CN1319989C - 一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因及应用该基因增强植物抗逆性的方法。本发明提供的增强植物抗逆性的方法，是将植物抗逆性相关蛋白的编码基因插入真核细胞表达载体，得到含有所述植物抗逆性相关蛋白编码基因的重组表达载体，将该重组表达载体导入目的植物，从表达所述植物抗逆性相关蛋白的植株或所述植物抗逆性相关蛋白表达量增加的植株中筛选得到抗逆性增强的植株；其中，所述植物抗逆性相关蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明的植物抗逆性相关蛋白及其编码基因可增强植物抗逆性，特别是增强植物对盐胁迫的抗性。

Description

一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

盐渍化土壤在世界上的面积分布很广，据不完全统计，全世界约有3.8亿hm²不同程度的盐渍化土壤，约占可耕地面积的10％左右。中随着人口的增长、工业污染的加剧、不合理的灌溉、化肥使用不当等原因，次生化盐渍土壤面积还在扩大，对于粮食产量和种植面积构成新的威胁。

目前，国际上改良和利用大面积的盐渍化土壤有两条基本的途径：一是通过农业工程措施改良土壤，降低土壤盐分，改善土壤环境，缓解作物生长的胁迫条件；其二是走生物学路线，挖掘、培育耐盐作物品种或开发利用有价值的盐生植物资源以改良土壤。前者需要花费大量的人力、物力、财力，成本太高，且难以保持持久。在耕地面积日益减少，盐碱地逐年增加的形式下，淡水资源严重不足的情况下，走生物学路线，培育耐盐作物品种是改良和利用盐碱地资源最经济、最有效的措施之一，这对盐碱地区尽快建立合理的地貌结构，提高作物产量都具有重要的意义，也是长远而有效地利用盐碱化土壤资源的一条根本途径。

逆境胁迫下，脯氨酸作为渗透保护物质在植株抗逆生理中起着重要的作用，脯氨酸不仅是植物体内的重要能源，作为氮源、碳源，还作为渗透调节物质，在植物抵御渗透胁迫中起着重要作用。吡咯啉-5-羧酸合成酶(Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS)，作为脯氨酸生物合成的谷氨酸途径的限速酶，其全长cDNA序列已在羽扇豆、拟南芥、碗豆和水稻等植物中克隆，羽扇豆P5CS转化烟草结果表明，过量表达羽扇豆P5CS基因促进烟草脯氨酸的含量增加，盐胁迫下与对照比烟草生物量增加，抗胁迫能力增强。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因。

本发明所提供的植物抗逆性相关蛋白，名称为TaP5CS(Δ1-pyrroline-5-carboxylatesynthetase)，其来源于小麦，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。

其中，序列表中的序列2由716个氨基酸残基组成。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述植物抗逆性相关蛋白编码基因(TaP5CS)也属于本发明的保护范围。

上述植物抗逆性相关蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

其中，序列表中的SEQ ID №：1由2260个脱氧核苷酸组成，自5′第109位至2259位脱氧核苷酸为编码序列。

含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明的第二个目的是提供一种利用该基因增强植物抗逆性的方法。

本发明所提供的增强植物抗逆性的方法，是将上述植物抗逆性相关蛋白编码基因插入真核细胞表达载体，得到含有所述植物抗逆性相关蛋白编码基因的重组表达载体，将该重组表达载体导入目的植物，从表达所述植物抗逆性相关蛋白的植株或所述植物抗逆性相关蛋白表达量增加的植株中筛选得到抗逆性增强的植株。

所述真核细胞表达载体可为Ti类质粒载体和病毒载体，优选为pCAMBIA3301。

所述重组表达载体可为将所述植物抗逆性相关蛋白编码基因插入去除GUS基因的pCAMBIA3301得到的pCAMBIA3301-TaP5CS。

所述转化方法可为农杆菌介导转化法、基因枪介导转化法或花粉管通道法，优选为农杆菌介导转化法。

植物中的上述植物抗逆性相关蛋白编码基因的表达。

本发明的TaP5CS基因可通过现有的方法构建到真核细胞表达载体，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(BAR基因、GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。携带有本发明的TaP5CS基因或其反义核酸的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。

TaP5CS基因有两个表达高峰，TaP5CS基因是受盐胁迫诱导表达的，Northern blot和半定量RT-PCR分析表明，在盐胁迫2个小时，表达量即增强，随后减弱，盐胁迫12小时，表达量又上升到一个高峰，以后表达量稍有下降。TaP5CS基因在小麦根和叶片表达也是不同的，尽管根是先接触盐胁迫的部位，但是在盐胁迫后2个小时TaP5CS在根中的表达量并未明显增强，而在叶中胁迫2个小时达到高峰，而后下降，在胁迫12小时又达到高峰，根在12小时达到高峰后表达量有下降，24小时和叶片水平相当，96、168小时的表达高于叶片。伴随P5CS基因的表达脯氨酸含量增加，耐盐的小麦茶淀红的叶片在盐胁迫后24小时，脯氨酸有明显的增加，以后脯氨酸大量积累，到胁迫后156小时达到5mg/gFW。小麦脯氮酸的积累落后于TaP5CS基因的表达，这和其它植物如拟南芥、水稻是一样的(Savoure A，JaouaS，Hua X J.Isolation，characterization，and chromosomal location of a geneencodingthe P5CS in Arabidopsis thaliana，FEBS Letters，1995，372：13-19；Igwrashi.Charaterization of the gene for pyrroline carboxlate synthetase and correctionbetween the expression of the gene and salt tolerance in oryza satioa L.Plant Mol.Biol.，1997，33(5)：857-865)。说明TaP5CS基因是受盐胁迫诱导表达的基因。通过Southernbot分析表明，TaP5CS基因是2个拷贝的基因，这和人类、番茄、拟南芥的结果是一致的，TaP5CS基因是能够促进脯氨酸的合成积累。

小麦TaP5CS基因在拟南芥中的Northern blot的结果表明，在正常情况下，小麦TaP5CS基因在拟南芥中高效表达，盐、PEG和ABA胁迫进一步加强小麦TaP5CS基因转录本的积累，也促进了脯氨酸的积累。尽管小麦为单子叶植物，拟南芥为双子叶植物，小麦TaP5CS基因在拟南芥中的异源表达不仅是高效表达，而且确实增加了拟南芥的耐盐性。根长的实验结果表明，在50mM的NaCl胁迫下，表达小麦TaP5CS基因的拟南芥转基因植株根的伸长几乎不受影响，而对照的生长被抑制了20-25％，在100mM的NaCl胁迫下表达的转基因植株生长被抑制了30％，而对照抑制了50％。表达的转基因植株不仅根的长度长于对照，而且根的生物量增加，侧根增多，这些结果和羽扇豆VuP5CS基因在烟草的过量表达结果一致。

拟南芥苗期耐盐性的鉴定结果表明盐逆境下，表达小麦TaP5CS基因可促进植株的生长，生物量增加，株高和干重均高于野生型对照和空载体对照。可溶性蛋白和叶绿素是评价植物耐盐性的重要生理指标，结果表明：在盐胁迫下，在拟南芥中表达TaP5CS基因，在50和100mMNaCl胁迫下，促进了拟南芥可溶性蛋白的合成，在200mM NaCl的高浓度盐胁迫下稳定蛋白的合成。在拟南芥中表达TaP5CS基因，在50和100mM NaCl胁迫下，叶绿素含量均为上升趋势，在200mM NaCl的高盐胁迫下，叶绿素含量降低，而空载体对照在低盐胁迫下，叶绿素含量下降，在高盐胁迫下，下降幅度更大。说明在拟南芥幼苗早期和苗期表达TaP5CS基因均能增加拟南芥的抗盐性，表达不仅增加了拟南芥的抗盐性，对拟南芥的开花期也有影响，无论盐胁迫还是正常生长情况下，表达小麦TaP5CS基因的使得拟南芥苗期延长，莲座叶增大，但是叶片叶色淡，而空载体和野生型叶片小，叶色绿，叶绿素含量高。

为了验证小麦TaP5CS基因的功能又进行了反义表达的实验。反义表达的长片段P5CS-2151包含整个ORF，和拟南芥的AtP5CSA的核苷酸有63.3％的一致性，和AtP5CSB的核苷酸有40％的序列一致性。短片段位置P5CS-262从+1396bp到+1658bp，属于谷氨酸-半醛脱氢酶的保守域。P5CS-262的核苷酸序列和AtP5CSA有62％一致性，和AtP5CSB有58％的一致性，但是它包含133bp的一段区域和AtP5CSA和AtP5CSB分别有79％和81％的一致性。反义表达的结果表明，在T1代长片段P5CS-2151的反义表达没有短片段P5CS-262的反义表达症状明显。反义表达的T1代转基因植株在株型和植株大小上与野生型没有明显的区别，但反义表达的转基因株系茎干变细，后期变为红色，果荚变小，每荚的种子数变少，但种子变大，果荚颜色暗红，而对照果荚皮色为乳白色，果荚大，荚内种子数多，T1代的实验结果说明反义表达抑制了内源AtP5CS的表达，由于小麦TaP5CS基因和拟南芥的AtP5CS在谷氨酸激酶和谷氨酸-半醛脱氢酶两个保守域氨基酸序列并不太一致，所以反义表达并没有完全抑制内源AtP5CS基因的表达。反义表达能够部分抑制AtP5CS基因的活力，使转基因植株抗盐能力降低，根长的实验结果表明，盐胁迫下反义表达的转基因株系根长生长被抑制，而且反义表达的P5CS-262比反义表达的P5CS-2151被抑制的作用更大。盐胁迫下脯氨酸的测定结果表明，反义表达抑制了脯氨酸的合成。无论在正常情况下还是盐胁迫条件下，反义表达的P5CS-262转基因株系脯氨酸含量都比对照低，但在低盐胁迫下，反义表达的P5CS-2151比对照含量高，可能是盐胁迫诱导了鸟氨酸合成途径或对内源AtP5CS基因的活力只是部分抑制。本发明通过遗传转化在模式植物拟南芥中进行表达功能验证，表明该基因在拟南芥中的表达能够促进脯氨酸的合成积累，可溶性蛋白的合成，从而提高植物的耐盐性。

本发明的植物抗逆性相关蛋白及其编码基因可增强植物抗逆性，特别是增强植物对盐胁迫的抗性。

附图说明

图1为TaP5CS基因cDNA的RT-PCR电泳分析。

图2为不同植物P5CS基因的进化树。

图3为小麦TaP5CS基因推测的氨基酸序列与水稻拟南芥P5CS基因序列的比较分析图。

图4为小麦TaP5CS基因的Sourthern blot分析图。

图5为用中国春小麦的缺四体和端体对小麦TaP5CS基因的Sourthern blot定位分析图。

图6为小麦TaP5CS基因的Northern blot分析图。

图7为小麦TaP5CS基因的半定量RT-PCR分析图。

图8为盐胁迫促进小麦叶片脯氨酸的积累点线图

图9为pCAMBIA3301载体部分酶切图。

图10为小麦TaP5CS基因表达载体pCAMBIA3301-TaP5CS。

图11为表达载体pCAMBIA3301-TaP5CS的酶切图。

图12为转化的植株在含7mg/L PPT的MS培养基平板上筛选图。

图13为转基因植株的PCR验证图。

图14为转基因植株的Southern blot验证图。

图15小麦TaP5CS基因促进拟南芥莲座叶的生长图。

图16为转基因植株的Northern blot杂交分析图。

图17为过量表达小麦TaP5CS基因增加逆境胁迫下，转基因拟南芥叶片的脯氨酸含量分析图。

图18为不同盐胁迫对转基因苗根伸长的影响图。

图19为盐胁迫16天的转基因植株的生长情况图。

图20为盐胁迫对可溶性蛋白含量的影响。

图21为盐胁迫对叶绿素含量的影响。

图22为pCAMBIA3301-P5CS-2151和pCAMBIA3301-P5CS-262的扩增。

图23为pCAMBIA3301-P5CS-2151的酶切鉴定图谱。

图24为pCAMBIA3301-P5CS-262的酶切及PCR鉴定图谱。

图25为转pCAMBIA3301-P5CS-2151植株的PCR验证图。

图26为转pCAMBIA3301-P5CS-262植株的PCR验证图。

图27为T1代反义表达植株的生长状况图。

图28为盐胁迫处理18天对转pCAMBIA3301-P5CS-2151和pCAMBIA3301-P5CS-262苗根长的影响图。

图29为盐胁迫对转pCAMBIA3301-P5CS-2151和pCAMBIA3301-P5CS-262叶片脯氨酸含量的影响点线图。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。

T0表示由拟南芥农杆菌蘸花侵染得到的转基因植株，T1表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株，T2表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、TaP5CS及其编码基因的获得

以100-200mg中国地方小麦茶淀红叶片为材料，用Trizol方法提取总RNA，经1％琼脂糖电泳检测RNA的完整性。ss cDNA的合成按照SuperScriptTM II RNase H-ReverseTranscriptase的方法，合成单链(ss)cDNA。通过NCBI数据库检索到水稻的OsP5CS基因的全长序列(登陆号为AY574031)，以水稻的OsP5CS基因序列为探针，Blast小麦的EST数据库，设计了一对引物，正向引物P5CSF为5′CTGCGGCGACGAGGAAAATACACT3′，反向引物P5CSR为5′TCATTGCAAAGGAAGGCTCT3′。以反转录得到的cDNA为模板，通过RT-PCR扩增小麦的P5CS基因，PCR反应条件如下：先94℃ 5分钟；然后按照如下条件进行30个循环：94℃ 30秒，64℃ 4分钟；最后72℃延伸15分，4℃保温。扩增完的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳结果如图1所示，结果表明扩增到了2kb左右的条带。图1中，中间泳道为PCR产物，两侧的泳道为DNA分子量标准(200bp)。电泳完毕在紫外灯下切下目的条带，用琼脂糖凝胶试剂盒纯化后与pGEM-T Easy载体连接，将连接产物进行热激转化大肠杆菌TOP10，含50μg/ml羧苄青霉素的LB平板上，37℃培养9-12小时，挑取单菌落大量培养，提质粒并用EcoR I酶切鉴定。挑选酶切正确的14个质粒，用BigDyeTM Dye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction Kit方法测序，因为克隆得到的基因大约为2.1Kb，为了使核酸序列准确可靠，在用T7(5′TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG3′)和SP6(5′ATT TAG GTG ACA CTA TAG AA3′)测序后，根据得到的序列，又设计合成了2对测序引物如下：P5CS1F：5′TGGGCTGATGGCACTCTATGAC3′和P5CS1R：5′TCAGCATGGCCAAGAACAGGAATC3′；P5CS2F：5′GAGACAAGTCCCGTGTTGGT3′和P5CS2R：5′ATGCGCAACAGGCCCACAATAAAG3′。测序所用仪器为XL3730 DNA analyzer(ABI)。测序结果表明，该片段大小是2260bp。它具有序列表中序列1的DNA序列，自5′第109位至2259位脱氧核苷酸为编码序列，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的TaP5CS。

用TaP5CS的基因序列和其它植物P5CS的基因序列进行blast比对，结果表明TaP5CS基因和水稻OsP5CS，拟南芥AtP5CSA、AtP5CSB，猕猴桃AdP5CS，大豆GmP5CS，羽扇豆VuP5CS基因分别有84％，69％，69％，72％，70％，44％的序列一致性。系统发育分析发现，TaP5CS基因和水稻的OsP5CS基因关系最近，和羽扇豆的VuP5CS基因关系最远(图2)。用TaP5CS的氨基酸序列在NCBI数据库进行保守域比对，TaP5CS有完整的哺乳动物和植物P5CS基因的保守域：γ-GK激酶结构域和γ-GSA脱氢酶区域。和拟南芥、水稻比较，在谷氨酸激酶域(γ-Glu-5-kinase domain)和拟南芥AtP5CSA比有7个氨基酸的变异，和AtP5CSB比有6个氨基酸的变异，而且部分变异位点在AtP5CSA和AtP5CSB间是不同的。和水稻OsP5CS比较，在谷氨酸激酶域有5个变异位点。在谷氨酸-半醛脱氢酶(γ-GSA-DH domain)区域和AtP5CSA比，有6个氨基酸位点的变异，和AtP5CSB也有6个位点的变异，其中有5个位点的变异在两个拟南芥基因间是相同的。小麦TaP5CS基因和水稻OsP5CS有两个氨基酸的变异位点。谷氨酸激酶和谷氨酸-半醛脱氢酶保守域比较说明这两个保守域在拟南芥、水稻和小麦之间是不保守的，P5CS拟南芥和小麦之间的一致性小于小麦和水稻之间的一致性。此外，小麦TaP5CS基因有假定的亮氨酸保守域，这个部位P5CS在拟南芥、水稻和小麦之间的氨基酸序列一致性也很差。图3表明TaP5CS在γ-GK激酶和GSA脱氢酶区域2个保守域内氨基酸变化较大。图3中I为ATP结合位点(自序列2的氨基端第59位至第66位氨基酸残基)；II为Glu-5-kinase domain(自序列2的氨基端第232位至第255位氨基酸残基)；III为NADPH-bindingdomain(自序列2的氨基端第428位至第467位氨基酸残基)；IV为putativeleu domain(自序列2的氨基端第558位至第586位氨基酸残基)；V为conserbved GSA-DH domain(自序列2的氨基端第648位至第684位氨基酸残基)。

TaP5CS和拟南芥、水稻、猕猴桃、松叶菊等植物的P5CS比，在自序列2的氨基端第125位和128位分别有保守的天冬氨酸(Asp，D)和苯丙氨酸(Phe，F)这两个位点是脯氨酸反馈抑制作用位点，通过氨基酸序列比对，已克隆到的所有植物的P5CS在该位点均为天冬氨酸(Asp，D)和苯丙氨酸(Phe，F)，说明脯氨酸反馈抑制位点在不同植物中是很保守的(Hong ZL，Lakkineni K，Zhang Z H，et al.Removal of feedback inhibition of ％1-pyrroline-5-carboxylate synthetase results in increased proline accumulation and protectionof plants fromosmotic stress.Plant Physiol.，2000，122：1129-1136)，而这两个位点和E.coil及酵母不同，说明植物和微生物的差异。通过氨基酸序列比较发现所有的植物P5CS均是ATP和NADPH依赖的有共同的ATP和NADPH结合位点。小麦和拟南芥基因结构的分析说明尽管P5CS基因是脯氨酸生物合成途径的基因，双功能酶，都有完整的保守域，但是保守域内部在不同植物间氨基酸有变异，氨基酸的变异可能引起基因功能的差异。

实施例2、Southern blot分析及基因的定位分析

分别提取六倍体小麦中国春(Chinese spring)、2倍体乌拉尔图小麦(T.urartu)A基因组、拟斯卑尔脱(Ae.speltoides ssp spelroide)S基因组、粗山羊草(Ae.squarrosa sspstrangulate)D基因组的DNA，用HindIII、EcoR I、EcoRV酶切，酶切的DNA低压电泳(1V/cm)10小时，电泳结束后，以小麦TaP5CS的cDNA为探针进行Sourthern blot分析。结果如图4所示，表明用EcoR I酶切，六倍体小麦为3条带，A、B、D基因组均为2条带；EcoRV酶切中国春为4条带，A基因组为2条带，S和D基因组为2条带，Hind III酶切均为2条带，由此推断小麦TaP5CS基因可能是两个拷贝。图4中，1为六倍体小麦中国春(Chinese spring)、2为二倍体乌拉尔图小麦(T.urartu)A基因组、3为二倍体拟斯卑尔脱(Ae.speltoides sspspeltoide)S基因组、4为二倍体粗山羊草(Ae.squarrosa ssp strangulate)D基因组。以小麦TaP5CS基因的cDNA作为探针，与中国春小麦的缺四体DNA膜进行同位素杂交，对基因进行定位分析，结果如图5所示，表明小麦TaP5CS基因是定位在2B染色体上。图5中N表示缺失的染色体，T表示补上的染色体。

实施例3、TaP5CS基因的表达分析

(1)Northern blot分析：将生长一叶一心的小麦茶淀红幼苗的根系置于250mM的NaCl胁迫处理0、2、8、12、24、96小时后提取叶片的总RNA，按照Sambrook的方法进行Nornthern杂交。其中，探针为TaP5CS的全长cDNA基因，用³²P-dCTP进行标记。结果如图6所示，表明小麦的TaP5CS基因是受盐胁迫诱导的，在正常生长情况下，小麦的TaP5CS基因表达量很低，在盐胁迫后2小时表达量增强，8小时下降，但表达量高于对照(未经盐胁迫处理的生长30天的小麦茶淀红幼苗)，12小时表达量增强，24小时表达量又达到高峰，96小时表达量仍高于对照。

(2)半定量RT-PCR

将生长一叶一心的小麦茶淀红幼苗的根系置于250mM的NaCl溶液分别处理0、2、4、8、12、24、96、168小时后，分别提取根和叶的总RNA，用SuperScriptTM Rnase H Reverase IIITranscriptase(Invitrogen)直接反转录为cDNA。首先用组成型表达的Tubulin的特异引物扩增，以调cDNA的浓度一致。Tubulin正向引物5′AGAACAGTGTTGTAAGGCTCAAC3′，反向引物为5′GAGCTTTACTGCCTCGAACATGG3′；反应条件为：先94℃ 5min；再25个循环(94℃ 30sec；55℃ 30sec；72℃ 1min)；然后72℃延伸15min，15℃保温。将不同样品的起始cDNA浓度调节一致后，以P5CS特异的引物对P5CSF和P5CSR扩增全长cDNA。程序为：先94℃ 5min；然后22个循环(94℃ 30sec；64℃ 4min)；再72℃延伸15min，15℃保温。结果如图7所示，表明：盐胁迫下小麦叶片TaP5CS基因在2小时表达量增强，4小时，8小时表达量又下降但稍高于对照，盐胁迫处理12小时表达量增加到最大量，而后表达量下降，但是都高于对照。盐胁迫下小麦根P5CS基因表达量在2小时没有明显增加，在4、8小时表达量有所下降，盐处理12小时表达量增强，24、96小时根的表达量仍然很高，168小时稍有下降。

实施例4、脯氨酸含量的测定

将生长至一叶一心的小麦茶淀红幼苗的根系置于250mM的NaCl溶液分别处理0、4、8、12、24、72、156小时后，采用茚三酮法测小麦叶片脯氨酸的含量。小麦叶片中脯氨酸含量的变化如图8所示，表明正常情况下，小麦叶片脯氨酸含量很低；随盐胁迫处理时间的延长，叶片脯氨酸含量增加，但在胁迫24小时之前增加的速度缓慢；胁迫24小时后，脯氨酸含量直线增加，到72小时增加到2.0mg/g干重；胁迫6.5天增加到4.8mg/g干重。这表明小麦叶片脯氨酸含量受盐胁迫的诱导而积累。

实施例5、TaP5CS基因在拟南芥中的表达

1、表达载体的构建

小麦TaP5CS基因在编码序列的起始密码前有Nco I位点，所以设计修饰引物时仅在反向引物P5CSNR加Nhe I识别序列，正向引物为P5CSF，反向引物为P5CSNR，序列如下：P5CSF：5’CTGCGGCGACGAGGAAAATACACT3’，P5CSNR：5’AT GCTAGCTCATTGCAAAGGAAGG3’(带下划线的序列为Nhe I识别序列)。以中国地方小麦茶淀红叶片为材料，用Trizol方法提取总RNA，经1％琼脂糖电泳检测RNA的完整性。ss cDNA的合成按照SuperScriptTM II RNase H-ReverseTranscriptase的方法，合成单链(ss)cDNA。以反转录得到的cDNA为模板，利用P5CSF和P5CSNR通过RT-PCR扩增小麦的TaP5CS基因。其中，PCR反应程序为：先94℃ 5分钟；30个循环(94℃ 30秒，64℃ 4分钟，)；再72℃延伸15分，15℃保温。扩增完的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳。电泳完毕在紫外灯下切下目的条带，用琼脂糖凝胶试剂盒纯化(购自天为时代)后与pGEM-T Easy连接，将连接产物进行热激转化大肠杆菌TOP10，含50μg/ml羧苄青霉素的LB平板上，37℃培养9-12小时，挑取单菌落大量培养，提质粒并用Nco I和NheI双酶切质粒进行鉴定，挑选酶切得到2260bp片段的质粒用BigDye Dye Terminator方法测序。将含有2260bp的TaP5CS基因的pGEM-T Easy命名为pGEM-T-TaP5CS。

载体pCAMBIA3301(CAMBIA，Australia)(有两个Nhe I识别位点)先用Nco I完全酶切，再用Nhe I部分酶切，载体的部分酶切见图9，泳道M是DNA标准分子量(1Kb)，泳道1是线性化的pCAMBIA3301，泳道2和3是pCAMBIA3301的部分酶切。回收去GUS基因的载体条带，得到去GUS基因的9293bp的载体片段。用Nco I和Nhe I双酶切含有TaP5CS基因cDNA序列的质粒pGEM-T-TaP5CS，得到起始密码子前带有Nco I酶切位点和终止密码子后带有Nhe I酶切位点的小麦TaP5CS基因全长片段，将该片段连接到经部分酶切去除GUS基因的9293bp的pCAMBIA3301载体上(流程如图10)，构建的载体转化大肠杆菌TOP10(购自北京天为时代科技有限公司)和根癌农杆菌GV3101。分别提取转化的大肠杆菌TOP10和根癌农杆菌GV3101中的质粒，均用Nco I和Nhe I，Bgl II和Nco I分别酶切鉴定。构建正确的载体用Nco I和Nhe I酶切后为3条带，分子量分别为5847bp，3421bp，2151bp；因小麦TaP5CS基因在+1768bp处有Bgl II的酶切位点，所以构建正确的载体用Bgl II和Nco I酶切后应为2条带，分别为9676bp和1768bp的片段。图11中，1，3，5泳道为Bgl II和Nco I酶切，有1768bp和9676bp2条带；2，4，6泳道为Nco I和Nhe I酶切的质粒，有5847bp，3421bp，2151bp 3条带。将得到的构建正确的表达载体命名为pCAMBIA3301-TaP5CS。

2、转pCAMBIA3301-TaP5CS拟南芥的获得

(1)转化

含有pCAMBIA3301-TaP5CS的根癌农杆菌GV3101通过蘸花侵染的方法转化拟南芥。由于pCAMBIA3301-TaP5CS带有抗除草剂的Bar基因，它在转化时能随目的基因一起转入植物体，所以可以用含有PPT的培养基平板对转化的植株进行筛选。

(2)平板筛选

T1代种子经0.5％的次氯酸钠消毒后，无菌水冲洗3遍，播种在含有0.7％的PPT除草剂的MS平板上，4℃春化3天，正常生长4天，结果如图12所示，转化后得到的T1代种子，转基因苗含有抗除草剂的Bar基因，在含有PPT的培养基上能旺盛生长；非转化苗在含PPT的培养基上不能正常生长、枯萎。图12中，其中图片A是B的放大照片，箭头示转基因苗。转基因苗移栽到营养土中后能正常生长。转基因苗转接到MS平板上复壮3天后，移栽到土中。通过除草剂筛选，得到了45株抗除草剂的转基因植株，在T1代，转基因植株(阳性植株)和野生型对照及空载体对照植株(转pCAMBIA3301的拟南芥植株)在植株形态和开花时间上没有差异，只是转基因植株的叶片比对照植株更绿。

(3)PCR筛选

提取平板筛选获得的转基因植株的基因组DNA，用TaP5CS基因的修饰引物(P5CSNR和P5CSF)和Bar基因的引物分别进行PCR扩增，反应条件如下：

小麦TaP5CS基因的扩增：用TaKaRa LA-Taq酶进行目的基因的扩增。10μl反应体系如下：基因组DNA 1.6μl(20μg/ul)，2×PCR缓冲液5.0μl，dNTP(25mM)0.16μl，P5CSNR和P5CSF各2μl(2μm)，LA-Taq酶0.1μl，ddH2O 1.14μl共10μl。反应程序为：先94℃，5min；再30个循环(94℃1min，64℃ 4min)；然后72℃，20min；15℃保温。

抗除草剂基因(Bar)的扩增：用上海promega公司提供的Taq酶，20μl的反应体系10×PCR缓冲液2.0μl，dNTP(25mM)0.16μl，Mg²⁺(25mM)1.44μl，Bar基因的引物各3.2μl(2.0mM)，基因组DNA 4μl(20μg/ul)，ddH₂O 5.8μl共20μl。反应程序为：先94℃，5min；再22个循环(94℃ 30sec，68℃ 2min，)；然后72℃20min；15℃保温。

阳性植株因为转入了表达载体，所以应能够扩增出2200bp和400bp的目的条带，而未转化植株则无PCR产物。转pCAMBIA3301的植株只能扩增出400bp的Bar基因条带，扩增产物的电泳图如图13所示，图中A为小麦TaP5CS基因的扩增；B为除草剂Bar基因的扩增，泳道1，2，3，4，7，8，9，10，11，12为转小麦TaP5CS基因的植株；6，13，14为野生型对照；5为转空载体对照(转pCAMBIA3301的植株)；M为200bp的marker。表明阳性植物中转入了表达载体。

(4)转化植株进行Southern blot检测。

为了进一步证实PCR鉴定的准确性，对PCR检测阳性的植株进行了Southern blot检测分析，用TaP5CS的cDNA全长作探针。不同的转化株系用EcoRI完全酶切，16小时，电泳转膜杂交。Southern blot的结果如图14所示，表明不同的株系转化基因的拷贝数不同，转基因株系12，14，16均为3个拷贝，株系18和株系40为1个拷贝，株系17为2个拷贝，株系19为多个拷贝。图中泳道1和10是野生型对照，泳道2和11是转空载体对照(转pCAMBIA3301的植株)，其它泳道为转pCAMBIA3301-TaP5CS株系，其中泳道3为(35S：TaP5CS-12)，泳道4为(35S：TaP5CS-18)；泳道5为(35S：TaP5CS-14)；泳道6为(35S：TaP5CS-16)；泳道7为(35S：TaP5CS-17)；泳道8为(35S：TaP5CS-19)；泳道9为(35S：TaP5CS-40)。

(5)T2代转基因植株的筛选

T2代转基因种子播在含有7mg/L PPT的MS培养基上4℃春化3天，22℃条件下光照培养4天。结果表明T1代幼苗自交后产生的T2代种子在含有PPT的MS培养基上生长，带有外源基因TaP5CS和除草剂Bar基因的植株能够成活，统计结果表明有2/3的幼苗成活。

成活的T2代转基因植株和空载体对照(转pCAMBIA3301的T2代植株)相比，T2代转基因植株莲座叶片肥大，而转pCAMBIA3301的T2代植株莲座叶片小，T2代转基因植株整个生育期长于空载体对照。此外，T2代转基因植株分枝能力强，植株生长茂盛，如图15所示，其中A图是B图莲座叶片的放大；35S：TaP5CS为成活的T2代转基因植株，p3301(CK)为转pCAMBIA3301的T2代植株。

(6)Northern blot分析

为了进一步证实小麦TaP5CS基因在拟南芥中是否表达及表达后是否和逆境胁迫相关，进行了Northern blot杂交分析。方法如下：T2代转TaP5CS基因的植株和转pCAMBIA3301的植株(p3301)，播种在含7mg/L PPT的MS培养基上，4℃处理3天，光照培养4天，将能够成活的幼苗转移到不含PPT的MS培养基上，正常生长6天。野生型的种子直接播种到MS培养基上生长10天。分别将野生型，转pCAMBIA3301的植株和TaP5CS转基因植株的根系置于250mM的NaCl，50mM的ABA和8％的PEG 6000胁迫处理14小时，同时以未经胁迫处理的植株作为对照(Control)。用Trizol试剂提取拟南芥的叶片总RNA，进行Northern blot分析。其中，探针为TaP5CS的全长cDNA基因，用³²P-dCTP进行标记。结果如图16所示，图中A为转空载体对照(转pCAMBIA3301的植株，p3301)；B为野生型(WT)；C为转基因株系14(35S：TaP5CS-14)；D为转基因株系16(35S：TaP5CS-16)，从图中可以看出，在正常生长情况下，P5CS在转TaP5CS以南芥中就表达很强，只是不同的株系表达量不同，转基因株系14(35S：TaP5CS-14)表达量强于转基因株系16(35S：TaP5CS-16)，而野生型(WT)和转pCAMBIA3301的植株没有表达。在250mM的NaCl胁迫14小时后，转基因35S：TaP5CS-14和35S：TaP5CS-16的P5CS表达量大大增强，而空载体和野生型对照内源拟南芥P5CS基因只有微量的表达。在50mM ABA胁迫下，转基因株系的35S：TaP5CS-14和35S：TaP5CS-16的转录水平高于非胁迫处理，野生型对照和转pCAMBIA3301的植株内源拟南芥P5CS基因仅有微量的表达。在PEG6000胁迫条件，35S：TaP5CS-16的P5CS转录水平大大增强，35S：TaP5CS-14杂交信号强度和非胁迫处理相当，35S：TaP5CS-14的初始RNA量远远低于p3301，所以尽管35S：TaP5CS-14杂交信号和转pCAMBIA3301的植株杂交信号相当，但是35S：TaP5CS-14的表达水平高于转pCAMBIA3301的植株和野生型的内源拟南芥P5CS基因的表达量。在50mM ABA胁迫条件下，转录水平高于对照但低于盐胁迫。小麦TaP5CS在拟南芥中的表达分析表明，在35S强启动子的作用下，小麦TaP5CS在拟南芥中高效表达，而且小麦TaP5CS基因的转录在盐、ABA、PEG6000胁迫下有较高水平的积累。

实施例6、转TaP5CS基因拟南芥的抗逆性鉴定

1、脯氨酸含量的分析

为了验证表达小麦TaP5CS基因是否增加脯氨酸的合成，进行了不同胁迫处理条件下的脯氨酸含量的测定。T2代转TaP5CS基因的植株和转pCAMBIA3301植株，野生型，按照实施例5中步骤2的(6)的方法分别用250mM的NaCl，50mM的ABA和8％的PEG6000进行胁迫处理14小时，进行脯氨酸含量的测定。脯氨酸含量的测定采用茚三酮法(Bates L S.Rapiddetermination of free proline for water stress studies.Plant Soil，1973，39：205-207)。结果如图17所示，表明表达TaP5CS的拟南芥植株，无论在盐、PEG、ABA的胁迫下均促进脯氨酸的积累，而转pCAMBIA3301植株(p3301)和野生型(WT)对照无论在盐胁迫还是PEG、ABA胁迫下脯氨酸积累量都很小。表达TaP5CS的拟南芥株系，在PEG胁迫下脯氨酸积累量大于盐胁迫，盐胁迫大于ABA胁迫下脯氨酸的积累。在不同的胁迫条件下转TaP5CS基因植株脯氨酸含量均高于野生型对照(WT)和转pCAMBIA3301植株。

2、耐盐性鉴定及生理指标的测定

1)盐胁迫对幼苗早期根长的影响：

在含7mg/L PPT的MS培养基上生长4天的T2代转TaP5CS基因幼苗和转pCAMBIA3301植株以及在不含PPT的MS培养基上生长4天的野生型拟南芥幼苗，同时转移到不同浓度的NaCl培养基上(0，5，100，200mM)，生长10天拍照，测定根长。盐胁迫抑制拟南芥根的伸长如图18所示，图中B从A中选择的代表性植株；1，2，3分别为野生型(WT)，转TaP5CS基因株系16(35S：TaP5CS-16)和转pCAMBIA3301植株(空载体对照)。盐胁迫处理10天，在50mMNaCl的胁迫下，野生型和空载体对照根的伸长速率约为正常条件下的75％和80％，而转TaP5CS基因植株的根仍保持非胁迫处理条件下的生长速率(表1)；在100mM的中盐胁迫下野生型和空载体转基因植株根的伸长为对照的50％，而转基因35S：TaP5CS-16为对照的67％；在200mM的NaCl胁迫下，转TaP5CS基因植株和对照根的伸长速率均被严重的抑制，叶片变红，甚至白化，转转TaP5CS基因植株基因植株和野生型及空载体对照比，根的伸长速率仍有明显的差异。而且对照植株有更多的白化苗。

                                      表1盐胁迫对根长的影响

	0mM NaCl	50mM NaCl	100mM NaCl	200mM NaCl
					WT	5.25a±0.22	3.94a±0.25	2.62a±0.13	0.39a±0.08
转pCAMBIA3301植株	5.23a±0.33	4.26a±0.13	2.65a±0.11	0.30a±0.08
					35S：TaP5CS-16	5.16a±0.22	5.18b±0.32	3.47b±0.18	0.53b±0.02

注：小写字母不同的表示差异显著

2)盐胁迫对株高的影响

在MS培养基上生长10天的T2代转TaP5CS基因幼苗和转pCAMBIA3301(p3301)植株以及在不含PPT的MS培养基上生长10天的野生型拟南芥幼苗，移栽到7cm的方形营养钵中，培养条件为长日照16小时光照/8小时黑暗。移栽12天，进行盐处理，处理浓度为50，100，200mM NaCl，处理16天，选择代表性的植株测量株高后，地上部在105℃杀青10分钟，70℃烘至恒重，称干重。并采用张宪政(张宪政.作物生理研究法.北京：农业出版社，1992，148-192)的方法测莲座叶叶绿素含量，采用Bradford的方法(F.奥斯伯等.精编分子生物学实验指南.科学出版社.2001，332-333)测定叶片可溶性蛋白含量，以牛血清蛋白(BSA)为标准蛋白。

株高测量结果如图19所示，在正常情况下，表达小麦TaP5CS基因对拟南芥植株的高度没有显著的影响；在盐胁迫条件下，株高受到影响，在不同的盐浓度胁迫下，差异均达显著水平，而且随盐胁迫程度的加重，植株高度受抑制的程度加重。图19中，图中A为OmM NaCl胁迫，B为50mM NaCl胁迫，C为100mM NaCl胁迫，D为200mM NaCl胁迫；1为转基因株系16(35S：TaP5CS-16)，2为野生型(WT)，3为转pCAMBIA3301植株。由表2的数据得知，在50mM NaCl的低盐胁迫下，野生型和转pCAMBIA3301植株株高分别被抑制达9.3％和18.9％，而转基因35S：TaP5CS-14仅降低4.4％，35S：TaP5CS-16增加1.2％，在200mM NaCl的高盐胁迫下，野生型和空载体对照(转pCAMBIA3301植株)株高分别降低33％和29.2％，而转基因株系35S：TaP5CS-14和35S：TaP5CS-16降低18.3％和15.1％，显著高于转空载体和野生型的对照。

                     表2盐胁迫对拟南芥转基因植株高度(cm)的影响

	0mM NaCl	50mM NaCl	100mM NaCl	200mM NaCl
					WT	26.90a±1.0403	24.38a±0.9351	23.25a±1.5299	18.00a±1.0913
转pCAMBIA3301植株	29.97a±2.0600	24.30a±1.8000	23.30a±0.1255	21.20a±1.714
					35S：TaP5CS-14	30.84a±1.1900	29.47b±0.4660	27.30b±0.8566	25.16b±0.7505
35S：TaP5CS-16	30.58a±1.5000	30.97b±0.9350	28.15b±1.4935	25.95b±0.8017

注：小写字母不同的表示差异显著

干重测量结果如表3所示，表达小麦TaP5CS基因增加了拟南芥植株的干重，在正常生长条件下，转TaP5CS的转基因植株的干重和野生型及空载体植株有显著的差异，在不同浓度的盐胁迫下，差异仍达显著水平。在50mM的NaCl胁迫下，和非盐胁迫下比，野生型和空载体对照干重分别下降了21％和14％，而转基因株系35S：TaP5CS-14和5S：TaP5CS-16分别增加了6.0％和5.5％；在中度盐(100mM)胁迫下，野生型和空载体对照分别下降了39.8和41.5％，而转基因株系35S：TaP5CS-14仅下降了12.3％，35S：TaP5CS-16没有下降；在200mM的高盐胁迫下，野生型下降了50.8％的干重生物量空载体对照下降了47.4％的干重生物量，而转基因转基因株系35S：TaP5CS-14仅下降了23.6％，35S：TaP5CS-16缩减了32.3％。

                           表3盐胁迫对拟南芥转基因植株干重的影响

	0mM NaCl	50mM NaCl	100mM NaCl	200mM NaCl
					WT	0.1540a±0.0169	0.1075a±0.0058	0.0927a±0.0052	0.0757a±0.0029
转pCAMBIA3301植株	0.1255a±0.0138	0.1210a±0.0153	0.0733a±0.0018	0.0660a±0.0033
					35S：TaP5CS-14	0.2710b±0.00237	0.2880c±0.0166	0.2376b±0.0359	0.2070b±0.0125
35S：TaP5CS-16	0.2242b±0.0142	0.2366b±0.0125	0.2256b±0.0184	0.1513b±0.0122

注：小写字母不同的表示差异显著

可溶性蛋白含量的测定结果如图20所示，在正常情况下，TaP5CS转基因拟南芥叶片可溶性蛋白含量低于转空载体pCAMBIA3301(p3301)对照和野生型(WT)，野生型和空载体可溶性蛋白分别为9.5mg/g干重和7.1mg/g干重，转基因株系14(35S：TaP5CS-14)和转基因株系16(35S：TaP5CS-16)分别为6.9和5.64mg/g干重。在50mM的低盐胁迫下，转基因植株可溶性蛋白含量高于对照，和对照比转基因株系14(35S：TaP5CS-14)和转基因株系16(35S：TaP5CS-16)分别提高了45.36％和27.14％，而野生型和空载体对照降低了16.94％和5.71％。在100mMNaCl胁迫下，转TaP5CS基因植株可溶性蛋白含量继续增加，而空载体和野生型对照继续下降。在200mM的高盐胁迫下，野生型和空载体对照分别下降了39.28％和15.45％，而转基因株系14(35S：TaP5CS-14)恢复到对照水平，而株系16(35S：TaP5CS-16)仍高于对照。

叶绿素含量测定的结果如图21所示，正常情况下，转TaP5CS基因植株叶绿素含量低于转空载体的对照和野生型对照(WT)，在50mM的低盐胁迫下，转基因和非转基因植株叶绿素含量均升高，野生型叶绿素上升幅度大于转TaP5CS基因植株，空载体对照上升幅度小于转基因株系14(35S：TaP5CS-14)和16(35S：TaP5CS-16)。在100mM的NaCl胁迫下，野生型和空载体叶绿素含量分别下降了26.65％和21.83％，而转基因株系14(35S：TaP5CS-14)和16(35S：TaP5CS-16)叶绿素含量继续上升，和对照比分别增加了11.74％和17.56％。在200mM的NaCl胁迫下，野生型和空载体叶绿素含量大幅度下降，和对照比分别下降了48.97％和53.93％，转基因株系14(35S：TaP5CS-14)则下降了26.00％，株系16(35S：TaP5CS-16)保持对照水平。

实施例7、小麦TaP5CS基因在拟南芥中的反义表达

(1)反义TaP5CS表达载体的构建

TaP5CS基因反义表达长片段P5CS-2151含有TaP5CS完整的ORFcDNA全长序列。正向引物含有Nhe I酶切位点，反向引物含有Nco I酶切位点。正向引物anti-P5CS1F为：

5′AT GCTAGCATGGCCGGCGCCGACCCCAAC3′，反向引物anti-P5CSlR为：

5′TA CCATGGTCATTGCAAAGGAAGGCTCT3′。PCR反应体系为：先94℃5min；然后28个循环(94℃30sec，60℃1min，70℃4min)；再72℃延伸15min，15℃保温。TaP5CS反义表达基因P5CS-262含有小麦TaP5CS基因的γ-谷氨酸磷酸还原酶(Gamma-glutamyl phosphatereductase)的保守域，位置从+1396bp到+1658bp，正向引物含有Pml I酶切位点，反向引物含有Bgl II酶切位点。正向引物anti-P5CS2F为5’CT CACGTGGCCTTATTACAACTAGAGAT3’(自序列1的5′端第1397到1416位核苷酸)，反向引物anti-P5CS2R为5’ATA AGATCTTTATGAACAAGCAACG3’(自序列1的5′端第1643到1658位核苷酸)；PCR反应体系为：先94℃5分min；28个循环(94℃30sec，57℃1min，70℃2min)；再72℃延伸15min，15℃保温。扩增得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，结果如图22所示，其中A为P5CS-2151的扩增结果；B为P5CS-262的扩增结果。TaP5CS基因反义表达长片段P5CS-2151和短片断P5CS-262经PCR扩增分别获得带有Nco I和Nhe I酶切位点2151bp及带有Pml I和Bgl II酶切位点262bp的片段。电泳完毕在紫外灯下切下目的条带，用琼脂糖凝胶试剂盒纯化(购自天为时代)。纯化后连到pGEM-T Easy载体上，分别用Nco I和Nhe I及PmlI和Bgl II双酶切鉴定，分别对Nco I和Nhe I酶切得到2151bp、Pml I和Bgl II酶切得到262bp的质粒进一步用XL3730NDA测序仪测序鉴定，将含有序列正确的P5CS-2151的质粒命名为pGEM-T-P5CS-2151，含有序列正确的P5CS-262的质粒命名为pGEM-T-P5CS-262。

载体pCAMBIA3301先用Nco I完全酶切，再用Nhe I部分酶切。回收去除GUS基因的载体条带，得到去GUS基因的9293bp的载体片段，与用Nco I和Nhe I双酶切pGEM-T-P5CS-2151得到的2151bp片段连接，将得到的连接产物，转化大肠杆菌TOP10，提质粒，分别利用NcoI和NheI双酶切和Pml I和BglII双酶切鉴定，结构正确的质粒用Nco I和NHe I会得到2kb，5kb和6kb 3种条带，因BglII在基因内部+1768部位有切点，所以用Pml I和BglII双酶切出1.7K和9K的条带。双酶切鉴定结果如图23所示，其中1，2，3，4为含有长片段P5CS-2151的不同质粒，A为BglII和PmlI双酶切，B为Nco I和Nhe I双酶切，M为200bp。将酶切鉴定正确的质粒，利用引物对anti-P5CS1F和anti-P5CS1R进行PCR鉴定，得到结构正确的质粒(PCR产物大小为215Ibp)，命名为pCAMBIA3301-P5CS-2151。

载体pCAMBIA3301用Pml I和BglII双酶切得到去除GUS基因的载体片段。去除GUS基因的载体片段经回收纯化，与用Pml I和BglII双酶切pGEM-T-P5CS-262得到的262bp片段连接，将得到的连接产物，转化大肠杆菌TOP10，提质粒，质粒用BglII和Pml I进行双酶切，结构正确的质粒获得262bp和9kb两个条带，因两个片段大小差距太大，所以尽管两个片段浓度相同，但清晰度差距很大，9kb的载体条带很亮，而262bp的条带很弱，为了进一步验证，利用引物anti-P5CS2F和anti-P5CS2R对酶切鉴定正确的质粒进行PCR检测。酶切及PCR检测的结果如图24所示，表明得到结构正确的质粒(PCR产物大小为262bp)，命名为pCAMBIA3301-P5CS-262。图中A为质粒酶切(1，2，3，4，5，6，7，8，9，10为Bgl II和Pml I双酶切)；B为质粒PCR(11，12，14，为带有短片断P5CS-262的质粒，13为pCAMBIA3301，15为水对照)；M为lkb的Marker。

(2)拟南芥的转化

将pCAMBIA3301-P5CS-2151和pCAMBIA3301-P5CS-262转入农杆菌GV3101，用蘸花侵染(floral dipping)的方法转化拟南芥。阳性植株的筛选同实施例5的步骤2。转pCAMBIA3301-P5CS-2151的T1代植株共收到14960粒种子，通过0.05％的PPT筛选，共得到70株转基因植株，转化效率为4.7‰；转pCAMBIA3301-P5CS-262的T1代植株共收到11435粒种子，通过0.05％的PPT筛选，共得到45株转基因植株，转化效率为3.9‰。提取经PPT筛选阳性植株的DNA，分别用引物对基因的特异引物引物对anti-P5CS1F和anti-P5CS1R、引物对anti-P5CS2F和anti-P5CS2R和除草剂Bar的引物分别进行PCR扩增，结果表明转pCAMBIA3301-P5CS-262的PPT阳性植株中能扩增出2151bp和470bp的条带，部分PPT阳性植株的扩增结果如图25所示，图中1、2、3、4、7、8、9、10、11、12、13、16、17、18、20、21、23、24、26、29、30、31、32、33为PCR检测阳性植株；5、6、19、22为野生型；p为空载体对照(转pCAMBIA3301的植株)，M为标准分子量200bpMarker。

转pCAMBIA3301-P5CS-262的PPT阳性植株中能扩增出262bp和470bp的条带，而未转化植株无PCR产物。转空载体的植株(转pCAMBIA3301的植株)只能扩增出470bp的Bar基因条带。部分植株的PCR检测结果如图26所示。图26中1、2、3、4、6、7、8、9、14、15、18、19、20、21、22、23、25、26、27、32为转pCAMBIA3301-P5CS-262植株；22、24、29为野生型；13为空载体对照(转pCAMBIA3301的植株)，M为标准分子量200bp的Marker。

实施例8、TaP5CS基因在拟南芥中的反义表达及反义表达转基因植株的功能

1、鉴定T1代转化植株生长状况

转pCAMBIA3301-P5CS-2151和转pCAMBIA3301-P5CS-262的T1代植株，在株型和植株大小和空载体对照(转pCAMBIA3301的植株)相比，转pCAMBIA3301-P5CS-2151和转pCAMBIA3301-P5CS-262植株的分枝能力减弱，植株茎干变细，颜色暗红，开花、结荚期提前，果荚颜色暗红，荚果变的短小，许多果荚不能正常结实，一些果荚能结实，但果荚中的种子数减少。上述症状转pCAMBIA3301-P5CS-262植株比转pCAMBIA3301-P5CS-2151植株明显(图27)。图27中，A为空载体对照(转pCAMBIA3301的植株)；B为转pCAMBIA3301-P5CS-2151植株；C为转pCAMBIA3301-P5CS-262植株。

(2)根长的测定

将在含7mg/L PPT的MS培养基上生长4天的转pCAMBIA3301-P5CS-2151和转pCAMBIA3301-P5CS-262的T1代幼苗，转移到含有不同浓度NaCl(0，5，100，200mM)的MS培养基上，生长18天拍照，测定根长。结果如图28和表4所示，表明在正常生长情况下，正义表达的转pCAMBIA3301-TaP5CS株系12(35S：TaP5CS-12)根长长于空载体对照(转pCAMBIA3301的植株)和反义表达的转基因株系(转pCAMBIA3301-P5CS-2151植株和转pCAMBIA3301-P5CS-262植株)，在50mM的NaCl胁迫下，所有株系的根长都大大缩短，但35S：TaP5CS-12根长长于转pCAMBIA3301的植株和反义表达的转pCAMBIA3301-P5CS-2151植株和转pCAMBIA3301-P5CS-262植株，35S：TaP5CS-12和转pCAMBIA3301的植株及转pCAMBIA3301-P5CS-262的植株根长有极显著的差异；转pCAMBIA3301-P5CS-2151植株又长于转pCAMBIA3301-P5CS-262的植株，两者之间有显著的差异。在100mM的NaCl胁迫下，35S：TaP5CS12根长长于转pCAMBIA3301植株及转pCAMBIA3301-P5CS-2151植株和转pCAMBIA3301-P5CS-262植株，且差异显著，转pCAMBIA3301植株和转pCAMBIA3301-P5CS-2151和转pCAMBIA3301-P5CS-262的各株系间没有明显的差异。在高盐胁迫下，35S：TaP5CS-12和转pCAMBIA3301植株没有明显的差异，但是和转pCAMBIA3301-P5CS-2151和转pCAMBIA3301-P5CS-262的各株系间有明显的差异。根长的实验结果表明，表达小麦的TaP5CS增加了拟南芥的抗盐性，小麦TaP5CS在拟南芥反义表达抑制了拟南芥内源AtP5CS的表达，抗盐能力降低，特别是反义短片段P5CS-262对拟南芥根长的抑制作用大于反义长片段P5CS-2151。图28中A为35S：TaP5CS12；B为转pCAMBIA3301的植株；C为转pCAMBIA3301-P5CS-2151植株；D为转pCAMBIA3301-P5CS-262植株。

                        表4盐胁迫对拟南芥转基因植株根长的影响

	0mM NaCl	50mM NaCl	100mM NaCl	200mM NaCl
					转pCAMBIA3301植株	9.50Aa±0.3733	5.05Ab±0.3125	2.93Aa±0.2957	0.41Aab±0.0718
35S：TaP5CS12	10.04Aa±0.2759	6.04Bc±0.1858	3.50Ab±0.1356	0.47Ab±0.07637
					转pCAMBIA3301-P5CS-2151植株	9.68Aa±0.3056	4.29Ab±0.2621	2.53Aa±0.1201	0.37Aa±0.0521
转pCAMBIA3301-P5CS-262植株	9.84Aa±0.1977	2.92Aa±0.4051	2.41Aa±0.1875	0.33Aa±0.0553

注：大写字母不同表示表示差异极显著，小写字母不同表示差异显著。

(3)脯氨酸含量的测定

T2代转pCAMBIA3301-P5CS-2151植株和转pCAMBIA3301-P5CS-262植株和转pCAMBIA3301的植株(空载体对照)，播种在含7mg/LPPT的MS培养基上，4℃春化3天，光照培养4天，将能够成活的幼苗转移到不含PPT的MS培养基上，生长6天。野生型的种子直接播种到MS培养基上生长10天。用200mM的NaCl，50mM的ABA和8％的PEG6000进行胁迫处理16小时，用茚三酮法测定叶片脯氨酸含量，结果如图29所示，表明在正常情况下，转pCAMBIA3301-TaP5CS株系12(35S：TaP5CS-12)脯氨酸含量高于空载体对照(p3301)，空载体对照又高于转pCAMBIA3301-P5CS-2151植株(P5CS-2151-2)和转pCAMBIA3301-P5CS-262(P5CS-262-50)植株的各个株系，转pCAMBIA3301-P5CS-2151植株和转pCAMBIA3301-P5CS-262植株的各个株系间没有明显的差异；在200mM NaCl胁迫下，和正常条件比，空载体对照脯氨酸含量增加了3倍，35S：TaP5CS-12增加了4.8倍，而转pCAMBIA3301-P5CS-2151植株增加了3.8倍，转pCAMBIA3301-P5CS-262植株没有变化。在8％的PEG胁迫下，过量表达的转基因植株脯氨酸含量增加了10.3倍，空载体对照仅增加了5.2倍，而转pCAMBIA3301-P5CS-2151植株和转pCAMBIA3301-P5CS-262植株分别增加了4倍和3倍；在50mM的ABA胁迫下，空载体对照和转pCAMBIA3301-P5CS-2151植株和转pCAMBIA3301-P5CS-262植株脯氨酸含量没有增加，而35S：TaP5CS-12增加了7倍。表明小麦的TaP5CS基因在盐、PEG和ABA胁迫下，转录本进一步积累，而内源拟南芥AtP5CS在短期盐胁迫下表达量低，脯氨酸合成积累少。小麦TaP5CS在拟南芥中反义表达，可能干扰了拟南芥AtP5CS的表达，从而影响到脯氨酸的合成积累。

                                序列表

<160>2

<210>1

<211>2260

<212>DNA

<213>小麦(Triticum aestivum L.)

<400>1

tctgcggcga cgaggaaaat acactgcaga taagagagag ggaggggcga gcgagcgaga      60

cagggagagg cggcgcgccg agccagccag cccacaccgc ccgcggccat ggccggcgcc     120

gaccccaacc ggagcttcat gaaggacgtg aagcgcatca tcatcaaggt gggcactgca     180

gttatcacca gaaatgatgg aagactggct ttgggcagga ttggagccct gtgcgagcag     240

gtcaaggatc ttaatgctca aggatatgag gtgattatgg tcacctcggg cgctgtcggt     300

gtggggcgac agcggctcag gtaccggaag cttgtcaata gcagctttgc tgatctgcaa     360

aagccacaga tggagctgga tggaaaggcg tgcgctgctg ttggtcagag tgggctgatg     420

gcactctatg acatgttgtt tacccaactt gatgtgtcat catcacaact tcttgtgaca     480

gatagtgact tcgacaattc aaatttccgg gagcgactcc gcgaaactgt cgagtcatta     540

ttagagctta gagttattcc aatatttaat gaaaatgatg ccatcagtac gaggaaggct     600

ccatacgagg attcatctgg tatattctgg gataatgaca gtttggcagg tctactggca     660

ttggaactga aagctgatct ccttgttctg cttagtgatg tggatggcct ctacagcggt     720

ccaccaagtg aaccttcatc aaagttaata catacttata tcaaggaaaa acattatcat     780

gaaattactt ttggagacaa gtcccgtgtt ggtagaggtg gcatgacagc taaagtccaa     840

gctgctgtgt gggcttcaac gggtggtgta cctgttgtta ttacaagtgg atgtgcatct     900

cagagccttg ttaaagttct ccgtggggaa aaaattggta ctctttttca taaaaatgca     960

agtttgtggg aaccatccaa ggagaccagt gtccgtgaaa tggctgttgc tgcacgggat    1020

tgttcaaggc gtctacagaa tttgtcatca gaggagcgca agaaaatatt gttagatgtt    1080

gcggatgctt tagaggcaaa tgaggattta attagatccg agaatgaagc agatttagca    1140

gcagcacatg aggctgggta tgagagtgct ttggtttcta gattgactct gaaaccagga    1200

aagatagcaa gccttgccaa atctgttcgc actcttgcga atatggaaga ccctattaac    1260

gagatactga aaaggacaga ggttgctgat ggtttagttc ttgagaaaac atcttgccct    1320

ttgggtgttc tattgattat ttttgagtcc cgacctgatg ccttagtcca gattgcgtct    1380

ttagccattc gaagtggtaa tggtcttctc ctaaaaggtg gaaaagaagc aatgagatca    1440

aacgcaatat tgcataaggt tataaccaat gctattcctg acaatgttgg cgaaaaattg    1500

attggcctta ttacaactag agatgaaatt gcggatttgc taaagcatga tgatgtcatt    1560

gatcttgtca ttccaagagg gagtaataag cttgttgctc aaatcaaatc atcaacaaag    1620

attcctgttc ttggccatgc tgatggtgtt tgtcatgtat atattgacaa atcagcagac    1680

atggatatgg caaaacgtat tgtgatggat gcaaaaattg attacccagc tgcctgcaac    1740

gcaatggaga cgttgcttgt tcataaagat cttatgaaga ctccagaact caatgacata    1800

ctagtagcac tcaagacagc aggagttaat ctttattgtg ggcctgttgc gcataaagta    1860

ttgggctacc caaaagcaga ttcattacat ctggagtaca gttctatggc ttgcacagtt    1920

gagatagttg atgatgtaca atcagcaatt gaccatatac atcgctatgg aagtgcacat    1980

acagactgtg tggtcactac agatgataaa gtagcagaga cctttctacg tcaagttgat    2040

agtgctgccg tattatacaa cgcgagtaca agattctccg atggtgctcg ttttggactc    2100

ggtgctgagg ttggcataag tacaggccgt atacatgcac gtggacctgt gggtgttgaa    2160

ggtcttttaa ctacacgatg gctcttacga gggaaagggc aagtggtgaa tggtgacaag    2220

gatgttgagt acacccataa gagccttcct ttgcaatgag                          2260

<210>2

<211>716

<212>PRT

<213>小麦(Triticum aestivum L.)

<400>2

Met Ala Gly Ala Asp Pro Asn Arg Ser Phe Met Lys Asp Val Lys Arg

1               5                   10                  15

Ile Ile Ile Lys Val Gly Thr Ala Val Ile Thr Arg Asn Asp Gly Arg

            20                  25                  30

Leu Ala Leu Gly Arg Ile Gly Ala Leu Cys Glu Gln Val Lys Asp Leu

        35                  40                  45

Asn Ala Gln Gly Tyr Glu Val Ile Met Val Thr Ser Gly Ala Val Gly

    50                  55                  60

Val Gly Arg Gln Arg Leu Arg Tyr Arg Lys Leu Val Asn Ser Ser Phe

65                  70                  75                  80

Ala Asp Leu Gln Lys Pro Gln Met Glu Leu Asp Gly Lys Ala Cys Ala

                85                  90                  95

Ala Val Gly Gln Ser Gly Leu Met Ala Leu Tyr Asp Met Leu Phe Thr

            100                 105                 110

Gln Leu Asp Val Ser Ser Ser Gln Leu Leu Val Thr Asp Ser Asp Phe

        115                 120                 125

Asp Asn Ser Asn Phe Arg Glu Arg Leu Arg Glu Thr Val Glu Ser Leu

    130                 135                 140

Leu Glu Leu Arg Val Ile Pro Ile Phe Asn Glu Asn Asp Ala Ile Ser

145                 150                 155                 160

Thr Arg Lys Ala Pro Tyr Glu Asp Ser Ser Gly Ile Phe Trp Asp Asn

                165                 170                 175

Asp Ser Leu Ala Gly Leu Leu Ala Leu Glu Leu Lys Ala Asp Leu Leu

            180                 185                 190

Val Leu Leu Ser Asp Val Asp Gly Leu Tyr Ser Gly Pro Pro Ser Glu

        195                 200                 205

Pro Ser Ser Lys Leu Ile His Thr Tyr Ile Lys Glu Lys His Tyr His

    210                 215                 220

Glu Ile Thr Phe Gly Asp Lys Ser Arg Val Gly Arg Gly Gly Met Thr

225                 230                 235                 240

Ala Lys Val Gln Ala Ala Val Trp Ala Ser Thr Gly Gly Val Pro Val

                245                 250                 255

Val Ile Thr Ser Gly Cys Ala Ser Gln Ser Leu Val Lys Val Leu Arg

            260                 265                 270

Gly Glu Lys Ile Gly Thr Leu Phe His Lys Asn Ala Ser Leu Trp Glu

        275                 280                 285

Pro Ser Lys Glu Thr Ser Val Arg Glu Met Ala Val Ala Ala Arg Asp

    290                 295                 300

Cys Ser Arg Arg Leu Gln Asn Leu Ser Ser Glu Glu Arg Lys Lys Ile

305                 310                 315                 320

Leu Leu Asp Val Ala Asp Ala Leu Glu Ala Asn Glu Asp Leu Ile Arg

                325                 330                 335

Ser Glu Asn Glu Ala Asp Leu Ala Ala Ala His Glu Ala Gly Tyr Glu

            340                 345                 350

Ser Ala Leu Val Ser Arg Leu Thr Leu Lys Pro Gly Lys Ile Ala Ser

        355                 360                 365

Leu Ala Lys Ser Val Arg Thr Leu Ala Asn Met Glu Asp Pro Ile Asn

    370                 375                 380

Glu Ile Leu Lys Arg Thr Glu Val Ala Asp Gly Leu Val Leu Glu Lys

385                 390                 395                 400

Thr Ser Cys Pro Leu Gly Val Leu Leu Ile Ile Phe Glu Ser Arg Pro

                405                 410                 415

Asp Ala Leu Val Gln Ile Ala Ser Leu Ala Ile Arg Ser Gly Asn Gly

            420                 425                 430

Leu Leu Leu Lys Gly Gly Lys Glu Ala Met Arg Ser Asn Ala Ile Leu

        435                 440                 445

His Lys Val Ile Thr Asn Ala Ile Pro Asp Asn Val Gly Glu Lys Leu

    450                 455                 460

Ile Gly Leu Ile Thr Thr Arg Asp Glu Ile Ala Asp Leu Leu Lys His

465                 470                 475                 480

Asp Asp Val Ile Asp Leu Val Ile Pro Arg Gly Ser Asn Lys Leu Val

                485                 490                 495

Ala Gln Ile Lys Ser Ser Thr Lys Ile Pro Val Leu Gly His Ala Asp

            500                 505                 510

Gly Val Cys His Val Tyr Ile Asp Lys Ser Ala Asp Met Asp Met Ala

        515                 520                 525

Lys Arg Ile Val Met Asp Ala Lys Ile Asp Tyr Pro Ala Ala Cys Asn

    530                 535                 540

Ala Met Glu Thr Leu Leu Val His Lys Asp Leu Met Lys Thr Pro Glu

545                 550                 555                 560

Leu Asn Asp Ile Leu Val Ala Leu Lys Thr Ala Gly Val Asn Leu Tyr

                565                 570                 575

Cys Gly Pro Val Ala His Lys Val Leu Gly Tyr Pro Lys Ala Asp Ser

            580                 585                 590

Leu His Leu Glu Tyr Ser Ser Met Ala Cys Thr Val Glu Ile Val Asp

        595                 600                 605

Asp Val Gln Ser Ala Ile Asp His Ile His Arg Tyr Gly Ser Ala His

    610                 615                 620

Thr Asp Cys Val Val Thr Thr Asp Asp Lys Val Ala Glu Thr Phe Leu

625                 630                 635                 640

Arg Gln Val Asp Ser Ala Ala Val Leu Tyr Asn Ala Ser Thr Arg Phe

                645                 650                 655

Ser Asp Gly Ala Arg Phe Gly Leu Gly Ala Glu Val Gly Ile Ser Thr

            660                 665                 670

Gly Arg Ile His Ala Arg Gly Pro Val Gly Val Glu Gly Leu Leu Thr

        675                 680                 685

Thr Arg Trp Leu Leu Arg Gly Lys Gly Gln Val Val Asn Gly Asp Lys

    690                 695                 700

Asp Val Glu Tyr Thr His Lys Ser Leu Pro Leu Gln

705                 710                 715

Claims (3)

1、一种增强植物抗盐性的方法，是将植物抗逆性相关蛋白的编码基因插入真核细胞表达载体，得到含有所述植物抗逆性相关蛋白编码基因的重组表达载体，将该重组表达载体导入目的植物，从表达所述植物抗逆性相关蛋白的植株或所述植物抗逆性相关蛋白表达量增加的植株中筛选得到抗逆性增强的植株；其中，所述植物抗逆性相关蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述植物抗逆性相关蛋白的编码基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

2)在高严谨条件下可与SEQ ID NO：1所示的DNA序列杂交的核苷酸序列。

3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体为将所述植物抗逆性相关蛋白编码基因插入去除GUS基因的pCAMBIA3301得到的pCAMBIA3301-TaP5CS。

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