CN100342015C

CN100342015C - 一种柠条谷胱甘肽S－转移酶基因－CkGST及其应用

Info

Publication number: CN100342015C
Application number: CNB2005100042448A
Authority: CN
Inventors: 胡赞民; 胡军; 霍春月; 陈宇红; 尹维波; 苏晓华
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2005-01-14
Filing date: 2005-01-14
Publication date: 2007-10-10
Anticipated expiration: 2025-01-14
Also published as: CN1804040A

Abstract

本发明提供了一种新的CkGST基因。该基因来源于可以生长在沙漠中的灌木植物柠条(Caragana korshinskii Kom)。该基因编码谷胱甘肽S-转移酶。本发明还涉及含CkGST的载体、宿主细胞，以及CkGST基因在转化植物获得转基因植物中的应用。

Description

一种柠条谷胱甘肽S-转移酶基因-CkGST及其应用

技术领域

本发明涉及一种谷胱甘肽S-转移酶基因，具体地说，本发明涉及一种来源于可以生长在沙漠中的灌木植物柠条(Caragana korshinskii Kom)的谷胱甘肽S-转移酶基因，命名为CkGST。本发明还涉及该基因编码的蛋白----谷胱甘肽S-转移酶，含有CkGST的原核表达载体和植物表达载体，所表达蛋白的分离、纯化和酶活性检测，以及利用该基因转化植物。

背景技术

在植物受到外界逆境胁迫时(如盐胁迫、干旱胁迫、除草剂喷洒、重金属污染等)，都会导致植物体内反应活性氧(ROS)(如O₂、H₂O₂、O₂ ^·、OH^·等)的产生。而这些所产生的反应活性氧(ROS)具有很高的破坏性，其主要攻击细胞膜上脂类中的不饱和双键，产生自由基连锁反应，导致这类脂类化合物的过氧化，被裂解，对细胞产生毒害^【1】。

谷胱甘肽-S-转移酶(GST，E.C.2.5.1.18)作为一种多功能酶，主要用于催化还原型的谷胱甘肽(GSH)与疏水的、亲电的化合物发生亲电取代反应。在动、植物以及微生物中均有发现。由于其可催化植物细胞质中还原态GSH与亲电化合物发生发应，从而增加这类化合的水溶性、消除其亲电性，减少了细胞内亲电化合物对细胞膜的破坏性，具有减毒作用。在植物中，这类蛋白首先作为抗杀虫剂而获得研究。此外，来自某些植物的这类蛋白还具有过氧化酶活性，相信这类蛋白在抗冻、抗渗透胁迫和增强对除草剂所诱导的伤害抗性中，起着重要作用。该蛋白还可以作为结合蛋白或配体以分子伴侣的形式参与细胞胞质中物质的转运，其中已知的这类蛋白作为载体可以与如细胞分裂素、植物激素、花青素等相结合，参与这类物质的胞内运输。在所发现的植物众多GST中，发现这类蛋白受到外界的多种逆境胁迫因子的诱导，如2，4-D、乙烯、除草安全剂、重金属、热激胁迫、氧化胁迫、病原体以及干旱胁迫所诱导^【2，3】，且近年研究表明这类蛋白可作为分子伴侣参与细胞中花青素的转运，可调控花的颜色^【4】。

目前在大豆、拟南芥、小麦、玉米、烟草、豌豆等众多植物中均发现有GST的存在，且利用这类基因所获得的转基因植株可以表现出对除草剂、重金属胁迫的抗性^【5】。由于其可以催化还原态GSH对ROS的消除反应，其具有抗氧化性能力，而盐胁迫、干旱胁迫、低温胁迫均会导致ROS的产生，产生氧化胁迫。因此利用这类基因进行遗传转化，可以提高目标植物的抗逆性^【1】。目前尚未检索到来自灌木植物柠条的编码GST的基因CkGST。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种具有较强耐逆性的基因CkGST。该基因来源于可以在沙漠中生长的柠条(Caragana korshinskii Kom)，其cDNA核苷酸序列与其编码的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

本发明的另一个目的是提供一种含CkGST的表达载体，利用该表达载体转化的大肠杆菌细胞及利用该表达载体和大肠杆菌细胞表达GST蛋白。

本发明还提供了一种分离、纯化原核表达GST蛋白的方法。

本发明的再一个目的是提供一种利用CkGST培育转基因植株的方法，该方法包括用本发明的CkGST基因构建植物表达载体；用构建的表达载体转化植物组织；将转化的植物组织培育成植株。

本发明的又一个目的是提供一种含CkGST基因的植物表达载体。可使用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体。这些植物表达载体包括但不限于，双元农杆菌载体，例如pBIN19，pBI121，pB221，含DRE和/或ABRE元件的启动子以及用于单子叶植物微弹轰击的植物表达载体。

本发明的载体也可含有适当的启动子。在本发明中可使用任何一种强启动子。这些启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV 35S)、Ubiqutin、Actin启动子。它可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。

为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，包括加入植物可选择性标记。可使用的选择性标记包括对抗生素抗性的酶，抗生素包括庆大霉素、潮霉素、卡那霉素等。同样，可使用产生通过颜色变化(例如GUS)或发光(例如荧光酶)来识别的化合物的酶。另外，也可不用任何筛选标记。

本发明的表达载体可通过使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体，直接的DNA转化，微注射，电穿孔等导入植物细胞。

可使用本发明的方法转化的植物宿主包括单子叶植物和双子叶植物，所述单子叶植物例如小麦、玉米、水稻、禾本科牧草等，所述双子叶植物例如杨树、大豆、棉花、油菜等。

附图说明

图1.CkGST基因cDNA核苷酸序列，SEQ ID NO：1。

图2.CkGST基因所编码的氨基酸序列，SEQ ID NO：2。

图3.CkGST所编码的氨基酸序列功能域分析。

图4.CkGST原核表达蛋白SDS-PAGE电泳，泳道1为标准蛋白带，泳道2为未诱导的GST-pET28a原核蛋白带，泳道3为诱导1.5小时GST-pET28a原核表达蛋白带，泳道4为诱导19小时GST-pET28a原核表达蛋白带。

图5.CkGST原核表达纯化蛋白的SDS-PAGE电泳，泳道1为标准蛋白带，泳道2为纯化的GST原核表达蛋白带。

图6.CkGST原核表达蛋白的酶活性检测。

图7.CkGST植物表达载体图。

图8.农杆菌转染CkGST的毛白杨分化出的丛生芽。

图9.转入生根培养基的CkGST转基因毛白杨植株。

图10.移栽的CkGST转基因毛白杨植株。

图11.CkGST转基因毛白杨的PCR检测，泳道1为标准DNA带，泳道2为阴性对照，泳道3为阳性对照，泳道4-12为CkGST转基因毛白杨的PCR结果。

图12.CkGST转基因毛白杨植株的Western杂交结果，泳道1-2为所转化的阳性株，泳道CK为毛白杨的阴性对照，泳道3为所纯化的GST原核表达蛋白。

具体实施方式

下面通过参考实施例具体描述本发明，但本领域的普通技术人员可以理解的是，本发明并不局限于下述实施例。

实施例1.柠条CkGST基因的克隆与序列结构分析

以生长2-3月的柠条幼苗(中科院新疆吐鲁番沙漠植物园柠条种子萌发)为材料，用100uM ABA(Sigma公司)过夜诱导。取叶片，洗净后，放入经DEPC水处理、灭菌后的匀浆器中，加入TRIzol(Invitrogen)研磨、匀浆，室温放置5分钟。加入氯仿抽提两次，取上清，用异丙醇沉淀总RNA，空气干燥后，溶于DEPC水。以带polyT的引物进行逆转录获得cDNA，并进行RT-PCR(具体操作参见Kit DRR019A，Takara Biotech.(Dalian)Co.Ltd)。

poly T的引物序列如下：

5′-CGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTTTTTTTTTTTTTTTT-3′(SEQ IDNO：3)

RT-PCR反应条件如下：

DEPC水 85uL

Rnase抑制剂(40U/uL) 5uL

Oligo dT-引物 10uL

RNA 10uL

于65℃温浴10分钟，立即于冰上淬冷，然后加入

MgCl₂ 40uL

10XRNA缓冲液 20uL

dNTP混合物 20uL

AMV 10uL

总计 200uL

然后进行下列操作：

1. 30℃ 10min

2. 42℃ 1h

3. 99℃ 5min

4. 5℃ 5min

取适量(5uL)上述逆转录产物以下述引物(一条正向引物与一条polyT上引物组合)进行PCR扩增。

正向引物：

L15′-CCGGTTCTCATCCACAATGG-3′(SEQ ID NO：4)

反向引物：

R15′-CGAGCGGCCGCCCGGGCAGG-3′(SEQ ID NO：5)

PCR条件：

1. 95℃ 1min

2. 94℃ 30s

3. 60℃ 40s

4. 72℃ 2min 2 29个循环

5. 72℃ 10min

6. 4℃ 终止

将PCR产物连接到pMD18-T载体(Takara Biotech.(Dalian)Co.Ltd)上用于测序，获得含3’端序列部分GST序列。再以此序列为模板序列设计以下引物分别从逆转录反应片段(上述逆转录产物)中进行5’RACE扩增，获得基因5’端序列。具体方法操作参见BD Biosciences Clontech的BDSMART^TM RACE cDNA Amplification Kit(Cat.No.634914)，并作如下改进。

以前面所合成的cDNA采用末端转移酶(TdT)(Takara Biotech.(Dalian)Co.Ltd)进行5’加C。

反应体系

cDNA 10uL

5XTdT缓冲液 10uL

0.1％BSA 12.5uL

10mM dCTP(终浓度2mM) 10uL

ddH₂O 5.5uL

总计 48uL

于94℃2-3分钟，在冰上淬冷，加入2uL TdT，轻柔混合均匀，37℃温育20min，然后65℃10分钟灭活TdT。进行5’RACE PCR。

左端5’引物序列

5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG-3′(SEQ ID NO：6)

右端5’引物序列

5′-CTCTGATAAGGATCAGAAGGCAACAAGGG-3′(SEQ ID NO：7)

PCR反应体系为：

模板 1uL

左端5’引物(10uM) 1uL

右端5’引物(10uM) 1uL

ddH₂O 7uL

PremixTaq(Takara Biotech.(Dalian)Co.Ltd) 10uL

PCR程序如下：

1. 95℃ 2min

2. 94℃ 20s

3. 72℃ 3min 2 4个循环

4. 94℃ 30s

5. 55℃ 30s

6. 72℃ 2min 2 29个循环

7. 72℃ 10min

8. 4℃ 终止

获得5’端序列。PCR产物连接到pMD18-T载体(Takara Biotech.(Dalian)Co.Ltd)上用于测序。经拼接后，设计以下特异性引物用PCR扩增获得基因cDNA全长。

正向引物(含BamH I酶切位点，其识别序列以下划线表示).

5′-CGCC GGATCCATGGCAAATGAGGTGG-3′(SEQ ID NO：8)

反向引物(含Sac I酶切位点，其识别序列以下划线表示)

5′-CGAG GAGCTCTACTCAATGCCAAACCTCT-3′(SEQ ID NO：9)

PCR反应后，将PCR产物连接到pMD18-T载体(Takara Biotech.(Dalian)Co.Ltd)上测序，获得了CkGST的全长cDNA。该基因mRNA全长为995bp，含有660bp开放阅读框架，编码219个氨基酸组成的多肽(SEQID NO：2)，其5′端为77bp，3′端为243bp。该基因所编码的蛋白含有GST类基因的N端(GSH结合位点)和C端(底物如CDNB结合位点)结构域(见图3)。

实施例2、用于转化的原核表达载体的构建及原核表达

利用PCR技术以CkGSTcDNA为模板，在CkGSTcDNA编码区域两端，引入Sac I和Xho I酶切位点。

所用引物为：

左端引物(含Sac I酶切位点，其识别序列以下划线表示)：

5’-ATCT GAGCTCATGGCAAATGAGGTGGTTCTG-3’(SEQ ID NO：10)

右端引物(含Xho I酶切位点，其识别序列以下划线表示)：

5’-TCAT CTCGAGCTACTCAATGCCAAACCTCTTTC-3’(SEQ ID NO：11)

PCR反应条件为：

a)95℃ 2min

b)94℃ 30s

c)60℃ 40s

d)72℃ 2min 2 29循环

e)72℃ 10min

f)4℃ 中止

将扩增得到的PCR产物采用Sac I和Xho I双切，加T4连接酶，与已用这两个酶双切好的原核表达载体pET28a片段相连(Novagen公司)，即获得GST-pET28a，经IPTG在大肠杆菌中诱导表达(具体操作参见Novagen公司pET system manual)。所表达蛋白的SDS-PAGE(浓缩胶5％，分离胶15％)检测表明该基因能够在大肠杆菌中进行体外翻译表达。而未经诱导的菌株没有蛋白表达带出现(见图4)。如图4所示，Marker为标准蛋白；CK为空载pET28a大肠杆菌诱导蛋白带；后两条为1.5小时和19小时诱导表达蛋白带。可见利用IPTG诱导的大肠杆菌中GST-pET28a，在31Kd处可以表达出诱导蛋白带。

实施例3、原核表达的CkGST蛋白分离及酶活检测

鉴于所克隆、表达的基因为CkGST，故采用GST磁珠(Promega的MagneHis^TM Protein Purification System，Cat.V8500)进行分离、纯化细菌表达的CkGST蛋白。

具体纯化操作如下：

1.诱导500ml的菌液，收集菌体。用无菌水洗一到两次。

2.将所收集的菌体于-20℃速冻15-20分钟。

3.加入100ml的细胞裂解液(cell lysis Reagent)，在室温下轻柔混匀裂解三十分钟。

4.超声破碎细胞至溶液透明(超声3s，间隔3-5s，工作次数100-200次，400w)。

5. 16000Xg离心40min，取上清。

6.取50ml混匀GST磁珠(Promega)，加入125ml的洗涤液(Binding/WashBuffer)，洗涤磁珠。用磁架吸附，弃上清。重复洗涤3-5次。

7.加入50ml吸附液(Binding/Wash Buffer)和前面菌体裂解液(100ml)，于低温4℃轻柔混匀30分钟进行吸附。用磁架捕获磁珠，弃上清。

8.加125毫升洗涤液(Binding/Wash Buffer)，于室温轻柔混匀洗涤5分钟，再用磁架捕获。重复洗涤一次。

9.最后加入10毫升的洗脱液(Elution Buffer)。室温温育，轻柔混匀15分钟，洗脱目的蛋白。

10.用磁架捕获磁珠，收集上清，获得纯化蛋白。

其中所用的细胞裂解液、洗涤液和洗脱液组成如下：

1)细胞裂解液(Cell lysis solution)

30mM Tris-Cl(pH 7.1)

0.1mM EDTA

20％(m/v)蔗糖

2)结合/洗涤液(Binding/Wash Buffer(pH 6.9))

4.2mM Na₂HPO₄

2mM K₂HPO₄

140mM NaCl

10mM KCl

(配制后为pH 8.0，用HCl调至pH 6.9)

3)洗脱液(Elution Buffer)

GSH终浓度50mM

Tris终浓度50mM

图5是经GST Tag分离、纯化所获得的CkGST蛋白的SDS-PAGE(浓缩胶5％，分离胶15％)电泳图片。该蛋白与原核表达载体pET28a上所诱导获得的蛋白大小一致，位于蛋白Marker 31Kd左右。

体外所表达蛋白CkGST酶活性检测

为了能确证CkGST的功能，利用GST类酶可以催化CDNB与GSH间的亲和反应。CDNB与GSH反应所生成的物质在340nm附近有强吸收峰，据此可对所克隆获得的CkGST体外原核表达蛋白酶活性进行定性检测^【6，7】。

具体操作如下：在1200微升总体积底物溶液中，CDNB(Sigma公司)终浓度为4mM，GSH(华美生物公司)终浓度为5mM，加入300微升经过超声破碎后的全菌蛋白或约100ng/20uL纯化蛋白(在pH 6.5的磷酸盐缓冲液里)，观测340nm处吸光度的变化。以底物溶液为参照物，对加有CkGST酶反应液进行定性扫描。采用紫外光度扫描300nm-420nm。扫描图见图6。蓝色(如图6中(2)扫描曲线所示)为加有所表达CkGST酶的活性检测液的吸收扫描图谱。红色(如图6中(1)扫描曲线所示)为不含所表达CkGST酶的活性检测液扫描图谱。可见加有目的蛋白的检测液在340nm处有吸收峰，由此表明体外原核所表达的蛋白具有GST类酶活性，证实了所克隆的CkGSTcDNA所编码的蛋白具有GST类酶活性。

实施例4、用于转化的植物表达载体的构建

CkGST植物表达载体的构建按常规分子生物学手段进行(参见“精编分子生物学实验指南”2001，科学出版社，颜子颖，王海林译)。以CkGST编码区域cDNA为模板，使用上述正向和反向引物进行PCR扩增，通过在正向引物中引入BamH I位点和反向引物中引入Sac I位点，将其插入pBI121双元表达载体^【8】中的CaMV 35S启动子后面，得到一个双元表达载体。其图谱如图7所示，经BamH I和Sac I酶切、PCR鉴定插入片段无误后，转入农杆菌LBA4404^【9】，再提质粒，酶切、PCR确认。该表达载体可直接用于植物的转化。

实施例5、CkGST基因在杨树中的转化

1.毛白杨转化材料的繁殖

1)诱导叶片再生芽：

将毛白杨(毛白杨#66，来自河北农业大学)的无菌叶片背面间隔约0.5cm垂直于叶柄方向划伤口，背面贴紧分化培养基，正面向上培养。

分化培养基(诱导叶片再生芽)

Y1：MS₀+玉米素0.5mg/L+IBA 0.25mg/L+IAA 0.25mg/L

2)扩繁培养：

直接切茎，保留叶片，插入扩繁培养基，伤口部位再分生长出新芽。

扩繁培养基Y2：MS₀+6BA0.5mg/L

3)生根培养：

直接切茎，保留叶片，插入生根培养基，伤口部位生根，植株长大。

生根培养基Y3：MS₀+NAA0.2mg/L+VB₁ 10mg/L

注：MS₀为MS基本培养基，玉米素、IBA、IAA、6BA、NAA和VB₁购自北京耀北生物技术有限公司。

2.农杆菌的培养

将含有pGST的农杆菌接种到20ml(30mg/L链霉素、50mg/L卡那霉素)YEP液体培养基中，28℃，220rpm摇菌16-18h，使农杆菌培养至对数期，OD₆₀₀值0.6-0.8。

取菌液1-2mL转入40mL不含抗生素的YEP中，28℃，220rpm摇菌过夜。

3.转化

将菌液倒入无菌培养皿中(40mL/per)，把刚划好伤口的叶片，放入菌液中侵染10-20min后，用无菌水漂洗一下，将叶片上的菌液用灭菌滤纸稍吸干，转入不加抗生素的MS₀培养基上。浸染过的叶片接种在MS₀培养基上，平放并稍捻入培养基，28℃暗处共培养2-4天，直至可看见农杆菌菌斑。

4.选择培养：

立即将共培养的、可看见农杆菌菌斑的转化叶片放入含抗生素(羧苄青霉素500mg/L、卡那霉素50mg/L)的筛选分化培养基中，筛选培养3-4周。待出芽后，转入含抗生素(羧苄青霉素500mg/L、卡那霉素50mg/L)的生根培养基中。图8是农杆菌转染的毛白杨分化出的丛生芽(60天)。图9为从分化出的丛生芽长成的转基因毛白杨植株(60天)。图10为移栽的转基因毛白杨植株。

实施例6、转基因毛白杨植株的检测

1.CkGST转基因毛白杨的PCR检测

提取转基因毛白杨植株的DNA(加入RNAase消化RNA)，利用上述正向和反向的CkGST引物进行PCR扩增。图11是PCR所扩增出的凝胶图。其中1为Marker；2为毛白杨的阴性对照；3为CkGST质粒的阳性对照；4-12为转基因杨树。可见获得了接近0.7kb PCR扩增片段(CkGST完整的阅读框全长为660bp)，由此可判断CkGST已转入了杨树基因组中。

2.转化植株的Westernbloting

利用GST Tag大量纯化细菌表达的CkGST蛋白，经透析、浓缩得到500ug/ml的蛋白5ml。免疫注射兔子，获得一抗兔血清，二抗是以碱性磷酸酶标的羊抗兔IgG(华美公司)。提取PCR鉴定阳性转化植株蛋白、对照植株蛋白和原核表达的纯化蛋白，SDS-PAGE(浓缩胶5％，分离胶15％)胶电泳，转膜，按常规方法进行免疫显色杂交，用NBT/BCIP显色。

具体操作如下：

1.将所提取转基因植物蛋白、阴性植株蛋白(对照植株蛋白)及纯化蛋白SDS-PAGE胶电泳。

2. 60伏特电转膜3小时，于缓冲液TBS-T里平衡10分钟。

3.用5％脱脂奶粉的杂交液封阻1小时。

4.缓冲液TBS-T洗膜2-3次。

5.在含5％脱脂奶粉中加入一抗(用TBS-T按1∶1000稀释)，4℃杂交过夜。

6.缓冲液TBS-T洗膜2-3次。

7.加入含二抗(用TBS-T按1∶500稀释)新鲜杂交液于室温杂交1-2小时。

8.缓冲液TBS-T洗膜2-3次。

9.于10mL显示液中，暗处室温显色2-5分钟。

杂交液：

TBS-T

1L的TBS-T中Tris-HCl(pH7.6，1M)20ml，NaCl 8g，加去离子水至1L，最后加Tween-201ml

转膜溶液：

1L缓冲液中

25mM Tris pH 8.3，192mM甘氨酸，200ml甲醇，0.25％-0.1％SDS

检测溶液：

Tris 12.1g，NaCl 5,84g，MgCl₂·6H₂O 20.35g

调pH 9.5

显色液：

200微升NBT/BCIP(Roch公司)加在10毫升检测液里

结果如图12。其中1、2为转化植株。CK为未转化的植株，3为阳性对照，即为纯化的GST蛋白。杂交结果说明在转化植株1，2中所转入的CkGST表达出了相应的蛋白。

参考文献：

1.Blokhina O et al.(2003)Antioxicants，oxidative damage and oxygendeprivation stress：a review.Annals ofBotany 91：179-194.

2.Marrs KA(1996)The functions and regulation of glutathioneS-transferases in plants.Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.47：127-158.

3.Xu FX et al.(2002)Tandemly duplicatied safener-induced glutathioneS-transferase genes from Triticum tauschii contribute to genome-andorgan-specific expression in hexaploid wheat.Plant Physiology130：362-373.

4.Larsen ES et al.(2003)A carnation anthocyanin mutant is complementedby the glutathione S-transferases encoded by maize Bz2 and petunia An9.Plant Cell Reptor 21：900-904.

5.Ezaki B et al.(2000)Expression of aluminum-induced genes in transgenicArabidopsis plants can ameliorate aluminum stress and/or oxidative stress.Plant Physiology 122：657-665.

6.袁亚莉，邓健，许金生(2002)催化动力学光度法测定血清中谷胱甘肽S-转移酶.数理医药学杂志15(6)：564-565。

7.刘小丽，廖祥儒，赵立梅，陈彤，刘强，孟虎(2003)GST酶的提取纯化及特性分析.河北大学学报23(2)：170-174。

8.Chen PY，Wang CK，Soong SC，To KY(2003)Complete sequence of thebinary vector pBI121 and its application in cloning T-DNA insertion fromtransgenic plants.Molecular Breeding 11：287-293.

9.Hoekema A，Hirsch PR，Hooykaas PJJ，Schilperoort RA(1983)A binaryplant vetor strategy based on separation of vir-and T-region of theAgrobacterium tumefaciens Ti-plasmid.Nature 303：179-180.

IBO50162-序列表

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>一种柠条谷胱甘肽S-转移酶基因-CkGST及其应用

<130>IB050162

<160>11

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>660

<212>DNA

<213>柠条(Caragana korshinskii Kom)

<400>1

atggcaaatg aggtggttct gctagatttt tggccaagtc cttttgggat gaggctaagg 60

atagcccttg ctgaaaaggg tatcaagtat gagtacaaag aggaagacct gaggaacaag 120

agccccttgc tgttacaaat gaacccggtt cacaagaaaa tcccggttct catccacaat 180

gggaaacccg tttgtgaatc tctgatagct gttcagtaca tcgatgaggt gtggagtgat 240

agatctccct tgttgccttc tgatccttat cagagagcac aggctagatt ctgggctgat 300

tatgttgaca aaaagatata tgaagttgga aggaatgttt ggactaaaaa aggagaggaa 360

caagaagctg ccaagaagga attcatagat gcactcaaat tgttggagga acagttggga 420

gacaagacat attttggagg ggaaaagctt ggctatgtgg atatagcatt aatcccattc 480

tacacctggt ttaaagccta tgaggtattt ggcaacctta atatagaaaa ggaatgtccc 540

aagttcatta cttgggccaa gagatgcatg cagattgaga acgtttccag gtctcttcct 600

gaccagcata aggtctatga gttcattgtg gagatcagaa agaggtttgg cattgagtag 660

<210>2

<211>219

<212>PRT

<213>柠条(Caragana korshinskii Kom)

<400>2

Met Ala Asn Glu Val Val Leu Leu Asp Phe Trp Pro Ser Pro Phe Gly

1 5 10 15

Met Arg Leu Arg Ile Ala Leu Ala Glu Lys Gly Ile Lys Tyr Glu Tyr

IBO50162-序列表

20 25 30

Lys Glu Glu Asp Leu Arg Asn Lys Ser Pro Leu Leu Leu Gln Met Asn

35 40 45

Pro Val His Lys Lys Ile Pro Val Leu Ile His Asn Gly Lys Pro Val

50 55 60

Cys Glu Ser Leu Ile Ala Val Gln Tyr Ile Asp Glu Val Trp Ser Asp

65 70 75 80

Arg Ser Pro Leu Leu Pro Ser Asp Pro Tyr Gln Arg Ala Gln Ala Arg

85 90 95

Phe Trp Ala Asp Tyr Val Asp Lys Lys Ile Tyr Glu Val Gly Arg Asn

100 105 110

Val Trp Thr Lys Lys Gly Glu Glu Gln Glu Ala Ala Lys Lys Glu Phe

115 120 125

Ile Asp Ala Leu Lys Leu Leu Glu Glu Gln Leu Gly Asp Lys Thr Tyr

130 135 140

Phe Gly Gly Glu Lys Leu Gly Tyr Val Asp Ile Ala Leu Ile Pro Phe

145 150 155 160

Tyr Thr Trp Phe Lys Ala Tyr Glu Val Phe Gly Asn Leu Asn Ile Glu

165 170 175

Lys Glu Cys Pro Lys Phe Ile Thr Trp Ala Lys Arg Cys Met Gln Ile

180 185 190

Glu Asn Val Ser Arg Ser Leu Pro Asp Gln His Lys Val Tyr Glu Phe

195 200 205

Ile Val Glu Ile Arg Lys Arg Phe Gly Ile Glu

210 215

<210>3

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

(400>3

cgagcggccg cccgggcagg tttttttttt tttttt 36

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

IBO50162-序列表

<400>4

ccggttctca tccacaatgg 20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cgagcggccg cccgggcagg 20

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ggccacgcgt cgactagtac gggggggggg 30

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ctctgataag gatcagaagg caacaaggg 29

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

cgccggatcc atggcaaatg aggtgg 26

<210>9

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

cgaggagctc tactcaatgc caaacctct 29

<210>10

IBO50162-序列表

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

atctgagctc atggcaaatg aggtggttct g 31

<210>11

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

tcatctcgag ctactcaatg ccaaacctct ttc 33

Claims

1.一种谷胱甘肽S-转移酶基因，其特征在于来源于柠条(Caraganakorshinskii Kom)，并具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的基因所编码的谷胱甘肽S-转移酶，其特征在于具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.一种表达载体，其特征在于包含权利要求1所述的基因。

4.权利要求3所述的表达载体，其为双元农杆菌载体或植物表达载体。

5.权利要求4所述的表达载体，其中所述的植物表达载体含DRE和/或ABRE元件的启动子。

6.一种宿主细胞，其特征在于包含权利要求3所述的表达载体。

7.权利要求6所述的宿主细胞，其为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

8.权利要求1所述的基因在转化植物获得转基因植物中的应用。

9.权利要求8所述的应用，其中所述植物选自单子叶植物或双子叶植物。

10.权利要求9所述的应用，所述单子叶植物选自由小麦、玉米、水稻和禾本科牧草组成的组，所述双子叶植物选自由杨树、大豆、棉花和油菜组成的组。

11.权利要求1所述的基因在提高植物抗逆境胁迫中的应用。

12.权利要求11所述的应用，其中所述逆境胁迫选自由盐胁迫，干旱胁迫，除草剂喷洒，重金属污染组成的组。

13.一种培育转化权利要求1所述基因的植株的方法，包括构建含权利要求1所述基因的植物表达载体；用所述构建的表达载体转化植物细胞；和将转化的植物细胞培育成转基因植株。