CN1886042A - 用转基因构建体进行多于一个基因的基因表达的协同减少和增加 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及核酸分子和核酸构建体，以及其它与RNA表达的同时上调和下调有关的试剂。特别是，其包括在提高第一种RNA表达的同时抑制第二种RNA的表达。本发明还特别提供了能同时提高第一种RNA表达并同时抑制第二种RNA表达的构建体，使用这些试剂的方法以及含有这些试剂的植物。本发明还提供了其它构建体包括多顺反子构建体。

Description

用转基因构建体进行多于一个基因的基因表达的协同减少和增加
发明领域
本申请涉及核酸分子和核酸构建体，以及其它与RNA表达的同时上调和下调有关的试剂。特别是，其包括用单一构建体在提高第一种RNA表达的同时抑制第二种RNA的表达的方法。本发明还特别提供了能同时提高第一种RNA表达并同时抑制第二种RNA表达的构建体，使用这些构建体的方法以及含有这些构建体的植物。本发明还提供了其它构建体包括多顺反子构建体。
发明背景
许多复杂的生物化学途径现在已经可以从基因上，通常是通过单一基因的抑制或过表达探作。对植物基因操作的可能性的进一步研究需要对一条途径中的多个基因进行协同操作。许多方法已被用于在一个植物中联合转基因——包括有性杂交(sexual crossing)，再转化(retransformation)，共转化(co-transformation)，和连锁转基因的使用。具有连锁的部分基因序列的嵌合转基因可被用于协同地抑制多个植物内源基因。按病毒多蛋白模建的构建体可用于向植物细胞中同时引入多个编码基因(其综述参见Halpin et al.，Plant Mol.Biol.47：295-310(2001))。
植物中基因表达的增强可以通过向植物细胞中引入所述基因的编码序列的额外拷贝或者，优选地，向所述植物基因组中掺入所述基因的编码序列的额外拷贝实现。过表达也可以通过增加调节基因表达，即基因表达的上调的调控机制的活性实现。
在植物中基因表达的抑制，也称为基因的沉默，发生在转录水平和转录后水平。有各种方法可抑制宿主细胞中内源序列的表达。这些方法包括，但不限于，反义抑制(Smith et al.，Nature 334：724-726(1988))，共抑制(Napoli et al.，Plant Cell 2：279-289(1989))，核糖酶(Kohler et al.，J.Mol.Biol.285：1935-1950(1999))，有义和反义的组合(Waterhouse et al.，PNAS USA 95：13959-13964(1998))，启动子沉默(Park et al.，Plant J.9(2)：183-194(1996))，和DNA结合蛋白(Beerli et al.，PNAS USA 95：14628-14633(1997)；Liu et al.，PNAS USA 94：5525-5530(1998))。
这些机制中的某些与DNA或RNA水平上的核酸同源性有关(Matzke et al.，Current Opinion in Genetics and Development11：221-227(2001))。在植物中，双链RNA分子能诱导序列特异性的沉默。在植物中这种现象通常称为双链RNA(“dsRNA”)。已报道在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中也存在这种现象，其中这种基因特异性沉默通常称为RNA干涉或RNAi(Fire et al.，Nature391：806-811(1988))。其他人报道了在植物，真菌和动物中存在这种现象(Sharp，Genes and Development 13：139-141(1999)；Matzkeet al.，Curr.Opin.Genet.Dev.，11：221-227(2001)；Cogoni and Macino，Curr.Opin.Genet.Dev.，10：638-643(2000)；Sharp，Genes andDevelopment 15：485-490(2001)；Waterhouse et al.，PNAS USA95：13959-13964(1988)；Wesley et al.，Plant J.27：581-590(2001)；Grierson，WO98/53083)。Wesley et al.报道了两种载体，pHANNIBAL和pHELLSGATE的设计和使用，它们可以用作基因沉默载体(Wesleyet al.，同上)。据报道这些载体含有在有义和反义序列之间的内含子序列，其中所述有义和反义序列相应于靶编码序列，5’UTR或3’UTR。通过使用位于靶有义和反义序列之间的非靶内含子，获得了较高比例的沉默转化体(Wesley et al.，同上)。用dsRNA使基因沉默的另一个策略涉及具有内含子间隔子的发夹构建体(Smith et al.，Nature407：319-320(2000))。
其它抑制策略包括但不限于反义和有义抑制。参见例如Fillatti inPCT WO 01/14538。
所期望的植物表型可能要求表达一个基因，同时降低另一个基因的表达。因此，需要在植物中用单个转基因构建体同时过表达一种多肽和抑制，或下调，第二种多肽的表达。而且，需要用单个构建体同时抑制或下调多于一个多肽的表达。
发明简述
本发明包括并且提供了包含含有多肽编码序列的第一种核酸区段和含有基因抑制序列的第二种核酸区段的核酸分子，其中所述核酸分子在宿主细胞中的转录导致在所述宿主细胞中所述多肽编码序列编码的多肽的表达和基因的抑制。
本发明包括和提供了具有核酸分子的植物，所述核酸分子包含含有多肽编码序列的第一种核酸区段和含有基因抑制序列的第二种核酸区段，其中所述核酸分子在宿主细胞中的转录导致在所述宿主细胞中所述多肽编码序列编码的多肽的表达和基因的抑制，其中所述第一种核酸区段和所述第二种核酸区段与单一启动子序列可操作地相连。
本发明还包括和提供了同时改变多于一种RNA分子的表达的方法，包括向植物细胞中引入包含含有多肽编码序列的第一种核酸区段和含有基因抑制序列的第二种核酸区段的核酸分子，其中所述核酸分子在宿主细胞中的转录导致在所述宿主细胞中所述多肽编码序列编码的多肽的表达和基因的抑制，其中所述第一种核酸区段和所述第二种核酸区段与单一启动子序列可操作地相连，并且所述第一种核酸区段和所述第二种核酸区段被表达。
附图简述
图1是载体pMON75565中的DNA构建体元件的示意图。
图2是载体pMON75571中的DNA构建体元件的示意图。
图3A和3B描述了分别用pMON75565(图3A)或pMON75571(图3B)转化的植物的R2代的拟南芥(Arabidopsis)种子的总生育酚含量中α-生育酚的百分比。
图4表示了所选的用pMON75565转化的植物的R3代的拟南芥(Arabidopsis)种子中的平均种子油和油酸(18∶1)水平。
图5A和5B显示了用pMON75565转化的植物的R3代的拟南芥(Arabidopsis)种子的总生育酚水平(图5A)和总生育酚含量中α-生育酚的百分比(图5B)。
发明详述
核酸序列描述
SEQ ID NO：1是编码陆地棉(Gossypium hirsutum)γ-生育酚甲基转移酶的DNA分子的核酸序列。
SEQ ID NO：2和3是用于扩增陆地棉γ-甲基转移酶的引物的核酸序列。
SEQ ID NO：4是pMON75565的碱基3345-4947上的RNAi操作元件的1405个核苷酸长的DNA序列。SEQ ID NO：4在5’到3’方向上包括拟南芥FAD2的有义方向的3’UTR序列(碱基1-135)，其与除去了剪接位点的拟南芥FAD2的有义方向的内含子序列(碱基144-1275)相连，后者与拟南芥FAD2的反义方向的3’UTR序列(碱基1281-1405)相连。基本如SEQ ID NO：4中所示的FAD2内含子元件位于pMON75565内的碱基3687-4818，位于SEQ ID：5内的碱基3396-4515。
SEQ ID NO：5是载体pMON75565的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)边界元件之间的转化插入元件，即用于通过RNAi同时增加GMT的表达和减少Δ12去饱和酶的表达的第一转录单元和BAR标记的第二转录单元的元件的8179个核苷酸长的DNA序列。
SEQ ID NO：6是载体pMON75571的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)边界元件间的转化插入元件，即用于通过内含子有义抑制同时增加GMT的表达和减少Δ12去饱和酶的表达的第一转录单元和BAR标记的第二转录单元的元件的7713个核苷酸长的DNA序列。
定义：
本文中所用的“基因”指包括与所述基因产物的表达相关的5’启动子区域，任何内含子和外显子区域以及与所述基因产物的表达相关的3’不翻译区域(“UTR”)的核酸序列。
本文所用的“转基因植物”是以易于使转基因通过任何有性或无性方法从植物传输的方式稳定地并入该转基因的任何植物。
本文所用的“转基因”指与引入到生物体的细胞中的基因的表达相关的核酸序列。转基因包括，但不限于所述生物体的内源基因或非天然存在于所述生物体中的基因。
本文所用的“基因沉默”或“抑制”指通过任何方法对基因表达的下调，所述方法包括但不限于反义抑制，有义抑制和有义内含子抑制。这种下调可以是部分下调。
本文所用的“基因抑制序列”是当转录时能下调基因表达的任何核酸序列。这种方法包括但不限于反义抑制，有义抑制和有义内含子抑制。
本文所用的“反义抑制”指由于引入了反义RNA分子导致的基因沉默。
本文所用的“有义抑制”指由于引入了包括但不限于编码区域或其片段的有义方向的基因片段导致的基因沉默。
本文所用的“有义内含子抑制”指由于引入了基因的有义方向的内含子或其片段导致的基因沉默。有义内含子抑制如Fillatti在PCTWO01/14538 A2中所述。
本文中当表示蛋白质和核酸的时候，使用普通的大写字母，例如“GMT”或“FAD2”，表示酶，蛋白质，多肽，或肽，使用斜体大写字母，例如“GMT”或“FAD2”，表示核酸，包括但不限于基因，cDNA和mRNA。
本文中当表示试剂例如蛋白质和核酸的时候，“衍生”指从已知的蛋白质或核酸直接地(例如，通过查看已知蛋白质或核酸的序列并制备具有与已知蛋白质或核酸的序列相似，至少是部分相似的蛋白质或核酸)或间接地(例如从与已知蛋白质或核酸相关的生物体中获得蛋白质或核酸)获得蛋白质或核酸。其它从已知蛋白质或核酸“衍生”蛋白质或核酸的方法是所属领域技术人员公知的。
本文中当提及核酸构建体的时候，应当理解所述构建体可以是线状或环状形式的。
本文所用的“核酸区段”是较大核酸分子的一部分。这种核酸区段可以，例如，但不限于，包括多肽编码序列或基因抑制序列或二者。
本文所用的“RNAi”和“dsRNA”，指由于引入双链RNA分子导致的基因沉默。
本文所用的“dsRNA分子”和“RNAi分子”均指当引入到细胞或生物体中的时候能至少部分降低细胞中或生物体的细胞中存在的mRNA种类的水平的双链RNA分子。
本文所用的“内含子dsRNA分子”和“内含子RNAi分子”均指当引入到细胞或生物体中的时候能至少部分降低一个或多个细胞中存在的mRNA种类的水平的双链RNA分子，其中所述双链RNA分子与所述细胞或生物体中存在的基因的内含子具有足够的相同性，足以降低含有该内含子序列的mRNA的水平。
术语“非编码”指不编码表达蛋白质的部分或全部的核酸分子的序列。非编码序列包括但不限于内含子，启动子区域，3’不翻译区域(“3’UTR”)，和5’不翻译区域(“5’UTR”)。
本文所用的术语“内含子”指该术语的正常理解，指核酸分子，通常是DNA的区段，其不编码表达蛋白质的部分或全部，在其为内源的情况下，转录成RNA分子，但是在RNA翻译成蛋白质以前被从内源RNA中剪切掉。
本文所用的术语“外显子”指该术语的正常理解，指核酸分子，通常是DNA的区段，其编码表达蛋白质的部分或全部。
如本文所用的，与一个或多个核酸序列“可操作相连”的启动子能驱动一个或多个核酸序列，包括在多顺反子结构或构建体中排列的多个编码或非编码核酸序列的表达。
本文所用的“植物启动子”包括但不限于植物病毒启动子和合成的，嵌合的或杂交的启动子，其是单一的转录单位，能在植物细胞中发挥作用促进mRNA的表达。
“多顺反子结构”或“多顺反子构建体”是包括多于一个基因的核酸序列的结构。应当理解在“多顺反子结构”中可能有相应于外显子，内含子或二者的序列，“多顺反子结构”可以，例如但不限于，含有相应于一个基因的一个或多个外显子和第二个基因的一个或多个内含子的序列。
本文所用的“多顺反子基因”或“多顺反子mRNA”是含有相应于多于一个基因的核酸序列的核酸序列的任何基因或mRNA。应当理解这种多顺反子基因或mRNA可以含有相应于外显子，内含子或二者的序列，重组多顺反子基因或mRNA可以，例如但不限于，含有相应于一个基因的一个或多个外显子和第二个基因的一个或多个内含子的序列。
本文所用的“物理上相连的”核酸序列是单个核酸分子上的核酸序列。
本文所用的“表达”指转录和翻译过程。
本文所用的多于一种试剂例如mRNA或蛋白质的“同时表达”指一种试剂与另一种试剂同时表达。这种表达可以仅仅是部分重叠，也可以是在不同的组织中或以不同的水平发生。
本文所用的多于一种试剂例如mRNA或蛋白质的“同时改变表达”指同时改变一种试剂与另一种试剂的表达。这种多于一种试剂的表达可以是在不同的组织中或以不同的水平被改变。
本文所用的多于一种试剂例如mRNA或蛋白质的“共表达”指一种试剂与另一种试剂在相同的时间以及在相同的细胞或组织中同时表达。
本文所用的多于一种试剂的“协同表达”指当多于一种试剂的表达是使用共用的或相同的启动子进行的时候，这些试剂的共表达。
如本文所用的，试剂例如蛋白质或mRNA的“至少部分提高”或“增加”的水平是至少部分提高的或是增加的，如果该试剂的水平相对于具有相似基因背景但没有引入编码所述蛋白质或mRNA的核酸分子的细胞，组织，植物或生物体中存在的该试剂的水平有所增加。
本文所用的“多肽”包括十五个或更多个氨基酸残基。
本文所用的“肽”含有14个或更少的氨基酸残基。
如本文所用的，试剂例如蛋白质，多肽，肽或mRNA的“提高”的水平是提高的，如果该试剂的水平相对于具有相似基因背景但没有引入编码所述蛋白质或mRNA的核酸分子的细胞，组织，植物或生物体中存在的该试剂的水平增加至少25％。
如本文所用的，试剂例如蛋白质，多肽，肽，或mRNA的水平是“显著地提高的”，如果该试剂相对于具有相似基因背景但没有引入编码所述蛋白质或mRNA的核酸分子的细胞，组织，植物或生物体中存在的该试剂的水平增加至少75％。
如本文所用的，试剂例如蛋白质，多肽，肽，或mRNA的水平的“降低”意味着该水平相对于具有相似基因背景但不具有能减少该试剂的核酸序列的细胞，组织，植物或生物体有所降低。
如本文所用的，试剂例如蛋白质，多肽，肽，或mRNA的水平的“至少部分降低”意味着该水平相对于具有相似基因背景但不具有能减少该试剂的核酸序列的细胞，组织，植物或生物体降低至少25％。
如本文所用的，试剂例如蛋白质，多肽，肽，或mRNA的水平的“显著地降低”意味着该水平相对于具有相似基因背景但不具有能减少该试剂的核酸序列的细胞，组织，植物或生物体有所降低，其中所述试剂的水平的降低是至少75％。
如本文所用的，试剂例如蛋白质，多肽，肽，或mRNA的“有效消除”是相对于具有相似基因背景但不具有能减少所述试剂的核酸序列的细胞，组织，植物或生物体的，其中所述试剂的水平的减少大于95％。
本文所用的“异源的”是指不是天然一起存在的。
本文所用的“内源基因”是不是通过转化或转染被引入到宿主中的任何基因。
本文所用的“总油水平”指脂肪酸的总量，而不管脂肪酸的类型。
本文所用的“改变的种子油组成”指其中脂肪酸的类型的相对百分含量被改变的种子组成。
本文所用的任何范围都包括该范围的端点，除非另外说明。
本发明的试剂就其结构特征，例如核酸分子与另一个核酸分子杂交的能力，或者蛋白质与抗体结合(或与另一个分子竞争这种结合)的能力而言优选是“生物活性的”。或者，这种生物活性可以是催化活性，其因而涉及所述试剂调节化学反应或应答的能力。
试剂优选是“基本上纯化的”。本文所用的术语“基本上纯化的”指分子基本上与所有在天然环境条件下正常地与之结合的其它分子相分离。更优选地基本上纯化的分子是制备物中存在的主要物质。基本上纯化的分子可以是大于60％地，大于75％地，优选大于90％地，最优选大于95％不含天然混合物中存在的其它分子(除溶剂外)。术语“基本上纯化”不意在包括在天然环境条件下存在的分子。
本发明的试剂还可以是重组的。本文所用的术语“重组”指由于对核酸分子或肽的人为操作得到的，或间接导致的任何试剂(例如，包括但不限于DNA，RNA，肽)。
本发明的试剂可以用便于检测所述试剂的反应物(例如荧光标记，Prober et al.，Science 238：336-340(1987)；Albarella et al.，EP144914；化学标记，Sheldon et al.，U.S.Patent 4,582,789；Albarella etal.，U.S.Patent 4,563,417；修饰的碱基，Miyoshi et al.，EP 119448)标记。
本文所用的“％相同性”是用下述参数和算法确定的：SmithWaterman算法用于确定相同性。多肽序列比较的参数典型地包括下列参数：算法：Needleman and Wunsch，J Mol.Biol.48：443-453(1970)。比较矩阵：Hentikoff and Hentikoff，PNAS USA 89：10915-10919(1992)的BLOSSUM62。空位罚分：12；空位长度罚分：4.能采用这些参数运行的程序是公众可获得的，如Genetics Computer Group(″GCG″)，Madison，Wisconsin的“gap”程序。没有末端空位罚分的上述参数是进行肽比较的默认参数。核酸分子序列比较的参数如下所述：算法：Needleman and Wunsch，J.Mol.Bio.48：443-453(1970)。比较矩阵：匹配-+10，不匹配＝0；空位罚分：50；空位长度罚分：3；用上述参数作为核酸分子序列比较的默认参数，用GCG的“gap”程序10.2版本确定“％相同性”。
本文所用的γ-生育酚甲基转移酶(也称为GMT，γ-GMT，γ-MT，γ-TMT，或γ-甲基转移酶)是能特异地催化γ-生育酚转化为α-生育酚的任何多肽。在特定的植物物种例如大豆中，GMT还可以催化δ-生育酚转化为β-生育酚。在其它植物中，GMT也可以催化δ-生育三烯酚转化为β-生育三烯酚。
本文所用的“FAD2”，“Δ12去饱和酶”或“Ω-6去饱和酶”基因是编码能催化双键插入到从羧基端数第十二位的脂肪酰部分中的酶的基因。
核酸分子，构建体和载体
适于将转化DNA引入到宿主植物细胞中的载体系统包括但不限于二元细菌人工染色体(BIBAC)载体(Hamilton et al.，Gene 200：107-116(1997))；RNA病毒载体(Della-Cioppa et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.792(Engineering Plants for Commercial Products andApplications)：57-61(1996))；植物选择性的YAC(酵母人工染色体)载体例如Mullen et al.，Molecular Breeding 4：449-457(1988)所描述的；粘粒；和细菌人工染色体(BAC)，这些载体系统可用于本发明的核酸分子。在本发明的一个方面，这些载体包含包括含有多肽编码序列的第一种核酸区段和含有基因抑制序列的第二种核酸区段的核酸分子，其中所述核酸分子在宿主细胞中的转录导致在所述宿主细胞中所述多肽编码序列编码的多肽的表达和基因的抑制。在另一方面，所述第一种核酸区段和所述第二种核酸区段与单一启动子序列可操作地相连。第二种核酸区段可以以，例如但不限于dsRNA分子，RNAi分子，内含子dsRNA分子，或内含子RNAi分子的形式被表达。在本发明的一个方面，该第一种核酸区段和第二种核酸区段可以在宿主细胞中被表达，被共表达，或被协同表达，在表达的时候，由所述第二种核酸区段编码的RNA被抑制。
A.启动子
在本发明的一个方面，核酸分子，构建体或载体含有与一个或多个核酸序列可操作连接的启动子。在植物细胞中能发挥功能促使生成mRNA分子的任何启动子，例如本文所述的那些启动子，但不限于此，都可以使用。在优选的实施方案中，所述启动子是植物启动子。
大量在植物细胞中有活性的启动子已在文献中描述。包括但不限于胭脂碱合酶(NOS)启动子(Ebert et al.，PNAS USA 84：5745-5749(1987))，章鱼碱合酶(OCS)启动子(在根癌农杆菌的诱癌质粒上携带)，花椰菜花叶病毒属启动子例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton et al.，Plant Mol.Biol.9：315-324(1987))，和CaMV35S启动子(Odell et al.，Nature 313：810-812(1985))，玄参花叶病毒35S启动子(美国专利No.5,378,619)，核酮糖-1，5-二-磷酸羧化酶的小亚基的光诱导的启动子(ssRUBISCO)，Adh启动子(Walker etal.，PNAS USA 84：6624-6628(1987))，蔗糖合酶启动子(Yang et al.，PNAS USA 87：4144-4148(1990))，R基因复合体启动子(Chandleret al.，Plant Cell 1：1175-1183(1989))和叶绿素a/b结合蛋白基因启动子。这些启动子已被用于制备在植物中表达的DNA构建体(参见，例如PCT WO 84/02913)。优选CaMV 35S启动子用于植物中。还可参见美国专利6,437,217，其中公开了玉米RS81启动子；美国专利5,641,876，其中公开了稻肌动蛋白启动子；美国专利6,426,446，其中公开了玉米RS324启动子；美国专利6,429,362，其中公开了玉米PR-1启动子；美国专利6,232,526，其中公开了玉米A3启动子，以及美国专利6,177,611，其中公开了组成型玉米启动子。带有稻肌动蛋白内含子的稻肌动蛋白1启动子特别适用于实施本发明。
特别地，优选的启动子还可以用于在种子或果实中表达本发明的核酸分子。实际上，在优选的实施方案中，所使用的启动子是种子特异性启动子。这类启动子的实例包括基因例如napin基因(Kridl et al.，Seed Sci.Res.1：209：219(1991))，菜豆蛋白(Bustos et al.，Plant Cell1(9)：839-853(1989))，大豆胰蛋白酶抑制剂(Riggs et al.，PlantCell 1(6)：609-621(1989))，ACP(Baerson et al.，Plant Mol.Biol.22(2)：255-267(1993))，硬脂酰-ACP去饱和酶(Slocombe et al.，Plant Physiol.104(4)：167-176(1994))，大豆β-伴球蛋白a’亚基(大豆7S启动子，(Chen et al.PNAS USA 83：8560-8564(1986)))，脂肪酸延长(FAE1)启动子(PCT WO 01/11061)，和油质蛋白(oleosin)(参见，例如，Hong et al.，Plant Mol.Biol.34(3)：549-555(1997))的5’调控区域。更多的实例包括β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)的启动子(Chen et al.，Dev.Genet.10：112-122(1989))。优选用于在种子中表达的启动子是7S和napin启动子。
还包括玉米蛋白启动子，这是一类在玉米胚乳中发现的贮藏蛋白。玉米蛋白基因的基因组克隆已经被分离出来(Pedersen et al.，Cell29：1015-1026(1982)；Russell et al.，Transgenic Res.6(2)：157-168(1997))，这些克隆，包括15kD，16kD，19kD，22kD和27kD基因的启动子也可以使用。其它已知的在例如玉米中起作用的启动子，包括下列基因的启动子：waxy，Brittle，Shrunken 2，分枝酶(branchingenzymes)I和II，淀粉合酶，去枝酶(debranching enzymes)，油质蛋白(oleosin)，谷蛋白和蔗糖合酶。用于玉米胚乳表达的特别优选的启动子是稻的谷蛋白基因启动子，更特别的是Osgt-1启动子(Zhenget al.，Mol.Cell Biol.13：5829-5842(1993))。适于在小麦中表达的启动子的实例包括ADP葡萄糖pyrosynthase(ADPGPP)亚基，颗粒结合型和其它淀粉合酶，分枝和去枝酶，胚胎发生丰富蛋白，醇溶蛋白和麦谷蛋白的启动子。稻中的这类启动子的实例包括ADPGPP亚基，颗粒结合型和其它淀粉合酶，分枝酶，去枝酶，蔗糖合酶和谷蛋白的启动子。特别优选的启动子是稻谷蛋白启动子，Osgt-1。大麦中的这类启动子的实例包括ADPGPP亚基，颗粒结合型和其它淀粉合酶，分枝酶，去枝酶，蔗糖合酶，大麦醇溶蛋白，胚胎球蛋白和糊粉特异性蛋白的启动子。
本发明的蛋白质的组织特异性表达是特别优选的实施方案。可以使用的组织特异性启动子包括豌豆的叶绿体谷氨酰胺合成酶GS2启动子(Edwards et al.，PNAS USA 87：3459-3463(1990))，小麦的叶绿体果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)启动子(Lloyd et al.，Mol.Gen.Genet.225：209-216(1991))，马铃薯的核光合作用ST-LS1启动子(Stockhauset al.，EMBO J.8：2445-2451(1989))，拟南芥的丝氨酸/苏氨酸激酶(PAL)启动子和葡萄糖淀粉酶(CHS)启动子。还报道了在光合作用活性组织中有活性的是美洲落叶松(Larix larcina)的核酮糖-1，5-双磷酸羧化酶(rbcS)启动子，松树的cab基因的启动子，cab6(Yamamotoet al.，Plant Cell Physiol.35：773-778(1994))，小麦的Cab-1基因的启动子(Fejes et al.，Plant Mol.Biol.15：921-932(1990))，菠菜的CAB-1基因的启动子(Lubberstedt et al.，Plant Physiol.104：997-1006(1994))，稻的cab1R基因的启动子(Luan et al.，Plant Cell 4：971-981(1992))，玉米的磷酸丙酮酸二激酶(PPDK)启动子(Matsuoka etal.，PNAS USA 90：9586-9590(1993))，烟草Lhcb1*2基因的启动子(Cerdan et al.，Plant Mol.Biol.33：245-255(1997))，拟南芥SUC2蔗糖-H+同向转运启动子(Truernit et al.，Planta.196：564-570(1995))和菠菜的类囊体膜蛋白的启动子(psaD，psaF，psaE，PC，FNR，atpC，atpD，cab，rbcS)。叶绿素a/b结合蛋白的其它启动子也可用于本发明，例如白芥的LhcB基因和PsbP基因的启动子(Sinapis alba；Kretschet al.，Plant Mol.Biol.28：219-229(1995))。
用于基因的块茎特异性或块茎增加性表达的许多启动子都是已知的并且是可以使用的，包括I类patatin启动子(Bevan et al.，EMBO J.8：1899-1906(1986)；Jefierson et al.，Plant Mol.Biol.13：995-1006(1990))，马铃薯块茎ADPGPP基因，大亚基和小亚基的启动子，蔗糖合酶启动子(Salanoubat and Belliard，Gene 60：47-56(1987)，Salanoubat and Belliard，Gene 84：181-185(1989))，主要块茎蛋白包括22kd蛋白复合物和蛋白酶抑制剂的启动子(Hannapel，PlantPhysiol.101：703-704(1993))，颗粒结合型淀粉合酶基因(GBSS)启动子(Visser et al.，Plant Mol.Biol.17：691-699(1991))和其它I类和II类patatin启动子(Koster-Topfer et al.，Mol.Gen.Genet.219：390-396(1989)；Mignery et al.，Gene.62：27-44(1988))。
根特异性启动子也可以使用。这种启动子的实例是酸性几丁酶基因启动子(Samac et al.，Plant Mol.Biol.25：587-596(1994))。还可以通过使用已鉴别的CaMV35S启动子的根特异性子域实现在根组织中的表达(Lam et al.，PNAS USA 86：7890-7894(1989))。其它根细胞特异性启动子包括那些Conkling et al.报道的(Conkling et al.，PlantPhysiol.93：1203-1211(1990))。
用于本发明的核酸构建体中的启动子可以被修饰，如果需要的话，以改变它们的控制特性。启动子可以通过与操纵子区域连接，随机或受控突变等方法衍生化。而且，启动子可以被改变使之含有多个“增强子序列”以辅助增加基因表达。这些增强子是本领域已知的。通过在这些构建体中包含增强子序列，所选蛋白质的表达可以被增强。这些增强子在在真核细胞中起作用的启动子中通常是在转录起始点的5’处，但是通常可以正向或反向方向插入到编码序列的5’或3’。在一些实例中，这些5’增强元件是内含子。认为特别可用作增强子的是稻肌动蛋白1和稻肌动蛋白2基因的5’内含子。根据本发明可使用的其它增强子的实例包括CaMV 35S启动子，章鱼碱合酶基因，玉米醇脱氢酶基因，玉米shrunken 1基因和非植物真核细胞启动子的元件。
当增强子与启动子一起用于所选蛋白质的表达的时候，认为优选将所述增强子置于所述启动子和所选编码区域的起始密码子之间。但是，还可以使用相对于其它序列的不同的增强子排列，仍然可以获得所述增强子带来的有益性质。例如，所述增强子可以置于所述启动子区域的5’，所述启动子区域内部，所述编码序列内部(包括在可能存在的任何其它内含子序列内部)，或者所述编码区域的3’。
除了具有增强活性的内含子，其它类型的元件也可以影响基因表达。例如，被预测为能增强基因表达以及“共有”的不翻译的前导序列以及优选的前导序列已被鉴别。优选的前导序列包含那些具有被预测能使得所连接的编码区域实现最佳表达的序列，即包含能增加或维持mRNA稳定性并防止不正确地翻译起始的优选共有前导序列。这些序列的选择是所属领域技术人员根据现有技术可知的。衍生自在植物中，特别是在玉米中高度表达的基因的序列是最优选的。例如，衍生自核酮糖二磷酸羧化酶(RUBISCO)的小亚基的序列。
通常优选在基因组中随机引入异源DNA，即在非特定的位置。在特定的情况下靶定异源核酸插入以获得位点特异性整合可能是有用的，例如替换基因组中存在的基因。在其它一些情况下可以靶定异源核酸整合到基因组中已知基因表达在该处发生的预定位点。已知存在几个在植物中起作用的位点特异性重组系统，包括如美国专利4,959,317中公开的cre-lox，和如美国专利5,527,695中公开的FLP-FRT。
其它可以使用的启动子如，例如美国专利5,378,619；5,391,725；5,428,147；5,447,858；5,608,144；5,614,399；5,633,441；5,633,435；和4,633,436中所述。此外，可以使用组织特异性增强子(Fromm et al.，Plant Cell 1：977-984(1989))。
B.核酸分子
在本发明的一个方面，所述核酸分子含有核酸序列，当其被引入到细胞或生物体中的时候，能在表达一种或多种能抑制一种或多种RNA分子在所述细胞或生物体中表达的水平的其它RNA分子的同时过表达，表达，共表达或协同表达一种或多种RNA分子以产生一种或多种蛋白质，其片段，多肽，或肽。
在本发明的该方面，任何蛋白质，其片段，多肽或肽可以被表达，任何RNA分子可以被抑制。编码这种蛋白质，其片段，多肽，和肽的核酸序列以及用于抑制一种或多种mRNA分子在所述细胞或生物体中表达的核酸序列可以衍生自，例如但不限于基因，其片段，eDNA，其片段等。
本发明的基因可以是任何基因，无论是内源的或是引入的。这类基因的核酸序列可以从多个来源，包括但不限于数据库例如www-ebi.ac.uk/swisprot/；www-expasy.ch/；www-embl.heidelberg.de/；和www-ncbi.nlm.nih.gov上的EMBL和Genbank获得。这类基因的核酸序列还可以自，但不限于例如http-genes.mit.edu/GENSCAN.html上的GENSCAN程序的来源获得。在另一个实施方案中，其它基因可以通过能鉴别其它基因的任何方法获得。在优选的实施方案中，其它基因可以通过用已知基因序列的探针筛选基因文库获得。所述基因然后可以被克隆并证实。其它基因可以，例如但不限于，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增并用于本发明的实施方案中。此外，其它核酸序列的基因对于所属领域的普通技术人员来说是显而易见的。
多种方法中的任何一种都可以用于获得一种或多种基因。自动核酸合成仪可用于该目的，制备具有也存在于细胞或生物体中的序列的核酸分子。作为这种合成的替代方法，核酸分子可用于确定可在PCR中使用以扩增和获得任何所期望的第一种基因的核酸分子或片段的一对引物。
在一个优选的方面，所述基因，mRNA或蛋白质是非病毒基因，mRNA或蛋白质。在另一个优选的方面，所述基因，RNA或蛋白质是内源基因，RNA或蛋白质。在一个优选的方面，基因是GMT基因。本发明的优选的GMT基因是植物或蓝细菌GMT，更优选是在选自下组的生物体中发现的GMT：拟南芥(Arabidopsis)，稻，玉米，棉花，萼距花，油菜，番茄，大豆，金盏花，高粱，和韭菜，最优选是在选自下组的生物体中发现的GMT：拟南芥(Arabidopsis thaliana)，水稻(Oryza sativa)，玉米(Zea mays)，陆地棉(Gossypium hirsutum)，Cuphea pulcherrima，甘蓝型油菜(Brassica napus)，番茄(Lycopersiconesculentum)，大豆(Glycine max)，万寿菊(Tagetes erecta)，和亚洲百合(Lilium asiatic)。GMT基因的代表性序列包括，但不限于2002年8月16日提交的美国专利申请序列号10/219,810中所述的。
在一个方面，本发明的另一个优选的基因是FAD2基因。FAD2的代表性序列包括，但不限于2002年6月21日提交的美国专利申请序列号10/176,149，和2000年8月11日提交的美国专利申请序列号09/638,508，以及1999年8月26日提交的美国临时申请序列号60/151,224，以及1999年12月17日提交的美国临时申请序列号60/172,128中所述的。在一个优选的方面，GMT蛋白被表达而FAD2蛋白的表达被抑制。
在本发明的一个方面，核酸分子包含含有多肽编码序列的第一种核酸区段和含有基因抑制序列的第二种核酸区段，其中所述核酸分子在宿主细胞中的转录导致在所述宿主细胞中所述多肽编码序列编码的多肽的表达和基因的抑制，其中所述第一种核酸区段和所述第二种核酸区段与单一启动子序列可操作地相连。
在本发明的一个优选的方面，所述核酸分子进一步含有与本发明的编码蛋白质，其片段，多肽，或肽的核酸分子可操作融合的编码质体转运肽的核苷酸序列。
本发明的核酸分子或蛋白质，其片段，多肽，或肽可以在核酸或氨基酸序列上与基因或其翻译产物不同，但是与基因的核酸或氨基酸序列有一定百分比的相同性。“相同性”，如本领域中所理解的一样，是两个或多个多肽序列或两个或多个核酸分子序列之间的关系，通过比较这些序列来确定。在本领域中，“相同性”也意味着多肽或核酸分子序列之间序列相关性的程度，通过这些序列的排列匹配来确定。“相同性”可以容易地用已知的方法计算。
在另一个方面，本发明的核酸分子的核酸序列可以含有与编码蛋白质，其片段，多肽，或肽的序列不同的序列，这是由于蛋白质，其片段，多肽，或肽可以具有一个或多个保守性氨基酸变化，因此编码所述多肽的核酸序列可以具有序列差异。
本领域公知天然序列中的一个或多个氨基酸可以被其它电荷和极性与该天然氨基酸类似的氨基酸取代，即保守性氨基酸取代。当进行氨基酸变化的时候还可以考虑氨基酸的亲水指数(hydropathicindex).亲水氨基酸指数对于赋予蛋白质的相互作用生物功能的重要性在本领域是被广泛了解的(Kyte and Doolittle，J Mol.Biol.157：105-132(1982))。还应当理解，在本领域中，可以基于蛋白质的亲水性有效地进行相似氨基酸的取代。美国专利4,554,101描述了蛋白质的最大局部平均亲水性，由其相邻氨基酸的亲水性决定，与蛋白质的生物学性质相关。在进行这种变化的时候，亲水性值在±2以内的氨基酸的取代是优选的，在±1以内的是特别优选的，在±0.5以内的是更特别优选的。
由于遗传密码的简并性，不同的核苷酸密码子可以用于编码特定的氨基酸。宿主细胞通常显示出优选的密码子使用模式。结构性核酸序列优选利用特定宿主细胞的密码子使用模式构建。这通常增加了结构性核酸序列在转化的宿主细胞中的表达。任何上述核酸和氨基酸序列都可以进行修饰以表现出包含其在内的宿主细胞或生物体的优选密码子使用。使其符合植物中最佳的密码子使用而进行的对结构性核酸序列的修饰如美国专利No.5,689,052所述。
本发明的优选的实施方案包括含有第一种，第二种或全部二种核酸区段的核酸分子，其全长至少50％，60％，或70％与植物基因相同。更优选的是含有其全长至少80％或至少85％与植物基因相同的区域的第一种，第二种或全部二种核酸区段。在这一点上，其全长有至少90％相同性的第一种和第二种核酸区段是特别优选的，那些有至少95％相同性的是尤其优选的。而且，那些有至少97％相同性的是高度优选的，那些有至少98％和至少99％相同性的是特别高度优选的，那些具有100％相同性的是最高度优选的。
本发明的核酸分子的第一种或第二种核酸区段的子集包括片段核酸分子。片段核酸分子可以由植物基因的重要部分，或实际上由植物基因的大部分组成。或者，片段可以含有更小的寡核苷酸，具有大约15个至大约400个连续核苷酸残基，更优选地，大约15个至大约45个连续的核苷酸残基，大约20个至大约45个连续的核苷酸残基，大约15个至大约30个连续的核苷酸残基，大约21个至大约30个连续的核苷酸残基，大约21个至大约25个连续的核苷酸残基，大约21个至大约24个连续的核苷酸残基，大约19个至大约25个连续的核苷酸残基，或大约21个连续的核苷酸残基。在优选的实施方案中，片段与植物基因的区域显示出100％的相同性。在另一个优选的实施方案中，片段含有更大核酸序列的一部分。在另一个方面，片段核酸分子具有具有本发明的核酸分子的至少15，25，50，或100个连续核苷酸的核酸序列。在优选的实施方案中，核酸分子具有具有植物基因的至少15，25，50，或100个连续核苷酸的核酸序列。
应当理解本发明的核酸可以是任何方向，这种分子可以是有义方向或反义方向。
第一种核酸区段可以是在物理上与具有第二种核酸区段的多顺反子构建体相连，或是其的一部分。在第一种或第二种核酸区段内部的核酸序列可以是在物理上与具有其它核酸区段的多顺反子构建体相连，或是其的一部分。启动子可以是在物理上与具有第一种核酸区段和第二种核酸区段的多顺反子构建体相连，或是其的一部分。这种多顺反子构建体可以是能够表达多顺反子mRNA。
i.能被转录为一个或多个RNA的第一种核酸区段
第一种核酸区段可以是能被转录和表达为mRNA的任何核酸序列。在一个方面，所述核酸序列相应于在天然存在的基因或基因的部分例如基因的转录区段中发现的核酸序列。这种基因可以是任何生物体中的任何基因。在一个优选的方面，所述基因来自于植物。在另一个优选的方面，所述基因来自于微生物。一种示例性的基因是GMT基因。被转录和表达为mRNA的第一种核酸区段可以被翻译成蛋白质，其片段，多肽，或肽。在一个方面，所述蛋白质，其片段，多肽，或肽也可以是宿主内源的。在另一个方面，所述蛋白质，其片段，多肽，或肽通常在植物中没有。在另一个方面，所述蛋白质，其片段，多肽，或肽的氨基酸序列在非转化的宿主中没有。
还应当理解第一种核酸区段可以含有编码多于一种蛋白质，其片段，多肽，或肽的序列。在此方面，所述蛋白质，其片段，多肽，或肽可以是宿主内源的，通常在植物中没有的，或在非转化的宿主中没有的蛋白质，其片段，多肽，或肽的组合。在此方面，第一种核酸区段可以编码两个，三个，四个，五个，或多于五个蛋白质，其片段，多肽，或肽。
ii.能抑制一种或多种RNA的第二种核酸序列
第二种核酸区段可以是任何核酸序列，当它被引入到细胞或生物体中的时候，能够有效消除，显著地降低，至少部分降低或降低基因编码的mRNA转录物或蛋白质的水平。在本发明的一个方面，基因是内源基因。在本发明的一个方面，基因是植物基因。一种示例性的基因是FAD2基因。
还应当理解第二种核酸区段可以是任何核酸序列，当它被引入到细胞或生物体中的时候，能够有效消除，显著地降低，至少部分降低或降低一种，两种，三种，四种，五种或更多种mRNA的水平。还应当理解在此方面，单独的mRNA可以通过不同方法被抑制，例如RNAi和反义抑制。
在本发明的一个方面，本发明的第二种核酸序列，优选是dsRNA构建体，优选是有义RNA构建体，或优选是反义RNA构建体，能够至少部分降低，更优选显著地降低，或最优选有效消除另一种试剂例如蛋白质或mRNA。在本发明的一个方面，所述其它试剂是FAD2基因编码的FAD2蛋白或mRNA。
在另一个方面，一种或多种试剂的水平被降低，至少部分降低，显著地降低或有效消除，而一种或多种同时共表达或协同表达的试剂的水平至少部分提高，至少提高，或显著地提高。
在另一个实施方案中，核酸分子，当引入到细胞或生物体中的时候，选择性地增加由第一种基因编码的第一种蛋白质或RNA转录物或二者的水平，同时减少由第二种基因编码的第二种蛋白质，转录物或二者的水平，还改变α-生育酚的含量，油组成，以及所述细胞或生物体的油水平。
多种方法可用于有效地消除，显著地降低，或至少部分降低由基因编码的mRNA转录物或蛋白质的水平。这些方法可以导致基因特异性沉默或者导致多个基因沉默。这种基因沉默的实例包括但不限于那些由于引入双链RNA分子，反义，和有义RNA而导致的基因沉默。
在另一个方面，第二种核酸区段可以是任何核酸序列，当它被引入到细胞或生物体中的时候，能够有效消除，显著地降低，至少部分降低或降低由基因编码的两个，三个，四个，五个或多于五个mRNA转录物或蛋白质的水平。
a.dsRNA
可用于基因沉默的双链分子包括含有相应于存在于转录物中的核酸序列的核酸序列的dsRNA分子。这种核酸序列包括但不限于编码蛋白质，其片段，多肽，或肽的核酸序列，以及那些相应于转录的内含子，转录的3’不翻译区域(UTR)，以及转录的5’UTR的核酸序列。
本发明的核酸分子的第二种核酸序列的一个子集是表达为双链RNA的核酸序列，其含有(1)与要被抑制的第二种基因的转录区域具有相同性的第一种RNA片段，(2)能与第一种RNA形成双链RNA分子的第二种RNA。第一种RNA片段可以由要被抑制的植物基因的重要部分，或实际上由其大部分组成。
在一个方面，本发明的核酸分子含有与来自第二种植物基因的一种或多种植物内含子具有足够同源性的核酸序列，当其作为dsRNA构建体被引入到植物细胞或植物中的时候，能够有效消除，显著地降低，或者至少部分降低由衍生出所述内含子的基因编码的mRNA转录物或蛋白质的水平。
在一个方面，本发明的核酸分子含有与来自第二种植物基因的一种或多种植物外显子具有足够同源性的核酸序列，当其作为dsRNA构建体被引入到植物细胞或植物中的时候，能够有效消除，显著地降低，或者至少部分降低由衍生出所述外显子的基因编码的mRNA转录物或蛋白质的水平。
在一个方面，本发明的核酸分子含有与来自第二种植物基因的一种或多种植物的转录的3’UTR具有足够同源性的核酸序列，当其作为dsRNA构建体被引入到植物细胞或植物中的时候，能够有效消除，显著地降低，或者至少部分降低由衍生出所述3’UTR的基因编码的mRNA转录物或蛋白质的水平。
在一个方面，本发明的核酸分子含有与来自第二种植物基因的一种或多种植物的转录的5’UTR具有足够同源性的核酸序列，当其作为dsRNA构建体被引入到植物细胞或植物中的时候，能够有效消除，显著地降低，或者至少部分降低由衍生出所述5’UTR的基因编码的mRNA转录物或蛋白质的水平。
在另一个优选的方面，dsRNA构建体包含外显子序列，但是所述外显子序列不对应于植物外显子的能有效消除，显著地降低，或者至少部分降低由衍生出所述外显子的第二种基因编码的mRNA转录物或蛋白质的水平的足够部分。用dsRNA构建体抑制基因表达的策略包括2000年6月9日提交的美国临时专利申请序列号No.60/390,186中所述的。
b.反义抑制
可用于基因沉默的反义分子包括含有相应于在转录物或其部分中发现的核酸序列的互补序列的核酸序列的任何分子或其互补性足以用作反义分子的分子。这种分子包括但不限于的序列是那些编码蛋白质，其片段或多肽的序列的互补序列，以及那些相应于转录的内含子，转录的3’不翻译区域(UTR)，和转录的5’UTR的序列的互补序列。
反义方法是一种通过靶定基因物质防止或降低基因功能的方法(Mol et al.，FEBS Lett.268：427-430(1990))。反义方法的目的是利用与靶基因互补的序列阻断其表达，产生突变细胞系或生物体，其中单个所选蛋白的水平被选择性地降低或破坏。失活的位点和其发育效果可以通过反义基因的启动子的选择或通过外部使用或显微注射的时序来操纵。反义可以通过选择靶基因的独特区域或与其它相关基因具有同源性的区域而操纵其特异性(Hiatt et al.，In：GeneticEngineering.Setlow(ed.)，Vol.11，New York：Plenum 49-63(1989))。
反义RNA技术包括向细胞中引入与靶mRNA互补的RNA，导致通过反义底物和靶mRNA之间的碱基对形成特异的RNA：RNA双链(Green et al.，Annu.Rev.Biochem.55：569-597(1986))。在一个实施方案中，所述过程包括反义基因序列的引入和表达。在这种序列中正常基因序列的部分或全部以反方向置于启动子控制之下，使得“错误的”或互补链被转录为不编码的反义RNA，它与靶mRNA杂交并干扰其表达(Takayama and Inouye，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.25：155-184(1990))。反义载体用标准方法构建，通过转化，转染，电穿孔，显微注射，感染等方式引入到细胞中。转化的类型和载体的选择决定了表达是瞬时的还是稳定的。用于反义基因的启动子可能影响反义抑制的水平，时机，组织，特异性，或可诱导性。
c.共抑制或有义抑制
可用于基因沉默的有义抑制分子包括含有相应于在转录物或其部分中发现的核酸序列的核酸序列的任何分子或其互补性足以用作有义分子的分子。这种分子包括但不限于的序列是那些编码蛋白质，其片段或多肽的序列，以及那些相应于转录的内含子，转录的3’不翻译区域(UTR)，和转录的5’UTR的序列。
共抑制是通过能转录与内源基因的转录物具有相同链(strandedness)的mRNA的同源有义构建体的表达使得特定的内源基因或基因家族的表达水平降低，通常是在RNA水平上(Napoli et al.，Plant Cell 2：279-289(1990)；van der Krol et al.，Plant Cell 2：291-299(1990))。共抑制可由与细胞内存在的核酸序列同源的单拷贝核酸分子(Prolls and Meyer，Plant J.2：465-475(1992))或与细胞内存在的核酸序列同源的核酸分子的多个拷贝(Mittlesten et al.，Mol.Gen.Genet.244：325-330(1994))的稳定转化导致。基因，即使是不同的，与同源启动子连接都可能造成连接的基因的共抑制(Vaucheret，C.R.Acad.Sci.III 316：1471-1483(1993)；Flavell，PNAS USA，91：3490-3496(1994)；van Blokland et al.，Plant J.6：861-877(1994)；Jorgensen，Trends Biotechnol.8：340-344(1990)；Meins and Kunz，In：Gene Inactivation and Homologous Recombination in Plants，Paszkowski(ed.)，pp.335-348，Kluwer Academic，Netherlands(1994))。
iii.核酸分子的抑制或表达
在本发明的一个方面，本发明提供了与单一启动子序列可操作相连的能编码两个，三个，四个，五个，或多于五个蛋白，其片段，多肽，或肽的核酸分子。
在本发明的另一个方面，本发明提供了与单一启动子序列可探作相连的核酸分子，当它被引入细胞或生物体中的时候，能够有效消除，显著地降低，至少部分降低或降低由基因编码的两个，三个，四个，五个，或多于五个mRNA转录物或蛋白质。
C.构建体/载体的其它组分
构建体或载体还可以包括，在感兴趣的区域内，其全部或部分能终止该区域的转录的核酸序列。多种这样的序列已被分离，包括Tr73’序列和NOS 3’序列(Ingelbrecht et al.，Plant Cell 1：671-680(1989)；Bevan et al.，Nucleic Acids Res.11：369-385(1983))。在本发明的植物表达构建体中也可以提供调控转录终止区域。转录终止区域可由编码感兴趣基因的DNA序列提供，或者可由不同的基因来源获得的适宜的转录终止区域提供，例如天然与转录起始区域结合的转录终止区域。技术人员应当认识到能在植物细胞中终止转录的任何适宜的转录终止区域都可以用于本发明的构建体中。
载体或构建体还可以包括调控元件。其实例包括Adh内含子1(Callis et al.，Genes and Develop.1：1183-1200(1987))，蔗糖合酶内含子(Vasil et al.，Plant Physiol.91：1575-1579(1989))和TMV omega元件(Gallie et al.，Plant Cell 1：301-311(1989))。在合适的时候可以包括这些和其它的调控元件。
载体或构建体还可以包括选择标记。选择标记也可用于选择含有外源基因物质的植物或植物细胞。其实例包括但不限于：neo基因(Potrykus et al.，Mol.Gen.Genet.199：183-188(1985))，其编码卡那霉素抗性，可以用卡那霉素，RptII，G418，hpt进行选择；编码双丙胺磷(bialaphos)抗性的bar基因；突变的EPSP合酶基因(Hincheeet al.，Bio/Technology 6：915-922(1988)；Reynaerts et al.，Selectableand Screenable Markers，In Gelvin and Schilperoort，Plant MolecularBiology Manual，Kluwer，Dordrecht(1988))；aadA(Scofield et al.，Mol.Gen.Genet.244(2)：189-96(1994))，其编码草甘膦(glyphosate)抗性；提供溴苯腈抗性的腈水解酶基因(Stalker et al.，J.Biol.Chem.263：6310-6314(1988))；提供咪唑啉酮或磺脲抗性的突变的乙酰乳酸合酶基因(ALS)(欧洲专利申请154,204(1985年9月11日))；ALS(D′Halluin et al.，Bio/Technology 10：309-314(1992))；和氨甲喋呤抗性DHFR基因(Thillet et al.，J.Biol.Chem.263：12500-12508(1988))。
载体或构建体还可以包括筛选标记。筛选标记可以用于监控表达。示例性的筛选标记包括：编码其各种发色底物已知的酶的β-葡糖醛酸酶或uidA基因(GUS)(Jefferson，Plant Mol.Biol，Rep.5：387-405(1987)；Jefferson et al.，EMBO J.6：3901-3907(1987))；R-位点基因，其编码调控植物组织中花青素色素(红色)的产生的产物(Dellaporta et al.，Stadler Symposium 11：263-282(1988))；β-内酰胺酶基因(Sutclifie et al.，PNAS USA 75：3737-3741(1978))，编码其各种发色底物已知(例如PADAC，发色头孢菌素)的酶的基因；荧光素酶基因(Ow et al.，Science 234：856-859(1986))；编码能转化发色邻苯二酚的邻苯二酚加双氧酶的xylE基因(Zukowsky et al.，PNASUSA 80：1101-1105(1983))；α-淀粉酶基因(Ikatu et al.，Bio/Technology8：241-242(1990))；编码能使酪氨酸氧化成DOPA和多巴醌然后缩合为黑色素的酶的酪氨酸酶基因(Katz et al.，J.Gen.Microbiol.129：2703-2714(1983))；和α-半乳糖苷酶基因，其编码能转变发色α-半乳糖底物的酶。
术语“选择或筛选标记基因”还包括编码分泌标记的基因，该分泌标记的分泌可以被检测以作为鉴别或选择转化细胞的手段。实例包括编码能通过抗体相互作用鉴别的分泌性抗原的标记，或者甚至能被催化地检测的分泌性酶。分泌蛋白包括多个类别，包括可检测的(例如通过ELISA)小的，可扩散的蛋白，可在胞外溶液中检测的小的活性酶(例如α-淀粉酶，β-内酰胺酶，膦丝菌素转移酶)，或插入或陷入细胞壁中的蛋白质(例如包括例如在延伸的表达单位或烟草PR-S中发现的前导序列的蛋白质)。其它可能的选择和/或筛选标记基因对于所属领域技术人员来说是显而易见的。
转基因植物，其部分和植物细胞
外源基因物质可以被转移到植物细胞中，所述植物细胞可以再生成为整个的，有生殖力的或不育的植物或植物部分。外源基因物质可以是来自任何来源的能够插入到任何生物体中的任何基因物质，无论是天然存在的或是其它的。这种外源基因物质包括但不限于含有本发明的核酸序列，如本文所述的，的核酸分子和构建体。
在一个优选的方面，本发明的植物细胞或植物包括含有第一种和第二种核酸序列的核酸分子，其中所述第一种核酸序列当表达的时候，能够至少部分提高，增加，提高，或显著地提高mRNA转录物或蛋白质的水平，所述第二种核酸序列与一种或多种植物基因具有足够的同源性，从而当其表达的时候，能够有效消除，显著地降低，或至少部分降低由衍生出它的基因或与该基因具有同源性的任何基因编码的mRNA转录物或蛋白质的水平。
应当理解可以使用会抑制基因表达的任何方法。
在本发明的一个方面，本发明的植物细胞或植物包括含有能够增加由GMT基因编码的蛋白质，转录物或二者，同时选择性减少由FAD2基因编码的蛋白质，转录物或二者的核酸序列的核酸分子。
在一个优选的方面，本发明的植物细胞或植物包括含有第一种核酸区段和第二种核酸区段的核酸分子，其中所述第一种核酸区段，第二种核酸区段或二者能够改变种子油组成。在一个更优选的方面，所述第一种核酸序列，当表达的时候，能够增加α-生育酚的水平，所述第二种核酸区段与一种或多种植物基因的互补序列具有足够的同源性，从而当它表达的时候，能够增加油酸或油含量，或二者的水平，所述第一种核酸序列和所述第二种核酸区段与单一启动子序列可操作地连接。
基因物质可以被引入到任何物种中，例如，但不限于单子叶植物或双子叶植物，包括，但不限于苜蓿，苹果，拟南芥(Arabidopsis)，香蕉，大麦，油菜(Brassica campestris)，油菜(canola)，蓖麻，菊花，咖啡树，棉花，棉籽，玉米，海甘蓝，酸果蔓，黄瓜，石槲兰，薯蓣，核树，羊茅，亚麻，剑兰，百合，亚麻子，黍，香瓜，芥菜，燕麦，油椰，油籽，木瓜，花生，多年生植物，菜豆(Phaseolus)，马铃薯，油菜籽，稻，黑麦，黑麦草，红花，芝麻，高粱，大豆，甜菜，甘蔗，向日葵，烟草，番茄，草坪草，和小麦(Christou，INO：Particle Bombardment for Genetic Engineering of Plants，BiotechnologyIntelligence Unit.Academic Press，San Diego，California(1996))，其中苜蓿，拟南芥(Arabidopsis)，油菜(Brassica campestris)，canola，蓖麻，玉米，棉花，棉籽，海甘蓝，亚麻，亚麻子，芥菜，油椰，油籽，花生，马铃薯，油菜籽，红花，芝麻，大豆，向日葵，烟草，番茄，和小麦是优选的，油菜(Brassica campestris)，canola，玉米，油椰，油籽，花生，油菜籽，红花(safflower)，大豆，和向日葵是更优选的。在一个更优选的方面，基因物质被转入canola中。在另一个更优选的方面，基因物质被转入到油籽(oilseed rape)。在另一个特别优选的实施方案中，基因物质被转入到大豆或玉米中。
基因物质还可以引入到合适的细胞例如植物细胞中。所述细胞可以是存在于多细胞环境中。在本发明的一个方面，所述多细胞环境可以是在转化的植物中。
基因物质还可以引入到细胞或生物体例如哺乳动物细胞，哺乳动物，鱼细胞，鱼，鸟细胞，鸟，藻细胞，藻，真菌细胞，真菌，或细菌细胞中。优选的宿主和转化体包括：真菌细胞例如曲霉(Aspergillus)，酵母，哺乳动物，特别是牛和猪，昆虫，细菌和藻。特别优选的细菌是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和大肠杆菌(E.coli)。
产物例如转录物或蛋白质的水平可以在整个生物体例如植物中，或者可以在所述生物体的一个或多个特定器官或组织中局部被增加或被减少，或被增加和减少。例如产物的水平可以在植物的一个或多个组织和器官中被增加或被减少，包括但不限于：根，块茎，茎，叶，杆，果实，浆果，坚果，树皮，英，种子和花。优选的器官是种子。
在本发明的一个方面，在用本发明的核酸转化植物或其它生物体之后，一种或多种试剂的水平至少部分提高，增加，提高，或显著地提高，而第二种试剂与第一种试剂同时表达，共表达，或协同表达。
在另一个方面，在用本发明的核酸转化植物或其它生物体之后，一种或多种试剂的水平至少部分提高，增加，提高，或显著地提高，而第二种试剂同时表达，共表达，或协同表达，所述第二种试剂的同时表达，共表达，或协同表达导致另一种试剂的降低，优选至少部分降低，显著地降低或有效消除。
在另一个方面，在用本发明的核酸转化植物或其它生物体之后，一种或多种试剂的水平至少部分提高，增加，提高，或显著地提高，而第二种试剂与两种或多于两种试剂同时表达，共表达，或协同表达。
在另一个方面，在用本发明的核酸转化植物或其它生物体之后，一种或多种试剂的水平至少部分提高，增加，提高，或显著地提高，而第二种试剂与三种或多于三种试剂同时表达，共表达，或协同表达。
在另一个方面，在用本发明的核酸转化植物或其它生物体之后，一种或多种试剂的水平至少部分提高，增加，或显著地提高，而其它试剂与第一种试剂同时表达，共表达，或协同表达，所述其它试剂，优选两种或更多种，三种或更多种，四种或更多种，或五种或更多种试剂的同时表达，共表达或协同表达导致多于一种试剂，优选两种或更多种，三种或更多种，四种或更多种，或五种或更多种试剂的至少部分降低，显著地降低或有效消除。
在一个方面，在用本发明的核酸转化植物或其它生物体之后，一种或多种试剂至少部分提高，增加，提高，或显著地提高(substantiallyenhanced)，而另一种或多种试剂同时表达，共表达或协同表达，这种表达导致一种或多种试剂至少部分降低，显著地降低或有效消除。
当将试剂水平进行比较的时候，这种比较优选在具有相似基因背景的生物体之间进行。在一个优选的方面，相似的基因背景是其中所比较的生物体的核基因物质的共同部分有50％或更多的背景。在一个更优选的方面，相似的基因背景是其中所比较的生物体的核基因物质的共同部分有75％或更多，甚至更优选其核基因物质的共同部分有90％或更多的背景。在另一个更优选的方面，相似的基因背景是其中所比较的生物体是植物，并且除了原来用植物转化技术引入的任何基因物质之外所述植物是等基因的。
在一个优选的方面，通过比较mRNA转录物的水平实现核酸序列部分地提高，提高或显著地提高试剂的水平的能力。在一个优选的方面，通过比较由所述基因编码的蛋白质，其片段或多肽实现核酸序列部分地提高，提高或显著地提高基因相对于另一个基因的水平的能力。在一个优选的方面，通过比较mRNA转录物的水平实现核酸序列降低基因相对于另一个基因的水平的能力。在一个优选的方面，通过比较由所述基因编码的蛋白质，其片段或多肽的水平实现核酸序列的降低基因相对于另一个基因的水平的能力。如本文所用的，mRNA转录物包括处理的和未处理的mRNA转录物。如本文所用的蛋白质，其片段或多肽包括具有或没有翻译后修饰的蛋白质，其片段或多肽。在另一个优选的方面，通过表型的比较实现核酸序列提高基因相对于另一个基因的水平的能力。在一个优选的方面，所述表型的比较是α-生育酚含量的比较。在一个优选的方面，所述表型的比较是脂肪酸组成的比较。在一个优选的方面，所述表型的比较是总油水平的比较。
向植物或生物体引入核酸分子的方法
有许多方法可用于向植物细胞中引入核酸分子。据信合适的方法实际上包括可将核酸分子引入到细胞中的任何方法，例如农杆菌感染或核酸分子的直接递送例如，通过转染，注射，发射，PEG介导的转化，通过电穿孔或者通过DNA包覆颗粒的加速，等等。(Potrykus，Aun.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.42：205-225(1991)；Vasil，Plant Mol.Biol.25：925-937(1994))。例如，电穿孔已用于转化玉米原生质体(Fromm et al.，Nature 312：791-793(1986))。
核酸还可以通过包括但不限于接合，胞吞作用，和吞噬作用的方法被引入到生物体中。而且，所述核酸可以被引入到衍生自植物，植物细胞，藻，藻细胞，真菌，真菌细胞，细菌细胞，哺乳动物细胞，鱼细胞，或鸟细胞的细胞或生物体中。特另优选的微生物是大肠杆菌和农杆菌物种。
将DNA引入到细胞中的方法是所属领域技术人员公知的。四种将基因递送到细胞中的一般方法已有描述：(1)化学方法(Graham andvan der Eb，Virology 54：536-539(1973))；(2)物理方法例如显微注射(Capecchi，Cell 22：479-488(1980))，电穿孔(Wong and Neumann，Biochem.Biophys.Res.Commun.107：584-587(1982)；Fromm et al.，PNAS USA 82：5824-5828(1985)；美国专利5,384,253)；基因枪(Johnstonand Tang，Methods Cell Biol.43：353-365(1994))；和真空渗入(Bechtoldet al.，C.R.Acad.Sci.Paris，Life Sci.316：1194-1199.(1993))；(3)病毒载体(Clapp，Clin.Perinatol.20：155-168(1993)；Lu et al，J.Exp.Med.178：2089-2096(1993)；Eglitis and Anderson，Biotechniques6：608-614(1988))；和(4)受体介导的机制(Curiel et al.，Hum.Gen.Ther.3：147-154(1992)；Wagner et al.；PNAS USA 89：6099-6103(1992))。
可以使用的加速方法包括，例如微弹轰击等。向植物细胞中递送转化核酸分子的方法的一个实例是微弹轰击。该方法在综述Yang andChristou(eds.)，Particle Bombardment Technology for Gene Transfer，Oxford Press，Oxford，England(1994)中有描述。非生物颗粒(微弹)可以用核酸分子包覆，通过推动力递送到细胞中。示例性的颗粒包括那些含有钨，金，铂等的颗粒。
微弹轰击的特定优点，除了它是可再生地转化单子叶植物的有效方法之外，就是不需要分离原生质体(Cristou et al.，Plant Physiol.87：671-674(1988))也不需要对于农杆菌感染的易感性。通过加速向玉米细胞中递送DNA的方法的一个说明性的实施方案是生物弹α-颗粒递送系统，其可用于通过筛，例如不锈钢或Nytex筛，将包覆有DNA的颗粒推进到覆盖有悬浮培养的玉米细胞的过滤器表面。Gordon-Kamm et al.，描述了用DNA包覆钨颗粒的基本程序(Gordon-Kamm etal.，Plant Cell 2：603-618(1990))。所述筛使钨核酸颗粒分散使之不会以大的凝聚体递送到受体细胞中。适用于本发明的颗粒递送系统是氦加速PDS-1000/He枪，可从Bio-Rad Laboratories(Bio-Rad，Hercules，California)获得(Sanford et al.，Technique 3：3-16(1991))。
对于轰击，悬浮细胞可以在过滤器上浓缩。含有要被轰击的细胞的过滤器以合适的距离置于微弹挡板(microprojectile stopping plate)下。如果需要的话，还可以在所述枪和要被轰击的细胞之间放置一个或数个筛。
或者，未成熟的胚胎或其它靶细胞可以置于固体培养基上。要被轰击的细胞以合适的距离置于微弹挡板下。如果需要的话，还可以在加速装置和要被轰击的细胞之间放置一个或数个筛。通过使用本文所述的技术，可以获得1000个或更多个瞬时表达标记基因的细胞点。在轰击后48小时在一个点上表达外源基因产物的细胞数目通常为一到十，平均为一到三。
在轰击转化中，可以最优化轰击前的培养条件和轰击参数以产生最大数量的稳定转化体。在此技术中轰击的物理和生物参数都是重要的。物理因素是那些涉及操纵DNA/微弹沉淀物的因素或那些影响大的或微弹的飞行或速度的因素。生物因素包括轰击之前和刚轰击之后细胞的操作中涉及的所有步骤，有助于减轻轰击伴随着的损伤的靶细胞的渗透调节以及转化DNA的性质，例如线状DNA或完整超螺旋质粒。认为轰击前的操作对于未成熟胚胎的成功转化是特别重要的。
相应地，预期可能希望在小规模研究中调整轰击参数的各个方面以完全最优化所述条件。可能特别希望调整物理参数例如间隙距离，飞行距离，组织跨距和氦压力。还可以通过改变影响受体细胞的生理状态从而可能影响转化和整合效率的条件使损伤减少因素最小化。例如，渗透状态，组织水合和受体细胞的传代培养阶段或细胞周期可以被调整以达到最佳转化。其它常规调整的实施是所属领域技术人员参考本发明公开的内容可知的。
农杆菌介导的转移是用于将基因引入到植物细胞中的广泛应用的系统，这是因为所述DNA可以被引入到整个植物组织中，从而不需要从原生质体再生完整植物。使用农杆菌介导的植物整合载体将DNA引入到植物细胞中是本领域公知的。参见，例如Fraley et al.，Bio/Technology 3：629-635(1985)和Rogers et al.，Methods Enzymol.153：253-277(1987)中所述的。而且，Ti-DNA的整合是一种相对精确的过程，几乎不导致重排。要转移的DNA的区域是由边界序列确定的，插入DNA通常插入到植物基因组中，如文献所述(Spielmann et al.，Mol.Gen.Genet.205：34(1986))。
现代的农杆菌转化载体能够在大肠杆菌中和农杆菌中复制，使得可以方便地操作，如Klee et al.，in Plant DNA Infectious Agents，Hohnand Schell(eds.)，Springer-Verlag，New York，pp.179-203(1985)中所述。而且，农杆菌介导的基因转移载体上的技术进展改进了载体上基因和限制性位点的排布，以便于构建能够表达各种多肽编码基因的载体。所描述的载体具有方便的多连接物区域，其侧翼是启动子和多聚腺苷酸化位点，以直接表达插入的多肽编码基因，并适用于本发明的目的(Rogers et al.，Methods Enzymol.153：253-277(1987))。此外，含有不卸甲(armed)或卸甲(disarmed)Ti基因的农杆菌可用于转化。在那些农杆菌介导的转化是有效的植株中，其就是应选择的方法，因为基因转移是容易的和确定的。
用农杆菌转化方法形成的转基因植物典型地在一个染色体上含有单个基因。这种转基因植物可称为对加入的基因是杂合的。更优选的是对于加入的结构基因是纯合的转基因植物；即，含有两个加入的基因的转基因植物，在染色体对的每个染色体上的相同座位处有一个基因。纯合的转基因植物的获得可以通过如下获得：使独立的分离种，含有单独一个加入的基因的转基因植物，进行有性杂交(自交)，使产生的某些种子发芽，分析得到的产生的植物是否有感兴趣的基因。
还应当理解两种不同的转基因植物也可以杂交以产生含有两个独立分离的，外源的构建体的后代。合适后代的自交可以产生对于两个编码感兴趣多肽的加入的外源基因是纯合的植物。也可以与亲本植株回交和与非转基因植物异型杂交，以及无性繁殖。
植物原生质体的转化可以通过基于磷酸钙沉淀，聚乙二醇处理，电穿孔以及这些处理的组合的方法获得(参见，例如Potrykus et al.，Mol.Gen.Genet.205：193-200(1986)；Lorz et al.，Mol.Gen.Genet.199：178(1985)；Fromm et al.，Nature 319：791(1986)；Uchimiya etal.，Mol.Gen.Genet.204：204(1986)；Marcotte et al.，Nature335：454-457(1988))。将这些系统应用于不同的植株依赖于从原生质体再生该特定植物株的能力。从原生质体再生谷类的说明性方法如文献所述(Fujimura et al.，Plant Tissue Culture Letters 2：74(1985)；Toriyama et al.，Theor.Appl.Genet.205：34(1986)；Yamada et al.，Plant Cell Rep.4：85(1986)；Abdullah et al.，Biotechnology 4：1087(1986))。
要转化不能成功从原生质体再生的植株，可以使用将DNA引入到完整细胞或组织中的其它方法。例如，从未成熟的胚胎或外植体再生谷类可能是有效的，如文献所述(Vasil，Bio/Technology 6：397(1988))。此外，可以使用“颗粒枪”或高速微弹技术(Vasil et al.，Bio/Technology10：667(1992))。使用后一种技术，DNA携带在小的金属颗粒表面上，通过细胞壁，进入到细胞质中，如文献所述(Klein et al.，Nature328：70(1987)；Klein et al.，PNAS USA 85：8502-8505(1988)；McCabeet al.，Bio/Technology 6：923(1988))。金属颗粒穿透数层细胞，因而允许在组织外植体内进行细胞的转化。
转化双子叶植物，主要是通过使用根癌农杆菌，和获得转基因植物的方法已经公开，用于棉花(美国专利5,004,863；美国专利5,159,135；美国专利5,518,908)；大豆(美国专利5,569,834；美国专利5,416,011；McCabe et al.，Biotechnology 6：923(1988)；Christou etal.，Plant Physio.87：671-674(1988))；芸苔(Brassica)(美国专利5,463,174)；花生(Cheng et al.，Plant Cell Rep.15：653-657(1996)，McKently et al.，Plant Cell Rep.14：699-703(1995))；木瓜；豌豆(Grantet al.，Plant Cell Rep.15：254-258(1995))；和拟南芥(Arabidopsisthaliana)(Bechtold et al.，C.R.Acad.Sci.Paris，Life Sci.316：1194-1199(1993))。转化拟南芥的近来的方法通常称为“浸渍”或真空渗入或种质转化。
用电穿孔，颗粒轰击和农杆菌转化单子叶植物也已被报道。转化和植物再生已在芦笋(Bytebier et al.，PNAS USA 84：5354(1987))；大麦(Wan and Lemaux，Plant Physio 104：37(1994))；玉米(Rhodeset al.，Science 240：204(1988)；Gordon-Kamm et al.，Plant Cell 2：603-618(1990)；Fromm et al.，Biol/Technology 8：833(1990)；Koziel et al.，Bio/Technology 11：194(1993)；Armstrong et al.，Crop Science35：550-557(1995))；燕麦(Somers et al.，Biol/Technology 10：1589(1992))；鸭茅(Horn et al.，Plant Cell Rep.7：469(1988))；稻(Toriyama et al.，Theor Appl.Genet.205：34(1986)；Part et al.，PlantMol.Biol.32：1135-1148(1996)；Abedinia et al.，Aust.J.Plant Physiol.24：133-141(1997)；Zhang and Wu，Theor.Appl.Genet.76：835(1988)；Zhang et al.，Plant Cell Rep.7：379(1988)；Battraw and Hall，PlantSci.86：191-202(1992)；Christou et al.，Bio/Technology 9：957(1991))；黑麦(De la Pena et al.，Nature 325：274(1987))；甘蔗(Bower andBirch，Plant J 2：409(1992))；牛尾覃(Wang et al.，Bio/Technology10：691(1992))和小麦(Vasil et al.，Bio/Technology 10：667(1992)；美国专利5,631,152)中实现。
已经开发出基于克隆的核酸构建体的瞬时表达的基因表达的检测，通过聚乙二醇(PEG)处理，电穿孔，或颗粒轰击将所述核酸分子引入到植物细胞中(Marcotte et al.，Nature 335：454-457(1988)；Marcotte et al.，Plant Cell 1：523-532(1989)；McCarty et al.，Cell66：895-905(1991)；Hattori et al.，Genes Dev.6：609-618(1992)；Goff et al.，EMBO J.9：2517-2522(1990))。瞬时表达系统可以用于对基因构建体进行功能性分析(参见，通常，Maliga et al.，Methods inPlant Molecular Biology，Cold Spring Harbor Press(1995))。
本发明的任何核酸分子都可以以永久或瞬时方式引入到植物细胞中。本发明的核酸分子可以被稳定地整合到核，叶绿体或线粒体基因组中，优选整合到核基因组中。
细胞或生物体转化的其它方法也可以使用，包括但不限于通过直接将DNA转移到花粉中(Hess et al.，Intern ReV.Cytol.107：367(1987)；Luo et al.，Plant Mol Biol.Reporter 6：165(1988))，通过将DNA直接注射到植物的生殖器官中(Pena et al.，Nature 325：274(1987))，通过将DNA直接显微注射到原生质体中(Crossway et al.，Mol.Gen.Genet.202：179-185(1986))，或者通过在干燥胚胎再水化之后将DNA直接注射到未成熟胚胎的细胞中(Neuhaus et al.，Theor.Appl.Genet.75：30(1987))将DNA引入到植物中。还可以参见EP 0238 023；Yelton et al.，PNAS USA，81：1470-1474(1984)；Malardier et al.，Gene，78：147-156(1989)；Becker and Guarente，In：Abelson and Simon(eds.)，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology，Method Enzymol.，Vol.194，pp.182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito et al.，J.Bacteriol.，153：163(1983)；Hinnen etal.，PNAS USA，75：1920(1978)；和Bennett and LaSure(eds.)，More Gene Manipualtionins in fungi，Academic Press，CA(1991)。
从单个植物原生质体转化体或不同的转化外植体再生，发育和培养植物的方法是本领域公知的(Weissbach and Weissbach，In Methodsfor Plant Molecular Biology，Academic Press，San Diego，CA，(1988))。这种再生和生长过程典型地包括下列步骤：转化细胞的选择和培养那些个体化的细胞经过通常的胚胎发育阶段和经过生根小树苗阶段。转基因胚胎和种子类似地再生。得到的转基因的生根的嫩芽然后种植在合适的植物生长介质例如土壤中。
含有编码感兴趣蛋白的外来的外源基因的植物的发育或再生是本领域公知的。优选地，再生的植物自花传粉产生纯合的转基因植物。另外，得自再生植物的花粉与农艺上重要种系的种子生长植物杂交。相反，这些重要种系植物的花粉用于给再生植物授粉。含有所希望多肽的本发明的转基因植物用所属领域技术人员公知的方法培养。
有多种方法可用于从植物组织再生植物。再生的特定方法取决于起始的植物组织和要再生的特定植物物种。
本发明还提供了植物部分，特别是生殖或储藏部分的产生。植物部分，不限于，包括种子，胚乳，胚珠，花粉，根，块茎，茎，叶，杆，果实，浆果，坚果，树皮，英，和花。在本发明的一个特别优选的实施方案中，所述植物部分是种子。
本发明的任何植物或其部分都可以经过处理生产出饲料，膳食，蛋白质，或油制备物。为此目的特别优选的植物部分是种子。在优选的实施方案中，所述饲料，膳食，蛋白质或油制备物设计用于家畜动物或人，或二者。生产饲料，膳食，蛋白质或油制备物的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利4,957,748，5,100,679，5,219,596，5,936,069，6,005,076，6,146,669，和6,156,227。在优选的实施方案中，所述蛋白制备物是高蛋白制备物。这种高蛋白制备物优选蛋白含量高于5％w/v，更优选10％w/v，甚至更优选15％w/v。在优选的油制备物中，所述油制备物是高油制备物，来自于本发明的植物或其部分的油含量为高于5％w/v，更优选10％w/v，甚至更优选15％w/v。在优选的实施方案中，所述油制备物是液体。在优选的实施方案中，所述油制备物的体积大于1，5，10或50升。本发明提供了由本发明的植物生产的或由本发明的方法产生的油。这种油可具有提高的氧化稳定性。而且，这种油可以是任何所得产品的次要或主要组分。而且这种油可以和其它油混合。在优选的实施方案中，所述由本发明的植物生产的或由本发明的方法产生的油构成任何组合物的油成分的体积或重量的高于0.5％，1％，5％，10％，25％，50％，75％或90％。在另一个实施方案中，所述油制备物可以混合，可组成混合物体积的高于10％，25％，35％，50％或75％。由本发明的植物生产的油可以与一种或多种有机溶剂或石油馏出物混合。
本发明的植物可以是育种程序的部分或自育种程序产生。育种方法的选择取决于植物繁殖的模式，所改进的性状的遗传性，和商业上使用的栽培品种的类型(例如F1杂交栽培品种，纯系栽培品种等)。所选择的用于培育本发明的植物的非限制性方法如下所述。育种程序可以通过对任何杂交后代进行标记辅助选择来增强。而且应当理解任何商业的和非商业的栽培品种可用于育种程序。因素例如突出体活力(emergence vigor)，营养体活力，胁迫耐受，疾病抗性，分枝，开花，结种率，种子粒度，种子密度，standability，和threshability通常决定了其选择。
对于高度遗传的性状，选择在单个位置上评价为优良的个体植物是有效的，然而对于具有低遗传性的性状，选择应基于从相关植物家族的重复评估获得的平均值。通用的选择方法通常包括谱系选择，修饰的谱系选择，混合选择，和轮回选择。在优选的实施方案中，采用回交或轮回育种程序。
遗传的复杂性影响育种方法的选择。回交育种可以用于将一个或几个有利的具有高遗传性性状的基因转移到所希望的栽培品种中。这种方法已广泛用于培育有疾病抗性的品种。各种轮回选择方法被用于提高由多个基因控制的数量遗传性状。在自花传粉的农作物中轮回选择的使用取决于授粉的容易程度，每次授粉成功杂交的频率，和每次成功杂交的杂交后代的数目。
繁殖种系可以在代表商业靶区域的环境下进行检测并与适当的标准进行比较，进行两代或更多代。最佳的种系是新的商业栽培品种的候选者；那些在性状上仍然有缺陷的种系可以用作亲本产生新的种群以进行进一步的选择。
鉴别优良植物的一种方法是观察它相对于其它实验植物和相对于广泛培养的标准栽培品种的表现。如果单次观察不能确定，重复观察能为其基因价值提供更好的评估。育种者能够选择和杂交两种或更多种亲本种系，然后重复自交和选择，产生多个新的基因组合。
新的栽培品种的开发需要开发和选择品种，使这些品种杂交和选择优良杂交品种。杂交种子可以通过在选择的雄性可育的亲本之间进行人工杂交，或者通过使用雄性不育系统产生。杂交体根据特定的单一基因性状例如英颜色，花颜色，种子产量，柔毛颜色，或除草剂抗性被选择，其表明所述种子真正是杂交体。亲本种系的其它数据，以及杂交体的表型，影响育种者决定是否用特定的杂交品种继续。
谱系育种和轮回选择育种方法可用于从繁殖种群开发栽培品种。育种程序组合了来自于两种或更多种栽培品种或者不同的广泛来源的所希望的性状，形成育种库，可以据此通过自交和选择所需表型开发栽培品种。新的栽培品种可以被评估以确定哪个具有商业潜力。
谱系育种通常用于改进自花传粉农作物。两个具有有利的互补性状的亲本进行杂交产生F1。通过一个或几个F1自交产生F2种群。从最好的家族中选择最好的个体。对家族(family)的重复检测可以在F4代中开始以提高具有低遗传性的性状的选择效率。在近亲繁殖的晚期(即F6和F7)，对最好的种系或表型上类似的种系的混合物进行检测确定其是否能成为新的栽培品种。
回交育种已用于将简单遗传的，高度遗传性的性状的基因转移到所希望的纯合栽培品种或近交系中，其是轮回亲本。这种欲转移性状的来源称为供体亲本。预期得到的植物具有轮回亲本(例如栽培品种)的性质和转移自供体亲本的所希望的性状。在初次杂交之后，选择具有所述供体亲本的所述表型的个体，与轮回亲本重复杂交(回交)。得到的亲本预期具有轮回亲本(例如栽培品种)的性质和转移自供体亲本的所希望的性状。
在严格意义上来说单粒传法程序(single-seed descent procedure)指种植分离的群体，每颗植物收获一个种子的样本，用该单粒种子样本种植下一代。当所述群体从F2发展到近亲繁殖的希望水平的时候，衍生出所述种系的植物每个都追溯到不同的F2个体。群体中植物的数目每一代都有所下降，这是因为有些种子没有发芽或有些植物没有产生至少一个种子。结果是，于代的培育结束的时候，不是所有最初从所述群体中采样的F2植物都有后代代表。
在多粒种子程序中，育种者通常从群体的每个植物上收集一个或多个英，一起脱粒使之形成一堆。将所述堆的部分用于种植下一代，部分储存起来。所述程序被称为修饰的单粒传法或英堆技术(pod-bulktechnique)。
多粒程序用于在收获的时候节约劳动力。用机器对英进行脱粒比单粒程序中手工从每个英中除下一粒种子要显著地更快。多粒程序还使得可能对近亲繁殖的每一代的种群都种植相同数目的种子。
通常用于不同性状和农作物的其它育种方法的描述可以在几本参考书中找到(例如，Fehr，Principles of Cultivar Development Vol.1，pp.2-3(1987))。
本发明的转基因植物还可以用单性生殖(apomixis)进行繁殖。单性生殖是一种植物中繁殖的基因控制方法，其中无需雌性配子和精子的结合就可形成胚胎。有三种基本类型的单性生殖性繁殖：1)无孢子生殖，其中由来自于核的胚囊中染色体未减少的雌性配子发育成胚胎，2)倍数孢子形成，其中由来自于大孢子母细胞的胚囊中未减少的雌性配子发育成胚胎，3)偶发性胚胎生殖，其中胚胎直接由体细胞发育而来。在单性生殖的大部分形式中，极核假受精或受精产生胚乳对于种子成活力是必需的。在无孢子生殖中，nurse cultivar可用作花粉来源以在种子中形成胚乳。由于栽培品种的未减少的雌性配子(unreduced egg)进行孤雌生殖发育，nurse cultivar不影响无孢子生殖的单性生殖栽培品种的遗传，但能够产生胚乳。单性生殖在在经济上是很重要的，特别是在转基因植物中，因为它使任何表型，不管是否杂合的，都产生纯种植物。因此，通过单性生殖繁殖，杂合的转基因植物在重复的生命循环中可以维持其基因保真度(genetic fidelity)。单性生殖植物产生的方法是本领域已知的，参见，例如美国专利5,811,636。
下述实施例是举例说明而并非以任何方式进行限制。
实施例1
本实施例举例说明了所制备的以证明本发明的实施的构建体。
参照图1，其以示意图方式显示了DNA构建体的元件，按顺序包括
(a)napin启动子的DNA，
(b)编码从陆地棉(棉花)中分离的γ-甲基转移酶(GMT)的DNA，
(c)拟南芥fad2的3’UTR的有义方向的DNA，
(d)除去了剪接位点的拟南芥fad2中的内含子的DNA，
(e)(c)元件的互补序列，即拟南芥fad2的3’UTR的反义方向的DNA，以及
(f)napin 3’终止子的DNA。
所述构建体与BAR标记元件一起插入到载体的根癌农杆菌的TI边界之间。参照SEQ ID NO：5，称为pMON75565的载体的相关DNA元件如表1所示。
               表1
       载体pMON75565的元件
  碱基  DNA区段描述
  1-285  根癌农杆菌右边界
  520-2282  napin启动子
  2344-3381  陆地棉gnt
  3425-3470  napin 3’转录终止子
  3545-3678  有义方向的fad2 3’UTR
  3687-4818  fad2内含子
  4823-4947  反义方向的fad2 3’UTR
  4985-6199  napin 3’转录终止子
  6381-6780  CaMV 35S启动子
  6781-7328  BAR标记基因
  7333-7590  NOS转录终止子
  7597-8179  根癌农杆菌左边界
参照图2，其以示意图方式显示了DNA构建体的元件，按顺序包括
(a)napin启动子的DNA，
(b)编码从陆地棉(棉花)中分离的γ-甲基转移酶(GMT)的DNA，
(c)除去了剪接位点的拟南芥fad2中的内含子的DNA，以及
(d)napin 3’终止子的DNA。
所述构建体与BAR标记元件一起插入到载体的根癌农杆菌的TI边界之间。参照SEQ ID NO：6，称为pMON75571的载体的相关DNA元件如表2所示。
             表2
     载体pMON75571的元件
  碱基   DNA区段描述
  1-285   根癌农杆菌右边界
  520-2282   napin启动子
  2344-3381   陆地棉gmt
  3396-4515   fad2内含子
  4519-5733   napin 3’转录终止子
  5915-6314   CaMV 35S启动子
  6315-6862   BAR标记基因
  6867-7124   NOS转录终止子
  7131-7713   根癌农杆菌左边界
用pMON75565和pMON75571转化植物
载体，pMON75565和pMON75571，用于拟南芥植物转化，以指导GMT的表达和抑制fad2基因的表达。二元载体构建体pMON75565和pMON75571通过Holsters et al.，Mol.Gen.Genet.163：181-187(1978)的方法转化到ABI株的农杆菌细胞中。转基因拟南芥植物通过Valverkens et al.，PNAS USA 85：5536-5540(1988)，Bent et al.，Science 265：1856-1860(1994)，和Bechtold et al.，C.R.Acad.Sci.，Life Sciences 316：1194-1199(1993)所述的农杆菌介导的转化获得。通过将转化的R1种子直接洒入土壤中，然后在4℃在缺乏光照的条件下春化处理4天对转基因植物进行选择。然后将种子转移到21℃，16小时光照的条件下，在播种后7天和14天喷洒1∶200稀释的Finale(Basta)除草剂。转化的植物生长至成熟，产生的R2种子分析其生育酚含量。
图3A和3B显示了表达来自于pMON75565(图3A)或pMON75571(图3B)的在napin种子特异性启动子控制之下的GMT的转基因拟南芥植物的R2种子的α-生育酚水平分析的数据。下述表3给出了各种转化的和对照的植物种系的特定生育酚的水平的结果(α，γ和δ)。
                                        表3
  构建体   α-生育酚  γ-生育酚  δ-生育酚   总生育酚   ％α   代数
  对照   7  453  12   472   1.5   R3
  9  446  12   467   1.9   R3
  5  440  10   455   1.1   R3
  7  460  12   479   1.5   R3
  9  460  13   482   1.9   R3
  6  443  10   459   1.3   R3
  6  459  11   476   1.3   R3
  8  456  10   474   1.7   R3
  6  447  11   464   1.3   R3
  7  436  9   452   1.5   R3
  pMON75565   67  386  11   464   14.4   R2
  320  152  5   477   67.1   R2
  304  142  6   452   67.3   R2
  309  142  5   456   67.8   R2
  292  134  4   430   67.9   R2
  320  143  5   468   68.4   R2
  360  145  5   510   70.6   R2
  317  121  4   442   71.7   R2
  329  124  4   457   72.0   R2
  336  79  3   418   80.4   R2
  369  78  3   450   82.0   R2
  392  68  4   464   84.5   R2
  391  66  4   461   84.8   R2
  422  51  2   475   88.8   R2
  pMON75571   10  492  13   515   1.9   R2
  137  350  8   495   27.7   R2
  296  166  5   467   63.4   R2
  313  136  5   454   68.9   R2
  364  124  4   492   74.0   R2
  354  119  3   476   74.4   R2
  371  91  2   464   80.0   R2
  381  87  2   470   81.1   R2
  391  52  2   445   87.9   R2
  422  55  3   480   87.9   R2
  436  54  2   492   88.6   R2
  410  45  2   457   89.7   R2
  449  45  1   495   90.7   R2
  439  31  1   471   93.2   R2
  475  22  1   498   95.4   R2
图3A和3B和表3显示了与未转化的植物种系相比，所述构建体增加了转化的植物种系中的α-生育酚的水平。
用气相色谱分析用构建体pMON75565和pMON75571转化的拟南芥(Arabidopsis)种系的种子的脂肪酸组成。表4提供了用这些构建体获得的脂肪酸水平一览。如其所示，pMON75565构建体的表达导致油酸(18:1)表达的增加，亚油酸(18:2)和亚麻酸(18:3)表达的轻微减少，硬脂酸(18:0)水平实质上没有变化。12:0，14:0，16:0，16:1，20:0，20:1，20:2，22:0，22:1和22:2脂肪酸水平没有显著变化。pMON75565和pMON75571的结果不同。而且，用RNAi抑制比有义抑制具有更高的成功百分率。
表5提供了用所述构建体获得的油水平一览。如其所示，当采用pMON75565和pMON75571构建体时，与对照构建体相比，蛋白质，碳，氮和硫的总水平实质上保持相同。
图4描述了用pMON75565和pMON75571构建体获得的脂肪酸和油水平的图示。种系AT_G490和AT_G499(均是用pMON75565获得的)具有最高的油酸，并且表现出α-生育酚表型，并且二者都用于下一代进行生育酚和油酸和油分析。双链FAD2 RNA序列的表达导致脂肪酸和油组成的改变。
为了确定pMON75565构建体的表型，表达pMON75565构建体的R2植物进行自交得到R3植物。表6证实R3植物的双链FAD2 RNA序列的表达导致脂肪酸和油组成的改变。特别地，与对照构建体相比，油酸的水平增加了，亚油酸和亚麻酸的水平轻微减少。这个结果与FAD2表达的下调一致。
表7和图5证实R3植物表达GMT RNA序列，这导致α-生育酚水平增加，而生育酚总水平基本保持相同。
这些数据显示出本发明的构建体上调棉花GMT蛋白并且下调FAD2的表达。GMT表达的增加导致α-生育酚水平的增加。(GMT将γ-生育酚转化为α-生育酚)。油酸水平增加和亚油酸水平减少与下调作用一致。
                                   表4
  构建体   株系ID   18:0   18:1   18:2   18:3
  对照   9979-54-49   2.98   14.09   28.71   18.88
  9979-54-50   2.89   14.28   29.51   18.41
  9979-54-51   2.8   14.46   29.28   18.43
  9979-54-52   2.75   15.5   29.53   17.57
  9979-54-53   2.78   15.61   29.39   17.63
  pMON75565   AT_G485   3.04   22.4   20.82   18.38
  AT_G486   2.9   18.09   25.88   18.25
  AT_G487   2.95   16.39   26.28   19.71
  AT_G488   2.97   22.53   20.95   18.16
  AT_G489   2.8   28.87   18.17   15.53
  AT_G490   3   32.34   15.18   15.05
  AT_G492   2.8   18.26   26.68   17.51
  AT_G493   2.86   24.25   21.16   16.85
  AT_G494   3.02   23.36   20.44   18.12
  AT_G495   2.9   23.9   21.43   16.88
  AT_G496   3.02   21.53   22.08   18.59
  AT_G497   2.79   27.9   17.46   16.58
  TT_G498   2.88   1935   24.42   18.22
  AT_G499   3.04   30.19   17.08   15.55
  对照   9979-54-59   2.84   14.86   29.6   17.91
  9979-54-60   2.83   14.96   29.41   18.14
  9979-54-61   3.02   14.97   29.05   18.62
  9979-54-62   2.71   14.78   29.6   18.18
  9979-54-63   2.95   15.29   30.13   17.43
  pMON75571   AT_G500   2.84   15.38   28.74   18.39
  AT_G501   2.75   16.73   29.31   16.88
  AT_G502   2.85   15.86   27.86   18.79
  AT_G503   2.8   17.18   29.52   16.38
  AT_G504   2.9   15.29   29.01   18.38
  AT_G505   2.93   16.25   28.94   17.59
  AT_G506   2.86   16.3   29.18   17.23
  AT_G507   2.89   16.31   27.88   18.27
  AT_G508   2.98   16.44   29.93   16.73
  AT_G509   2.89   15.77   28.8   17.9
  AT_G510   2.84   16.91   29.78   16.44
  AT_G511   2.79   15.32   27.82   19.05
  AT_G512   2.77   17.88   29.68   15.62
  AT_G513   2.86   16.7   29.52   16.78
  AT_G514   2.86   15.84   28.66   18.19
                                                              表5
  构建体   事件   代数   油％   蛋白质％   ％C   ％N   ％S   COLOR
  --------------------   -----   -----   -----   -----   -----   -----   -----
  对照   9979-AT00002-54-49   R3   36.4   22.3   53.4   3.7   0.75   0.981
  9979-AT00002-54-50   R3   35.4   22.7   52.8   3.8   0.86   0.985
  9979-AT00002-54-51   R3   35.1   23.5   53   3.9   0.88   0.974
  9979-AT00002-54-52   R3   37.3   21.5   53.6   3.6   0.85   0.978
  9979-AT00002-54-53   R3   35.4   23.5   53   3.9   1.03   0.968
  pMON75565   AT_G485   R2   32   25.2   51.8   4.2   0.89   0.982
  AT_G486   R2   36.9   22.6   53.8   3.8   0.79   0.981
  AT_G487   R2   35.7   23.1   53.1   3.8   0.86   0.98
  AT_G488   R2   36.9   22.5   53.9   3.8   0.74   0.979
  AT_G489   R2   37.1   22.2   53.9   3.7   0.91   0.984
  AT_G490   R2   37.2   22   54   3.7   0.86   0.981
  AT_G492   R2   36.8   21.7   53.4   3.6   0.89   0.986
  AT_G493   R2   37.2   22.8   53.9   3.8   0.97   0.976
  AT_G494   R2   36.8   22.3   53.7   3.7   0.8   0.975
  AT_G495   R2   36.3   21.7   53.5   3.6   0.9   0.999
  AT_G496   R2   36.5   23   53.6   3.8   0.8   0.984
  AT_G497   R2   35.5   23.5   53.2   3.9   0.95   0.983
  AT_G498   R2   37.1   22.9   53.8   3.8   0.91   0.988
  AT_G499   R2   36.5   22.4   53.6   3.7   0.83   0.985
  对照   9979-AT00002-54-59   R3   36.5   22.5   53.7   3.8   0.96   0.977
  9979-AT00002-54-60   R3   36.3   22.4   53.6   3.7   0.96   0.978
  9979-AT00002-54-61   R3   35.9   23   53.5   3.8   0.94   0.976
  9979-AT00002-54-62   R3   36.3   22.9   53.6   3.8   1   0.977
  9979-AT00002-54-63   R3   36   22.9   53.6   3.8   0.95   0.975
  pMON75571   AT_G500   R2   37.1   22.5   53.9   3.7   0.94   0.976
  AT_G501   R2   36.2   22.9   53.5   3.8   1.14   0.971
  AT_G502   R2   36.3   23.4   53.7   3.9   1.01   0.976
  AT_G503   R2   36.2   22.2   53.6   3.7   1   0.98
  AT_G504   R2   37.1   22.1   53.9   3.7   0.96   0.974
  AT_G505   R2   37.4   21.7   54   3.6   0.88   0.983
  AT_G506   R2   38   21.3   54.3   3.6   0.95   0.976
  AT_G507   R2   36.5   23.1   53.7   3.8   1.01   0.974
  AT_G508   R2   36.9   22.2   53.8   3.7   0.97   0.981
  AT_G509   R2   36.7   22.3   53.7   3.7   0.99   0.978
  AT_G510   R2   36.9   22.2   53.9   3.7   0.98   0.978
  AT_G511   R2   34.8   23.8   53   4   1   0.982
  AT_G512   R2   35   23.7   53.2   3.9   1.15   0.973
  AT_G513   R2   36.1   22.6   53.4   3.8   0.99   0.982
  AT_G514   R2   37.3   22.3   54   3.7   0.96   0.976
                                   表6
  构建体   株系ID   18:0   18:1   18:2   18:3
  pMON75565   AT_G490-2   2.95   21.4   23.91   17.38
  AT_G490-4   2.99   22.46   22.47   17
  AT_G490-3   2.83   22.78   22.64   17.13
  AT_G490-8   2.88   22.82   22.81   16.59
  AT_G490-5   3   23.33   22.51   16.51
  AT_G490-6   2.93   26.1   20.29   16.02
  AT_G490-7   3.07   27   19.72   15.89
  AT_G490-9   2.99   28.59   18.55   15.59
  AT_G490-1   2.94   29.9   18.12   14.83
  AT_G490-10   2.99   31.8   15.49   14.59
  AT_G499-9   3.25   26.35   20.47   16.09
AT_G499-1   3.12   27.19   17.99   16.59
  AT_G499-6   3.13   28.49   20.52   14.81
  AT_G499-2   3.05   28.86   19.75   14.73
  AT_G499-3   3.11   30.21   18.27   14.88
  AT_G499-5   3.11   30.76   19.83   13.71
  AT_G499-10   3.09   32.56   15.77   14.33
  AT_G499-8   2.91   32.88   16.02   14.46
  AT_G499-4   2.86   33.16   16.08   14.17
  AT_G499-7   3.67   34.04   14.53   11.07
  对照   997-40-92   2.74   15.3   29.07   17.16
  9979-40-94   2.64   15.9   29.02   17.16
  9979-40-95   2.81   15.92   29.03   17.35
  9979-40-88   2.85   16.17   28.87   17.14
  9979-40-97   2.79   16.42   28.9   16.58
  9979-40-90   2.56   16.5   29.15   16.45
  9979-40-93   2.72   16.65   29.22   16.31
  9979-40-91   2.67   16.84   29.61   16.33
  9979-40-96   2.78   16.88   29.07   16.44
  9979-40-89   2.71   16.92   28.88   16.51
  9979-40-100   2.67   14.86   28.84   17.59
  9979-40-105   2.81   15.08   28.3   18
  9979-40-99   2.78   15.4   28.78   17.71
  9979-40-101   2.73   15.6   28.74   17.44
  9979-40-103   2.85   15.67   29.09   17.34
  9979-40-106   2.69   15.83   28.96   17.31
  9979-40-102   2.87   15.94   28.45   17.25
  9979-40-107   2.79   16.75   29.16   16.4
  9979-40-104   2.82   16.78   28.41   17.03
  9979-40-98   2.89   16.89   27.99   16.94
                                         表7
  构建体   株系ID   α-生育酚   γ-生育酚   δ-生育酚   总生育酚   α生育酚％   代数
  对照   9979-40-100   5   495   16   516   1   R3
  9979-40-94   5   469   15   489   1   R3
  997-40-93   6   468   14   488   1   R3
  9979-40-101   6   461   14   481   1   R3
  9979-40-95   6   455   14   475   1   R3
  9979-40-91   7   491   17   515   1   R3
  9979-40-90   7   491   16   514   1   R3
  9979-40-96   7   490   15   512   1   R3
  9979-40-99   7   473   16   496   1   R3
  9979-40-106   7   471   15   493   1   R3
  9979-40-107   7   469   14   490   1   R3
  9979-40-103   7   458   14   479   1   R3
  9979-40-92   7   447   15   469   1   R3
  9979-40-89   8   498   18   524   2   R3
  9979-40-88   8   496   16   520   2   R3
  9979-40-102   8   485   15   508   2   R3
  9979-40-97   8   474   16   498   2   R3
  9979-40-98   9   462   14   485   2   R3
  9979-40-104   9   460   15   484   2   R3
  9979-40-105   9   453   15   477   2   R3
  pMON75565   AT_G499-9.   286   161   7   454   63   R3
  AT_G490-8.   268   143   8   419   64   R3
  AT_G499-5.   274   147   7   428   64   R3
  AT_G490-4.   291   153   7   451   65   R3
  AT_G490-2.   282   143   7   432   65   R3
  AT_G499-2.   286   145   7   438   65   R3
  AT_G499-6.   301   152   7   460   65   R3
  AT_G490-5.   274   123   8   405   68   R3
  AT_G490-3.   285   128   8   421   68   R3
  AT_G490-9.   312   116   7   435   72   R3
  AT_G490-7.   330   85   6   421   78   R3
AT_G490-10. 330   80   6   416   79   R3
  AT_G499-3.   352   84   6   442   80   R3
  AT_G499-1.   344   71   5   420   82   R3
  AT_G490-1.   368   71   6   445   83   R3
  AT_G499-10.   380   56   5   441   86   R3
  AT_G499-4.   368   55   4   427   86   R3
  AT_G499-7.   441   56   4   501   88   R3
  AT_G499-8.   423   48   4   475   89   R3
  AT_G490-6.   367   34   4   405   91   R3
                          序列表
<110>Van Eenennaam，Alison
     Shewmaker，Christine K.
<120>用转基因构建体进行多于一个基因的基因表达的协同减少和增加
<130>16517.330
<140>To Be Assigned
<141>2004-09-24
<150>US 10/668,240
<151>2003-09-24
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1038
<212>DNA
<213>陆地棉
<400>1
atggctgccg cgttacaatt acaaacacac ccttgcttcc atggcacgtg ccaactctca     60
cctccgccac gaccttccgt ttccttccct tcttcctccc gctcgtttcc atctagcaga    120
cgttccctgt ccgcgcatgt gaaggcggcg gcgtcgtctt tgtccaccac caccttgcag    180
gaagggatag cggagtttta cgatgagtcg tcggggattt gggaagacat atggggtgac    240
catatgcacc atggatatta cgagccgggt tccgatattt cgggttcaga tcatcgtgcc    300
gctcagattc gaatggtcga agaatcgctc cgttttgctg gaatatcaga ggacccagca    360
aacaggccca agagaatagt tgatgttggg tgtgggatag gaggcagttc taggtatcta    420
gcaaggaaat atggggcaaa atgccaaggc attactttga gccctgttca agctggaaga    480
gccaatgctc ttgctaatgc tcaaggacta gcagaacagg tttgttttga agttgcagat    540
gccttgaacc aaccattccc tgatgaccaa tttgatcttg tttggtctat ggaaagcgga    600
gaacacatgc ctgacaaacc caagtttgtt aaagagctgg tgcgagtggc agctccagga    660
ggcacaataa tagtagtgac atggtgccat agggatcttg gtccatctga agagtctttg    720
cagccatggg agcaaaagct tttaaacaga atatgtgatg cttactattt accagagtgg    780
tgttctactt ctgattatgt caaattattt cagtccctat ctctccagga tataaaggca    840
ggagactgga ctgagaatgt agcacccttt tggccagcag tgatacgttc agcattgaca    900
tggaagggct tcacatcgct gctacgaagt ggattaaaaa caataaaagg tgcactggtg    960
atgccattga tgatcgaagg tttccagaaa ggggtgataa agtttgccat cattgcttgc   1020
cggaagccag ctgagtag                                                 1038
<210>2
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>2
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg cggccgcaca atggctgccg cgttacaatt     60
ac                                                                    62
<210>3
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>3
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ctgcaggcta ctcagctggc ttccggc        57
<210>4
<211>1405
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>4
cgcccttcgg ccgcgcatga tggtgaagaa attgtcgacc tttctcttgt ctgtttgtct     60
tttgttaaag aagctatgct tcgttctaat aatcttattg tccattttgt tgtgttatga    120
cattttggct gctcccatgg caggtccgtc gcttctcttc catttcttct cattttcgat    180
tttgattctt atttctttcc agtagctcct gctctgtgaa tttctccgct cacgatagat    240
ctgcttatac tccttacatt caaccttaga tctggtctcg attctctgtt tctctgtttt    300
tttcttttgg tcgagaatct gatgtttgtt tatgttctgt caccattaat aataatgaac    360
tctctcattc atacaatgat tagtttctct cgtctacaaa acgatatgtt gcattttcac    420
ttttcttctt tttttctaag atgatttgct ttgaccaatt tgtttagatc tttattttat    480
tttattttct ggtgggttgg tggaaattga aaaaaaaaaa aaacagcata aattgttatt    540
tgttaatgta ttcatttttt ggctatttgt tctgggtaaa aatctgcttc tactattgaa    600
tctttcctgg attttttact cctattgggt ttttatagta aaaatacata ataaaaggaa    660
aacaaaagtt ttatagattc tcttaaaccc cttacgataa aagttggaat caaaataatt    720
caggatcaga tgctctttga ttgattcaga tgcgattaca gttgcatggc aaattttcta    780
gatccgtcgt cacattttat tttctgttta aatatctaaa tctgatatat gatgtcgaca    840
aattctggtg gcttatacat cacttcaact gttttctttt ggctttgttt gtcaacttgg    900
ttttcaatac gatttgtgat ttcgatcgct gaatttttaa tacaagcaaa ctgatgttaa    960
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tttttttctt ttggtcgaga atctgatgtt tgtttatgtt ctgtcaccat taataataat   3600
gaactctctc attcatacaa tgattagttt ctctcgtcta caaaacgata tgttgcattt   3660
tcacttttct tctttttttc taagatgatt tgctttgacc aatttgttta gatctttatt   3720
ttattttatt ttctggtggg ttggtggaaa ttgaaaaaaa aaaaaacagc ataaattgtt   3780
atttgttaat gtattcattt tttggctatt tgttctgggt aaaaatctgc ttctactatt   3840
gaatctttcc tggatttttt actcctattg ggtttttata gtaaaaatac ataataaaag   3900
gaaaacaaaa gttttataga ttctcttaaa ccccttacga taaaagttgg aatcaaaata   3960
attcaggatc agatgctctt tgattgattc agatgcgatt acagttgcag ggcaaatttt   4020
ctagatccgt cgtcacattt tatcttctgt ttaaatatct aaatctgata tatgatgtcg   4080
acaaattctg gtggcttata catcacttca actgttttct tttggctttg tttgtcaact   4140
tggttttcaa tacgatctgt gatttcgatc gctgaatttt taatacaagc aaactgatgt   4200
taaccacaag caagagatgt gacctgcctt attaacatcg tattacttac tgctagtcgt   4260
attctcaacg caatcgtttt tgtatttctc acattatgcc gcttctctac tctttattcc   4320
ttttggtcca cgcattttct atttgtggca atccctttca caacctgatt tcccactttg   4380
gatcatttgt ctgaagactc tcttgaatcg ttaccacttg tttcttgtgc atgctctgtt   4440
ttttagaatt aatgataaaa ctattccata gtcttgagtt ttcagcttgt tgattctttt   4500
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aatgtaataa gaactactcc gtagacggta ataaaagaga agtttttttt tttactcttg   4620
ctactttcct ataaagtgat gattaacaac agatacacca aaaagaaac aattaatcta    4680
tattcacaat gaagcagtac tagtctattg aacatgtcag attttctttt tctaaatgtc   4740
taattaagcc ttcaaggcta gtgatgataa aagatcatcc aatgggatcc aacaaagact   4800
caaatctggt tttgatcaga tacttcaaaa ctatttttgt attcattaaa ttatgcaagt   4860
gttcttttat ttggtgaaga ctctttagaa gcaaagaacg acaagcagta ataaaaaaaa   4920
caaagttcag ttttaagatt tgttattgac ttattgtcat ttgaaaaata tagtatgata   4980
ttaatatagt tttatttata taatgcttgt ctattcaaga tttgagaaca ttaatatgat   5040
actgtccaca tatccaatat attaagtttc atttctgttc aaacatatga taagatggtc   5100
aaatgattat gagttttgtt atttacctga agaaaagata agtgagcttc gagtttctga   5160
agggtacgtg atcttcattt cttggctaaa agcgaatatg acatcaccta gagaaagccg   5220
ataatagtaa actctgttct tggtttttgg tttaatcaaa ccgaaccggt agctgagtgt   5280
caagtcagca aacatcgcaa accatatgtc aattcgttag attcccggtt taagttgtaa   5340
accggtattt catttggtga aaaccctaga agccagccac cctttttaat ctaatttttg   5400
taaacgagaa gtcaccacac ctctccacta aaaccctgaa ccttactgag agaagcagag   5460
cgcagctcaa agaacaaataa aacccgaag atgagaccac cacgtggcgg cgggagcttc   5520
aggggacggg gaggaagaga tggcggcgga cgctttggtg gcggcggcgg acgttttggt   5580
ggcggcggtg gacgttttgg tggcggcggt ggacgctttg gtggtggata tcgtgacgaa   5640
ggacctccca gtgaagtcat tggttcgttt actcttttct tagtcgaatc ttattcttgc   5700
tctgctcgtt gttttaccga taaagctagg tacagcttgg cactggccgt cgttttacaa   5760
cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct   5820
ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc   5880
agcctgaatg gcgaatggcg ccaagctcct cgagctatct gtcacttcat caaaaggaca   5940
gtagaaaagg aaggtggcac ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggctatcgtt   6000
caagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg   6060
gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga tatctccact   6120
gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga   6180
agttcatttc atttggagag gacacgctga aatcaccagt ctctctctac aaatctatct   6240
ctctctattt tctccataat aatgtgtgag tagttcccag ataagggaat tagggttctt   6300
atagggtttc gctcatgagc ccagaacgac gcccggccga catccgccgt gccaccgagg   6360
cggacatgcc ggcggtctgc accatcgtca accactacat cgagacaagc acggtcaact   6420
tccgtaccga gccgcaggaa ccgcaggagt ggacggacga cctcgtccgt ctgcgggagc   6480
gctatccctg gctcgtcgcc gaggtggacg gcgaggtcgc cggcatcgcc tacgcgggcc   6540
cctggaaggc acgcaacgcc tacgactgga cggccgagtc aaccgtgtac gtctcccccc   6600
gccaccagcg gacgggactg ggctccacgc tctacaccca cctgctgaag tccctggagg   6660
cacagggctt caagagcgtg gttgctgtca tcgggctgcc caacgacccg agcgtgcgca   6720
tgcacgaggc gctcggatat gccccccgcg gcatgctgcg ggcggccggc ttcaagcacg   6780
ggaactggca tgacgtgggt ttctggcagc tggacttcag cctgccagta ccgccccgtc   6840
cggtcctgcc cgtcaccgag atttgagaat tgatcgttca aacatttggc aataaagttt   6900
cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc atataatttc tgttgaatta   6960
cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta tttatgagat gggtttttat   7020
gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa   7080
ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta gatcctcgag cgatcgtgaa   7140
gtttctcatc taagccccca tttggacgtg aatgtagaca cgtcgaaata aagatttccg   7200
aattagaata atttgtttat tgctttcgcc tataaatacg acggatcgta atttgtcgtt   7260
ttatcaaaat gtactttcat tttataataa cgctgcggac atctacattt ttgaattgaa   7320
aaaaaattgg taattactct ttctttttct ccatattgac catcatactc attgctgatc   7380
catgtagatt tcccggacat gaagccattt acaattgaat atatcctgcc gccgctgccg   7440
ctttgcaccc ggtggagctt gcatgttggt ttctacgcag aactgagccg gttaggcaga   7500
taatttccat tgagaactga gccatgtgca ccttcccccc aacacggtga gcgacggggc   7560
aacggagtga tccacatggg acttttaaac atcatccgtc ggatggcgtt gcgagagaag   7620
cagtcgatcc gtgagatcag ccgacgcacc gggcaggcgc gcaacacgat cgcaaagtat   7680
ttgaacgcag gtacaatcga gccgacgttc acg                                7713

Claims (19)

1.一种核酸分子，包含含有多肽编码序列的第一种核酸区段和含有基因抑制序列的第二种核酸区段，其中所述第一种核酸区段和所述第二种核酸区段与单一启动子可操作地相连，其中所述核酸分子在宿主细胞中的转录导致在所述宿主细胞中由所述多肽编码序列编码的多肽的表达和基因的抑制。
2.根据权利要求1的核酸分子，其中所述第二种核酸区段表达为dsRNA分子。
3.根据权利要求2的核酸分子，其中所述第二种核酸区段具有相应于mRNA的至少21个连续的核苷酸。
4.根据权利要求3的核酸分子，其中所述第二种核酸区段具有相应于所述mRNA的内含子的至少21个连续的核苷酸。
5.根据权利要求3的核酸分子，其中所述第二种核酸区段具有相应于所述mRNA的外显子的至少21个连续的核苷酸。
6.根据权利要求3的核酸分子，其中所述第二种核酸区段具有相应于所述mRNA的3’UTR的至少21个连续的核苷酸。
7.根据权利要求3的核酸分子，其中所述第二种核酸区段具有相应于所述mRNA的5’UTR的至少21个连续的核苷酸。
8.根据权利要求1的核酸分子，其中所述基因的抑制是所述宿主细胞的内源基因的抑制。
9.一种转化的植物，其基因组中具有核酸分子，该核酸分子包含含有多肽编码序列的第一种核酸区段和含有基因抑制序列的第二种核酸区段，其中所述第一种核酸区段和所述第二种核酸区段与单一启动子可操作地相连，其中所述核酸分子在宿主细胞中的转录导致在所述宿主细胞中由所述多肽编码序列编码的多肽的表达和基因的抑制。
10.一种同时改变植物中多于一种RNA分子的表达的方法，包括向所述植物的基因组中引入包含含有多肽编码序列的第一种核酸区段和含有基因抑制序列的第二种核酸区段的核酸分子，其中所述第一种核酸区段和所述第二种核酸区段与单一启动子可操作地相连，其中所述核酸分子在宿主细胞中的转录导致在所述宿主细胞中所述多肽编码序列编码的多肽的表达和基因的抑制。
11.根据权利要求10的方法，其中所述第二种核酸区段表达为dsRNA分子。
12.根据权利要求11的方法，其中所述第二种核酸区段具有相应于mRNA的至少21个连续的核苷酸。
13.根据权利要求11的方法，其中所述第二种核酸区段具有相应于所述mRNA的内含子的至少21个连续的核苷酸。
14.根据权利要求11的方法，其中所述第二种核酸区段具有相应于所述mRNA的外显子的至少21个连续的核苷酸。
15.根据权利要求11的方法，其中所述第二种核酸区段具有相应于所述mRNA的3’UTR的至少21个连续的核苷酸。
16.根据权利要求11的方法，其中所述第二种核酸区段具有相应于所述mRNA的5’UTR的至少21个连续的核苷酸。
17.根据权利要求10的方法，其中至少一种所述多于一种RNA分子的表达水平至少部分被降低。
18.根据权利要求17的方法，其中至少一种所述多于一种RNA分子的表达水平被显著降低。
19.根据权利要求18的方法，其中至少一种所述多于一种RNA分子的表达水平被有效消除。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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