CN1842601A

CN1842601A - 通过靶向抑制内源贮藏蛋白增强植物种子中异源多肽的累积

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Publication number: CN1842601A
Application number: CNA2004800246186A
Authority: CN
Inventors: 比约登·拉鲁斯·奥瓦尔
Original assignee: ORF Liftaekni hf
Current assignee: ORF Liftaekni hf
Priority date: 2003-08-27
Filing date: 2004-08-27
Publication date: 2006-10-04
Also published as: IS8376A; RU2373285C2; AU2004269200A1; EP1668137B1; AU2004269200A8; JP2007503212A; RU2006109553A; CA2543605A1; WO2005021765A2; AU2004269200B8; AU2004269200B2; EP1668137A2; EP1668137B8; WO2005021765A3; US20070143872A1

Abstract

本发明涉及增加植物种子中异源蛋白的累积水平的改进方法，通过靶向抑制与异源蛋白竞争有限资源，诸如氨基酸、核糖体结合位点以及参与翻译和翻译后加工的酶的作用的内源蛋白来用于分子耕作。本发明提供了利用反义“抑制”或双链RNA－诱导的RNA干预或转录后基因沉默(PTGS)来抑制通过转录激活大麦醇溶蛋白基因获得的大麦中的转录因子的表达的方法。

Description

通过靶向抑制内源贮藏蛋白增强植物种子中异源多肽的累积

发明领域

本发明属于植物分子生物学领域，且具体地涉及通过抑制竞争单子叶植物胚乳中种子贮藏蛋白的内源表达增加植物种子中异源蛋白表达的方法。

背景技术

许多植物在发育种子的胚乳中表达和贮藏大量具有不同功能的蛋白，诸如各种贮藏蛋白，代谢酶，内源几丁质酶，蛋白合成抑制因子，蛋白酶抑制因子，淀粉酶，凝集素和过氧化物酶。胚乳中的贮藏蛋白诸如通常在许多单子叶作物中，可超过种子干重的15％。因此，在特定的发育阶段，种子胚乳中的细胞机构主要由这些特定蛋白的制备和贮藏所占据。此外，发现大多数贮藏蛋白基因在几天到几周的时间内以多拷贝形式存在，反映了这些蛋白快速累积的重要性。

作物种子的发育胚乳中蛋白累积的固有生物学能力是指许多作物植物，尤其是单子叶植物具有作为用于大规模生产异源重组蛋白，例如用于制药工业的高价值多肽的实用和有效载体的潜能；这种生产方法通常称作分子耕作。此外，在种子中贮藏异源多肽减少了下游加工成本，因为这些种子可以贮藏好几年而不影响异源多肽的特性。这种蛋白的表达，优选在种子-特异性或胚乳-特异性启动子的调控下。

当提高用于分子耕作的特定植物中异源蛋白的表达水平时，利用常规分子生物学策略，诸如合适启动子的选择和亚细胞定位，尽管表达水平也受待表达蛋白的特性及其复杂性与功能的显著影响。然而，尤其令人担忧的异源蛋白的低表达水平(总可溶性蛋白的低百分比或％TSP)，甚至当在种子表达时。需要新的生物技术方法来进一步增强表达水平。这是是相当大的挑战，尤其因为细胞机理已被程序设计用于其内源作用，其在发育种子中，优选被贮藏蛋白的累积和休眠依赖存活者的常规制备所占据。最经常地用于驱动目的异源基因在单子叶植物的胚乳或种子中表达的启动子主要为来自贮藏蛋白基因的启动子，诸如GluB-1，一种来自水稻的1.3kb胚乳-特异性启动子(Patel等，2000；GenBank登录号：X54314)，或来自大麦的0.45kb D-大麦醇溶蛋白启动子(Srensen等，1996；GenBank登录号X84368)。尽管这些启动子强烈驱动异源目的蛋白的表达，它们在时间和空间上的活性与驱动最丰富的贮藏蛋白的内源启动子的活性一致，引起有限资源的竞争，诸如氨基酸，核醣体结合位点和参与翻译翻译后加工的酶集合。这些竞争消极地影响目的异源多肽的表达水平。

高度理想地是具有一种抑制内源基因，诸如在时间和空间上与异源目的蛋白的表达积极争夺资源的许多内源贮藏蛋白基因表达的方法。因此，如果提供了抑制的实用方法，抑制贮藏蛋白可满足多种工业需求。这一点可能是分子耕作中相当重大的挑战，特别是如果内源基因为多基因家族的成员时。在大麦中，例如，胚乳中的主要资源库是占高达50％总胚乳蛋白的B-大麦醇溶蛋白贮藏蛋白(Shewry 1993：in Barley；Chemistry and Technology)。

术语“库”，“库基因”和“库蛋白”在这里是指在细胞中积极表达和吸收大量可用资源的基因和基因产物，即，库“消耗”细胞的大部分资源，因此限制了用于表达其它基因和基因产物的可用资源。

反义技术是作为减少植物细胞中特异性内源基因产物表达的有效手段出现的(参见，例如美国专利5,759,829；rvar等1997；Coles等，1999)。然而，该技术并不是直接抑制基因家族成员的基因表达的实用方法，例如种子贮藏蛋白的情况，诸如每一单倍体基因组至少20个的B-大麦醇溶蛋白基因Shewry等，1985)；该技术较好地适于调控不属于基因家族的基因的表达。

减少内源基因表达的另一方法是用于转录后基因沉默(PTGS)的双链RNA的应用。此RNA-诱导的基因沉默或RNA-干预，其中特定内源基因的正义及其互补反义RNA链在一个dsRNA中合成，首先显示于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)(Fire等，1998等，1998)中。Hamilton等，(1999)显示短的核苷酸RNAs(21-23核苷酸长)为调节植物PTGS中内源靶mRNA裂解的裂解产物。植物中双-链基因沉默的更有效的方法为Wesley等(2001)所描述的方法，其中基因沉默基因以转录后形成“发夹-环”RNA(hpRNA)的方式构建。hpRNA基因沉默的一种形式是内含子-剪接的hpRNA(ihpRNA)其中发夹-环中的间隔基为内含子。ihpRNA可以是植物中非常强烈的PTGS(参见Waterhouse等2001和Smith等2000)。在特定载体中产生这种PTGS构建体的方法描述在美国专利申请2003-A-0049835中。

需要一种提高分子耕作中且特别是单子叶植物诸如大麦中异源基因表达的新方法。为增加分子耕作中目的药物蛋白表达而减少目的异源基因和内源“库”基因之间表达竞争的能力，在现有技术中尚未被实现。现有技术也没有显示利用例如hpRNA-诱导的PTGS，靶基因沉默可以为何，事实上可增加分子耕作中目的异源基因的表达水平。

发明概述和目的

本发明的主要目的被概括为提供用于增加在分子耕作中用作制备载体的转基因种子中目的异源多肽的累积水平的方法和核酸构建体。主要方法是限制单子叶植物中编码胚乳-特异性贮藏蛋白的内源不希望的mRNA的蛋白翻译的资源竞争来有利于在上述胚乳中表达重组产生的目的异源多肽。

上述抑制基因家族成员的基因表达的方法是靶向所有具有其特征的基因家族成员的编码序列内的独立成员或同源区域。本发明的一个目的是通过以协调方式调控上述基因家族的多数成员的表达抑制单基因转录调节因子表达来减弱基因家族的表达避免以前描述的方法的缺点。

本发明的另一目的是利用转录调节因子的hpRNA-诱导的PTGS来抑制单子叶植物的胚乳中主要贮藏蛋白的表达，且由此，避免利用用于相同目的的本领域更常规的所谓反义技术，或所谓的共-抑制。

如果可获得主要贮藏蛋白基因诸如大麦醇溶蛋白的转录调节因子的hpRNA-诱导的PTGS，而不影响驱动编码目的异源蛋白的转基因的特定启动子的转录调节因子的表达水平，用于翻译的有限资源的竞争将减少而有助于编码目的异源蛋白的mRNA，从而导致特定目的异源蛋白累积的增加。

本发明的一个目的是提供抑制主要贮藏蛋白基因的转录调节因子表达的方法，且由此减少所述贮藏蛋白基因的表达水平，不影响驱动编码在植物中产生的异源蛋白的目的转基因表达的特定启动子的活性。

本发明的第一个方面提供了增强植物种子中目的异源多肽的表达和累积的方法，所述方法包括：

(a)用与编码一或多种转录调节因子(TF)或其部分、包括不同TFs的嵌合组合、调节编码种子贮藏蛋白的一或多种内源基因的转录的DNA序列可操作连接的种子-特异性启动子的DNA序列转化植物细胞，其中所述TF DNA序列的转录链能够形成能抑制、延缓或减少所述植物细胞中一或多种所述种子贮藏蛋白的表达的“发夹”RNA，和

(b)选择没有被如上(a)中所述转录调节因子识别的顺式作用元件的种子-特异性启动子，和

(c)用与编码目的异源多肽的DNA序列可操作连接的(b)所述的启动子的DNA序列转化(a)所述的相同的或另一植物细胞；

(d)由所述转化的植物宿主细胞再生植物，以及在其中所述编码一或多种TF或其部分的DNA序列被转录的条件下栽培所述植物，由此减少所述内源mRNA的表达，因此减少所述种子贮藏蛋白的表达，和由此增强所述异源目的多肽的表达和累积。

在一个有用的实施方案中，步骤(a)的DNA序列以及步骤(c)的DNA序列被导入到相同的植物细胞中。在这种实施方案中，该序列可以可操作连接在一个DNA序列中。

然而，在其它有意义的实施方案中，步骤(a)的DNA序列被导入到第一植物宿主细胞的基因组中，且所述步骤(c)的DNA序列被导入到第二植物宿主细胞的基因组中。然后由所述第一植物宿主细胞再生第一转基因植物并且由所述第二植物宿主细胞产生第二转基因植物，且由所述第一和第二转基因植物之间的有性杂交产生转基因植物的子代，该子代植物具有包括编码所述一或多种TF-s的DNA序列以及编码目的异源蛋白的DNA序列的细胞，因此该植物能够表达和累积所述的异源蛋白。

在优选的实施方案中，抑制的种子贮藏蛋白为大麦的大麦醇溶蛋白，例如，B-大麦醇溶蛋白和C-大麦醇溶蛋白之一或二者。

编码目的异源多肽的DNA序列可以是编码原核或真核生物蛋白的DNA序列，其可以在本发明的植物细胞中累积。可选择用于本发明生产的蛋白的实例为胶原蛋白，胶原酶，同源盒多肽，单克隆抗体，分泌的抗体，单链抗体，甘露糖-结合的凝集素，胃蛋白酶，糜蛋白酶，胰蛋白酶，酪蛋白，人生长激素，人血清白蛋白，人胰岛素，乳铁蛋白，溶菌酶，纤维素酶，果胶酶，半纤维素酶，肌醇六磷酸酶，水解酶，过氧化物酶，纤维蛋白原，因子IX，因子XIII，凝血酶，蛋白C，木聚糖酶，异淀粉酶，葡糖淀粉酶，淀粉酶，溶菌酶，β-葡聚糖酶，葡糖脑苷脂酶，酪蛋白，乳糖酶，尿素酶，葡萄糖异构酶，转化酶，链霉亲和素，酯酶，碱性磷酸酶，蛋白酶抑制因子，蛋白酶，胃蛋白酶，糜蛋白酶，胰蛋白酶，木瓜酶，激酶，磷酸酶，脱氧核糖核酶，核糖酶，磷脂酶，脂酶，漆酶，蛛丝蛋白，抗冻蛋白，抗微生物肽或防卫素，生长因子和细胞分裂素。

在某些实施方案中，所述DNA序列编码来自嗜热生物的目的蛋白，诸如例如碳水化合物结合组件(CBM)。合适的CBM的实例为来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的CBM9-2。CBM9-2基因组DNA序列可获自GenBank登录号Z46264且其属于CBM-s的IX家族。同时，包括所述CBM或其它合适CBM的融合蛋白可由DNA序列编码且在本发明种子中超表达。纯化这种CBMs和CBM融合蛋白的方法进一步具体描述在申请人与此申请同时申请的悬而未决的国际专利申请“由植物纯化重组蛋白的非-失活方法”和“重组蛋白的蛋白水解和纯化的方法”中，且其全文引入作为参考。

在一个特定的实施方案中，所述DNA序列包括编码HoxB4蛋白的人同源盒B4(HoxB4)基因。所述人HoxB4蛋白优选地具有SEQ IDNO：1序列，或与SEQ ID NO：1具有显著序列同一性的序列，因此表达的蛋白优选地具有天然HoxB4蛋白的所有功能特征。在上下文中的显著序列同一性表示至少50％序列同一性且更优选地至少60％，诸如至少70％的序列同一性，诸如至少80％和优选地至少90％的序列同一性，诸如至少95％或99％的序列同一性。

如在这里所显示的，编码一或多种TF或其部分的所述DNA序列优选地能够形成能抑制、延缓或减少一或多种所述种子贮藏蛋白的表达的“发夹”RNA。所述DNA序列可包含完整的TF序列，然而，有时即使仅仅TF序列的一部分也在原位影响抑制。因此，在这些实施方案中，一或多种TF序列的充分长度部分是影响抑制所需要的。有时，短至20个核苷酸长的部分TF序列的是充分的，但优选利用至少20-500个核苷酸范围内的部分，包括约20-200个，诸如在20-100范围内，或50-100核苷酸长的范围内。

在特定有用的实施方案中，编码一或多种TF的DNA序列为嵌合DNA序列，如在这里定义的，由编码TF或其部分的两种或多种DNA序列的区域组成。在其它有用的实施方案中，在嵌合DNA序列中编码一或多种TF的DNA序列可同时包括能够在“发夹”RNA中形成环的内含子序列。

优选的实施方案利用编码TF或其部分的DNA序列，包括来自bZIP蛋白组的编码TF或其部分的区域，更优选地为选自大麦BLZ1和BLZ2蛋白的bZIP蛋白(参见Onate等，1999)。所述DNA序列可包含编码这种蛋白的影响抑制的足够长度的部分序列，或编码所述蛋白的部分序列的组合。

所述DNA序列优选地包括如SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的序列，或编码与通过所述序列编码的任一氨基酸序列具有显著序列同一性的蛋白的序列，或具有足够长度来根据本发明方法导致抑制的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4序列的一部分的序列。如上所述，所述序列的任意组合，诸如一或多种部分上述序列的组合可能是有用的，这种组合的实例显示为SEQ ID NO：5，其是部分BLZ1和部分BLZ2的嵌合体。

本发明的另一目的是提供利用hpRNA-诱导的PTGS技术来抑制主要贮藏蛋白基因的转录调节因子的表达的方法。因此，在特定的实施方案中，本发明的方法应用hpRNA-诱导的PTGS技术来抑制内源贮藏蛋白的表达且，由此增加诸如氨基酸，核糖体结合位点和参与翻译和翻译后加工的酶的集合，用于翻译编码目的异源多肽的mRNA的资源的利用率。因此，在优选的实施方案中，所述编码一或多种优选来自如上所述的bZIP蛋白的组的TF或其部分或组合的DNA序列能够在所述植物细胞中表达“发夹”RNA(hpRNA)。

所述DNA序列优选地包括长度足以根据在这里所述的方法尤其在种子和/或胚乳中，诸如优选地在大麦胚乳中导致抑制的，选自SEQID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQID NO：6或SEQ ID NO：7，SEQ IDNO：8的序列及其任意的部分或组合。

因此，本发明的目的是提供用于减少大麦胚乳中B-大麦醇溶蛋白和C-大麦醇溶蛋白的水平的分子生物学方法和手段。更具体地，本发明的目的是提供包括能够形成hpRNA，且因此能够减少所述胚乳基因表达的BLZ1和BLZ2基因的区域的基因构建体。

更具体地，本发明提供了编码能在大麦胚乳中形成能够进行PTGS的hpRNA的转录本的BLZ1和BLZ2基因的区域的基因构建体。

在上述的一个优选的实施方案中，制备具有降低的胚乳贮藏蛋白水平的转基因植物的方法包括：(1)提供能够再生成为可繁殖的植物的单子叶植物细胞，优选大麦；(2)用包括在5′至3′方向阅读的表达盒，种子特异性优选胚乳特异性的启动子，编码调节内源种子贮藏蛋白的转录调节因子的核酸序列，另一种子-特异性优选没有被调节待抑制的贮藏蛋白的转录调节因子识别的顺式作用元件的胚乳-特异性的启动子，编码目的异源多肽的核酸序列以及3′非翻译区的核酸构建体转化植物细胞；(3)再生所述植物细胞来提供具有调节种子贮藏蛋白表达的转录调节因子的降低水平以及内源贮藏蛋白的降低水平的第一转基因植物。

本发明也包括在单子叶种子中高水平表达目的异源多肽的DNA构建体。此DNA构建体包括：在给定的单子叶种子中具有功能，并与编码目的异源多肽的序列可操作连接的启动子；以及在给定单子叶种子中与功能性启动子可操作连接的编码能够形成在大麦胚乳中能够进行PTGS的hpRNA的转录本的BLZ1和BLZ2基因的区域的嵌合基因构建体。

本发明的另一个方面提供了诸如尤其是如上所述的，可通过在这里描述的方法获得的转基因植物。所述植物具有上述的目的特性，即抑制选择的主要资源“库″蛋白的表达以增强重组产生的目的蛋白的表达和累积。本发明优选的植物包括大麦植物，例如大麦变种，其可用于本发明来在种子中表达和累积异源蛋白。本发明的大麦植物优选地在其基因组序列中编码在这里描述的优选TFs诸如来自bZIP蛋白的组的TF或其部分。

附图说明

图1.由大麦cv.Skegla(开花期后49天)利用水溶液萃取(条带1)，盐萃取(条带2)和EtOH萃取(条带3)获得总蛋白进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳。箭头表示B-(下面)和C-大麦醇溶蛋白(上面)。

图2.利用a)引物SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10(参见实施例2)和b)引物SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13(实施例3)的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶分析。产物在1.0％琼脂糖凝胶上分离，用溴化乙锭染色并在UV下照相。左边的大小标记物为EcoRI/HindIII-切割的λ。箭头表示扩增的产物。

图3图示了二元植物转化载体pbDH101的克隆路线，该载体用于转化具有在D-大麦醇溶蛋白启动子调控下在大麦胚乳组织中表达的密码子-优化的HoxB4-CBM嵌合基因的大麦。缩写：D-hor，D-大麦醇溶蛋白启动子；CBM，编码来自Thermatoga maritima的碳水化合物结合结构域的密码子优化的基因；HoxB4，密码子-优化的(SEQ ID NO：20)；L，接头(PTPTPT；P为脯氨酸，T为苏氨酸)；kd，KDEL序列；pinII，马铃薯蛋白酶抑制因子II基因终止信号；CaMV 35S，花椰菜花叶病毒35S启动子；hph，来自E.coli的潮霉素磷酸转移酶(Genebank登录号，K01193)；Nos-ter，胭脂碱合成酶终止信号；R，右边界；L，左边界。

图4图示了构建用于在D-大麦醇溶蛋白启动子调控下发夹RNA-诱导的靶向抑制大麦中BLZ1和BLZ2的基因构建体。正义方向和反义方向中的114bp的BLZ1/BLZ2分别能在发夹环中形成茎部分而88bp内含子4形成环。

图5图解了二元植物转化载体pbDH104的克隆路线，用于转化具有在D-大麦醇溶蛋白启动子调控下在大麦胚乳组织中hpRNA-诱导的靶向抑制BLZ1和BLZ2的大麦。缩写：D-hor，D-大麦醇溶蛋白启动子；hpB1/2，由获自BLZ1和BLZ2的核苷酸序列(SEQ ID NO：8)组成的620bp抑制因子片段；CBM，编码来自Thermatoga maritima的碳水化合物结合结构域的密码子-优化的基因；HoxB4，密码子-优化的同源盒B4基因(SEQ ID NO：20)；L，接头(PTPTPT；P为脯氨酸，T为苏氨酸)；pinII，马铃薯蛋白酶抑制因子II基因终止信号；CaMV 35S，花椰菜花叶病毒35S启动子；hph，来自大肠杆菌的潮霉素磷酸转移酶(Genebank登录号K01193)；Nos-ter，胭脂碱合成酶终止信号；R，右边界；L，左边界。

发明详述

下面将具体描述本发明。

术语“蛋白”在这里与“多肽”和“肽”可互换使用。

术语“异源”在这里与术语“非天然”或“外来的”或“外源的”可互换使用，且应用于通常在没有经受包括重组DNA技术的遗传操作的宿主生物中未发现的蛋白和/或体外修饰的DNA序列。在这里使用的术语“目的异源多肽”或“目的多肽”是指用于在宿主生物中利用本发明的方法或组合物表达的任意多肽。作为非-限制的实例，药用多肽(例如，用于药物用途)或工业多肽(例如，酶)可按照本发明来制备。

术语“编码序列”是指编码特异性氨基酸序列的核苷酸序列。

“启动子”被定义为直接转录可操作连接的核酸的一系列核酸控制序列或转录调节因子结合位点。启动子是指控制编码序列或功能性RNA表达的核酸序列。术语“可操作连接”是指启动子(核酸表达控制序列，或系列转录因子结合位点)和第二核酸序列之间的功能性连接，其中启动子指导对应于第二序列的核酸的转录。

“转录调节因子”或“转录因子”是指其可结合于顺式作用元件(也称作顺式作用基序)的转录作用调节蛋白，所述顺式作用元件是位于基因上游或内含子内的或终止密码子下游的短DNA序列。

术语“内源基因”是指生物基因组中在其天然位置的天然基因。

术语“嵌合组合”或“嵌合基因”或“杂合基因”是指形成非内源性基因的任意两种或多种连接的DNA序列；包括通常在自然中不是一起发现的调节和或编码序列。术语“基因构建体”或“DNA构建体”或“核酸构建体”是指通过常规分子生物学策略装配的任意的DNA序列或DNA序列的组合。

这里的术语“表达”是指基因产物的生物合成，包括正义(mRNA)，反义RNA或其它由DNA序列的RNA聚合酶-催化的转录形成的单-或双-链形式的RNA聚合物的转录。表达也可指mRNA由所述基因翻译为多肽。

术语“转化”是指将核酸分子转移到宿主生物的基因组中，产生遗传稳定的遗传。含有转化的核酸片段的宿主生物称为“转基因”生物。术语“转基因”是指本发明的植物宿主细胞含有至少一个外来的，优选两个外来的稳定地整合到基因组中的核酸分子。植物转化方法的实例包括农杆菌-介导的转化(DeBlaere等，1987等，1987)和粒子-轰击或“基因枪”转化技术(Klein等，(1987)；美国专利4,945,050)。

术语“反义抑制”或“反义”或“反义抑制”是指反义链充分互补于内源转录产物或mRNA使得内源转录产物的翻译和表达被抑制或减少。术语“靶向抑制”是指利用重组DNA技术来设计和应用能够编码能干扰和抑制在某些活生物中选作抑制的内源基因表达的RNA转录本的DNA序列。术语“抑制转基因”是指编码能够干扰和抑制内源基因表达的RNA转录本的任意DNA序列。术语“共-抑制”是指当基因转化导入到细胞中并与相同细胞中的内源基因具有相同或类似序列时引起内源基因和导入基因的抑制。

在这里使用的“bZIP”蛋白是指含有参与DNA结合和二聚化的所谓的碱性螺旋/亮氨酸拉链结构域且通常结合于含有5′ACGT′3核心的DNA序列的调节蛋白。

在这里使用的术语“大麦醇溶蛋白”是指大麦中的贮藏蛋白并具体在胚乳中合成，且被分成4组：β(β，也称作B-)，D-，C-和γ大麦醇溶蛋白。

在这里使用的术语“分子耕作”是指利用植物来产生用于进一步加工的诸如蛋白的有价值的生物学化合物的方法。

可遗传操作的单子叶植物可用于本发明。优选植物为单子叶植物，更优选选自大麦、玉米、小麦、燕麦和水稻。大麦具有许多目的特性，使其成为本发明优选的候选物，尤其优选的大麦种类是大麦。可遗传转化的植物为可导入，表达，稳定维持，以及被传递到随后产生的子代中的异源DNA序列，包括用于编码区DNA序列或编码能够形成hpRNA的RNA转录本的DNA序列的植物。遗传操作和转化方法已经用于利用除草剂包括例如除草肽或basta或抗生素，诸如潮霉素作为选择性标记产生大麦植物。

选择合适的宿主植物后，选择启动子驱动目的异源基因的表达。大量在植物细胞中具有活性的启动子已描述在文献中。优选用于本发明DNA构建体中的启动子在累积所需的目的异源多肽的组织，诸如单子叶植物种子的胚乳中具有强烈的活性。进一步优选地选择的启动子不受本发明方法靶向抑制的转录调节因子，诸如调节与目的异源基因表达竞争资源的内源贮藏蛋白基因的表达的转录调节因子的调节。这种启动子可获自各种植物遗传物质或来自植物病毒。如下所述，优选特定选择的启动子适于在单子叶植物种子中，更优选地在大麦中，且最优选地在种子的胚乳组织中表达异源蛋白。这种可用于本发明目的的合适启动子的克隆和分析描述在实施例2中。

更进一步优选分析选作用于目的异源蛋白累积的靶向组织中的蛋白分布表达谱且按照本发明鉴定用于靶向抑制的最丰富的贮藏蛋白。所述分析可依赖于现有技术诸如来自公开文献的资料。这也包括用微阵列法利用由在与选作驱动异源蛋白表达的启动子该瞬间表达分布重叠的时间点的所述组织提取的mRNA，或利用Northern印迹分析，RT-PCR和/或Western印迹同时监控数千基因的表达谱。基于收集的信息，在时间和空间上与目的异源基因表达具有高度表达竞争的候选基因被选择用于本发明的靶向抑制。

可通过将目的DNA序列连接(插入)到可在细菌宿主中复制的合适质粒中来获得本发明的重组质粒。DNA序列，诸如编码目的异源蛋白的基因或设计用于靶向抑制内源基因的DNA序列优选地被可操作插入到质粒中，所述质粒除用于此目的的启动子之外如果需要，可含有其它的增强子DNA序列，支架-连接区域，内含子，聚腺苷酸添加信号，核糖体结合序列以及目的选择性标记基因诸如潮霉素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因，除草肽抗性基因等。

实施例

下列实施例提供了本发明较好的解释且用于指导本领域的普通技术人员实践本发明。除非另作说明，术语被理解为相关技术领域的普通技术人员的常规用法。

方法

RNA提取和Northern印迹分析

利用TRIzoI(Gibco BRL)按照产商的说明书分离总RNA，且每一泳道按10μg的总RNA进行电泳，并通过毛细管作用转入到Hybond N膜(Amersham)上。利用Stratolinker(Stratagene)将RNA与膜交联，且如(Daviset等，1994)所述严格杂交滤膜并进行冲洗。通过随机引物(T7QuickPrime Kit；Pharmacia)按照产商的说明书用³²P放射性标记探针。将EtBr-染色印迹的负片数字图象用作负载对照。

大麦转化

a)用于遗传转化的植物材料

将大麦cv Golden Promise种子播种在75％浅色水藓泥炭和25％浮石(中等粒度)的混合物上且植物在日间18℃(16小时)和12℃夜间(8小时)以及70％相对湿度以及日间250μmol m^-2s^-1的冷-白色荧光中的连续光照下培养且根据需求用水地下灌溉。在这些条件下，植物培养生长约55-95天或直至准备好用于转化的未成熟种子，其大约为开花期后8至14天。种子在旋转振荡器中的3％次氯酸钠中灭菌40分钟并用无菌水冲洗五次。

b)用于植物转化的菌株及制备物

用具有反式二元载体和具有vir区域的Ti-质粒的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)将具有调节目的异源蛋白表达的DNA构建体的T-DNA区域导入到大麦中。

通过如Maniatis等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1982)所描述的电穿孔进行E.coli XL-Blue和根癌农杆菌二者的转化。为了准备用于转化植物，将农杆菌培养物的单菌落接种在5ml的Agro培养基(胰蛋白胨5g/L，酵母抽提物2.5g/L，甘露醇5g/L，谷氨酸1g/L，KH₂PO₄250mg/L，MgSO₄-7H₂O 100mg/L，生物素1μg/L，pH7.0，25μg/ml利福平，50μg/ml状观霉素)中并在27℃培养24至40小时。在200μl培养物的无菌微量离心管中添加200μl的30％液态甘油(预先灭菌)并充分涡旋培养并在-80℃贮藏之前置于工作台上2小时。为进行每一次转化，由-80℃冰箱移取一个管，解冻并将大约200μl的农杆菌细菌原种添加至无抗生素的5ml Agro培养基中。然后在用于接种植物种子(参见下文)之前在27℃培养培养物17到20小时。

c)制备用于农杆菌-诱导转化的大麦外植体

大约开花期后8至14天的一天挑选在约10个大麦头，除去芒和种子且选择1.5mm和2mm之间大小的胚芽。初始植物种子需要是健康和成熟的，而不是浸满水的，且种子应该是绿色的，没有病征或真菌。种子置于50ml falcon管(不超过一半)中并用70％乙醇冲洗且然后倒掉乙醇。然后添加20％的漂白溶液(White King)并混合20分钟。在薄层气流通风柜中倒掉漂白溶液，用无菌水冲洗种子(约5-8次)并将管置于4℃的CO/N。将两个种子置于显微镜台上的无菌皮式培养皿中。胚芽的位置位于远离种子切口的末端且产生沿着种子侧面的切口。然后种子用钳子固定并对种子的中部施加压力使得胚芽突出来。

用钳子固定胚芽并将解剖刀片插入到子叶盘和茎轴之间的凹槽中并且慢慢地切除茎轴。将除去茎轴的胚芽置于再生培养基上，切口朝上，在皮式培养皿的中心，每平皿具有约25个胚芽。

d)所有二元载体在含有100μg/ml状观霉素的E.coli XI-Blue LB培养基中37℃增殖且随后利用QIAGEN^Plasmid Midi试剂盒由过夜培养的100ml培养物纯化载体。通过将1μl(1μg)的载体放置在具有0.1cm缺口(BioRad)的无菌小玻璃管中用电穿孔将纯化的二元载体导入到根癌农杆菌中，用40μl的电感受态细胞冲洗载体，且设置电压在2.5kV以及电容在21uF用于电穿孔。将细胞涂布在含有100μg/ml状观霉素和20μg/ml利福平的YEP选择平皿上，在28℃培养2天。由A.tumefaciens转化体进行质粒限制性降解分析，然后来证明二元载体的完整性。

e)大麦外植体的农杆菌感染

将约20μl的农杆菌培养物吸取到每一胚芽上，确保所有胚芽和溶液接触。轻弹胚芽(切面朝下)并且将再生培养基横向拖拉至平皿的外面，除去过量的农杆菌。然后以均匀的间距(每平皿25)将胚芽转入新鲜的再生培养基平皿(切面朝上)上并在24℃置于黑暗箱中。

f)感染农杆菌后大麦组织培养物中的再生和器官形成

三天后，将胚芽转入具有选择性标记诸如除草肽或潮霉素的新鲜再生培养基并保持四到六周，每两周移种一次。为了再生小芽，将愈伤组织转入诱导小芽的培养基(SIM)并且使愈伤组织存活并再生每两周转入新鲜的SIM的小芽直至形成小的幼苗。然后将幼苗转入根-诱导培养基(RIM)中并将成活的植物盆栽在土壤中用于进一步的筛选。

DNA提取，PCR和克隆

利用来自Clonetech的NucleoSpin Plant试剂盒^并按照产商的说明书由ca 200mg的嫩叶组织提取用于PCR扩增的基因组DNA。在具有加热的盖的peltier热循环仪(MJ Research，PTC-200)中进行PCR反应。用完全自动的DNA合成仪(Perkin-Elmer)化学合成所有引物。在1％EtBr-染色的琼脂凝胶上在紫外线灯下对所有DNA片段进行大小分级并利用QIAquickGel Extration试剂盒(Qiagen)纯化。限制性酶购自New England Biolabs Inc(Beverly，Mass.)和Fermentas并按照产商的说明书进行使用。克隆及其它DNA操作按照Maniatis等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1982)所述的标准方法进行，但所有连接反应使用以下条件：在缓冲液[50mM Tris-HCl(pH7.6)，5mM MgCl₂，1mM DTT，0.5mM ATP，2.5％聚乙二醇-8000]中T4DNA连接酶(2.5U)16℃，16小时。感受态的大肠杆菌XL-Blue用作转化实验中的受体用于DNA操作和质粒克隆的构建。利用Qiagen^Plasmid Midi试剂盒(Qiagen)制备所有质粒DNA midi制备物并利用自动DNA测序仪(ABI，Pharmacia)测定DNA片段的序列。

实施例1

大麦胚乳中“库”蛋白的分析

可利用由开花期后49天收集的种子中提取的蛋白的SDS-PAGE来鉴定那些对胚乳的总蛋白水平起主要贡献的胚乳-表达的蛋白大麦种子品种Skegla中的蛋白表达分析且，因此，用作靶向抑制的潜在候选物。在添加合适的提取缓冲液之前将来自大麦的五个茎轴的所有种子在液氮中手工精细地研磨。两种提取缓冲液，除水提取之外用于二样品。首先，在还原条件下在1％的2-巯基乙醇，10mM Tris-HCl pH8.0和1％聚乙烯吡咯烷(MW 360.000)存在下用乙醇提取(70％EtOH)进行总蛋白的提取。其次，在还原条件下在170mM NaCl，1％2-巯基乙醇，10mM Tris-HCl pH8.0和1％聚乙烯吡咯烷啶(MW 360.000)存在下提取总蛋白。在液氮中研磨样品后将提取缓冲液添加于提取小瓶中然后继续研磨3分钟。通过在40℃4000rpm离心10分钟纯化提取物，然后在Ultrafree-4浓缩器中用分子5kDa截流(UFV4BCC00-Millipore Corp.Bedford，MA，USA)十倍离心浓缩。100μl纯化的样品，浓缩的提取物添加到100μl的2×样品缓冲液中且将混合物置于沸水浴中5分钟。冷却后，将10μl样品装载在12％聚丙烯酰胶凝胶上用SDS PAGE分离。SDS-后用考马斯蓝R250着色剂染色，并脱色观察蛋白带。结果表明大麦品种Skegla的发育胚乳中最丰富的蛋白为B-和C-大麦醇溶蛋白(图1)。

结果表明根据本发明抑制调节编码B和C大麦醇溶蛋白的基因的转录调节因子非常可能减少资源竞争并允许增加表达的异源多肽的累积。

实施例2

用作外源蛋白表达的大麦中B-和C-大麦醇溶蛋白靶向抑制的启动子的选择

B-大麦醇溶蛋白(GenBank登录号X53690)和C-大麦醇溶蛋白(GenBank登录号M36941)的基因启动子包含100％相同的在参与它们的转录调控的二者中鉴定的顺式作用元件(Muller and Knudsen 1993；Vicente-Carbajosa等，1992)。这些顺式元件在位于翻译起始密码子上游约300bp的所谓胚乳盒(EM)内。EM停泊两种用于转录因子结合的不同顺式作用基序，醇溶蛋白盒(PB)，5′-TGTAAAG-3′和GCN4-样基序(GLM)，5′-(G/A)TGA(G/C)TCAT-3′。GLM由两种转录因子BLZ1(GenBank登录号X80068)，和BLZ2(GenBank登录号X80068)识别。在结合后，特定基因的转录被激活(参见Onate等，1999)。此两个基因为单拷贝基因且因此是用于本发明所述靶向抑制的良好候选物。Vieente-Carbajosa等，(1998)测定了它们在瞬时表达系统中的反义抑制而没有研究对稳定转化植物或对贮藏蛋白累积的影响。此外，还没有研究这种抑制对异源蛋白在相同组织中累积的影响。本发明工程操作的靶向抑制中的重要原则是驱动编码目的异源蛋白的转基因的启动子不应包含由负责待抑制贮藏蛋白表达的特定转录调节因子所识别的顺式作用基序。由于B-和C-大麦醇溶蛋白包含被BLZ1和BLZ2识别的GLM，B-和C-大麦醇溶蛋白启动子不能用于驱动编码目的异源蛋白的异源转基因的表达。另一个重要原则是驱动抑制因子转基因本身的启动子由组织特异性，例如胚乳-特异性启动子的驱动，使得转录调节因子在其它可能需要的组织中的表达将不被影响。这是很重要的，因为许多转录因子，诸如大麦中的BLZ1，在不止一种组织中表达。另一个原则是通过利用启动子来驱动不具有被本发明待抑制的转录调节因子识别的顺式作用元件的抑制因子转基因避免抑制因子转基因的“自我-抑制”。

基于这些原则，选择候选启动子来靶向抑制B-和C-大麦醇溶蛋白。

来自大麦cv Skegla的D-大麦醇溶蛋白启动子的分离、克隆和分析基于GenBank序列id.X84368所述的D-大麦醇溶蛋白基因的翻译起始位点作为如下的正义引物和翻译引物设计引物来扩增-435到-16的邻近启动子区域，正义引物为：

5′GGAATTCC_EcoR1CTTCGAGTGCCCGCCGAFGCCAGCAATGG(SEQ IDNO：9)，具有在5′末端导入的EcoRI限制性位点，反义引物为：

5′ATAAGAATGCGGCCGC_NotlAATGAATTGATCTCTAGTTTTGTGG(SEQ ID NO：10)，具有在5′末端导入的NotI限制性位点。在引物的5′末端导入这些限制性位点的目的是有助于克隆扩增的片段。利用来自大麦cv.Skegla的基因组DNA作为模板用于扩增420bp片段的反应溶液的组合物如下：

基因组DNA溶液 4μl(50ng)

无菌水 12μl

10×PCR缓冲液[100mM Tris-HCl(8.8)

500mM KCl，0.8％Nonidet P40] 2.5μl

50pmol/μl正义引物 1μl(50pmol)

50pmol/μl反义引物 1μl(50pmol)

MgCl₂ 1μl(2.5mM)

dNTP 2.5μl(1mM)

Taq DNA聚合酶(Fermentas) 1μl(5U)

总计 25μl

彻底混合上述反应溶液，除9μl无菌水和Tag DNA聚合酶，且加热溶液到94℃3分钟，然后冷却至80℃30秒并添加Tag DNA聚合酶和9μl的无菌水。第一循环的PCR进行如下：反应加热至94℃30秒，冷却至57℃30秒用于退火，然后加热至72℃45秒用于延伸。紧接着如下30个循环：94℃热变性30秒，62℃退火30秒并72℃延伸45秒。30个循环完成后，反应在72℃加热4分钟。420bp扩增的片段(图2a)用EcoRI/NotI降解然后连接于pKOH122载体的EcoRI/NotII位点来产生重组质粒pDH104。然后测定420bp DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)的插入。根据序列，D-大麦醇溶蛋白启动子不包含GLM且因此，通过靶向抑制BLZ1或BLZ2抑制B-并C-大麦醇溶蛋白(参见上述的讨论)将不影响D-大麦醇溶蛋白启动子的活性和目的异源蛋白的表达。此外，由于D-大麦醇溶蛋白启动子是胚乳-特异性的，此启动子可用于设计用于抑制BLZ1和BLZ2表达的抑制因子转基因。

由于关键是避免抑制因子转基因的“自我-抑制”，通过利用启动子来驱动不具有被本发明抑制的转录调节因子识别的顺式作用元件的抑制因子转基因，利用缺少GLM的D-大麦醇溶蛋白启动子来驱动抑制BLZ1和BLZ2的抑制因子基因，将不会导致这种“自我-抑制”。

实施例3

D-大麦醇溶蛋白编码区的克隆和D-大麦醇溶蛋白基因在mRNA水平的内源表达的分析

正义引物，5′GGAATTCC_EcoR1ATGGCTAAGCGGCTGGTCCTC(SEQ ID NO：12)，和反义引物，5′GGAATTCC_EcoRITTGCAATTGGATAGGTCTCTTG(SEQID NO：13)，被设计来由如GenBank序列id.X84368所描述的D-大麦醇溶蛋白基因的编码区扩增727bp的片段。利用来自Hordeum vulgarecv.Skegla的基因组DNA作为模板，用于扩增727bp片段的反应溶液的组合物如下：

基因组DNA溶液 4μl(50ng)

无菌水 12μl

10×PCR缓冲液[100mM Tris-HCl(8.8) 2.5μl

500mM KCl，0.8％Nonidet P40]

50pmol/μl正义引物 1μl(50pmol)

50pmol/μl反义引物 1μl(50pmol)

MgCl₂ 1μl(2.5mM)

dNTP 2.5μl(1mM)

Taq DNA聚合酶(Fermentas) 1μl(5U)

总计 25μl

彻底混合上述反应溶液，除9μl无菌水和Tag DNA聚合酶，且溶液加热到94℃3分钟，然后冷却至80℃30秒并添加Tag DNA聚合酶和9μl的无菌水。第一循环的PCR进行如下：反应加热至94℃30秒，冷却至60℃30秒用于退火，然后加热至72℃45秒用于延伸。紧接着如下30个循环：94℃热变性30秒，65℃退火30秒并在72℃延伸45秒。30个循环完成后，反应在72℃加热4分钟。用EcoRI降解727bp的扩增片段(图2b)然后连接于pKOH122载体的EeoRI位点来产生重组质粒pDH136。然后测定DNA插入子的核苷酸序列(SEQ ID NO：14)。

利用Northern印迹分析适当地分析胚乳40DAP，胚芽40DAP，叶子、茎和根中D-大麦醇溶蛋白基因的mRNA稳定水平：总RNA分离自200-250mg来自大麦cv Skegla的不同组织或植物部分的植物材料，在1.2％琼脂-甲醛凝胶上分离并根据供应商的说明书点样在Zeta-探针膜(Millipore，Bedford，Mass.)上。如(Davis等，1994)所描述进行点样、杂交和冲洗。利用D-大麦醇溶蛋白基因(SEQ ID NO：14)的₃₂P放射性标记的，随机-引物延伸的747bp片段作为探针进行杂交。

实施例4

将大麦胚乳-密码子-优化的HoxB4克隆到植物转化载体pbDH101中

通过GeneArt GmbH(德国)，利用如(参见申请人的共同悬而未决的申请“在植物中利用密码子优化高水平表达多肽的方法”)所描述的GeneBank ID NM_O24015中所述的基本序列信息和用于在胚乳中D-大麦醇溶蛋白启动子调控下密码子-优化表达的密码子-用法信息，合成大麦中D-大麦醇溶蛋白启动子调控下表达的密码子-优化的HoxB4。通过NcoI位点(CCATGG)侧接791bp的片段(SEQ ID NO：20)用于克隆且包括编码3′末端的接头-肠激酶切割位点DDDDKPTPTPT的27核苷酸序列。HoxB4片段被连接于pKOH122的NcoI/NcoI位点来产生pDH170。然后用NcoI释放片段并连接到pDH152中的NcoI位点，取代pDH152中的EK-L片段来产生pDH156。然后将来自pDH104的D-大麦醇溶蛋白启动子片段连接到pDH156的EcoRI/NotI位点来产生pDH157。用Sse83871/SfI释放D-启动子/SP/HoxB4-E-L/CBM/kd/pinII片段并连接到pKOH250的Sse83871/SfI位点来产生植物转化载体pbDH101(图3)。

实施例5

具有在D-大麦醇溶蛋白启动子调控下的BLZ1和BLZ2的发夹RNA-诱导的靶向抑制的植物转化载体pbDH104的构建

通过GeneArt GmbH(德国)合成用于BLZ1和BLZ2的发夹RNA-诱导的靶向抑制的基因作为592bp抑制因子片段继之以265bp nos-末端片段(SEQ ID NO：8)，并克隆到pUC19中的HindIII/EcoRI位点中来产生pDH144。该片段是来自形成正义和反义臂的BLZ1-基因(SEQIDNO：2)和BLZ2-基因(SEQ ID NO：4)的核苷酸序列，和被设计在转录后形成RNA发夹环(图4)的表示来自BLZ1基因(GenBank序列id.X80068)的内含子4的88bp核苷酸序列的嵌合组合物。用SacII/EcoRI释放857bp片段hpB1/2-nos且取代pDH158中的反义BLZ1-nos片段来产生pDH160。用Sse83871/SgfI降解释放pDH160中的完全插入子并连接到pKOH250的Sse83871/SgfI位点来产生二元植物转化载体pbDH104(图5)，所述二元植物转化载体能够将载体的左边界(L)和右边界(R)之间的DNA序列稳定整合到植物基因组中。

实施例6

用pbDH101和pDH104遗传转化大麦

开花后约8至14天收获大麦cv Golden Promise未成熟种子，并在4℃黑暗中贮藏过夜。冷-温育的未成熟种子在70％EtOH中处理1分钟然后在0.6％氯化钠中处理10分钟，继之以在无菌蒸馏水中彻底冲洗(5-8次)，并置于无菌条件下在层流净化罩中的解剖显微镜下的无菌Petri平皿中。胚芽的位置位于种子切口的末端并沿着种子侧面产生切割。然后用钳子固定种子并对种子的中部施加压力使得胚芽被挤出。用钳子固定胚芽，将解剖刀片插入到子叶盘和茎轴之间的凹槽中并且慢慢地切除茎轴。将子叶盘置于愈伤组织诱导培养基上，切面朝上，并用25μl至40μl的携带植物转化载体的全强度根癌农杆菌接种1至5分钟。接种后，将子叶盘拉至平皿的外面来降低细菌载量和减少共培养阶段的过度生长。将感染的子叶盘转入新的愈伤组织诱导培养基平皿且在24℃遮光温育平皿3天时间。3天后将子叶盘转入新的愈伤组织诱导培养基，其中具有100μg/ml用于杀死农杆菌的timentin和50μg/ml用于选择转化细胞的潮霉素，在24℃遮光培养4周时间，2周后继代培养。然后将愈伤组织转入包括2.5mg/L BAP，50μg/mltimentin和25μg/ml潮霉素的小芽诱导培养基中，在高亮度中培养4至10周。将个体再生幼苗转入根培养基(50μg/ml timentin和25μg/ml潮霉素且没有激素)。发育至具有根的5到7cm小芽后，将转基因植物移到土壤中并在完全的光下培养。

实施例9

靶向抑制BLZ1和BLZ2后HoxB4-CBM蛋白的累积

为测定B-和C-大麦醇溶蛋白在用pbDH101(仅hoxB4-ebm)或pbDH104(用hoxB4-cbm表达的BLZ1/2hpRNA)转化的转基因植物中的累积，可使用Smith(The Protein Protocols Handbooked.，Walker，第二版，Humana Press，2002)描述的胶体考马斯亮蓝G法。然后用SDS-PAGE和标准蛋白由种子提取物分离可溶性蛋白，随后用染色溶液(0.04％(w/v)亮蓝G的3.5％(w/v)高氯酸溶液)对凝胶染色1小时，然后在蒸馏水中脱色4小时。用扫描密度测定法分析相应的B-和C-大麦醇溶蛋白条带的强度并比较用pbDHI01或pbDH104转化的转基因植物中的相对条带强度。产生了对由BLZ1/2hpRNA引起的B-和C-大麦醇溶蛋白的抑制的评价。用pbDH101或pbDH104转化的植物中HoxB4-CBM的同一性和表达水平可通过包含一式两份样品的相同凝胶的片段的Western印迹进行证明和测定。可利用Biorad′s Mini transblot细胞将条带由凝胶片段电点样到硝化纤维膜上，但凝胶片段的外形在印迹之前在滤纸上进行标记。印迹和凝胶膜夹心分解后，用抗CBM的多克隆抗血清杂交硝化纤维，且多次冲洗步骤后(2*5分钟，2*15分钟，1*5分钟)，与结合于辣根过氧化酶(HRP)的次级抗体一起温育45分钟。随后的冲洗步骤后，如上所述，且在添加底物5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯和硝基蓝四唑氯化物于膜后，HRP显色反应阳性鉴定条带为HoxB4-CBM且产生和判断了BLZ1/2hpRNA表达对hoxB4-CBM水平的影响。

尽管仅仅具体描述了本发明优选的实施方案，对本领域技术人员来说可预料能产生本发明上述实施例所述的大量的改进和变化，只要不背离本发明的精神和范围。

参考文献

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序列表

<110>ORF Liftaekni hf.

<120>通过靶向抑制内源贮藏蛋白增强植物种子中异源多肽的累积(ENHANCING

ACCUMULATION OF HETEROLOGOUS POLYPEPTIDES IN

PLANT SEEDS THROUGH TARGETED SUPPRESSION OF ENDOGENOUS STORAGE PROTEINS)

<130>P3505PC00

<150>IS 6931

<151>2003-08-27

<160>15

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>251

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>1

Met Ala Met Ser Ser Phe Leu Ile Asn Ser Asn Tyr Val Asp Pro Lys

1 5 10 15

Phe Pro Pro Cys Glu Glu Tyr Ser Gln Ser Asp Tyr Leu Pro Ser Asp

20 25 30

His Ser Pro Gly Tyr Tyr Ala Gly Gly Gln Arg Arg Glu Ser Ser Phe

35 40 45

Gln Pro Glu Ala Gly Phe Gly Arg Arg Ala Ala Cys Thr Val Gln Arg

50 55 60

Tyr Ala Ala Cys Arg Asp Pro Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro

65 70 75 80

Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Leu Ser Pro Arg Ala Pro Ala Pro

85 90 95

Pro Pro Ala Gly Ala Leu Leu Pro Glu Pro Gly Gln Arg Cys Glu Ala

100 105 110

Val Ser Ser Ser Pro Pro Pro Pro Pro Cys Ala Gln Asn Pro Leu His

115 120 125

Pro Ser Pro Ser His Ser Ala Cys Lys Glu Pro Val Val Tyr Pro Trp

130 135 140

Met Arg Lys Val His Val Ser Thr Val Asn Pro Asn Tyr Ala Gly Gly

145 150 155 160

Glu Pro Lys Arg Ser Arg Thr Ala Tyr Thr Arg Gln Gln Val Leu Glu

165 170 175

Leu Glu Lys Glu Phe His Tyr Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg

180 185 190

Val Glu Ile Ala His Ala Leu Cys Leu Ser Glu Arg Gln Ile Lys Ile

195 200 205

Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Asp His Lys Leu Pro

210 215 220

Asn Thr Lys Ile Arg Ser Gly Gly Ala Ala Gly Ser Ala Gly Gly Pro

225 230 235 240

Pro Gly Arg Pro Asn Gly Gly Pro Arg Ala Leu

245 250

<210>2

<211>1173

<212>DNA

<213>Hordeum vulgare

<400>2

atggagcgcg tcttctccgt cgaggagatc cccgacccgt tctggggcca gccgtcgccg 60

cggcagcgcg ggcgccggcc gccggagggc gccatgaacc ggtgcccgtc cgagtggtac 120

ttccagaagt tcctcgagga ggccgtgctc gacagccccg ccgccgaccc tagcccgatg 180

tccggtgcta gcggacgagg tcaagcggcc tgccgtccgc gtggcgtggc ggggacggcg 240

acgggcccgg cggtggaccc ggtggagtac aacgccatgc tcaagcagaa gctcgagaag 300

gacctcgccg ccgtcgccat gtggagggcc tctggtgcca tgcctccaga acgttttgca 360

gctagtccgt catgcccaaa tgcagatggt cagcatatag gcactattaa tcccatagga 420

ggtaatgtgg ttccacttca aaacaagcta gctggtggcg caagcggggt gtcgggtcca 480

catctggtac aaaatgctga tgcccttgta aagcaagccg ctagctcttc ttcgcgggag 540

cagtcagaag atgatgatat ggaaggagaa gatgagatca ctgggaatgg ggtccctact 600

gatcaaaggc tgcggaggag gaagcaatcc aatcgggaat cggccaggcg ttcaagaagc 660

agaaaggcag ctcacctgaa tgaactcgaa gcacaggtat cacagttaag agttgaaaac 720

tcctcgctgt taaggcggct tgctgatgtt aatcagaaat acaatggtgc tgctgttgac 780

aatagggtgt taaaggcgga tgttgaaacc ttaagagcaa aggtgaagat ggccgaggac 840

tcggtgaagc gggtgacagg catgagcgct ctgttccctg cagggtccga catgtcatct 900

ctcagcatgc ccttcactgg ctctccatca gaagccacct ccgacgctgc gttcccggac 960

gacctgagcg cttacttctc cacaagcgag gctggaggta acaacggata catgcccgag 1020

atggcttcct cggcgcaaga ggatgacaac ttcctcaacg agaccatgga taccagcaag 1080

atgggcagac ccgactcgct gcatcgtgtg gcgagcctgg agcacctcca gaagaggatg 1140

tgcggcgggc cagcttcgtc cggatcgacc tca 1173

<210>3

<211>334

<212>DNA

<213>Hordeum vulgare

<400>3

ggccgaggac tcggtgaagc gggtgacagg catgagcgct ctgttccctg cagggtccga 60

catgtcatct ctcagcatgc ccttcactgg ctctccatca gaagccacct ccgacgctgc 120

gttcccggac gacctgagcg cttacttctc cacaagcgag gctggaggta acaacggata 180

catgcccgag atggcttcct cggcgcaaga ggatgacaac ttcctcaacg agaccatgga 240

taccagcaag atgggcagac ccgactcgct gcatcgtgtg gcgagcctgg agcacctcca 300

gaagaggatg tgcggcgggc cagcttcgtc cgga 334

<210>4

<211>1230

<212>DNA

<213>Hordeum vulgare

<400>4

atggagcccg tgttctcact gctggaggag gcgatgcccg agcccgactc taaccccggt 60

cggacctcgc cgccgcagct gcaggcacac gtgctcgccg gaggagtcag aggagcagga 120

ggagtgggcg tcggtgagat cgttggcgat ggcgcgacag aattgtgctt cgacaagtcc 180

atggaggagc cgtcgctgct caacgtcccc acggagccag tggcgaaccc ggacgcctcg 240

acgcttcacc ctaatcccac ggcggaggtg agccgcaaga ggcggtacga cgttcatgag 300

gaggaggagg tggtgggggt catccccacg ccgcctgcgg cgggcgcggt gctggacccc 360

gtgggctaca acgcgatgct gagacggaag ttggacgcgc atctcgccgc cgtcgccatg 420

tggaggacta ctcgaggaat ttgccgacaa agctcccatg acaatagagc atcacaaaat 480

ccagattcta tccaaggctc agaaaatcac actggagatg ctagtgtgca acaacttagc 540

tcttcctcat gggagccatc accatcggat gatgatatgg aaggggaggc acaaacaatt 600

ggaactatga atattagtgc agagaaagtg aacaaaagaa aagaatctaa ccgggattcg 660

gcgagacgct caaggagtag aaaagcagct catacgaagg aactagagga gcaagtctca 720

ctattaagag ttgcaaataa ctccttgatg agacatctag cagatgtaag tcacagatac 780

gtcaataccg ctattgacaa tagggtattg aaggcaaatg ttgaaaccct agaagcaaag 840

gtaaagatgg ccgaggaaac tatgaagaga attacatcca ccaacaattt cccccaagca 900

atatctggca tgtcatctct caggacccat ttcagtggtt cccaattgga tggcatcttt 960

gatactacat tgccaaccca aaacatgtca cttaaccatt tttccactac agcaacaaat 1020

tttgatgtga gcagcaacta catccccgag ctagctccgg cataccagat ccatgatcaa 1080

atatcttcgc tacatacgca acctatgcca tgcttggatc atcacccacg gaggatgccc 1140

tttggtattc caagtacatt ggtgcctacc ccacaacggg aatccactac attggattca 1200

aatgaaatag gcaacatggt gatgcagtag 1230

<210>5

<211>733

<212>DNA

<213>Hordeum vulgare

<400>5

gatactacat tgccaaccca aaacatgtca cttaaccatt tttccactac agcaacaaat 60

tttgatgtga gcagcaacta catccccgag ctagctccgg cataccagat ccatgatcaa 120

atatcttcgc tacatacgca acctatgcct gcttggatca tcacccacgg aggatgccct 180

ttggtattcc aagtacattg gtgcctaccc cacaacggga atccactaca ttggattcaa 240

atgaaatagg caacatggtg atgcagtagg aattatgtga gagacctgag ccggaattat 300

tattttaaaa taaatattgt cgttgttctt ggtggccatt gggggtattt gtaatggttt 360

ctcaccttgt taagctcaga cttgtttaag gccggccggg gccgaggact cggtgaagcg 420

ggtgacaggc atgagcgctc tgttccctgc agggtccgac atgtcatctc tcagcatgcc 480

cttcactggc tctccatcag aagccacctc cgacgctgcg ttcccggacg acctgagcgc 540

ttacttctcc acaagcgagg ctggaggtaa caacggatac atgcccgaga tggcttcctc 600

ggcgcaagag gatgacaact tcctcaacga gaccatggat accagcaaga tgggcagacc 660

cgactcgctg catcgtgtgg cgagcctgga gcacctccag aagaggatgt gcggcgggcc 720

agcttcgtcc gga 733

<210>6

<211>346

<212>DNA

<213>Hordeum vulgare

<400>6

ccgcggactg ggaatggggt ccctactgat caaaggctgc ggaggaggaa gcaatccaat 60

cgggaatcgg ccaggcgttc aagaagcaga aaggcagctc acctgaatga actcgaagca 120

ctcgagcagg tttgacaatt tacattgttg tttcttgact ggcagtggat tctgaaaaag 180

gcgctaatga gtttttgttg tggatggctc gttacaggtt agatcttgct tcgagttcat 240

tcaggtgagc tgcctttctg cttcttgaac gcctggccga ttcccgattg gattgcttcc 300

tcctccgcag cctttgatca gtagggaccc cattcccagt tctaga 346

<210>7

<211>358

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>synthesized portion of BLZ1 cDNA

<400>7

ccgcggacaa acaattggaa ctatgaatat tagtgcagag aaagtgaaca aaagaaaaga 60

atctaaccgg gattcggcga gacgctcaag gagtagaaaa gcagctcata cgaaggaact 120

agaggactcg agcaggtttg acaatttaca ttgttgtttc ttgactggca gtggattctg 180

aaaaaggcgc taatgagttt ttgttgtgga tggctcgtta caggttagat cttcctctag 240

ttccttcgta tgagctgctt ttctactcct tgagcgtctc gccgaatccc ggttagattc 300

ttttcttttg ttcactttct ctgcactaat attcatagtt ccaattgttt gttctaga 358

<210>8

<211>857

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>sequence encoding hpRNA，stem from both BLZ1 andBLZ2

<400>8

aagcttccgc ggactgggaa tggggtccct actgatcaaa ggctgcggag gaggaagcaa 60

tccaatcggg aatcggccag gcgttcaaga agcagaaagg cagctcacct gaatgaactc 120

gaagcaacaa acaattggaa ctatgaatat tagtgcagag aaagtgaaca aaagaaaaga 180

atctaaccgg gattcggcga gacgctcaag gagtagaaaa gcagctcata cgaaggaact 240

agaggactcg agcaggtttg acaatttaca ttgttgtttc ttgactggca gtggattctg 300

aaaaaggcgc taatgagttt ttgttgtgga tggctcgtta caggttagat cttcctctag 360

ttccttcgta tgagctgctt ttctactcct tgagcgtctc gccgaatccc ggttagattc 420

ttttcttttg ttcactttct ctgcactaat attcatagtt ccaattgttt gttgcttcga 480

gttcattcag gtgagctgcc tttctgcttc ttgaacgcct ggccgattcc cgattggatt 540

gcttcctcct ccgcagcctt tgatcagtag ggaccccatt cccagttcta gagaagcaga 600

tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat 660

gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat 720

gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc 780

gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat 840

gttactagat cgaattc 857

<210>9

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>synthesized primer

<400>9

ggaattccct tcgagtgccc gccgatttgc cagcaatgg 39

<210>10

<211>41

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>synthesized primer

<400>10

ataagaatgc ggccgcaatg aattgatctc tagttttgtg g 41

<210>11

<211>414

<212>DNA

<213>Hordeum vulgare

<400>11

ccttcgagtg cccgccgatt tgccagcaat ggctaacaga cacatattct gccaaaaccc 60

cagaacaata atcacttctc gtagatgaag agaacagacc aagatacaaa cgtccacgct 120

tcagcaaaca gtaccccaga actaggatta agccgattac gcggctttag cagaccgtcc 180

ctgttttgca aagctccaat tcctccttgc ttatccaatt tcttttgtgt tggcaaactg 240

cacttgtcca accgattttg ttcttcccgt gtttcttctt aggctaacta acacagccgt 300

gcacatagcc atggtccgga atcttcacct cgtccctata aaagcccagc caatctccac 360

aatctcatca tcaccgagaa caccgagaac cacaaaacta gagatcaatt catt 414

<210>12

<211>29

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>synthesized primer

<400>12

ggaattccat ggctaagcgg ctggtcctc 29

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>synthesized primer

<400>13

ggaattcctt gcaattggat aggtctcttg 30

<210>14

<211>3

<212>DNA

<213>Hordeum vulgare

<400>14

ggg 3

<210>15

<211>791

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>synthesized cDNA

<400>15

ccatggcaat gagctccttc ttgatcaact ccaactacgt ggatcccaag ttcccaccat 60

gcgaggagta ctcccaaagc gattacctcc ccagcgatca ttccccaggg tactacgccg 120

gcggccaaag gcgggagagc agcttccaac cagaggcagg cttcgggcgg cgcgcagcat 180

gcaccgtgca acgctacgca gcctgccggg atcccgggcc accaccccca ccaccacccc 240

caccaccacc cccaccaccc ccagggctgt ccccacgggc acccgcacca ccaccagccg 300

gggccctcct ccccgagcca ggccaacgct gcgaggcagt gagcagcagc ccaccacccc 360

caccatgcgc ccaaaaccca ctgcatccca gcccatccca ttccgcatgc aaggagccag 420

tggtgtaccc gtggatgcgc aaggtgcatg tgagcaccgt gaaccccaac tacgccggcg 480

gggagccaaa gcgctcccgg accgcctaca cccgccaaca agtgttggag ctggagaagg 540

agttccatta caaccgctac ctgacccggc gccggagggt ggagatcgcc catgcactct 600

gcctctccga gcgccaaatc aagatctggt tccaaaaccg gcgcatgaag tggaagaagg 660

atcataagtt gccaaacacc aagatccgct ccgggggggc agcaggctcc gccggggggc 720

ccccaggccg gccaaacggg ggcccacgcg cactcgacga cgacgacaag ccaaccccaa 780

cccaaccatg g 791

Claims

1.一种增强植物种子中目的异源多肽的表达和累积的方法，所述方法包括：

(a)用种子-特异性启动子的DNA序列转化植物细胞，所述启动子与编码一或多种转录调节因子(TF)或其部分，包括不同TF的嵌合组合可操作连接，调节一或多种编码种子贮藏蛋白的内源基因的转录，其中所述序列的转录链能够抑制、延缓或减少所述植物细胞中一或多种所述种子贮藏蛋白的表达，和

(b)选择没有被(a)中所述转录调节因子识别的顺式作用元件的种子-特异性启动子，和

(c)用(b)中的种子-特异性启动子的DNA序列转化(a)中的相同或其它的植物细胞，所述种子-特异性启动子与编码目的异源多肽的DNA序列可操作性连接；

(d)由所述转化的植物宿主细胞再生植物，并在使所述编码一或多种TF或其部分的DNA序列被转录的条件下培养所述植物，由此减少所述内源mRNA的表达，因此减少所述种子贮藏蛋白的表达，且由此增强所述异源目的多肽的表达和累积。

2.权利要求1的方法，其中编码一或多种转录调节因子(TF)或其部分的所述序列的转录链能够形成可抑制、延缓或减少所述植物细胞中一或多种所述种子贮藏蛋白的表达的“发夹”RNA。

3.权利要求1或2的方法，其中所述植物宿主细胞选自单子叶植物。

4.权利要求的方法3，其中所述植物宿主细胞选自包含大麦、玉米、小麦、燕麦和水稻的单子叶植物。

5.权利要求1或2的方法，其中步骤(a)的所述DNA序列和步骤(b)的所述DNA序列可操作地连接在一个DNA序列中。

6.权利要求1或2的方法，其中步骤(a)的所述DNA序列和步骤(b)的所述DNA序列导入到相同的植物细胞中。

7.权利要求1或2的方法，其中步骤(a)的所述DNA序列被导入到第一植物宿主细胞的基因组中，且其中所述步骤(b)的DNA序列被导入到第二植物宿主细胞的基因组中。

8.权利要求7的方法，其中由所述第一植物宿主细胞再生第一转基因植物并由所述第二植物宿主细胞产生第二转基因植物，且其中由所述第一和第二转基因植物间的有性杂交产生转基因植物的子代群体。

9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述一或多种种子贮藏蛋白是大麦的大麦醇溶蛋白。

10.权利要求1-9任一项的方法，其中编码目的异源多肽的所述DNA序列编码来自原核或真核生物的蛋白。

11.权利要求10的方法，其中编码目的异源多肽的所述DNA序列编码来自嗜热生物的蛋白。

12.权利要求10或11的方法，其中所述序列编码碳水化合物结合组件(CBM)。

13.权利要求10的方法，其中编码原核的或真核生物蛋白的所述DNA序列选自如下蛋白的DNA序列：胶原蛋白，胶原酶，同源盒多肽，单克隆抗体，分泌的抗体，单链抗体，甘露糖-结合的凝集素，胃蛋白酶，糜蛋白酶，胰蛋白酶，酪蛋白，人生长激素，人血清白蛋白，人胰岛素，纤维素酶，果胶酶，半纤维素酶，肌醇六磷酸酶，水解酶，过氧化物酶，纤维蛋白原，因子IX，因子XIII，凝血酶，蛋白C，木聚糖酶，异淀粉酶，葡糖淀粉酶，淀粉酶，溶菌酶，β-葡聚糖酶，葡糖脑苷脂酶，酪蛋白，乳糖酶，尿素酶，葡萄糖异构酶，转化酶，链霉亲和素，酯酶，碱性磷酸酶，蛋白酶抑制因子，胃蛋白酶，糜蛋白酶，胰蛋白酶，木瓜酶，激酶，磷酸酶，脱氧核糖核酶，核糖酶，磷脂酶，脂酶，漆酶，蛛丝蛋白，抗冻蛋白，抗微生物肽或防卫素，生长因子和细胞分裂素。

14.权利要求13的方法，其中编码真核生物蛋白的所述DNA序列为编码HoxB4蛋白的人同源盒B4(HoxB4)基因。

15.权利要求14的方法，其中所述HoxB4蛋白与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。

16.权利要求1-15任一项的方法，其中编码一或多种TF的所述DNA序列为包含两种或多种编码TF-s或其部分的DNA序列的区域的嵌合DNA序列。

17.权利要求1-16任一项的方法，其中所述编码TF或其部分的DNA序列包括编码来自bZIP蛋白的TF或其部分的区域。

18.权利要求17的方法，其中编码bZIP蛋白的所述DNA序列包括选自如下的DNA序列：

a)编码大麦BLZ1蛋白或其部分的DNA序列；

b)编码大麦BLZ2蛋白或其部分的DNA序列；

c)a)和b)的组合。

19.权利要求18的方法，其中所述DNA序列选自SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5及其任意的部分或组合。

20.权利要求1的方法，其中编码TF的所述DNA序列能够在所述植物细胞中表达发夹RNA(hpRNA)。

21.权利要求20的方法，其中编码TF的所述DNA序列包括编码来自bZIP蛋白的TF的区域或其部分。

22.权利要求21的方法，其中所述bZIP蛋白选自BLZ1，BLZ2以及BLZ1和BLZ2的嵌合组合。

23.权利要求22的方法，其中所述DNA序列包括选自如下的序列：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8及其任意的部分或组合。

24.可由权利要求1-23任一项的方法获得的转基因植物。

25.权利要求24的转基因植物，其中所述植物是大麦植物。

26.权利要求25的转基因大麦植物，在其基因组中具有：

a)编码种子-特异性启动子的DNA序列，所述启动子可操作连接于编码一或多种转录调节因子(TF)或其部分的DNA序列，所述转录调节因子包括不同TF的嵌合组合，调节一或多种编码种子贮藏蛋白的内源基因的转录，

b)没有被所述转录调节因子识别的顺式作用元件的种子-特异性启动子，所述启动子可操作连接于编码目的异源蛋白的DNA序列，

其中所述植物在其种子中表达所述异源蛋白且比相应的非-重组植物显著地表达较少的种子贮藏蛋白。