性不育系统，产生杂交种子。杂种根据某些单基因性状例如豆荚颜色、花序颜色、种子产量、茸毛颜色或除草剂抗性等进行选择，以证明该种子是真正的杂交种子。亲本系以及杂种表型的其它数据影响育种人员决定是否继续进行特定杂种的杂交。
谱系育种法和轮回选择育种法可以用来开发来自育种群体的栽培品种。育种程序使来自两个或两个以上的栽培品种或基于各种宽范围来源的所需性状组合形成由所需表型的自交和选择开发的栽培品种的育种库。对新栽培品种进行评价，以决定其是否具有商业潜力。
谱系育种通常用来改良自花授粉作物。使具有有利互补性状的两个亲本杂交，产生F1。通过使1株或若干株F1自交，产生F2群体。对来自最佳家系的最佳单株进行选择。在F4代可以开始对家系进行重复测试，以改进遗传力低的性状的选择效率。在近交后期(即F6和F7)，对最佳系或表型上相似的系的混合系成为新栽培品种的潜力进行测试。
回交育种已经用来将控制简单遗传的高遗传性状的基因转移到作为轮回亲本的所需纯合栽培品种或近交系中。需要转移的性状来源称为供体亲本。预期所产生的植株具有轮回亲本(例如栽培品种)的属性和从供体亲本转移的所需性状。初次杂交后，对具有供体亲本表型的个体进行选择，并且与轮回亲本重复杂交(回交)。预期所产生的亲本具有轮回亲本(例如栽培品种)的属性和从供体亲本转移的所需性状。
单粒种子世代程序在严格意义上是指将分离群体播种，每个植株收获一粒种子样品，然后用所述单粒种子样品种植下一代。当来自F2的群体发展到所需的近交水平，来自所述系的植株分别追溯到不同F2单株。由于某些种子不能萌发或者某些植株不能产生至少一粒种子，因此群体的植株数目每代都减少。结果，当世代递进完成时，并非群体中原始取样的所有F2植株都有子代。
在复粒种子程序中，育种人员通常从一个群体的每个植株收获一个或多个荚果，然后将其一起脱粒，形成混合种子。将所述混合种子的一部分用来播种下一代，而将另一部分贮藏。所述程序已被称为改良的单粒种子世代或荚果混合技术。
复粒种子程序已用来在收获时节省劳动力。从荚果中用机器脱粒比单粒种子程序用人工从各荚果取出1粒种子快得多。复粒种子程序也可以使每个近交世代的群体播种相同数目的种子。
有关不同性状和作物所常用的其它育种法的介绍可以在几种参考书中的任一本书中找到(例如Fehr，Principles of CultivarDevelopment，第1卷，第2-3页，(1987))。
本发明的转基因植物也可以采用无融合生殖来繁殖。无融合生殖是植物繁殖的一种可遗传控制方法，其中胚的形成不经卵子和精子的结合。无融合生殖有三种基本类型：1)无孢子生殖，其中胚由来源于珠心的胚囊中的染色体未减数卵发育而来，2)倍数孢子形成，其中胚由来源于大孢子母细胞的胚囊中的未减数卵发育而来，和3)不定胚生殖，其中胚直接由体细胞发育而来。在大多数形式的无融合生殖中，极核产生胚乳的假受精或受精对于种子活力是必不可少的。在无孢子生殖中，保育栽培品种可以用作种子中胚乳形成的花粉来源。保育栽培品种由于栽培品种的未减数卵孤雌发育，因此并不影响无孢子无融合生殖栽培品种的遗传，但可以产生胚乳。无融合生殖具有重要的经济价值，在转基因植物中尤其如此，因为它产生任何基因型，且与杂合性无关，因而使育种真实。因此，就无融合生殖而论，杂合转基因植物可以通过重复生活周期维持其遗传保真性。产生无融合生殖植物的方法是本领域已知的。参见美国专利第5,811,636号。
其它生物
可以将本发明的核酸导入任何细胞或生物例如哺乳动物细胞、哺乳动物、鱼细胞、鱼、鸟细胞、鸟、藻类细胞、藻类、真菌细胞、真菌或细菌细胞中。本发明的蛋白可以在合适的细胞或生物中产生。优选的宿主和转化体包括：真菌细胞例如曲霉属(Aspergillus)、酵母、哺乳动物、特别是牛和猪、昆虫、细菌和藻类。这类细胞或生物的转化方法是本领域已知的(EP 0 238 023；Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，81：1470-1474(1984)；Malardier等，Gene，78：147-156(1989)；Becker和Guarente，载于：Abelson和Simon(编著)，Guide toYeast Genetics and Molecular Biology，Method Enzymol.，第194卷，第182-187页，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，J.Bacteriology，153：163(1983)；Hinnen等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，75：1920(1978)；Bennett和LaSure(编著)，More Gene Manipualtionins in fungi，Academic Press，CA(1991))。本发明蛋白的生产方法也是已知的(Kudla等，EMBO，9：1355-1364(1990)；Jarai和Buxton，Current Genetics，26：2238-2244(1994)；Verdier，Yeast，6：271-279(1990)；MacKenzie等，Journal of Gen.Microbiol.，139：2295-2307(1993)；Hartl等，TIBS，19：20-25(1994)；Bergenron等，TIBS，19：124-128(1994)；Demolder等，J.Biorechnology，32：179-189(1994)；Craig，Science，260：1902-1903(1993)；Gething和Sambrook，Nature，355：33-45(1992)；Puig和Gilbert，J.Biol.Chem.，269：7764-7771(1994)；Wang和Tsou，FASEB Journal，7：1515-1517(1993)；Robinson等，Bio/Technology 1：138-384(1994)；Enderlin和Ogrydziak，Yeast，10：67-79(1994)；Fuller等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，86：1434-1438(1989)；Julius等，Cell，37：1075-1089(1984)；Julius等，Cell，32：839-852(1983))。
在一个优选的实施方案中，本发明蛋白或其片段在细胞或生物中的过量表达使得该细胞或生物相对于具有相似遗传背景的细胞或生物三烯生育酚水平增加。
在一个优选的实施方案中，本发明蛋白或其片段在细胞或生物中的过量表达使得该细胞或生物相对于具有相似遗传背景的未转化细胞或生物生育酚水平增加。
在一个优选的实施方案中，本发明蛋白或其片段在细胞或生物中的过量表达使得该细胞或生物相对于具有相似遗传背景的未转化细胞或生物α-生育酚水平增加。
在一个优选的实施方案中，本发明蛋白或其片段在细胞或生物中的过量表达使得该细胞或生物相对于具有相似遗传背景的未转化细胞或生物γ-生育酚水平增加。
在一个优选的实施方案中，本发明蛋白或其片段在细胞或生物中的过量表达使得该细胞或生物相对于具有相似遗传背景的未转化细胞或生物尿黑酸水平增加。
在一个优选的实施方案中，本发明蛋白或其片段在细胞或生物中的过量表达使得该细胞或生物相对于具有相似遗传背景的未转化细胞或生物质体醌醇或质体醌水平增加。
抗体
本发明的一方面涉及与本发明的一种或多种蛋白或肽分子及其同系物、融合体或片段特异性结合的抗体、单链抗原结合分子或其它蛋白。在一个特别优选的实施方案中，所述抗体与具有SEQ ID NO：2和4中所示的氨基酸序列的蛋白或其片段特异性结合。在另一个实施方案中，所述抗体与包含选自SEQ ID NO：2或4中所示的氨基酸序列的氨基酸序列的融合蛋白或其片段特异性结合。在另一个实施方案中，所述抗体与包含选自SEQ ID NO：2或4中所示的氨基酸序列的氨基酸序列的融合蛋白或其片段特异性结合。本发明的抗体可以用来定量或定性检测本发明的蛋白或肽分子，或者用来检测所述蛋白的翻译后修饰。本文所用的抗体或肽被认为与本发明的蛋白或肽分子“特异性结合”，如果这种结合不为存在的非相关分子所竞争性抑制的话。
编码本发明完整蛋白或其部分的核酸分子可以通过重组方法表达，以产生可以进而用来激发能够结合所表达蛋白或肽的抗体的蛋白或肽。这类抗体可以用于针对该蛋白的免疫测定。这类蛋白编码分子或其片段可以是“融合”分子(即较大核酸分子的一部分)，致使表达时，产生融合蛋白。人们知道，任一种本发明核酸分子可以通过重组方法表达，以产生由这些核酸分子编码的蛋白或肽。
特异性结合本发明蛋白和蛋白片段的抗体可以是多克隆抗体或者是单克隆抗体并且可以包含完整免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的抗原结合部分(例如(F(ab′)、F(ab′)2)或例如通过重组方法产生的单链免疫球蛋白。人们知道，专业人员熟悉描述抗体构建、操作和分离的具体条件和程序的标准资源材料(参见例如Harlow和Lane，载于：Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，New York(1988))。
如下所述，这种抗体分子或其片段可以用于诊断目的。在所述抗体用于诊断目的情况下，可能最好将其例如用配体基团(例如生物素)或可检测标记基团(例如荧光基团、放射同位素或酶)衍生化。
产生结合本发明蛋白或肽分子的抗体的能力使得可以鉴定衍生自该类分子的模拟化合物。这些模拟化合物可以含有所述蛋白或肽的片段或者仅含有结构上相似的区，尽管如此仍表现出特异性结合针对该化合物的抗体的能力。
示例性用途
本发明的核酸分子及其片段可以用来获得同一物种的其它核酸分子(来自玉米的核酸分子可以用来获得来自玉米的其它核酸分子)。这样的核酸分子包括完整蛋白编码序列以及启动子和该分子的侧翼序列。另外，这样的核酸分子包括编码其它同工酶或基因家族成员的核酸分子。这样的分子可以容易地通过应用上述核酸分子或其片段筛选cDNA或基因组文库来获得。这种文库的制备方法是本领域熟知的。
本发明的核酸分子及其片段也可以用来获得核酸同系物。这样的同系物包括植物和包括细菌和真菌在内的其它生物的核酸分子，包括编码其它植物种或其它生物的完整或部分蛋白同源物的核酸分子、遗传元件序列，例如启动子和转录调节元件。这样的分子可以容易地通过应用上述核酸分子或其片段筛选从这类植物种中获得的cDNA或基因组文库来获得。这种文库的制备方法是本领域熟知的。这样的同系物分子可能在其核苷酸序列方面与SEQ ID NO：1和3中的一个或多个及其互补序列中发现的核苷酸序列不同，因为完全互补性并不是稳定杂交所必需的。因此，本发明的核酸分子也包括尽管能够与所述核酸分子特异性杂交但可能缺乏“完全互补性”的分子。
各种各样方法中的任一种方法可以用来获得一种或多种上述核酸分子(Zamechik等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)83：4143-4146(1986)；Goodchild等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85：5507-5511(1988)；Wickstrom等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85：1028-1032(1988)；Holt等，Molec.Cell.Biol.8：963-973(1988)；Gerwirtz等，Science 242：1303-1306(1988)；Anfossi等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86：3379-3383(1989)；Becker等，EMBO J.8：3685-3691(1989))。自动化核酸合成仪可以用于此目的。代替这种合成，所公开的核酸分子可以用来限定可以用于聚合酶链式反应的一对引物(Mullis等，Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.51：263-273(1986)；Erlich等的欧洲专利50,424、欧洲专利84,796、欧洲专利258,017、欧洲专利237,362；Mullis的欧洲专利201,184；Mullis等的美国专利4,683,202；Erlich的美国专利4,582,788和Saiki等美国专利4,683,194)，以扩增并获得任何所需的核酸分子或片段。
采用本文提供的公开核酸序列，也可以获得与所公开的核酸序列中的一种或多种相关的启动子序列和其它遗传元件，包括但不限于转录调节侧翼序列。在一个实施方案中，这样的序列如下获得：将本发明的核酸分子与基因组文库成员一起温育，并且回收与该核酸分子杂交的克隆。在第二个实施方案中，“染色体步查”法或反向PCR可用来获得所述序列(Frohman等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85：8998-9002(1988)；Ohara等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86：5673-5677(1989)；Pang等，Biotechniques 22：1046-1048(1977)；Huang等，Methods Mol.Biol.69：89-96(1997)；Huang等，Method Mol.Biol.67：287-294(1997)；Benkel等，Genet.Anal.13：123-127(1996)；Hartl等，Methods Mol.Biol.58：293-301(1996))。术语“染色体步查”是指通过连续杂交步骤延伸基因图谱的方法。
本发明的核酸分子可以用来分离细胞增加性、细胞特异性、组织增加性、组织特异性、发育或环境调节表达分布型的启动子。对来自基因组文库的这些基因5′侧翼启动子序列进行分离和功能分析，例如，采用基因组筛选方法和PCR技术，将导致分离出有用的启动子和转录调节元件。这些方法是本领域技术人员已知的并且已有描述(参见例如Birren等，Genome Analysis：Analyzing DNA，1，(1997)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。利用本发明核酸分子获得的启动子也可经过修饰，以实现其控制特征。所述修饰序列的实施将包括但不限于增强子序列。所述遗传元件可以用来增强作物改良新性状和现有性状的基因表达。
本发明核酸分子的另一亚组包括作为标记的核酸分子。所述标记可以以分子遗传学领域多种常规方式使用。所述标记包括核酸分子SEQ ID NO：1和3、其互补序列、可用作标记的任一序列的片段以及可用作标记的本发明的其它核酸分子。
本发明的遗传标记包括“显性”标记或“共显性”标记。“共显性标记”揭示出在一个基因座存在两个或两个以上的等位基因(每个二倍体个体两个等位基因)。“显性标记”揭示出每个基因座仅存在一个等位基因。显性标记表型(例如DNA带)的存在表示一个等位基因或者是在纯合条件下或者是在杂合条件下。显性标记表型的不存在(例如不存在DNA带)仅证实存在“某些其它”未定义的等位基因。在其中个体主要为纯合的而基因座主要为双态性的群体的情况下，显性和共显性标记可能具有同等价值。由于群体趋于更多杂合和复等位基因，因此共显性标记比显性标记的基因型信息更多。标记分子可以例如能够检测多态性，例如单核苷酸多态性(SNP)。
动植物基因组在其不断进化的过程中自然经历自发突变(Gusella，Ann.Rev.Biochem.55：831-854(1986))。“多态性”是同一物种的某些成员中出现的基因序列或其侧翼区的变异或差异。所述变异序列和“原始”序列在所述物种的群体中共存。在某些情况下，所述共存为稳定平衡的或准稳定平衡。
因此，“多态性”被认为是“等位基因的”，因为由于多态性的存在，因此，群体的某些成员可能具有原始序列(即原始“等位基因”)，而其它成员可能具有变异序列(即变异“等位基因”)。在最简单的情况下，可以仅存在一种变异序列，因此，所述多态性被认为是二等位基因的。在其它情况下，所述物种的群体可以含有复等位基因，因而所述多态性称为三等位基因的等等。一个基因可以具有多种不同的不相关多态性。例如，它可以在一个位点具有二等位基因多态性，而在另一个位点具有多等位基因多态性。
限定多态性的变异范围可以在一个基因中从一个核苷酸变异至插入或缺失延伸区。在某些情况下，所述DNA序列变异在特征为包括核苷酸串联二核苷酸或三核苷酸重复基序的短串联重复(STR)的基因组区内。特征为所述串联重复的多态性被称为“可变数目的串联重复”(″VNTR″)多态性。已经将VNTR用于同一性分析(Weber，美国专利5,075,217；Armour等，FEBS Lett.307：113-115(1992)；Jones等，Eur.J.Haematol.39：144-147(1987)；Horn等，PCT专利申请WO91/14003；Jeffreys，欧洲专利申请370,719；Jeffreys，美国专利5,175,082；Jeffreys等，Amer.J.Hum.Genet.39：11-24(1986)；Jeffreys等，Nature 316：76-79(1985)；Gray等，Proc.R.Acad.Soc.Lond.243：241-253(1991)；Moore等，Genomics 10：654-660(1991)；Jeffreys等，Anim.Genet.18：1-15(1987)；Hillel等，Anim.Genet.20：145-155(1989)；Hillel等，Genet.124：783-789(1990))。
通过使用核酸扩增法可能便于检测DNA样品中的多态位点。这样的方法特异性增加跨越所述多态位点或者包括该位点以及距其较远或较近的序列的多核苷酸的浓度。所述经扩增的分子可以容易地通过凝胶电泳或其它方法检测。
在一个替代的实施方案中，所述多态性可以通过使用与所述多态性物理连锁的标记核酸分子进行检测。为此，可以使用包含位于1mb多态性内、更优选100kb多态性内、最优选10kb多态性内的多核苷酸的核苷酸序列的标记核酸分子。
多态性的鉴定可以以各种各样的方式来确定。通过植物中多态性的存在或不存在与表型的存在或不存在的关系，可以预测该植物的表型。如果多态性产生或破坏限制性内切核酸酶切割位点，或者如果它导致DNA的缺失或插入(例如VNTR多态性)，则它将改变用所述限制性内切核酸酶消化所产生的DNA片段的大小或分布型。因此，通过限制性片段分析，可以将具有变异序列的生物与具有原始序列的生物区分开来。可以用这种方法鉴定的多态性称为“限制性片段长度多态性”(″RFLP″)(Glassberg，英国专利申请2135774；Skolnick等，Cytogen.Cell Genet.32：58-67(1982)；Botstein等，Ann.J.Hum.Genet.32：314-331(1980)；Fischer等，PCT申请WO90/13668；Uhlen，PCT申请WO90/11369)。
多态性也可以通过单链构象多态性(SSCP)分析进行鉴定(Elles，Methods in Molecular Medicine：Molecular Diagnosis of GeneticDiseases，Humana Press(1996))；Orita等，Genomics 5：874-879(1989))。有关SSCP的各种各样的方案描述于包括但不限于以下的文献：Lee等，Anal.Biochem.205：289-293(1992)；Suzuki等，Anal.Biochem.192：82-84(1991)；Lo等，Nucleic Acids Research 20：1005-1009(1992)；Sarkar等，Genomics 13：441-443(1992)。人们知道，本发明的一种或多种核酸可以用作标记或探针，以通过SSCP分析检测多态性。
也可以运用称为扩增片段长度多态性(AFLP)的DNA指纹分析技术，发现多态性，AFLP基于选择性PCR扩增来自完全消化基因组DNA的限制性片段，以对该DNA进行分析(Vos等，Nucleic Acids Res.23：4407-4414(1995))。该方法允许大量限制性片段进行特异性共扩增，该限制性片段通过PCR显现，无需了解核酸序列。人们知道，本发明的一种或多种核酸可以用作标记或探针，以通过AFLP分析或指纹分析RNA检测多态性。
也可以运用随机扩增多态DNA(RAPD)(Williams等，Nucl.AcidsRes.18：6531-6535(1990))和可切割扩增多态序列(CAPS)(Lyamichev等，Science 260：778-783(1993))，发现多态性。人们知道，本发明的一种或多种核酸分子可以用作标记或探针，以通过RAPD或CAPS分析检测多态性。
单核苷酸多态性(SNP)的存在频率一般比其它多态标记的存在频率高，并且在其整个基因组中的间隔一致性比其它报道的多态性形式的间隔一致性高。SNP的较高频率和一致性意味着所述多态性将在目标遗传基因座附近或其中发现的概率要比其它多态性的情况下发现的概率高。SNP位于基因组的蛋白编码区和非编码区。这些SNP中的某些可以导致缺陷型或变异型蛋白表达(例如由于突变或缺陷型剪接)。特征性SNP的分析(基因型分析)可能仅需要加减分析(plus/minus assay)，而不需要长度测定，因而更易自动化。
SNP可以采用各种各样方法中的任一种方法进行表征。这样的方法包括对位点进行直接或间接测序、应用限制性酶(Botstein等，Am.J.Hum.Genet.32：314-331(1980)；Konieczny和Ausubel，Plant J.4：403-410(1993))、酶学和化学错配测定(Myers等，Nature 313：495-498(1985))、等位基因特异性PCR(Newton等，Nucl.Acids Res.17：2503-2516(1989)；Wu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：2757-2760(1989))、连接酶链式反应(Barany，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193(1991))、单链构象多态性分析(Labrune等，Am.J.Hum.Genet.48：1115-1120(1991))、单碱基引物延伸(Kuppuswamy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1143-1147(1991)；Goelet US 6,004,744；Goelet US5,888,819)、基于固相ELISA的寡核苷酸连接测定(Nikiforov等，Nucl.Acids Res.22：4167-4175(1994))、双脱氧指纹图谱法(Sarkar等，Genomics 13：441-443(1992))、寡核苷酸荧光猝灭测定(Livak等，PCRMethods Appl.4：357-362(1995a))、5′-核酸酶等位基因特异性杂交TaqManTM测定(Livak等，Nature Genet.9：341-342(1995))、模板定向染料终止子掺入(TDI)测定(Chen和Kwok，Nucl.Acids Res.25：347-353(1997))、等位基因特异性分子信标测定(Tyagi等，Nature Biotech.16：49-53(1998))、PinPoint测定(Haff和Smirnov，Genome Res.7：378-388(1997))、dCAPS分析(Neff等，Plant J.14：387-392(1998))、焦磷酸的荧光检测(pyrosequencing)(Ronaghi等，Analytical Biochemistry 267：65-71(1999)；Ronaghi等，PCT申请WO 98/13523；Nyren等，PCT申请WO98/28440；http//www.pyrosequencing.com)，运用质谱分析法例如MasscodeTM系统(Howbert等，WO 99/05319；Howber等，WO 97/27331；http//www.rapigene.com；Becker等，PCT申请WO 98/26095；Becker等，PCT申请WO 98/12355；Becker等，PCT申请WO 97/33000；Monforte等，US 5,965,363)、寡核苷酸探针的侵入性切割(Lyamichevi等，NatureBiotechnology 17：292-296；http//www.twt.com)和运用高密度寡核苷酸阵列(Hacia等，Nature Genetics 22：164-167；http//www.affymetrix.com)。
多态性也可以采用等位基因特异性寡核苷酸(ASO)进行检测，ASO可以例如与基于杂交的技术包括DNA印迹杂交、RNA印迹杂交和斑点印迹杂交、反向斑点印迹杂交和在微阵列上进行的杂交以及相关技术联合使用。
多态性检测的杂交严格性严格取决于各种各样的因素，包括等位基因特异性寡核苷酸的长度、序列组成、互补程度(即碱性错配的存在与否)、盐浓度和其它因素，例如甲酰胺浓度和温度。这些因素在杂交本身和进行的后续洗涤步骤以除去未特异性杂交的靶多核苷酸期间均是重要的。事实上，最终的最严格洗涤条件是最关键性的。另外，能够与等位基因特异性寡核苷酸杂交的靶多核苷酸的量也受诸如ASO和靶多核苷酸浓度等因素、作用于“结合(tie up)”水分子以便有效地浓缩试剂(例如PEG、葡聚糖、硫酸葡聚糖等)等因素的存在和浓度的控制，无论所述核酸是被固定化还是在溶液中，以及杂交和洗涤步骤时间。
杂交最好在ASO的解链温度(Tm)以下进行。杂交和/或洗涤步骤的温度越接近Tm，严格性越高。寡核苷酸的Tm近似值可以例如依照以下公式计算：Tm＝81.5+16.6×(log10[Na+])+0.41×(％G+C)-675/n；其中[Na+]为Na+或任何其它合适阳离子的摩尔盐浓度，而n＝寡核苷酸的碱基数。计算Tm近似值的其它公式也可使用，并且是本领域技术人员已知的。
最好对严格性进行调整，以便允许给定ASO与正确等位基因的靶多核苷酸和不正确等位基因的靶多核苷酸差别杂交。优选通过ASO与正确等位基因的靶多核苷酸杂交所产生的信号和ASO与不正确等位基因的靶多核苷酸交叉杂交所产生的信号水平之间有至少2倍的差别(例如突变型等位基因特异性ASO与野生型等位基因杂交)。在本发明更优选的实施方案中，有至少5倍的信号差别。在本发明高度优选的实施方案中，ASO与正确等位基因的靶多核苷酸杂交以及ASO与不正确等位基因的靶多核苷酸交叉杂交所产生的信号水平之间有至少一个数量级的信号差别。
尽管本文描述了用于检测多态性的某些方法，但是可以使用其它检测方法。例如，其它方法是已知的并且叙述于Birren等，GenomeAnalysis，4：135-186，A Laboratory Manual，Mapping Genomes，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1999)；Maliga等，Methods in Plant Molecular Biology.A Laboratory Course Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1995)；Paterson，Biotechnology Intelligence Unit：Genome Mapping in Plants，R.G.Landes Co.，Georgetown，TX，and Academic Press，San Diego，CA(1996)；The Maize Handbook，Freeling和Walbot编著，Springer-Verlag，New York，NY(1994)；Methods in Molecular Medicine：MolecularDiagnosis of Genetic Diseases，Elles编著，Humana Press，Totowa，NJ(1996)；Clark编著，Plant Molecular Biology：A Laboratory Manual，Clark编著，Springer-Verlag，Berlim，德国(1997)。
植物育种程序中标记辅助选择的要求为：(1)标记应该与所需性状共分离或密切连锁；(2)筛选大群体分子标记的有效方法应该是可利用的；和(3)筛选技术应该在实验室间有高度可再现性，最好使用经济并且是方便用户的。
标记分子的遗传连锁可通过以下的方法建立：基因作图模型，例如但不限于由Lander和Bostein(Genetics 121：185-199(1989))报道的侧翼标记模型；和区间作图，基于由Lander和Botstein(Genetics121：185-199(1989))介绍的并用软件包MAPMAKER/QTL(Lincoln和Lander，Mapping Genes Controlling Quantitative Traits UsingMAPMAKER/QTL，Whitehead Institute for Biomedical Research，Massachusetts，(1990))实施的最大似然方法。另外的软件包括Qgene，Version 2.23(1996)，Department of Plant Breeding and Biometry，266Emerson Hall，Cornell University，Ithaca，NY。使用Qgene软件是一种特别优选的方法。
计算标记存在的最大似然估计值(MLE)和假定没有QTL效应的MLE，以避免假阳性。然后如下计算优势率的log10(LOD)：LOD＝log10(存在QTL的MLE/没有相关QTL的MLE)。
LOD分值实质上表示存在QTL时的数据相对于没有OTL的可能性有多大。避免某一置倍限(例如95％)的假阳性的LOD阈值取决于标记数和基因组长度。表示LOD阈值的图叙述于Lander和Botstein，Genetics 121：185-199(1989)，并且详见Arús和Moreno-González，PlantBreeding，Hayward等(编著)，Chapman & Hall，London第314-331页(1993)。
在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸标记表现出目标性状或表型的LOD分值大于2.0，更优选大于2.5，甚至更优选大于3.0或4.0。在一个优选的实施方案中，所述目标性状是生育酚水平或组成改变。
可以使用其它模型。区间作图的许多改进和替代方法已有报道，包括使用非参数方法(Kruglyak和Lander，Genetics 139：1421-1428(1995))。也可以使用多重回归方法或模型，其中所述性状对大量标记回归(Jansen，Biometrics in Plant Breeding，van Oijen和Jansen(编著)，Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics inPlant Breeding，The Netherlands，第116-124页(1994)；Weber和Wricke，Advances in Plant Breeding，Blackwell，Berlin，16(1994))。Jansen和Stam(Genetics 136：1447-1455(1994))和Zeng(Genetics 136：1457-1468(1994))报道了区间作图与回归分析的联合方法，从而使表型在给定标记区间的一种推定QTL上并且在用作“辅因子”的许多标记上同时回归。一般而言，辅因子的使用减少估计QTL位置的偏倚和取样错误(Utz和Melchinger，Biometrics in Plant Breeding，van Oijen和Jansen(编著)，Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia SectionBiometrics in Plant Breeding，The Netherlands，第195-204页(1994)，从而改进QTL作图的精确度和有效性)(Zeng，Genetics 136：1457-1468(1994))。这些模型可以延伸至多种环境和实验，以分析遗传型-环境互应(Jansen等，Theo.Appl.Genet.91：33-37(1995))。
人们知道，本发明的一种或多种核酸分子可以用作分子标记。人们也知道，本发明的一种或多种蛋白分子可以用作分子标记。
在一个优选的实施方案中，在作图群体中存在多态性并可以根据所述作图群体进行筛选，所述作图群体例如能够与标记例如多态标记一起使用的植物集合物，以对性状的基因位置作图。合适作图群体的选择通常取决于所用的标记系统类型(Tanksley等，J.P.Gustafson and R.Appels(编辑)，Plenum Press，New York，第157-173页(1988))。考虑到作图群体中所用的亲本来源(适应种vs.外来种)。染色体配对和重组率在远缘杂交(适应种x外来种)中可能受到严重干扰(抑制)，一般导致大大降低连锁距离。当与亲缘杂交(narrow cross)(适应种x适应种)进行比较时，远缘杂交通常产生较大量多态性的分离群体。
F2群体是产生杂交种子后自交(自花授粉)的第一代。通常，使1株F1植株自交，产生所有基因以孟德尔(1∶2∶1)模式分离的群体。采用共显性标记系统，从完全分类的F2群体获得最大遗传信息(Mather，Measurement of Linkage in Heredity：Methuen and Co.，(1938))。就显性标记而论，子代试验(例如F3，BCF2)要求鉴定出杂合子，以便对群体进行分类。然而，该方法通常是禁止使用的，因为涉及子代试验的成本和时间。F2个体的子代试验通过用于图谱构建，其中表型并不始终如一地反映基因型(例如抗病性)或者性状表达受到QTL的控制。可以将从子代试验群体(例如F3，BCF2)获得的分离数据用于图谱构建。标记辅助选择则可以用于使子代根据标记-性状图谱联合进行杂交(F2，F3)，其中连锁群通过重组事件并未完全分离(即最大不平衡)。
重组近交系(RIL)(遗传相关系，通常＞F5，由F2系连续自交产生，趋向纯合性)可以用作作图群体。从显性标记获得的信息可以通过使用RIL最大化，因为所有基因座为纯合或几乎纯合。在紧密连锁的条件下(即约＜10％重组)，在RIL群体中评价的显性和共显性标记要比回交群体中的任一标记类型每一个体提供的信息更多(Reiter.Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)89：1477-1481(1992))。然而，由于标记间的距离变得较大(即基因座变得更加独立)，因此当与共显性标记进行比较时，RIL群体信息明显减少。
回交群体(例如由成功品种(轮回亲本)和携带前者中不存在的性状的另一品种(供体亲本)间杂交所产生的群体)可以用作作图群体。轮回亲本的一系列回交可以恢复其所需性状的大多数。因此，产生由几乎同轮回亲本一样但每个个体携带来自供体亲本的量不同或基因组区嵌合的个体组成的群体。如果轮回亲本中的所有基因座是纯合的并且供体亲本和轮回亲本均具有相反的多态标记等位基因，则回交群体可以用作对显性标记作图(Reiter等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.) 89：1477-1481(1992))。利用或者共显性标记或者显性标记从回交群体获得的信息要比从F2群体获得的信息更少，因为每个植株取一个而不是两个重组配子样品。然而，回交群体当与RIL进行比较时获得的信息多(在低标记饱和下)，由于连锁基因座间的距离在RIL群体中增加(即约0.15％重组)。重组增加对于分辨紧密连锁可能是有益的，但是在构建低标记饱和的图谱时可能是不想要的。
近等基因系(NIL)(由多次回交所产生的系，以产生基因组成几乎相同但询问(interrogation)性状或基因组区不同的个体的集合物)可以用作作图群体。在用NIL作图时，预期仅所述多态基因座的一部分用来对所选区作图。
混合分离分析(BSA)是一种开发用于快速鉴定标记和目标性状间连锁的方法(Michelmore等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：9828-9832(1991))。在BSA中，两个混合DNA样品取自来源于一次杂交的分离群体。这些混合样品含有与特定性状(对特定病害的抗性或敏感性)或基因组区相同但位于任意不连锁区的个体(即杂合子)。不与靶区连锁的区在BSA中在许多个体的混合样品间不同。
在本发明的一个方面中，本发明的一种或多种核酸分子用来测定植物(优选双低油菜、玉米、油菜、欧洲油菜、大豆、两节荠、芥末、蓖麻籽、花生、芝麻、棉籽、亚麻籽、红花、油棕、亚麻或向日葵)中部分或全部由本发明的一种或多种核酸分子编码的蛋白的表达水平(即样品中的mRNA浓度)或模式(即表达动力学、分解速率、稳定性分布型等)(统称为细胞或组织的“表达应答(ExpressionResponse)”)。
本文所用的由细胞或组织表现的表达应答如果它不同于不表现出所述表型的植物细胞或组织的表达应答则被认为是“改变的”。为了确定表达应答是否改变，将由表现出所述表型的植物细胞或组织表现的表达应答与不表现出所述表型的植物细胞或组织表现的表达应答进行比较。正如人们所认识到的，对不表现出所述表型的植物细胞或组织样品的表达应答进行再次确定是不必要的，因为每次都进行这样的比较；相反，可以将特定植物的表达应答与先前正常植株的所得值进行比较。本文所用的生物表型是生物的一个或多个特征中的任一特征(例如抗病性、耐虫性、环境耐受性例如非生物性胁迫的耐受性、雄性不育、品质改良或产量等)。基因型或表型的改变可以是瞬时的，或者是永久性的。另外，本文所用的组织样品是包含不止一种细胞的任何样品。在一个优选的方面，组织样品包含享有共同特征的细胞(例如从根、种子、花、叶、茎或花粉等获得的细胞)。
在本发明的一方面，可以进行评价，以确定是否存在特定RNA分子。本发明的一种或多种核酸分子用来检测mRNA种类的存在或数量。然后将这样的分子与植物细胞或组织提取物在足以允许核酸杂交的条件下温育。检测出双链探针-mRNA杂交分子表示存在所述mRNA；所形成的这种杂交分子的量与mRNA量成正比。因此，这样的探针可用来确定植物细胞或组织中产生所述mRNA的水平和程度。这样的核酸杂交可以在定量条件下进行(从而提供所存在的mRNA量的数值)。另一方面，所述测定可以依照指示存在mRNA或者其水平超过使用者设定的预定值的定性测定来进行。
许多方法可以用来比较两种或两种以上的细胞或组织样品间的表达应答。这些方法包括杂交测定，例如RNA印迹法、RNA酶保护测定和原位杂交。或者，所述方法包括PCR类型测定。在一个优选的方法中，通过将来自两种或两种以上的样品的核酸与核酸阵列杂交，对所述表达应答进行比较。所述阵列包含多种在所述样品细胞或组织中已知存在或怀疑存在的怀疑序列。
原位杂交优于核酸检测的常规技术的一个优点是其允许研究人员确定精确空间群体(Angerer等，Dev.Biol.101：477-484(1984)；Angerer等，Dev.Biol.112：157-166(1985)；Dixon等，EMBO J.10：1317-1324(1991))。原位杂交可以用来测量RNA累积的稳态水平(Hardin等，J.Mol.Biol.202：417-431(1989))。已经设计出许多有关原位杂交的方案，每种方案均有其组织制备、杂交和洗涤条件(Meyerowitz，PlantMol.Biol.Rep.5：242-250(1987)；Cox和Goldberg，载于：PlantMolecular Biology：A Practical Approach，Shaw(编著)，第1-35页，IRLPress，Oxford(1988)；Raikhel等，In situ RNA hybridization in planttissues，载于：Plant Molecular Biology Manual，第B9：1-32卷，KluwerAcademic Publisher，Dordrecht，比利时(1989))。
原位杂交也可供用于将蛋白质在组织或细胞中定位(Wilkinson，In Situ Hybridization，Oxford University Press，Oxford(1992)；Langdale，In Situ Hybridization，载于：The Maize Handbook，Freeling和Walbot(编著)，第165-179页，Springer-Verlag，New York(1994))。人们知道，本发明的一种或多种分子、优选本发明的一种或多种核酸分子或其片段或者本发明的一种或多种抗体可以用来通过原位杂交检测蛋白或其mRNA的水平或模式。
荧光原位杂交允许对特定DNA序列沿染色体方向定位，其中该方法可用来进行基因作图、检测杂交系的染色体或者检测具有易位、颠换或缺失的染色体。原位杂交已经用来鉴定若干植物种的染色体(Griffor等，Plant Mol.Biol.17：101-109(1991)；Gustafson等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)87：1899-1902(1990)；Mukai和Gill，Genome 34：448-452(1991)；Schwarzacher和Heslop-Harrison，Genome 34：317-323(1991)；Wang等，Jpn.J.Genet.66：313-316(1991)；Parra和Windle，Nature Genetics 5：17-21(1993))。人们知道，本发明的核酸分子可以用作探针或标记，以将各种序列沿染色体定位。
将分子表达定位的另一种方法是组织印迹法(tissue printing)。组织印迹法提供一种对不同植物或不同发育阶段的许多组织切片在相同的膜上同时筛选的方法(Yomo和Taylor，Planta 112：35-43(1973)；Harris和Chrispeels，Plant Physiol.56：292-299(1975)；Cassab和Varner，J.Cell.Biol.105；2581-2588(1987)；Spruce等，Phytochemistry 26：2901-2903(1987)；Barres等，Neuron 5：527-544(1990)；Reid和Pont-Lezica，Tissue Printing：Tools for the Study of Anatomy，Histochemistry and GeneExpression，Academic Press，New York，New York(1992)；Reid等，PlantPhysiol.93：160-165(1990)；Ye等，Plant J.1：175-183(1991))。
本领域技术人员可以参考有关详细描述本文所述的已知技术或等同技术的普通参考书。这些书籍包括Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel编著，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)和增补本(1998年9月)，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Sambrook等，第二版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)，Genome Analysis：A Laboratory Manual 1：Analyzing DNA，Birren等，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York(1997)；Genome Analysis：A Laboratory Manual 2：Detecting Genes，Birren等，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York(1998)；Genome Analysis：A Laboratory Manual 3：Cloning Systems，Birren等，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York(1999)；Genome Analysis：A Laboratory Manual 4：Mapping Genomes，Birren等，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York(1999)；PlantMolecular Biology：A Laboratory Manual，Clark，Springer-Verlag，Berlin，(1997)，Methods in Plant Molecular Biology，Maliga等，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，New York(1995)。当然，这些书籍也可以在实施或应用本发明某一方面时参阅。人们知道，本发明的任何因子可以是基本纯化和/或有生物活性和/或是重组的。
现在，总的来讲已经描述了本发明，同样，通过参考以下作为说明提供的实施例可以更加容易地理解本发明，以下实施例并不是用来限制本发明，除非另有说明。
本文中引用的每种期刊、专利和其它文件或参考文献都通过引用全部结合到本文中。
                     实施例1
               草生欧文氏菌tyrA的克隆
获得载体pJX1、pJX181和pJX184(Zhao和Jensen，MolecularEvolution 36(2)：107-20(1993))。使用引物tyrA5’(ACT GCC ATG GTGGCT GAA CTG ACC G(SEQ ID NO：5))和tyrA3’(ACT GGA ATTCTT ATT ATG GGC GGC TGT CAT TG(SEQ ID NO：6))，用来自载体pJX1、pJX181和pJX184的质粒DNA作为模板DNA，通过PCR扩增tyrA基因。采用Boehringer Mannheim的Expand TM高保真性PCR试剂盒，按照生产商的方案，在50μl的总体积中进行PCR反应。在以下条件下经过30个PCR循环扩增所述tyrA基因：95℃保温10分钟，接着将95℃1分钟、56℃退火1分钟和72℃延伸1.5分钟的循环重复30次。然后将这些反应72℃保温5分钟。来自pJX184的PCR产物根据基因克隆进行选择并用NcoI和EcoRI消化。将凝胶纯化限制性片段连接到经NcoI/EcoRI消化和凝胶纯化的pSE280(Invitrogen Co.，Carlsbad，CA)中，从而产生pMON26588(图2)。pMON26588中的tyrA插入片段通过DNA测序加以证实。
                       实施例2
                 大肠杆菌ryrA的克隆
使用引物tyrAecoliA5’(ACT GCC ATG GTT GCT GAA TTGACC G(SEQ ID NO：7))和tyrAecoliA3’(ACT GGA ATT CTT ATTACT GGC GAT TG(SEQ ID NO：8))，用大肠杆菌DH5α总基因组DNA作为模板DNA，通过PCR扩增来自大肠杆菌的tyrA基因。采用Qiagen的Qiaamp Tissue Kit(组织试剂盒)(Qiagen Inc.Valencia，CA)，分离大肠杆菌总基因组DNA。采用Boehringer Mannheim的Expand TM高保真性PCR试剂盒，按照生产商的方案，在50μl的总体积中进行PCR反应。在以下条件下经过30个PCR循环扩增所述tyrA基因：95℃保温10分钟，接着将95℃1分钟、56℃退火1分钟和72℃延伸1.5分钟的循环重复30次。然后将这些反应72℃保温5分钟。PCR产物用NcoI和EcoRI消化。将凝胶纯化限制性片段连接到经NcoI/EcoRI消化和凝胶纯化的pSE280(Invitrogen Co.，Carlsbad，CA)中，从而产生pMON26589(图3)。pMON26589中的tyrA插入片段通过DNA测序加以证实。
                   实施例3
     双功能预苯酸脱氢酶在大肠杆菌中的表达
将载体pMON26588和pMON26589转化到大肠杆菌DH5α中，让细胞在15ml LB培养物中生长至600nm下的光密度约为0.6，然后通过加入IPTG至终浓度为0.66μM进行诱导。孵育2-3小时后，收获细胞。将细胞沉淀重悬于0.5ml 25mM Tris/HCl pH8.2中，通过超声处理破碎细胞。膜和细胞碎片通过以100,000×g离心3小时而沉降。将上清液作为细胞粗提取物用于酶测定中。测量1.5ml含有1mM EDTA、1mM DTE、1mM NAD和1mM预苯酸(钡盐)的25mM Tris/HCl pH8.2的总体积中的预苯酸脱氢酶活性。依照Enzymology，第17卷(A篇)，第564-574页方法一节(1970)中描述的方法，通过监测NAD+转变为NADH，测定预苯酸脱氢酶的比活。结果示于以下表1中。
                     表1
载体设计 基因 比活
μmole/mg×min
野生型对照 2×10-5
pMON26588 tyrA(草生欧文氏菌) 5.75
pMON26589 TyrA(大肠杆菌) 3.44
                 实施例4
      使ryrA基因处于T7启动子的控制之下
将大肠杆菌tyrA基因和草生欧文氏菌tyrA基因切割为来自pMON26589和pMON26588的NcoI/EcoRI片段，凝胶纯化，然后克隆到经NcoI/EcoRI消化和凝胶纯化的pMON26541(图28)中，从而分别产生pMON26591和pMON26590(图4和图5)。这些载体使tyrA基因置于T7启动子的控制之下。
                  实施例5
         具有tyrA的植物表达载体的制备
草生欧文氏菌tyrA基因根据植物表达进行选择。通过NcoI/EcoRI限制性消化，从pMON26590切取所述基因，凝胶纯化，然后连接到经NcoI/EcoRI消化和凝胶纯化的pMON26541中，从而产生穿梭载体pMON36510(图6)。这些连接使所述细菌tyrA基因与CTP1融合，并使其处于e35S启动子控制之下，CTP1是来自拟南芥核酮糖二磷酸羧化酶小亚基的叶绿体引导肽。
为了使tyrA基因处于Napin启动子控制之下，将pMON36510用EcoRI消化，末端用Klenow片段(Maniatis)补平，然后将所述凝胶纯化载体用Bgl II消化。编码与CTP1融合的tyrA基因的较小片段进行凝胶纯化和连接，以连接到经消化和凝胶纯化的pCGN3223中(图45)。为了进行该连接，pCGN3224用PstI消化，末端用Klenow片段(Maniatis)补平，接着，所述载体用Bgl II消化并进行凝胶纯化。纯化载体和纯化CTP1::tyrA融合体的连接导致产生pMON36512(图7)。
为了将草生欧文氏菌tyrA基因转移到拟南芥双元载体中，pMON36510用HindIII和Sac I消化，将携带e35S启动子的凝胶纯化片段与CTP1融合，将tyrA连接到经HindIII/SacI消化和凝胶纯化的pMON26543(图29)中，从而产生pMON36511(图8)。该载体含有处于e35S启动子控制之下的tyrA。通过将带有pNapin::CTP1::tyrA::napin 3′表达盒的凝胶纯化Not I片段连接到Not I消化的pMON36176(图30)中，获得pNapin双元表达载体，从而产生pMON36520(图9)。
                  实施例6
       用pMON36520和pMON36511转化拟南芥
已用pMON36520和pMON36511转化的土壤杆菌如下制备。将100μl过夜培养物涂布在含有抗生素的琼脂LB平板上。将所述平板在30℃培养室中倒置培养过夜。在菌落形成后，取出所述平板(24-48小时)。
通过将10ml液体LB培养基加入到50ml试管，开始小规模培养。加入10μl卡那霉素(50μg/μL)、10μl壮观霉素(75-100μg/μL)和10μl氯霉素(25μg/μL)。加入来自平板的土壤杆菌，将所述试管振荡并在30℃摇床中放置过夜。
在10ml培养物生长过夜后，取出该培养物加入至500ml烧瓶中。烧瓶装有200ml液体LB，加入200μl卡那霉素(50μg/μL)、200μl壮观霉素(75-100μg/μL)和200μ氯霉素(25μg/μL)，然后加入全部10ml过夜培养物。将该500ml烧瓶放置在30℃摇床中并培养过夜。
将全部200ml培养物倒入离心管中，以3,750rpm 19℃下离心25分钟。离心后，倾出液体，将沉淀重悬于25ml 5％蔗糖(0.05％Silwet)溶液中。
将900μl蔗糖溶液和100μl的所述25ml细菌培养物加到样品杯中，将该杯用石蜡膜封口后振荡。空白OD读数为1ml蔗糖溶液的读数，然后读出所有细菌溶液的读数。记录每种培养物的OD(波长为600)。然后进行以下计算：C1V1＝C2V2；C1V1＝(0.8)(200ml)；C1V1＝160；V1＝160/C1；且V1＝Xml/10，以确定OD600＝0.8的土壤杆菌培养物。
将植株在水中浸泡至少30分钟，然后浸渍。将细菌溶液倾至浅塑料容器中，将植株的地上部分(籽实(bolt)，莲座)在温和搅拌下浸入溶液3-5秒。将浸渍植株侧放到衬有兜布的黑色盘(diaper lined blacktray)中，用拱形顶盖覆盖过夜(16-24小时)，以维持高湿度。揭去盖子，恢复正常植物生长条件持续4周。
在转化和高湿度处理后，将植株在22℃、60％RH和16小时光照周期下维持4周。转化后5-7天，让植株结球果(coned)。每周用弱20-20-20肥料施肥。生长4周后，将植株置于温室中，停止所有浇水，使植株干枯，以收获种子。植株在干枯后1-1.5周随时准备收获种子。
如下收获种子：在球果以下割下植株的基部，将植株放入垫有白色纸张的种子筛中，使籽实透过球果孔，收集过筛的洁净种子。
通过将真空干燥器软管与通风橱/流量台(flow bench)的真空连接，对种子消毒。将100ml漂白剂加入250ml烧杯中，然后向所述漂白剂中加入3ml浓盐酸。将该烧杯置入所述干燥器中，然后将试管架上种子试管中的种子置入所述干燥器中。盖上干燥器的盖子，进行抽真空。将干燥器保持过夜但不超过16小时。
消毒后，将种子放在选择培养基(所述选择培养基如下制备：加入10g(2g/L)Phyta-Gel、10.75g(2.15g/L)MS Basal Salts(M-5524，得自Sigma)、50g(10g/L)蔗糖和6ml(1.2ml/L)卡那霉素溶液(950mg/ml)、5ml(1ml/L)头孢噻肟溶液(250mg/ml)和5ml(1ml/L)羧苄青霉素溶液(250mg/ml)至总体积为5升，pH为5.7)上。将板上种子试管的旋塞扭紧，以便使种子分布均匀。将板用石蜡膜密封，置入4℃冰箱中，低温处理1-2天。在该低温处理后，将板置入28℃催芽室中。
所选小植株为绿色并已长出第2片叶。长出第2片叶后，将所选小植株移栽到土壤中。
将所述小植株上盆于盆栽土中，用拱形顶盖覆盖5天，以保持高湿度。在长角果底部(bottom siliques)开始变黄后，将所述小植株转移到温室中。
让从所选小植株获得的种子在装有土壤(1/2Metro-200；1/2PGXMix)的2.5英寸花盆中生长。将该土壤磨碎，花盆用网筛覆盖。将筛子与花盆用胶带系紧。播种种子并催芽拱形顶盖覆盖。
让幼苗在12小时光周期70％相对湿度28℃下生长。每隔1天按需浇水，每2周将Peter的20-20-20肥料施于根部。
                      实施例7
让来自实施例6、代表20个独立转化事件的转化种子植株生长，然后收获种子，以产生T2种子。让T2种子生长并测试生育酚水平。在图1中，生育酚水平以每毫克种子总生育酚的纳克数表示。通过将10-15mg拟南芥种子加入到2mL小试管中，测定生育酚水平。向该试管中加入大量的1g 0.5mm微珠(Biospecifics TechnologiesCorp.，Lynbrook，NY)和500μl含有5μg/mL母育酚的11％邻苯三酚(Sigma Chem，St.Louis，MO)的乙醇溶液。将该样品在FastPrep(Biol01/Savant)中以6.5的速度振荡2次45秒。将提取物过滤(GelmanPTFE acrodisc 0.2um，13mm针筒式滤器，Pall Gelman Laboratory Inc，Ann Arbor，MI)，滤液流到自动进样管中。采用Hewlett Packard HPLC(Agilent Technologies，Palo Alto CA)，在带有荧光检测的Zorbax HPLC硅柱4.6mm×250mm(5μm)上，进行HPLC。在290nm下进行样品激发，在336nm下监测发射。采用20μl的注射体积，1.5ml/min的流速和一轮时间12分钟(40℃)，用乙烷甲基叔丁基醚梯度，分离生育酚。运用Chemstation软件(Agilent Technologies，Palo Alto CA)，根据α、β、δ和γ-生育酚以及α、β、δ和γ-三烯生育酚的标准曲线，计算生育酚的浓度和组成。
                       实施例8
       用TyrA和其它生育酚生物合成基因转化植物
采用基本与Christou所述方法相似的微粒轰击法或土壤杆菌介导的转化法，用各种各样的DNA构建体转化双低油菜、欧洲油菜、拟南芥属和大豆植物，Christou的所述方法载于Particle Bombardmentfor the Genetic Engineering of Plants，Biotechnology Intelligence Unit，Academic Press，San Diego，California(1996)。产生两组DNA构建体。第一组构建体为“单基因构建体”。将以下基因中的每个基因插入到处于napin启动子控制之下的不同植物DNA构建体中(Krindl等，Seed Sci.Res.1：209：219(1991))，所述基因的产物可以通过所编码的质体引导肽靶向质体，所述质体引导肽例如CTP1(Keegstra，Cell56(2)：247-53(1989)；Nawrath等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：12760-12764(1994)或CTP2)：草生欧文氏菌tyrA基因(Xia等，J.Gen.Microbiol.138：1309-1316(1992))、slr1736基因(参见万维网的Cyanobase：kazusa.or.jp/cyanobase)、植物ATPT2基因(Smith等，Plant.J.11：83-92(1997))、dxs基因(Lois等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(5)：2105-2110(1998))、dxr基因(Takahashi等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(17)，9879-9884(1998))、拟南芥HPPD基因(Norris等，PlantPhysiol.117：1317-1323(1998))、GGH基因(Keller等，Eur.J.Biochem.251：413-417(1998))、拟南芥GGPPS基因(Bartley和Scolnik，PlantPhysiol.104：1469-1470(1994))、AANT1基因(Saint Guily等，PlantPhysiol.，100(2)：1069-1071(1992))、MT1基因(在对鱼腥藻品系(Anabaena sp.Strain)PCC 7120(Kanelo 2001)的EST进行blast搜索中使用集胞藻MT1(NCBI General Identifier Number 1653572)的序列)。与集胞藻MT1基本同源的序列见于对鱼腥藻品系PCC 7120的EST的blast搜索(Kaneko等，DNA Research 8(5)：205-213(2001))、TMT2基因(如于2001年10月25日申请的美国申请S/N 60/330,563中所公开的，该申请通过引用全部结合到本文中)、GMT基因(如于2001年8月17日申请的美国申请S/N 60/312,758中所公开的，该申请通过引用全部结合到本文中；WO 00/32757，WO 00/10380)和slr1737基因(见Cyanobase(参见万维网：kazusa.or.jp/cyanobase)和尿黑酸双加氧酶的反义构建体(Sato等，J.DNA Res.7(1)：31-63(2000)))。将每种构建体转化到至少一种双低油菜、欧洲油菜、拟南芥属和大豆植物中。对表达这些基因中每种基因的植物进行选择，以预见另外的杂交。也采用实施例7中叙述的方法，对每种植物中生育酚的组成和水平进行分析。使每个品种进行杂交，以产生具有以下组合的所导入基因的一个或多个的转基因植物：tyrA、slr1736、ATPT2、dxs、dxr、GGH、GGPPS、HPPD、MT1、TMT2、GMT、AANT1、slr1737和尿黑酸双加氧酶的反义构建体。在一个优选的组合中，一种或多种核酸构建体除编码tyrA外，也编码HPPD以及或者slr1736或者ATPT2。
也采用实施例7中叙述的方法，对通过杂交(包括所有中间杂交)产生的每种植物中生育酚的组成和水平进行分析。使来自这些构建体的转化体的后代相互杂交，以堆积另外的基因，达到所需的生育酚水平。
产生第二组DNA构建体，并将其称为“多基因构建体”。所述多基因构建体含有各自都处于napin启动子控制之下的多基因(Krindl等，Seed Sci.Res.1：209-219(1991))。将每种基因的产物通过所编码的质体引导肽靶向质体。所述多基因构建体可以具有以下基因中的一个或多个：tyrA、slr1736、ATPT2、dxs、dxr、GGH、GGPPS、HPPD、MT1、TMT2、GMT、AANT1、slr1737和尿黑酸双加氧酶的反义构建体。在一个优选的组合中，一种或多种核酸构建体除编码tyrA外，也编码HPPD以及或者slr1736或者ATPT2。
然后，将每种构建体转化到至少一种双低油菜、欧洲油菜、拟南芥属和大豆植物中。也采用实施例7中叙述的方法，对每种植物中生育酚的组成和水平进行分析。使来自这些构建体的转化体的后代相互杂交，以堆积另外的基因，达到所需的生育酚水平。
                     实施例9
具有TyrA、ATPT2和其它生育酚生物合成基因的转化拟南芥植物
用质粒载体pMON69907(图12)转化野生型拟南芥植物和拟南芥植物品系，让其生长，如以上实施例中描述的方法收集种子，如上所述分析种子中的生育酚和三烯生育酚的含量。质粒pMON69907编码双功能预苯酸脱氢酶(tyrA)和植基异戊烯基转移酶(ATPT2)。图14描绘了野生型植物和用质粒载体pMON69907转化的若干植物品系的拟南芥种子中的总生育酚和三烯生育酚含量。图15描绘了野生型植物和用质粒载体pMON69907转化的若干植物品系的拟南芥种子中的总生育酚含量。图31显示生育酚和三烯生育酚的LC/MS标准品。图32显示所选系的LC/MS结果，表明存在三烯生育酚。图33显示对照种子提取物的HPLC/FLD色谱图，表明不存在三烯生育酚。图34显示对照种子提取物的HPLC/FLD色谱图，表明在所选系中存在三烯生育酚。
                   实施例10
具有TyrA和其它生育酚生物合成基因的转化拟南芥植物
制备表达构建体pCGN10822、pMON36528、pMON69907和pMON69909，分别示于图10-13。
采用实施例8中描述的转化技术，用所述载体转化拟南芥植物。分离转化体，通过自花授粉让其生长至单个系，收集每个系的种子。采用实施例7中叙述的方法，对每个系的种子中总生育酚和三烯生育酚的组成进行分析。图16显示带有所述构建体的植物品系或对照的总生育酚和三烯生育酚的水平。对来自通过用载体pMON69909转化获得的植物品系的T2种子相对于野生型的分析示于图17。用pMON69909转化的植物品系证明总生育酚和三烯生育酚显著增加，其中δ生育酚、α三烯生育酚、δ三烯生育酚和γ三烯生育酚增加值最大。来自带有载体pMON69909的植物的某些种子由于尿黑酸的积蓄而呈黑色，所述结果通过LC/MS分析得到证实(参见图31和图32)。
tyrA在转基因拟南芥植物中的异源表达导致与对照系相比种子生育酚水平增加1.6倍。生育酚生物合成所必需的另一关键性酶是HPT，该酶参与植基焦磷酸(PPP)和尿黑酸(HGA)的缩合，得到用于合成生育酚的4种不同同种型的前体-2-甲基-6-植基质体醌醇(2M6PPQ)。HPT拟南芥(ATPT2)和HPT集胞藻(slr1736)独立在转基因拟南芥种子中的过量表达导致种子生育酚水平增加1.6倍。显示来自拟南芥(AANT1)、作为单基因表达的推定腺苷酸转运蛋白增加种子生育酚水平至拟南芥的1.4倍。为了测试这些基因的组合是否导致对生育酚生物合成的协同作用，在拟南芥中测试各种组合。
分析带有ATPT2和TyrA双基因构建体(pMON69907)、ATPT2、tyrA和HPPD三基因构建体(pMON69909)、ATPT2、tyrA和GGPPS三基因构建体(pMON69915(图35))和ATPT2、tyrA和AANT1三基因构建体(pMON69919(图36))的T2拟南芥种子中种子生育酚的含量和组成。总种子生育酚和三烯生育酚含量在用pMON69907(双基因载体)转化的系中增加至约2.4倍，而在携带三基因载体(pMON69909)的系中增加多达5倍(参见图16和图17)。作为单基因在拟南芥中表达的HPPD导致生育酚水平的勉强可检测增加。与仅带有ATPT2的系相比，HPPD与ATPT2的组合不导致生育酚水平的进一步增加(数据未显示)。相比之下，当将HPPD与tyrA和ATPT2组合，与tyrA、ATPT2组合相比，生育酚和三烯生育酚水平加倍。带有三基因构建体pMON69909的种子似乎比对照种子在颜色上深得多。
此外，已知野生型双子叶植物不积蓄三烯生育酚。然而带有所有4种构建体的转基因拟南芥种子都积蓄显著水平的三烯生育酚(通过HPLC证实，而对于所选样品通过LC-MS证实，参见图31、图32、图33和图34)。带有所述三基因表达构建体pMON69909的种子的生育酚和三烯生育酚含量由60％三烯生育酚和40％生育酚构成。当内源HGA的利用率由于HGA生物合成酶(tyrA和HPPD)与HPT一起过量表达而提高时，HPT将利用香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)和HGA，以在受内源水平的香叶基香叶基还原酶(GGH)的利用率限制的条件下产生三烯生育酚，而不产生生育酚。GGH发挥作用，使GGPP氢化为PPP即生育酚合成中HPT的底物。因此，在所测试的构建体中观察到的三烯生育酚积蓄增加可以克服与tyrA、HPPD和HPT组合时GGH的过量表达。
                  实施例11
    具有TyrA和其它生育酚生物合成基因的转化植物
采用实施例8中描述的技术，用以下表2和表3中所示的DNA构建体转化植物。所述构建体含有处于napin启动子(Krindl等，Seed Sci.Res.1：209-219(1991))、7Sα’启动子(Chen等，PNAS 83(22)：8560-8564(1998))或Arc5启动子(Goossens等，Plant Physiol.120：1095-1104(1999))控制之下的一种或多种基因。所述基因的产物可以通过所编码质体引导肽例如CTP1(Keegstra，Cell 56(2)：247-53(1989)；Nawrath等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：12760-12764(1994))或CTP2靶向质体。使用以下基因中的一个或两个：草生欧文氏菌tyrA基因(xia等，J.Gen.Microbiol.138：1309-1316(1992))、slr1736基因(参见万维网的Cyanobase：kazusa.org.jp/cyanobase)、ATPT2基因(Smith等，Plant.J.11：83-92(1997))、大肠杆菌dxs基因(Lois等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(5)：2105-2110(1998))、dxr基因(Takahashi等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(17)，9879-9884(1998))、HPPD基因(Norris等，PlantPhysiol.117：1317-1323(1998))、GGH基因(Keller等，Eur.J.Biochem.251：413-417(1998))、拟南芥GGPPS基因(Bartley和Scolnik，PlantPhysiol.104：1469-1470(1994))、AANT1基因(Saint Guily等，PlantPhysiol.，100(2)：1069-1071(1992))、MT1基因(如以上实施例8中所述)、TMT2基因(如以上实施例8中所述)、GMT基因(如以上实施例8中所述和WO 00/32757、WO 00/10380)、slr1737基因(见Cyanobase(万维网：kazusa.org.jp/cyanobase)和尿黑酸双加氧酶的反义构建体(以HGDAS表示)(Sato等，J.DNA Res.7(1)：31-63(2000))。将每种构建体转化到至少一种双低油菜、欧洲油菜、拟南芥属和大豆植物中。也采用实施例7中叙述的方法，对每种植物中生育酚的组成和水平进行分析。具有tyrA和其它生育酚生物合成基因的转化植物的实例包括用表2所述的构建体转化的拟南芥植物以及用表3所述的构建体转化的大豆植物。
具有所需特征的植物可以经过进一步杂交，以产生具有以下组合的导入基因的一个或多个的转基因植物：tyrA、slr1736、ATPT2、dxs、dxr、GGH、GGPPS、HPPD、MT1、TMT2、GMT、AANT1、slr1737和尿黑酸双加氧酶的反义构建体。可以使所述植物杂交，以在转基因植物中堆积上述基因中一个或多个基因的多拷贝。
                                                 表2
                             制备以下基因的组合并在拟南芥中进行测试
  1 pNapin∷CTP1∷TyrA草生欧文氏菌∷Napin 3′/pNapin∷CTP2∷HPPD拟南芥∷Napin3′/pNapin∷ATPT2拟南芥∷Napin 3′
  2 pNapin∷CTP1∷TyrA草生欧文氏菌∷Napin 3′/pNapin∷AANT1拟南芥∷Napin3′/pNapin∷ATPT2拟南芥∷Napin 3′
  3 pNapin∷CTP1∷TyrA草生欧文氏菌∷Napin 3′/pNapin∷GGPPS拟南芥∷Napin 3′/pNapin∷ATPT2拟南芥∷Napin 3′
  4 pNapin∷CTP1∷TyrA草生欧文氏菌∷Napin 3′/pNapin∷CTP1∷DXS大肠杆菌∷Napin3′/pNapin∷ATPT2拟南芥∷Napin3′/pNapin∷GGH∷Napin 3′
  5 pNapin∷CTP1∷TyrA草生欧文氏菌∷Napin 3′/pNapin∷CTP1∷DXR大肠杆菌∷Napin3′/pNapin∷ATPT2拟南芥∷Napin3′/pNapin∷GGH:Napin 3′
  6 pNapin∷CTP1∷TyrA草生欧文氏菌∷Napin 3′/pNapin∷HGDAS∷Napin3′
  7 pNapin∷CTP1∷TyrA草生欧文氏菌∷Napin 3′/pNapin∷HGDAS∷Napin3′/pNapin∷ATPT2拟南芥
  8 pNapin∷CTP1:TyrA草生欧文氏菌∷Napin 3′/pNapin∷HGDAS∷Napin3′/pNapin∷ATPT2拟南芥∷Napin3′/pNapin∷GGH∷Napin 3′
  9 pNapin∷CTP1:TyrA草生欧文氏菌∷Napin 3′/pNapin∷HGDAS∷Napin3′/pNapin∷ATPT2拟南芥∷Napin3′/pNapin∷CTP1∷DXS大肠杆菌∷Napin 3′/pNapin∷GGH∷Napin 3′
                                          表3
        制备以下基因的组合并在大豆中进行测试
  1 p7S∷CTP2∷HPPD∷E9 3′/p7Sα′∷CTP1∷TyrA∷E9 3′
  2 pArc5∷ATPT2∷Arc 3′/p7Sα′∷CTP1∷TyrA∷E9 3′/pNapin∷GGH:Napin 3′
  3 pArc5∷ATPT2∷Arc 3′/p7S∷CTP1:TyrA∷E9 3′/pNapin∷GGH∷Napin3′/pNapin∷CTP1∷DXS∷Napin 3′
                      实施例12
     带有各种组合的tyrA与其它生育酚合成基因的
                 植物双元载体的构建
每个基因表达盒的组分包括一个启动子，在本实施例中为napin启动子，一个终止子，一个质体引导肽(它可以是天然质体引导肽或者是在N端融合的叶绿体引导肽)和一个目标基因，如图18a和图18b中所示。所述表达盒可以以头-尾、头-头定向，或者可以改变所述方向。
使用邻接Bsp120 I和Not I限制位点的表达盒进行克隆。通过使引物SV MCS 1A和SV MCS 1B：
                       Xma I     Bsp120 I Eag   Xba I EcoRISV MCS 1A         GATCT CCCGGG AA GGGCCC CGGCCG TCTAGA GAATTC
Not I    Asc I   Age IvGCGGCCGC GGCGCGCC ACCGGT(SEQ ID NO：9)
                   Xma I    Bsp120 I Eag    Xba I EcoRISV MCS 1B      TCGA ACCGGT GGCGCGCC GCGGCCGC GAATTC TCTAGANot I   Asc I   Age ICGGCCG GGGCCC TT CCCGGG A(SEQ ID NO：10)退火并将其连接到经Bgl II和Xho I消化和凝胶纯化的pSP72(Promega，www.promega.com)中，构建穿梭载体(pMON36582(图19))。所产生的载体命名为pMON36582(图19)。所述载体通过DNA测序加以证实。
使所构建的所有基因表达盒都邻接Not I限制位点。通过用Not I消化上述载体，然后凝胶纯化表达盒，分离这些盒。pMON36582用Eag I消化，其中该载体中Eag I切割2次，在Not I位点内切割1次，且在Not I位点上游19bp切割1次。两个突出端与Not I匹配。将NotI表达盒连接到经凝胶纯化的Eag I消化的pMON36582中，产生具有一个Not I位点的载体。因此，所述表达盒可用作Bsp120 I/Not I盒。可作为Bsp120 I/Not I盒使用的拟南芥尿黑酸植基转移酶表达盒的一个实例如图20中pMON36586所示。该载体如上所述获得。
表达盒的装配在穿梭载体例如pMON36586中进行。通过Bsp120I/Not I消化，从其它穿梭载体中释放基因表达盒，然后将其连接到已用Not I消化的穿梭载体例如pMON36586中。所产生的载体带有一个额外的基因表达盒和一个Not I位点。该程序可以按需重复。完成所述基因装配后，可以通过Bsp120 I/Not I消化(pMON10098(图37))，释放组合的表达盒。然后将所述产生的携带所述表达盒的片段纯化，连接到双元载体的一个Not I位点中。或者，可以直接在双元载体(图21)中进行基因表达盒的装配。双元载体由存在的右边界序列和左边界序列限定，该序列为DNA从土壤杆菌转移到植物细胞中所必需的。该操作所用的所有化学试剂和酶为分子级。这些试剂和酶按照供应商的说明使用。使用标准分子克隆技术。
描绘了植物双元构建体的几个实例、它们的组成和质粒图谱。描绘含有tyrA与其它目标基因的组合用于生育酚途径工程的实例在图18a和图18b中列出。
这些构建体的组分也在表4中提供。如图22-27所示的载体图谱代表各种构建体。
表4.需要转化到拟南芥中以工程改造生育酚生物合成的双元载体一览表
pMON# 基因组合 遗传元件
36596 HPPDAt/tyrA Napin 5’& Napin 3’；CTP1 & 2
36597 HPPDAt/tyrA/GGHSya Napin 5’& Napin 3’；CTP1 & 2；native CTPs
77601 HPPDAt/tyrA/GGHAt/ATPT2 Napin 5’& Napin 3’；CTP1 & 2；native CTPs
77602 HPPDAt/tyrA/GGHSyn/ATPT2 Napin 5’& Napin 3’；CTP1 & 2；native CTPs
66657 HPPDAt/tyrA/GGHSyn/slr1736 Napin 5’& Napin 3’；CTP1 & 2；native CTPs
66659 HPPDAt/tyrA/GGHAt/ATPT2/TMT2 Napin 5’& Napin 3’；CTP1 & 2；native CTPs
HPPDAt/tyrA/GGHsyn/ATPT2/MT1 Napin 5’& Napin 3’；CTP1 & 2；native CTPs
HPPDAt/tyrA/ATPT2/TMT2 Napin 5’& Napin 3’；CTP1 & 2；native CTPs
HPPDAt/tyrA/GGHAt/ATPT2/MT1/DxS Napin 5’& Napin 3’；CTP1 & 2；native CTPs
HPPDAt/tyrA/GGHAt/ATPT2/DxSE.coll Napin 5’& Napin 3’；CTP1 & 2；native CTPs
HPPDAt/tyrA/GGHAt/slr1736/MT1/GGPPSAt Napin 5’& Napin 3’；CTP1 & 2；native CTPs
HPPDAt/tyrA/ATPT2/GGHAt/DxRAt Napin 5’& Napin 3’；CTP1 & 2；native CTPs
HPPDAt/tyrA/GGHAt/slr1736/Cyclasesyn/MT1 Napin 5’& Napin 3’；CTP1 & 2；native CTPs
HPPDAt/tyrA/GGHsyn/slr1736/Cyclasesyn Napin 5’& Napin 3’；CTP1 & 2；native CTPs
HPPDAt/tyrA/slr1736/Cyclasesyn Napin 5’& Napin 3’；CTP1 & 2；native CTPs
HPPDAt/tyrA/GGHAt/ATPT2/GMTAt Napin 5’& Napin 3’；CTP1 & 2；native CTPs
                     实施例13
               编码多种酶的载体的构建
本实施例叙述预苯酸脱氢酶(tyrA)例如草生欧文氏菌tyrA与生育酚生物合成途径中增加生育酚产量的其它关键酶联合在转基因植物种子例如拟南芥种子中的应用。与tyrA联合使用的酶包括ATPT2、来自拟南芥的对羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD拟南芥)和香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS拟南芥)。另外，也测试tyrA与ATPT2和来自拟南芥的推定腺苷酸转运蛋白(AANT1拟南芥)联合效应。
带有种子特异性tyrA和ATPT2表达盒的双基因载体的构建如下进行。使pMON36520(图38)的纯化质粒DNA经过部分KpnI消化，然后与从pMON43853(图39)中分离的4.2kbp凝胶纯化Kpn I片段连接。来自pMON43853的4.2kb插入片段含有PPT基因表达盒(pNapin∷ATPT2∷Napin 3′)。用所产生的植物双元载体pMON69907(图12)转化拟南芥，以测试tyrA和ATPT2的种子特异性表达的联合效应。
为了进一步增加生育酚的生物合成，让HPPD拟南芥在拟南芥种子中除表达tyrA外，还表达ATPT2。通过将HPPD拟南芥的种子特异性表达盒加入到pMON69907中，从而产生pMON69909，而实现这一点。通过用KpnI部分消化pMON69907，构建双元载体pMON69909。凝胶纯化单KpnI切割的pMON69907，然后与从pMON36525(图40)中分离的4.6kb KpnI/KpnI插入片段连接。来自pMON36525的4.6kb KpnI/KpnI插入片段含有HPPD基因表达盒pNapin∷CTP2∷HPPD拟南芥∷Napin 3′，以指导HPPD的种子特异性靶向表达。CTP2是来自拟南芥5-烯醇丙酮酰(pyruvyl)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因的叶绿体导向信号。
构建双元载体pMON69915(图35)，以测试三基因组合即tyrA、ATPT2和GGPPS拟南芥对种子生育酚产量的影响。载体pMON69907用KpnI部分消化。凝胶纯化单KpnI切割的pMON69907，与来自pMON43861(图41)的凝胶纯化4.3kb KpnI/KpnI片段连接，产生pMON69915。来自pMON43861的KpnI片段含有来自拟南芥的拟南芥香叶基香叶基二磷酸合酶的基因表达盒(pNapin∷GGPPS拟南芥∷Napin3′)。通过搜索EST数据库与文献中得利用的序列信息(Okada等，PlantPhysiol.122：1045-1056(2000))，GGPPS cDNA被鉴定为EST克隆。该EST克隆用NcoI消化并通过用klenow片段补平5′突出端而平端化。随后，该克隆用BamHI消化，以切取cDNA片段。将凝胶纯化BamHI/平端cDNA片段与BglII/SalI消化的(SalI平端化)载体pCGN7770(图42)连接，产生pMON43861。
构建植物双元载体pMON69919(图36)，以测试tyrA、ATPT2和AANT1拟南芥在种子生育酚水平上的联合表达。为了产生该载体，pMON69907用KpnI部分消化。凝胶纯化单KpnI切割的pMON69907，然后与来自pMON69911(图43)的4.2kb凝胶纯化KpnI/KpnI片段连接。所述4.2kb片段含有拟南芥腺苷酸转运蛋白AANT1种子特异性表达盒(pNapin∷AANT1拟南芥∷napin 3′)。通过用SalI和pstI消化切取来自pCGN11301(图44)的AANT1片段(PstI位点因用Klenow除去3′突出端而平端化)，然后与SalI/XhoI消化的(XhoI平端化)pCGN7770连接，产生pMON69911。
利用AANT1已发表的部分序列(Saint-Guily等，Plant Physiol.100(2)：1069-1071(1992))，在EST数据库中鉴定出几个全长克隆。用引物AANT1F 5′-GGATCC GCGGCCGCACCATGGTTGATCAAGTTCAGCA(SEQ IDNO：11)和AANT1R 5′-GAGCT CCTGCAGGGAAGCTTTTAGGCACCTCCTGATCCGT-3′(SEQID NO：12)，通过PCR扩增AANT1编码区。将NotI位点(下划线)置于引物AANT1F起始密码子(斜体)的上游，而将Sse8387I位点(下划线)置于AANT1R终止密码子(斜体)的下游。首先，将PCR产物克隆到pCR2.1中，该插入片段通过对两条链测序加以证实。随后，将NotI/Sse8387I片段插入到相对于napin启动子为有义方向的pCGN9979中napin表达盒的NotI/Sse8387I位点中，产生pCGN11301。如上所述，用所述植物表达构建体通过土壤杆菌介导的转化法转化拟南芥。
                        实施例14
           编码多种酶的载体在植物中的表达
采用实施例8中给出的转化技术，用实施例13的载体转化拟南芥植物。pMON69909的结果示于图14、图15、图16、图17和图31-34。其它结果示于下表以及图75和图76，该表和图显示具有pMON69909的转化植物中生育酚、三烯生育酚、尿黑酸和2-甲基植基质体醌醇的水平。
构建体 遗传元件 生育酚/三烯生育酚增加倍数 生育酚(％) 三烯生育酚(％)
pMON69907 pNapin∷HPT拟南芥∷napin 3′/pNapin∷CTP1∷tyrA草生欧文氏菌∷napin 3′     2.4倍 91   9
pMON69909 pNapin∷HPT拟南芥∷napin3′/pNapin∷CTP1∷tyrA草生欧文氏菌∷napin3′/pNapin∷CTP2∷HPPD拟南芥∷napin 3′     5倍 38   62
pMON69915 pNapin∷HPT拟南芥∷napin3′/pNapin∷CTP1∷tyrA草生欧文氏菌∷napin3′/pNapin∷GGPPS拟南芥∷napin 3′     2.9倍 86   14
pMON69919 pNapin∷HPT拟南芥∷napin3′/pNapin∷CTP1∷tyrA草生欧文氏菌∷Napin3′/pNapin∷AANT1拟南芥∷napin3′     3倍 89   11
                       实施例15
                各种构建体在大豆中的表达
本实施例描述涉及制备植物双元载体以测试单独的tyrA以及与增加转基因大豆(Glycine max)种子中生育酚产量的生育酚生物合成途径中的其它关键酶联合的方法。下表描述了用其相应的转基因种子特异性表达的目标基因表达盒转化大豆(G.max)而制备的植物双元载体。
大豆转化构建体一览表
构建体编号 遗传元件
pMON36575 p7Sα′∷CTP1∷tyrA草生欧文氏菌∷E9 3′
pMON69924 p7Sα′∷CTP2∷HPPD拟南芥∷E9 3′/p7Sα′∷CTP1∷tyrA草生 欧文氏菌∷E9 3′
pMON69943 p7Sα′∷CTP2∷HPPD拟南芥∷E9 3′/p7Sα′∷CTP1∷tyrA草生 欧文氏菌∷E9 3′/pArcelin-5∷CTP1∷slr1736∷Arcelin 3′
pMON69945 p7Sα′∷CTP2∷HPPD拟南芥∷E9 3′/p7Sα′∷CTP1∷tyrA草生 欧文氏菌∷E9 3′/pArcelin-5∷CTP1∷slr1736∷Arcelin3′/pNapin∷GGH拟南芥∷Napin 3′
通过在含有7Sα′∷CTP1∷tyrA草生欧文氏菌∷E9 3′表达盒的pMON36571(图48)的Not I位点连接来自pMON38207R(图47)的3kb凝胶纯化的Not I片段，制备pMON36575(图46)。CTP1编码来自拟南芥RUBISCO小亚基的叶绿体导向信号序列。所述3kb NotI片段含有选择标记盒pFMV∷CTP2∷CP4syn∷E9 3′。CTP2编码来自拟南芥5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的叶绿体导向信号序列。CP4syn为EPSPS合成基因。载体pMON36575用HindIII进一步消化，以释放含有p7Sα′∷CTP1∷tyrA草生欧文氏菌∷E9 3′表达盒的3kb片段。该片段通过用klenow片段补平5′突出端而平端化，凝胶纯化并且在携带p7Sα′∷CTP2∷HPPD拟南芥∷E9 3′表达盒的pMON36576(图49)的PmeI位点连接，产生pMON69924(图50)。
通过用Not I消化含有p7Sα′∷CTP2∷HPPD拟南芥∷E9 3′表达盒的pMON69929(图52)，然后与用Bspl20I和NotI消化pMON69936(图53)产生的7.3kb凝胶纯化的片段连接，制备植物双元载体pMON69943(图51)。该片段含有p7Sα′∷CTP1∷tyrA草生欧文氏菌∷E9 3′和pArcelin-5∷CTP1∷slrl736∷Arcelin 3′的表达盒。载体pMON69943用NotI进一步消化，然后与来自pMON36592(图54)4.5kb Bsp120I/NotI凝胶纯化片段连接，产生pMON69945(图55)。来自pMON36592的片段含有pNapin∷GGH拟南芥∷napin 3′表达盒。
按照WO 00/61771 A3第99-100页叙述的方法，用上述载体转化大豆。
                       实施例16
多种组合的基因在双低油菜中表达。
双低油菜中表达所用的所有基因表达盒制备为含有napin启动子、目标基因和napin终止子的Not I盒。除非存在天然叶绿体引导肽，否则将目标基因与叶绿体引导肽在N端融合。将所有组合的基因装配在一种多基因载体中。
为了易于多基因载体的构建，所述Not I表达盒如下分离：用NotI消化pMON16602(图56)、pMON36525(图57)、pMON36520(图38)，然后克隆到经Eag I消化和凝胶纯化的pMON36582(图19)中，从而产生pMON58171(图58)(slr1736表达盒)、pMON58172(图59)(HPPD拟南芥表达盒)和pMON58170(图60)(tyrA草生欧文氏菌表达盒)。所有所产生的表达盒都邻接Bsp120 I和Not I。
通过分离并凝胶纯化来自pMON36591(图61)的3191bp NotI/Hind III片段和来自pMON36588(图62)的5612bp Not I/Hind III片段，获得napin驱动的南芥GGH表达盒。连接这两种纯化片段，从而产生pMON36592(图63)。载体pMON36592用Bsp120I和Not I消化，凝胶纯化GGH表达盒，然后将其连接到经Eag I消化和凝胶纯化的pMON36582(图19)中，从而产生pMON58182(图64)。
通过用Bsp120I和Not I消化载体pMON58171、pMON58172、pMON58170和pMON58182，然后凝胶纯化来自每种构建体的较大片段，获得这4种基因组合在一起的多基因载体。这些片段分别含有slr1736、HPPD、tyrA和GGH表达盒。将来自pMON58170的tyrA表达盒连接到经Not I消化和碱性磷酸酶处理的pMON58171中，从而产生分别含有tyrA和slr1736的基因表达盒的双基因载体pMON58176(图65)。该载体再次用Not I消化，碱性磷酸酶处理，并且与来自pMON58172的HPPD表达盒连接。所产生的三基因载体pMON58183(图66)含有HPPD、tyrA和slr1736表达盒。另外，pMON58183用Bsp120 I消化，碱性磷酸酶处理，并且与凝胶纯化的GGH表达盒(参见上述纯化)连接，从而产生pMON58185(图67)。
通过将来自pMON36589(图69)的经Bsp120I/Not I消化的凝胶纯化tyrA表达盒连接到经Not I消化和碱性磷酸酶处理的pMON36590(图70)中，制备穿梭载体pMON36593(图68)(含有tyrA和HPPD表达盒)。
通过Bsp 120 I/Not I消化切取来自pMON36593(HPPD/tyrA)、pMON58183(HPPD/tyrA/slr1736)和pMON58185(HPPD，tyrA，slr1736，GGH)的联合基因表达盒。凝胶纯化这些联合基因表达盒，然后将其连接到经Not I消化的、碱性磷酸酶处理的pMON67162(图71)中，从而分别产生双元载体pMON58178(图72)、pMON58186(图73)和pMON58188(图74)。用后三种双元载体进行双低油菜转化。
                       序列表
<110>Valentin.Henry E.
     Mitsky.Timothy A.
<120>TyrA基因及其应用
<130>16515.149
<140>PCT/US02/13898
<141>2002-05-03
<150>US 60/289,527
<151>2001-05-09
<160>12
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>1122
<212>DNA
<213>草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)
<400>1
atggtggctg aactgaccgc gttacgcgat caaattgaca gtgtagataa agcgctgctg   60
gatctgctgg ctaagcgact ggaactggtg gccgaggtag gtgaggtgaa gagccgttac  120
ggcctgccta tctatgtgcc tgagcgtgag gcgtcgatgc tggcttcgcg tcgcaaagag  180
gccgaagcgc tcggcgtacc accggatctg attgaggatg tgctgcgtcg cgtgatgcgg  240
gaatcctata ccagcgagaa tgataaaggc tttaaaaccc tctgtcctga actgcgcccg  300
gtggtgattg tcggtggtaa gggccagatg ggccggctgt ttgaaaaaat gctcgggcta  360
tcaggctaca cggttaaaac gctggataaa gaggactggc ctcaggctga gactctgctc  420
agcgatgccg gaatggtgat cattagcgtg ccgattcacc tgaccgagca ggtgattgcc  480
caactgccac cactgccgga agattgtatt ctggtcgatc tggcgtcagt caaaaaccgg  540
cctctgcagg caatgctggc tgcccataac gggcctgtac tgggtctgca tccgatgttt  600
ggcccggaca gcggcagcct ggcaaaacag gtggtggtct ggtgtgatgg aagacaaccg  660
gaagcgtatc agtggttcct ggagcagatt caggtctggg gtgcgcgtct gcatcgtatc   720
agcgctgttg agcatgacca gaacatggca ttcattcagg cgctgcgtca ctttgctacc   780
ttcgcttatg gtctgcattt agccgaagag aacgtcaatc tggatcagct gctggcgctc   840
tcgtcgccca tttaccggct tgaactggcg atggtggggc ggttgttcgc tcaggatccg   900
caactctatg cggatatcat catgtcttca gagagtaatc tggcgctgat aaaacgctat   960
taccagcggt ttggtgaagc gattgcgctg ctggagcagg gcgacaagca ggcgtttatc  1020
gccagcttta accgggttga acagtggttt ggcgatcacg caaaacgctt cctggtcgaa  1080
agccgaagcc tgttgcgatc ggccaatgac agccgcccat aa                     1122
<210>2
<211>373
<212>PRT
<213>草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)
<400>2
Met Val Ala Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asp Gln Ile Asp Ser Val Asp
1               5                   10                  15
Lys Ala Leu Leu Asp Leu Leu Ala Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala Glu
            20                  25                  30
Val Gly Glu Val Lys Ser Arg Tyr Gly Leu Pro Ile Tyr Val Pro Glu
        35                  40                  45
Arg Glu Ala Ser Met Leu Ala Ser Arg Arg Lys Glu Ala Glu Ala Leu
    50                  55                  60
Gly Val Pro Pro Asp Leu Ile Glu Asp Val Leu Arg Arg Val Met Arg
65                  70                  75                  80
Glu Ser Tyr Thr Ser Glu Asn Asp Lys Gly Phe Lys Thr Leu Cys Pro
                85                  90                  95
Glu Leu Arg Pro Val Val Ile Val Gly Gly Lys Gly Gln Met Gly Arg
            100                 105                 110
Leu Phe Glu Lys Met Leu Gly Leu Ser Gly Tyr Thr Val Lys Thr Leu
        115                 120                 125
Asp Lys Glu Asp Trp Pro Gln Ala Glu Thr Leu Leu Ser Asp Ala Gly
    130                 135                 140
Met Val Ile Ile Ser Val Pro Ile His Leu Thr Glu Gln Val Ile Ala
145                 150                 155                 160
Gln Leu Pro Pro Leu Pro Glu Asp Cys Ile Leu Val Asp Leu Ala Ser
                165                 170                 175
Val Lys Asn Arg Pro Leu Gln Ala Met Leu Ala Ala His Asn Gly Pro
            180                 185                 190
Val Leu Gly Leu His Pro Met Phe Gly Pro Asp Ser Gly Ser Leu Ala
        195                 200                 205
Lys Gln Val Val Val Trp Cys Asp Gly Arg Gln Pro Glu Ala Tyr Gln
    210                 215                 220
Trp Phe Leu Glu Gln Ile Gln Val Trp Gly Ala Arg Leu His Arg Ile
225                 230                 235                 240
Ser Ala Val Glu His Asp Gln Asn Met Ala Phe Ile Gln Ala Leu Arg
                245                 250                 255
His Phe Ala Thr Phe Ala Tyr Gly Leu His Leu Ala Glu Glu Asn Val
            260                 265                 270
Asn Leu Asp Gln Leu Leu Ala Leu Ser Ser Pro Ile Tyr Arg Leu Glu
        275                 280                 285
Leu Ala Met Val Gly Arg Leu Phe Ala Gln Asp Pro Gln Leu Tyr Ala
    290                 295                 300
Asp Ile Ile Met Ser Ser Glu Ser Asn Leu Ala Leu Ile Lys Arg Tyr
305                 310                 315                 320
Tyr Gln Arg Phe Gly Glu Ala Ile Ala Leu Leu Glu Gln Gly Asp Lys
                325                 330                 335
Gln Ala Phe Ile Ala Ser Phe Asn Arg Val Glu Gln Trp Phe Gly Asp
            340                 345                 350
His Ala Lys Arg Phe Leu Val Glu Ser Arg Ser Leu Leu Arg Ser Ala
        355                 360                 365
Asn Asp Ser Arg Pro
    370
<210>3
<211>1122
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>3
atggttgctg aattgaccgc attacgcgat caaattgatg aagtcgataa agcgctgctg    60
aatttattag cgaagcgtct ggaactggtt gctgaagtgg gcgaggtgaa aagccgcttt   120
ggactgccta tttatgttcc ggagcgagag gcatctatgt tggcctcgcg tcgtgcagag   180
gcggaagctc tgggtgtacc gccagatctg attgaggatg ttttgcgtcg ggtgatgcgt   240
gaatcttact ccagtgaaaa cgacaaagga tttaaaacgc tttgtcctgc gttacgcccg   300
gtagttatcg ttggcggcgg cggtcagatg ggacgtctgt tcgagaagat gctgacactc   360
tcgggttatc aggtgcggat tctggagcaa catgactggg atcgagcggc tgatattgtt   420
gccgatgccg gaatggtgat tgttagtgtg ccaatccacg ttactgagca agttattggc   480
aaattaccgc ctttaccgaa agattgtatt ctggttgatc tggcatcagt gaaaaatgga   540
ccattacagg ccatgctggc ggcgcacgat ggcccggtac tggggttaca cccaatgttc   600
ggtccggaca gcggtagcct ggcaaagcaa gttgtggtct ggtgtgatgg acgtaaaccg   660
gaagcatacc aatggtttct ggagcaaatt caggtctggg gcgctcggtt gcatcgtatt   720
agcgccgtcg agcacgatca gaatatggcg tttattcagg cactgcgcca ctttgctact   780
tttgcttacg ggctgcacct ggcagaagaa aatgttcagc ttgagcaact tctggcgctc   840
tcttcgccga tttaccgcct tgagctggcg atggtcgggc gactgttcgc tcaggatccg   900
cagctttatg ccgacattat tatgtcgtca gagcgtaatc tggcgttaat caaacgttac   960
tataagcgtt tcggcgaggc gattgagttg ctggagcagg gcgataagca ggcgtttatt  1020
gacagtttcc gcaaggtgga gcactggttc ggcgattacg cacagcgttt tcagagtgaa  1080
agccgcgtgt tattgcgtca ggcgaatgac aatcgccagt aa                     1122
<210>4
<211>373
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>4
Met Val Ala Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asp Gln Ile Asp Glu Val Asp
1               5                   10                  15
Lys Ala Leu Leu Asn Leu Leu Ala Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala Glu
            20                  25                  30
Val Gly Glu Val Lys Ser Arg Phe Gly Leu Pro Ile Tyr Val Pro Glu
        35                  40                  45
Arg Glu Ala Ser Met Leu Ala Ser Arg Arg Ala Glu Ala Glu Ala Leu
    50                  55                  60
Gly Val Pro Pro Asp Leu Ile Glu Asp Val Leu Arg Arg Val Met Arg
65                  70                  75                  80
Glu Ser Tyr Ser Ser Glu Asn Asp Lys Gly Phe Lys Thr Leu Cys Pro
                85                  90                  95
Ala Leu Arg Pro Val Val Ile Val Gly Gly Gly Gly Gln Met Gly Arg
            100                 105                 110
Leu Phe Glu Lys Met Leu Thr Leu Ser Gly Tyr Gln Val Arg Ile Leu
        115                 120                 125
Glu Gln His Asp Trp Asp Arg Ala Ala Asp Ile Val Ala Asp Ala Gly
    130                 135                 140
Met Val Ile Val Ser Val Pro Ile His Val Thr Glu Gln Val Ile Gly
145                 150                 155                 160
Lys Leu Pro Pro Leu Pro Lys Asp Cys Ile Leu Val Asp Leu Ala Ser
                165                 170                 175
Val Lys Asn Gly Pro Leu Gln Ala Met Leu Ala Ala His Asp Gly Pro
            180                 185                 190
Val Leu Gly Leu His Pro Met Phe Gly Pro Asp Ser Gly Ser Leu Ala
        195                 200                 205
Lys Gln Val Val Val Trp Cys Asp Gly Arg Lys Pro Glu Ala Tyr Gln
    210                 215                 220
Trp Phe Leu Glu Gln Ile Gln Val Trp Gly Ala Arg Leu His Arg Ile
225                 230                 235                 240
Ser Ala Val Glu His Asp Gln Asn Met Ala Phe Ile Gln Ala Leu Arg
                245                 250                 255
His Phe Ala Thr Phe Ala Tyr Gly Leu His Leu Ala Glu Glu Asn Val
            260                 265                 270
Gln Leu Glu Gln Leu Leu Ala Leu Ser Ser Pro Ile Tyr Arg Leu Glu
        275                 280                 285
Leu Ala Met Val Gly Arg Leu Phe Ala Gln Asp Pro Gln Leu Tyr Ala
    290                 295                 300
Asp Ile Ile Met Ser Ser Glu Arg Asn Leu Ala Leu Ile Lys Arg Tyr
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Arg Phe Gly Glu Ala Ile Glu Leu Leu Glu Gln Gly Asp Lys
                325                 330                 335
Gln Ala Phe Ile Asp Ser Phe Arg Lys Val Glu His Trp Phe Gly Asp
            340                 345                 350
Tyr Ala Gln Arg Phe Gln Ser Glu Ser Arg Val Leu Leu Arg Gln Ala
        355                 360                 365
Asn Asp Asn Arg Gln
    370
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>5
actgccatgg tggctgaact gaccg                                     25
<210>6
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>6
actggaattc ttattatggg cggctgtcat tg                             32
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>7
actgccatgg ttgctgaatt gaccg                                       25
<210>8
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>8
actggaattc ttattactgg cgattg                                      26
<210>9
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>9
gatctcccgg gaagggcccc ggccgtctag agaattcgcg gccgcggcgc gccaccggt  59
<210>10
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>10
tcgaaccggt ggcgcgccgc ggccgcgaat tctctagacg gccggggccc ttcccggga  59
<210>11
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>11
ggatccgcgg ccgcaccatg gttgatcaag ttcagca                        37
<210>12
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>12
gagctcctgc aggaagcttt taggcacctc ctgatccgt                      39

Claims (74)

1.一种基本纯化的核酸分子，所述核酸分子包含以下的有效连接组分：(A)一个启动子区，所述启动子区在植物细胞中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；(B)一种异源核酸分子或其片段，所述异源核酸分子编码具有分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶活性的酶，而所述片段编码所述酶的至少20个连续氨基酸。
2.一种基本纯化的核酸分子，所述核酸分子包含以下的有效连接组分：(A)一个启动子区，所述启动子区在植物细胞中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；(B)一种异源核酸分子，所述异源核酸分子编码选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4以及它们的至少20个连续氨基酸的片段的氨基酸序列。
3.权利要求1的核酸分子，所述核酸分子还包含一种3′非翻译序列，所述3′非翻译序列在所述植物细胞中发挥作用，从而导致转录终止并且将聚腺苷酸核糖核苷酸添加到所述mRNA分子3′末端。
4.权利要求1的核酸分子，其中所述异源核酸分子编码草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)tyrA或大肠杆菌(Escherichia coli)tyrA。
5.权利要求1的核酸分子，其中所述异源核酸分子包含一种选自SEQ ID NO：1和3的核酸序列。
6.权利要求1的核酸分子，其中所述异源核酸分子还包含一个表达植基异戊烯基转移酶的表达盒。
7.权利要求6的核酸分子，其中所述异源核酸分子还包含一个表达羟基苯基丙酮酸脱氢酶的表达盒。
8.权利要求1的核酸分子，其中所述片段编码一种具有预苯酸脱氢酶活性的多肽。
9.权利要求1的核酸分子，其中所述异源核酸分子还包含两个或两个以上的表达盒，其中每个表达盒表达一个选自以下的成员：slr1736、ATPT2、dxs、dxr、GGH、GGPPS、HPPD、MT1、TMT2、GMT、AANT1、slr1737和尿黑酸双加氧酶的反义构建体。
10.权利要求1的核酸分子，其中所述异源核酸分子还包含一种编码HPPD以及或者slr1736或者ATPT2的核酸序列。
11.一种核酸分子，所述核酸分子包含以下的有效连接组分：(A)一个启动子区，所述启动子区在植物细胞中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；(B)一种异源核酸分子，所述异源核酸分子具有转录链和非转录链，其中所述转录链与编码具有分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶活性的蛋白的核酸分子互补。
12.一种核酸分子，所述核酸分子包含以下的有效连接组分：(A)一个启动子区，所述启动子区在植物细胞中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；(B)一种异源核酸分子，所述异源核酸分子具有转录链和非转录链，其中所述转录链与编码包含选自SEQ ID NO：2和4的氨基酸序列的蛋白的核酸分子互补。
13.一种转化植物，所述转化植物具有包含以下有效连接组分的核酸分子：(A)一个启动子区，所述启动子区在植物细胞中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；(B)一种外源核酸分子，所述外源核酸分子编码包含选自SEQ ID NO：2和4的氨基酸序列或其至少20个连续氨基酸的片段的多肽；和(C)一种3′非翻译序列，所述3′非翻译序列在所述植物细胞中发挥作用，从而导致转录终止并且将聚腺苷酸核糖核苷酸添加到所述mRNA分子3′末端。
14.权利要求13的转化植物，其中所述外源核酸分子还包含一个表达植基异戊烯基转移酶的表达盒。
15.权利要求14的转化植物，其中所述异源核酸分子还包含一个表达羟基苯基丙酮酸脱氢酶的表达盒。
16.权利要求13的转化植物，其中所述异源核酸分子还包含两个或两个以上的表达盒，其中每个表达盒表达一个选自以下的成员：slr1736、ATPT2、dxs、dxr、GGH、GGPPS、HPPD、MT1、TMT2、GMT、AANT1、slr1737和尿黑酸双加氧酶的反义构建体。
17.权利要求13的转化植物，其中所述异源核酸分子还包含一种编码HPPD以及或者slr1736或者ATPT2的核酸序列。
18.权利要求13的转化植物，其中所述植物是选自双低油菜、玉米、拟南芥属(Arabidopsis)、油菜(Brassica campestris)、欧洲油菜(Brassica napus)、大豆、两节荠、芥末、蓖麻籽、花生、芝麻、棉籽、亚麻籽、红花、油棕、亚麻和向日葵。
19.权利要求13的转化植物，其中所述植物是大豆。
20.权利要求13的转化植物，其中所述植物是双低油菜。
21.权利要求13的转化植物，其中所述植物是欧洲油菜。
22.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出生育酚水平增加。
23.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出生育酚水平增加至少约25％。
24.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出生育酚水平增加至少约250％。
25.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出生育酚水平增加至少约2500％。
26.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出三烯生育酚水平增加。
27.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出三烯生育酚水平增加至少约25％。
28.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出三烯生育酚水平增加至少约250％。
29.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出三烯生育酚水平增加至少约2500％。
30.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出α-生育酚水平增加。
31.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出α-生育酚水平增加至少约25％。
32.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出α-生育酚水平增加至少约250％。
33.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出α-生育酚水平增加至少约2500％。
34.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出α-三烯生育酚水平增加。
35.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出α-三烯生育酚水平增加至少约25％。
36.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出α-三烯生育酚水平增加至少约250％。
37.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出α-三烯生育酚水平增加至少约2500％。
38.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出γ-生育酚水平增加。
39.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出γ-生育酚水平增加至少约25％。
40.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出γ-生育酚水平增加至少约250％。
41.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出γ-生育酚水平增加至少约2500％。
42.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出γ-三烯生育酚水平增加。
43.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出γ-三烯生育酚水平增加至少约25％。
44.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出γ-三烯生育酚水平增加至少约250％。
45.权利要求13的转化植物，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述外源核酸分子的植物表现出γ-三烯生育酚水平增加至少约2500％。
46.权利要求13的转化植物，其中所述核酸分子还包含一种质体导向序列，其中所述质体导向序列与所述外源核酸分子有效连接，从而导致所述外源核酸分子的转录物还编码一种与所述氨基酸序列有效连接的质体肽导向序列。
47.权利要求13的转化植物，所述转化植物还包含一个表达植基异戊烯基转移酶的表达盒。
48.权利要求47的转化植物，其中所述核酸分子还包含所述表达盒。
49.权利要求13的转化植物，其中所述核酸分子编码SEQ ID NO：2或4的片段，其中所述片段具有预苯酸脱氢酶活性。
50.一种转化植物，所述转化植物具有包含以下有效连接组分的核酸分子：(A)一个外源启动子区，所述启动子区在植物细胞中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；(B)一种异源核酸分子，所述异源核酸分子具有转录链和非转录链，其中所述转录链与编码包含选自：SEQID NO：2、SEQ ID NO：4以及它们的包含至少20个连续氨基酸的片段的氨基酸序列的蛋白的核酸分子互补。
51.一种产生生育酚水平增加的植物的方法，所述方法包括：
(A)用一种核酸分子转化所述植物，其中所述核酸分子包含一个启动子区，其中所述启动子区与编码具有选自SEQ ID NO：2和4的氨基酸序列的蛋白的核酸序列连接；和
(B)培育所述植物。
52.权利要求51的方法，其中所述核酸分子还包含一个表达植基异戊烯基转移酶的表达盒。
53.权利要求52的方法，其中所述核酸分子还包含一个表达羟基苯基丙酮酸脱氢酶的表达盒。
54.权利要求51的方法，其中所述核酸分子还包含两个或两个以上的表达盒，其中每个表达盒表达一个选自以下的成员：slr1736、ATPT2、dxs、dxr、GGH、GGPPS、HPPD、MT1、TMT2、GMT、AANT1、slr1737和尿黑酸双加氧酶的反义构建体。
55.权利要求51的方法，其中所述核酸分子还包含一种编码HPPD以及或者slr1736或者ATPT2的核酸序列。
56.权利要求51的方法，其中所述核酸分子与在所述植物中发挥作用从而导致转录终止并且将聚腺苷酸核糖核苷酸添加到mRNA分子3′末端的3′非翻译序列连接，并且其中所述核酸分子的表达导致所述蛋白的过量表达。
57.一种产生依照权利要求51的植物的方法，其中所述植物选自双低油菜、玉米、拟南芥属、油菜、欧洲油菜、大豆、两节荠、芥末、蓖麻籽、花生、芝麻、棉籽、亚麻籽、红花、油棕、亚麻和向日葵。
58.一种产生依照权利要求51的植物的方法，其中所述植物是双低油菜。
59.一种产生依照权利要求51的植物的方法，其中所述植物是大豆。
60.一种产生依照权利要求51的植物的方法，其中所述植物是欧洲油菜。
61.一种产生依照权利要求51的植物的方法，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述核酸分子的植物表现出α-生育酚水平增加。
62.一种产生依照权利要求51的植物的方法，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述核酸分子的植物表现出γ-生育酚水平增加。
63.一种产生依照权利要求51的植物的方法，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述核酸分子的植物表现出生育酚水平增加。
64.一种产生依照权利要求51的植物的方法，其中所述植物相对于具有相似的遗传背景但缺乏所述核酸分子的植物表现出三烯生育酚水平增加。
65.一种降低植物中生育酚水平的方法，所述方法包括：
(A)用一种核酸分子转化所述植物，其中所述核酸分子包含作为有效连接组分的一个外源启动子区和一种异源核酸分子，所述外源启动子区在植物细胞中发挥作用，从而导致产生mRNA分子，而所述异源核酸分子具有转录链和非转录链，其中所述转录链与具有选自SEQID NO：1和3的核酸序列的核酸分子互补；并且其中所述核酸分子与在所述植物细胞中发挥作用从而导致转录终止并且将聚腺苷酸核糖核苷酸添加到所述mRNA序列3′末端的3′非翻译序列连接；和
(B)培育所述转化植物。
66.一种用于筛选植物中生育酚水平增加的方法，所述方法包括探测基因组DNA中与具有选自SEQ ID NO：1和3以及它们的互补序列的核酸序列的核酸分子特异性杂交的标记分子的存在或不存在；并且检测所述标记的所述存在或不存在。
67.一种细胞，所述细胞包含含以下有效连接组分的核酸分子：(A)一个启动子区，所述启动子区在植物细胞中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；(B)一种异源核酸分子，其中所述异源核酸分子编码具有分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶活性的酶，或者所述核酸分子编码包含至少20个连续氨基酸的片段。
68.权利要求67的细胞，其中所述核酸分子还包含一个表达植基异戊烯基转移酶的表达盒。
69.权利要求68的细胞，其中所述核酸分子还包含一个表达羟基苯基丙酮酸脱氢酶的表达盒。
70.权利要求67的细胞，其中所述核酸分子还包含两个或两个以上的表达盒，其中每个表达盒表达一个选自以下的成员：slr1736、ATPT2、dxs、dxr、GGH、GGPPS、HPPD、MT1、TMT2、GMT、AANT1、slr1737和尿黑酸双加氧酶的反义构建体。
71.权利要求67的细胞，其中所述细胞还包含一种编码HPPD以及或者slr1736或者ATPT2的核酸序列。
72.一种权利要求67的细胞，其中所述细胞是细菌细胞。
73.一种权利要求67的细胞，其中所述细胞是蓝绿藻细胞。
74.一种从转化植物种子获得的油，所述转化植物具有一种包含以下有效连接组分的核酸分子：(A)一个启动子区，所述启动子区在植物细胞中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；(B)一种外源核酸分子，所述外源核酸分子编码包含选自SEQ ID NO：2和4的氨基酸序列的蛋白；和(C)一种3′非翻译序列，所述3′非翻译序列在所述植物细胞中发挥作用从而导致转录终止并且将聚腺苷酸核糖核苷酸添加到所述mRNA分子3′末端。
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