CN1765924A - 植物抗逆性相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的植物逆性相关蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：3的序列；2)将序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。本发明的蛋白的过量表达能够促进脯氨酸的合成积累，可溶性蛋白的合成，从而提高植物的耐盐性。

Description

植物抗逆性相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

盐渍化土壤在世界上的面积分布很广，据不完全统计，全世界约有3.8亿hm²不同程度的盐渍化土壤，约占可耕地面积的10％左右。中随着人口的增长、工业污染的加剧、不合理的灌溉、化肥使用不当等原因，次生化盐渍土壤面积还在扩大，对于粮食产量和种植面积构成新的威胁。

目前，国际上改良和利用大面积的盐渍化土壤有两条基本的途径：一是通过农业工程措施改良土壤，降低土壤盐分，改善土壤环境，缓解作物生长的胁迫条件；其二是走生物学路线，挖掘、培育耐盐作物品种或开发利用有价值的盐生植物资源以改良土壤。前者需要花费大量的人力、物力、财力，成本太高，且难以保持持久。在耕地面积日益减少，盐碱地逐年增加的形式下，淡水资源严重不足的情况下，走生物学路线，培育耐盐作物品种是改良和利用盐碱地资源最经济、最有效的措施之一，这对盐碱地区尽快建立合理的地貌结构，提高作物产量都具有重要的意义，也是长远而有效地利用盐碱化土壤资源的一条根本途径。

从低等的原核生物(E.coli)，真核生物(酵母)到高等植物，脯氨酸及其合成前体在渗透调节均发挥着重要的作用。在高等植物中脯氨酸的生物合有两条途径，谷氨酸途径和鸟氨酸途径。在逆境胁迫下谷氨酸合成途径加强，而鸟氨酸合成途径被抑制。吡咯啉-5-羧酸还原酶(Δ1-Pyrroline-5-Carboxylate Reductase，P5CR)是脯氨酸生物合成的最后一步酶，不是限速酶。P5CR酶已在大麦、烟草、大豆中得到纯化。以前的研究主要集中在酶活力，如盐胁迫增加狼尾草、松叶菊、绿藻P5CR酶的活力；水分胁迫增加了大麦P5CR酶的活力。随着分子生物技术的发展，人们对P5CR的研究深入到了分子水平，P5CR cDNA的全长序列已在大豆、拟南芥中得到克隆。尽管P5CR不是脯氨酸合成的限速酶，但是伴随脯氨酸合成的积累，P5CR的转录和P5CR的活力增强，植物渗透调节能力表现明显增强。来自多种植物的证据表明，脯氨酸及其合成酶在植物抗逆反应中发挥着重要作用。在小麦中脯氨酸合成途径中还原酶仍未见报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因。

本发明所提供的植物抗逆性相关蛋白，名称为TaP5CR(Δ1-pyrroline-5-carboxylate reductase)，其来源于小麦(Triticum aestivum L)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：3；

2)将序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列经过一至几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。

所述一至几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

其中，序列表中的序列3由287个氨基酸残基组成，将具有该序列的TaP5CR命名为TaP5CR4，来源于六倍体小麦材料：温麦6号、山红麦、鲁麦14、Opata85、W7984和茶淀红。

TaP5CR4的自氨基端第38，73，102，141，146，158，230，284位氨基酸残基的分别由R，L，L，P，Q，T，A，L突变为H，H，P，S，R，I，V，P，得到TaP5CR1，TaP5CR1来源于茶淀红，由287个氨基酸残基组成。

TaP5CR4的自氨基端第14位氨基酸残基的由G突变为A，在第13位和14位之间插入P，45位由V突变为A，第187，204，215，233，282位氨基酸分别由T，M，R，V，R突变为I，V，X，A，Q得到TaP5CR2，TaP5CR2来源于茶淀红，由288个氨基酸残基组成。

TaP5CR4的自氨基端第29，62，132位的氨基酸残基分别由A，G，R突变为S，G，G，得到TaP5CR3，TaP5CR3来源于茶淀红，由287个氨基酸残基组成。

上述植物抗逆性相关蛋白编码基因也属于本发明的保护范围。它包括上述植物抗逆性相关蛋白的基因组基因和cDNA基因。

上述植物抗逆性相关蛋白的基因组基因可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：3蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

其中，序列表中的SEQ ID №：2由2687个碱基组成，为TaP5CR4的基因组基因。

上述植物抗逆性相关蛋白的cDNA基因可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：3蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

序列表中的SEQ ID №：1由1025个脱氧核苷酸组成，其编码序列为自5′端第30位-893位脱氧核苷酸，为TaP5CR4的cDNA基因。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明的第二个目的是提供一种利用该基因增强植物抗逆性的方法。

本发明所提供的增强植物抗逆性的方法，是将上述植物抗逆性相关蛋白编码基因插入真核细胞表达载体，得到含有所述植物抗逆性相关蛋白编码基因的重组表达载体，将该重组表达载体导入目的植物，从表达所述植物抗逆性相关蛋白的植株或所述植物抗逆性相关蛋白表达量增加的植株中筛选得到抗逆性增强的植株。

所述真核细胞表达载体可为Ti类质粒载体和病毒载体，优选为pCAMBIA3301。

所述重组表达载体可为将所述植物抗逆性相关蛋白编码基因插入去除GUS基因的pCAMBIA3301得到的pCAMBIA3301-TaP5CR。

本发明的TaP5CR基因可通过现有的方法构建到真核细胞表达载体，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转TaP5CR基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(BAR基因、GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。携带有本发明的TaP5CR基因或其反义核酸的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。

本发明的TaP5CR(TaP5CR1，TaP5CR2，TaP5CR3，TaP5CR4)在小麦中受盐胁迫诱导表达增强，随盐胁迫时间的增长表达量逐渐增强，24小时转录水平最高，96小时表达量高于对照。Northern杂交结果表明，TaP5CR(TaP5CR1，TaP5CR2，TaP5CR3，TaP5CR4)基因在拟南芥中高效表达，在盐、PEG、ABA不同的胁迫处理条件下，转TaP5CR基因株系脯氨酸合成积累能力均高于空载体对照。转TaP5CR(TaP5CR1，TaP5CR2，TaP5CR3，TaP5CR4)基因植株增加了脯氨酸的合成能力，减少了氧自由基对膜的攻击，在盐、ABA、PEG等不同的逆境下，丙二醛的含量低于对照。根长的实验结果表明，TaP5CR(TaP5CR1，TaP5CR2，TaP5CR3，TaP5CR4)基因在拟南芥中的表达促进根的伸长，在50mM、100mM的NaCl胁迫下，根的伸长长度和根的相对伸长速度和空载体对照比都有极显著的差异，盐胁迫下不仅促进根的伸长而且促进根侧根的发育，也增加了生物量的合成增加了脯氨酸的合成能力，以及强的捕捉氧自由基的能力，使转基因拟南芥的抗非生物胁迫的能力增强。此外，不同的转基因株系转化的基因拷贝数不同，合成脯氨酸的能力可能不同。

本发明所提供的植物抗逆性蛋白TaP5CR，在脯氨酸合成过程中起到调控作用，可以控制渗透调节，TaP5CR及其编码基因可用于培育抗逆性增强植物，特别是培育耐盐性提高植物，从而加速盐碱地改良的进程。

附图说明

图1为TaP5CR基因的PCR扩增电泳图。

图2为TaP5CR的保守域(CDS)示意图。

图3为不同生物P5CR基因序列进化树。

图4为不同生物P5CR基因氨基酸序列比较图。

图5为TaP5CR基因Sourthern杂交图。

图6为TaP5CR基因的Nornthern杂交分析图。

图7为pCAMBIA3301表达载体Bgl II和Nhe I的双酶切电泳图。

图8为TaP5CR基因表达载体的构建流程图。

图9为pCAMBIA3301-TaP5CR表达载体的酶切和PCR验证图。

图10为用PPT除草剂筛选T1代转化TaP5CR基因的拟南芥植株结果图。

图11为PCR检测转TaP5CR基因的拟南芥植株的电泳图。

图12为T1代转TaP5CR基因植株的生长情况照片。

图13为转TaP5CR基因拟南芥的表达分析图。

图14为转TaP5CR基因植物在盐胁迫下根伸长情况图。

图15为不同浓度的NaCl胁迫7天后，转TaP5CR基因植株的恢复生长情况图。

图16为不同的胁迫处理对脯氨酸和丙二醛含量的影响柱形图

具体实施方式

下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。

T0表示由拟南芥的农杆菌蘸花得到的转基因植株，T1表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株，T2表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、小麦吡咯啉-5-羧酸还原酶及其编码基因的获得

以100-200mg中国地方小麦茶淀红叶片为材料，提取基因组DNA；用Trizol方法提取总RNA，经1％琼脂糖电泳检测RNA的完整性。ss cDNA的合成按照SuperScriptTMII RNase H-Reverse Transcriptase的方法，合成单链(ss)cDNA。通过NCBI数据库检索到水稻的OsP5CR基因的全长序列(登陆号为AY574031)，以水稻的OsP5CS基因序列为探针，Blast小麦的EST数据库，设计了两对引物，第一对引物P5CR1序列如下：P5CR1F：5′AGCCGCCGCGCCCCTCTCCTAC 3′，P5CR1R：5′TATCAGTGTGCCGCGAAACGAACC3′；第二对引物P5CR2序列如下：P5CR2F：5′TAGCGAGACGGGTAAACATC 3′，P5CR2R5′ACACAGCTAGACCAGGAAAAT 3′。用上述引物，分别进行基因组PCR和RT-PCR。引物对P5CR1F和P5CR1R的PCR反应程序如下：先94℃5分钟；然后30个循环(94℃ 30sec，49℃ 1min，72℃ 2min)；最后72℃延伸15min，15℃保温。引物对P5CR2F和P5CR2R的PCR反应程序序如下：先94℃ 5min  ；然后30个循环(94℃ 30sec，49℃ 1min，72℃ 2min  )；最后72℃延伸15min，15℃保温。PCR产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。电泳完毕在紫外灯下切下目的条带，用琼脂糖凝胶试剂盒纯化(购自北京天为时代公司)。扩增的结果如图1所示，P5CR1引物在DNA水平扩增得到了2256bp的条带(gDNA)，在cDNA水平得到了882bp左右的条带，P5CR2引物在基因组(gDNA)和cDNA水平得到的均为300bp左右的条带。图中，泳道1，2分别为P5CR2在基因组和cDNA水平上PCR扩增产物；泳道3，4分别为P5CR1引物在基因组和cDNA水平上的PCR扩增产物；M为200bp的Marker。

将扩增得到的产物通过XL3730测序，DNAstar组装扩增得到的核苷酸序列，在cDNA上得到了1025bp的片段，该cDNA片段具有序列表中序列1的DNA序列，包含864bp的ORF区域，其编码287个氨基酸残基的TaP5CR，TaP5CR具有序列表中序列3的氨基酸序列，分子重量为29352.80D，等电点为8.43，为碱性氨基酸。在基因组DNA上得到了2687bp的DNA片段，该片段具有序列表中序列2的DNA序列，用NCBI网站Blast2sequence和DNAstar软件对cDNA和基因组DNA序列比对结果表明，该基因组基因有7个外显子和6个内含子，外显子和内含子交界处有典型的GT/AG结构。编码具有序列表中序列3的氨基酸序列的TaP5CR。

用TaP5CR的氨基酸序列在NCBI数据库中进行Conserved Domain Search(CDS)检索，结果如图2所示。表明TaP5CR有完整的P5CR(ProC)的保守域。用TaP5CR的基因序列与其它植物P5CR的基因序列进行blast比对，结果表明该基因和大麦、水稻、羽扇豆、拟南芥、人类、E.coli、酵母的P5CR基因分别有96％、87％、67％、67％、39％、37％、24％的序列一致性。用DNAstar聚类分析表明，TaP5CR的基因序列与大麦P5CR基因的亲源关系最近，与酵母的最远结果如图3所示。TaP5CR的氨基酸序列用ClusterX软件跟不同生物P5CR的氨基酸序列进行比对，结果如图4所示，表明尽管所有植物的P5CR有完整的P5CR保守域，但保守域内氨基酸有变异，不同植物间差异较大。小麦和大麦TaP5CR比较，在氨基酸序列有91％的一致性，在核苷酸序列有84％的一致性，尽管小麦和拟南芥在氨基酸水平上有67％的一致性，但是和拟南芥在核苷酸水平上一致性很差，仅为50％。通过不同生物P5CR基因的进化树可以推断，小麦P5CR基因和大麦P5CR基因亲缘关系最近，和水稻次之，拟南芥、羽扇豆亲缘关系比较远，和细菌、酵母序列一致性差，同源关系更远。

按照上述方法，分别以6个六倍体材料：小麦温麦6号、山红麦、鲁麦14、Opata85、W7984和茶淀红，和DM12、DR23、DR149、DR206(AB基因组)4个四倍体材料和Y2005(S基因组)二倍体的TaP5CR4基因在基因组上测序。对六倍体小麦温麦6号、山红麦、鲁麦14、Opata85、W7984和茶淀红6个材料的中TaP5CR基因在基因组序列分析结果表明，该基因组基因在六倍体材料中是很保守的，山红麦、鲁麦14、Opata85、W7984和茶淀红5个材料中的该基因序列完全一致，没有任何碱基的突变，温麦6号TaP5CR4的基因组基因和上述5个材料的TaP5CR4的基因组基因比较有2个碱基的突变，一个是鸟嘌呤变为腺嘌呤(G→A)，发生在外显子部位；一个是腺嘌呤变为鸟嘌呤(A→G)，发生在内含子部位，外显子的突变导致氨基酸由精氨酸变为组氨酸(R→H)。

根据分析结果设计了1对引物：P5CR1F 5’AGCCGCCGCGCCCCTCTCCTAC3’，P5CR2R5’ACACAGCTAGACCAGGAAAAT3’。以总RNA反转录得到的cDNA为模板扩增小麦的P5CR基因，PCR反应条件如下：先94℃5分钟；然后按照如下条件进行30个循环：94℃ 30秒，57℃，30分钟，70℃ 4分钟，；最后72℃延伸15分，4℃保温。扩增得到的片段与pGEM-T Easy载体连接，通过XL3730测序和DNAstar软件及ORF finder分析的结果表明，在cDNA上又得到了3种小麦的cDNA序列，分别命名为TaP5CR1，TaP5CR2，TaP5CR3。最初得到的命名为TaP5CR4。TaP5CR1，TaP5CR2，TaP5CR3与TaP5CR4的差异如下：

TaP5CR4的自氨基端第38，73，102，141，146，158，230，284位氨基酸残基的分别由R，L，L，P，Q，T，A，L突变为H，H，P，S，R，I，V，P，得到TaP5CR1，TaP5CR1来源于茶淀红，由287个氨基酸残基组成。

TaP5CR4的自氨基端第14位氨基酸残基的由G突变为A，在第13位和14位之间插入P，45位由V突变为A，第187，204，215，233，282位氨基酸分别由T，M，R，V，R突变为I，V，X，A，Q得到TaP5CR2，TaP5CR2来源于茶淀红，由288个氨基酸残基组成。

TaP5CR4的自氨基端第29，62，132位的氨基酸残基分别由A，G，R突变为S，G，G，得到TaP5CR3，TaP5CR3来源于茶淀红，由287个氨基酸残基组成。

实施例2、Southern blot分析及基因的定位分析

分别提取六倍体小麦中国春(Chinese spring)、2倍体乌拉尔图小麦(T.urartu)A基因组、拟斯卑尔脱(Ae.speltoides ssp speltoide)S基因组、粗山羊草(Ae.squarrosa ssp strangulate)D基因组的DNA，用HindIII、EcoR I、EcoRV酶切，酶切的DNA低压电泳(1V/cm)，电泳结束，用溴化乙锭进行染色。0.25M的HCl进行脱嘌呤处理，而后用去离子水冲洗3次，在0.4N的NaOH 碱性液中进行转膜，采用TaP5CR4的基因组DNA(序列2)为探针进行Southern blot分析。杂交结果表明用EcoRI酶切，六倍体小麦中国春(Chinese spring)为3条杂交带，2倍体乌拉尔图小麦(T.urartu)A基因组为3条杂交带，S基因组为2条杂交带，粗山羊草(Ae.squarrosassp strangulate)D基因组为1条杂交带；以EcoRV和Hind III酶切，六倍体小麦中国春(Chinese spring)是多条杂交带，2倍体乌拉尔图小麦(T.urartu)A基因组和粗山羊草(Ae.squarrosa ssp strangulate)D基因组为多条杂交带，拟斯卑尔脱(Ae.speltoides ssp speltoide)S基因组是2条杂交带。说明TaP5CR基因是多拷贝基因。图中，1，2，3，4分别为六倍体小麦中国春(Chinese spring)，2倍体乌拉尔图小麦(T.urartu)A基因组、拟斯卑尔脱(Ae.speltoides ssp speltoide)S基因组、粗山羊草(Ae.squarrosa ssp strangulate)D基因组；M为以λDNA的HindIII酶切产物为探针与λDNA的HindIII酶切产物杂交结果。

实施例3、TaP5CR基因的表达分析

将生长到一叶一心的小麦茶淀红幼苗的根系置于100mM的NaCl溶液分别处理0、2、4、8、24、96小时后提取叶片的总RNA，按照Sambrook的方法进行Nornthern杂交。其中，所用的探针为TaP5CR的cDNA(序列1)，用³²P-dCTP标记探针。结果如图6所示，表明TaP5CR基因是受盐胁迫诱导的，在正常生长情况下，TaP5CR基因低量表达，在盐胁迫后2小时表达量增强，24小时表达量达到高峰，一直到胁迫后96小时表达量均高于对照。表明TaP5CR盐胁迫下是上调表达的基因。

实施例4、TaP5CR基因在拟南芥中表达

1、表达载体pCAMBIA3301-TaP5CR的构建

pCAMBIA3301-TaP5CR的构建过程如图8所示，具体步骤如下：

以中国地方小麦茶淀红叶片为材料，用Trizol方法提取中国地方小麦茶淀红的总RNA，经1％琼脂糖电泳检测RNA的完整性。ss cDNA的合成按照SuperScriptTMIIRNase H-Reverse Transcriptase的方法，合成单链(ss)cDNA。以反转录得到的cDNA为模板，设计了一对引物对P5CR3TaP5CR基因的ORF区域进行扩增，P5CR3正向引物含有Bgl II酶切位点，反向引物含有Nhe I酶切位点：P5CR3F：5′AT AGATCTTATGGCGGCCGCGCCT 3′(带下划线的序列为BglII的识别序列)P5CR3R：5′TC GCTAGCCTAATTTTTTGAGAGC 3′(带下划线的序列为Nhe I的识别序列)。PCR反应程序为：94℃ 5min；25个循环(94℃，30sec；50℃，1min；72℃，30sec)；72℃延伸15min，15℃保温。经PCR扩增得到带有BglII和Nhe I酶切位点的基因片段，纯化后连到pGEM-T Easy连接载体上，将连接产物进行热激转化大肠杆菌TOP10，含50μg/ml羧苄青霉素的LB平板上，37℃培养9-12小时，挑取单菌落大量培养，提取质粒，经BglII和Nhe I双酶切鉴定，挑选酶切得到864bp片段的质粒用XL3730(ABI)方法测序，将含有864bp的TaP5CR基因ORF序列(自序列1的5′端第30位-893位脱氧核苷酸)的pGEM-T Easy命名为pGEM-T-TaP5CR。

pCAMBIA3301(CAMBIA，Australia)(有两个Nhe I识别位点)载体内部带有NheI的酶切位点，为得到去GUS且带有BglII和Nhe I双酶切位点的pCAMBIA3301载体上，先用BglII对pCAMBIA3301进行完全酶切，而后又用Nhe I进行部分酶切，从而得到去GUS的9295bp的片段，酶切电泳如图7所示，得到9295bp的酶切片段。图中，泳道M是1KbDNA标准分子量marker，泳道7是线性化的pCAMBIA3301，其余的泳道是pCAMBIA3301的部分酶切。用BglII和Nhe I双酶切含有TaP5CR基因ORF序列的质粒pGEM-T-TaP5CR，得到起始密码子前带有BglII酶切位点和终止密码子后带有Nhe I酶切位点的TaP5CR基因ORF全长片段，将该片段连接到经部分酶切去除GUS基因的9295bp的pCAMBIA3301载体上，构建的载体转化大肠杆菌TOP10(购自北京天为时代科技有限公司)，大肠杆菌质粒用BglII和Nhe I分别酶切鉴定表达载体的正确性，正确的质粒用于转化根癌农杆菌GV3101，提取被转化的根癌农杆菌GV3101中的质粒，用BglII和Nhe I双酶切，并利用引物对P5CR3进行质粒PCR，鉴定表达载体的正确性，结果如图9所示，图中A为表达载体BglII和Nhe I的双酶切，B为表达载体的质粒PCR(2，3，4，5，为pCAMBIA3301-TaP5CR；1为pCAMBIA3301载体；6为水对照)。通过BglII和Nhe I酶切pCAMBIA3301-TaP5CR得到3条带，其中864bp的条带为TaP5CR基因，3K和6K的片段为载体。PCR扩增也得到了864bp的条带，这表明表达载体构建成功。将构建正确的含有864bp的TaP5CR基因ORF序列的表达载体命名为pCAMBIA3301-TaP5CR。

2、转pCAMBIA3301-TaP5CR拟南芥的获得

(1)转化

含有pCAMBIA3301-TaP5CR的根癌农杆菌GV3101通过蘸花侵染的方法转化拟南芥。

(2)喷雾筛选：

由于所用的转化质粒pCAMBIA3301-TaP5CR带有抗除草剂的Bar基因，它在转化时能随目的基因一起转入植物体，所以可以用PPT除草剂喷雾对转化的植株进行筛选。T1代种子经过春化后直接播种到花盆中，正常生长1天，用0.05％的PPT除草剂喷雾筛选，连续喷3天，1周后，非转化植株枯黄，而真正的转化株则生长旺盛。T1代的筛选结果如图10所示。收获的种子为T2代种子。T2代种子首先在含有0.05％PPT除草剂的MS培养基上筛选，再移栽到土中生长。转化植株含有抗除草剂的Bar基因仍然能够正常生长，非转化植株逐渐枯萎。共收到11460种子，通过0.05％的PPT筛选，共得到58棵转基因植株，转化效率为5‰。

(3)PCR检测

提取平板筛选获得的转TaP5CR基因植株的基因组DNA，用TaP5CS基因的修饰引物(P5CR3F和P5CR3R)和Bar基因的引物分别进行PCR扩增，反应条件如下：

小麦TaP5CR基因的扩增：用TaKaRa LA-Taq酶进行目的基因的扩增。10μl反应体系如下：基因组DNA 1.6μl(20μg/ul)，2×PCR缓冲液5.0μ1，dNTP(25mM)0.16μl，P5CR3F和P5CR3R各2μ1(2μM)，LA-Taq酶0.1μ1，ddH2O1.14μl共10μ1。反应程序为：先94℃，5min；再30个循环(94℃ 1min，64℃ 4min，30sec)；然后72℃，20min；15℃保温。

抗除草剂基因(Bar)的扩增：用上海promega公司提供的Taq酶，20μl的反应体系中10×PCR缓冲液2.0μl，dNTP(25mM)0.16μl，Mg²⁺(25mM)1.44μl，Bar基因的引物各3.2μ1(2.0mM)，基因组DNA 4μ1(20ug/ul)，ddH₂O 5.8μl共20μl。反应程序为：先94℃，5min；再22个循环(94℃ 30sec，68℃ 2min，72℃ 2min)；然后72℃ 20min；15℃保温。

阳性植株能扩增出864bp和470bp的条带，而未转化植株无PCR产物。转pCAMBIA3301空载体对照的植株只能扩增出470bp的Bar基因条带。结果如图11所示，图中，A为TaP5CR基因引物的扩增情况；B为除草剂Bar基因的扩增情况，泳道1，2，3，4，5，6，10，11为转pCAMBIA3301-TaP5CR的植株扩增结果；7，8，9为野生型扩增情况；12为转pCAMBIA3301空载体对照扩增情况。

实施例5、转TaP5CS基因拟南芥植株的功能验证

1、T1代转基因植株的生长情况

TaP5CR的拟南芥T1代转基因植株，和转pCAMBIA3301对照相比，生长更旺盛。植株高度增加，分枝能力增强，果荚增多，照片如图12所示。图12中，A为转pCAMBIA3301空载体的植株，B为转pCAMBIA3301-TaP5CR的植株。

2、T2代转基因植株的筛选

T2代的种子首先播在含有7mg/L PPT的MS培养基上，春化3天，光照培养生长4天，T1代幼苗自交后在含7mg/L PPT的MS培养基上生长，带有外源基因TaP5CR和Bar基因的植株能够成活，统计结果表明有2/3的幼苗成活。

3、Northern blot分析

T2代转pCAMBIA3301-TaP5CR植株经过PPT筛选，在MS培养基上生长10天，用Trizol试剂提取拟南芥的叶片RNA，进行Northern blot分析。其中，所用的探针为TaP5CR的cDNA(序列1)，用³²P-dCTP标记探针。Northern blot结果如图13所示，1为野生型；2为转pCAMBIA3301空载体对照；3-5分别为转pCAMBIA3301-TaP5CR株系13(35S：TaP5CR-13)，转pCAMBIA3301-TaP5CR株系16(35S：TaP5CR-16)，转pCAMBIA3301-TaP5CR株系18(35S：TaP5CR-18)。结果野生型对照和转pCAMBIA3301空载体对照杂交带很弱，而不同的转pCAMBIA3301-TaP5CR植株杂交带很强，表明TaP5CR基因在拟南芥中高效表达，而且不同的转pCAMBIA3301-TaP5CR系表达量不同，株系18(35S：TaP5CR-18)的表达量相对弱，而株系16(35S：TaP5CR-16)的表达量最强，株系13(35S：TaP5CR-13)的表达量介于二者之间。

4、耐盐性鉴定及生理指标的测定

(1)转pCAMBIA3301-TaP5CR植株根长的测定

经过PPT筛选的转pCAMBIA3301-TaP5CR株系13(35S：TaP5CR13)株系进行盐胁迫实验，对照为转pCAMBIA3301的植株。在不同浓度(0、50、100mmol/L)NaCl的MS培养基上生长16天，拍照，如图14所示，根长的生长结果表明，35S：TaP5CR13植株(图14中A)和转pCAMBIA3301对照(图14中B)比，在非盐胁迫下，35S：TaP5CR13根长长于对照，侧根数没有明显的差异。在50mM的NaCl胁迫下，35S：TaP5CR13植株的根长于转pCAMBIA3301对照，35S：TaP5CR13植株根的相对伸长率为65.38％，而转pCAMBIA3301对照仅为52.08％，差异达到极显著水平，而且转pCAMBIA3301-TaP5CR植株侧根数增多。图14结果表明35S：TaP5CR13植株根的生物量增加。在100mM的NaCl胁迫下，根的增长速度减慢，但转pCAMBIA3301-TaP5CR植株根伸长长度和对照差异仍然达极显著水平，结果如表1所示。这些结果说明，TaP5CR的表达增加了脯氨酸的合成能力，增强了拟南芥的抗盐性。

                                 表1盐胁迫对根长的影响

	0mM NaCl	50mM NaCl		100mM NaCl
							根的伸长长度(cm)	根的伸长长度(cm)	相对伸长(％)	根的伸长长度(cm)	相对伸长(％)
pCAMBIA3301	9.37(0.22)A	4.88(0.31)A	52.08	2.93(0.11)A	31.27
						35STaP5CR-13	10.37(0.23)A	6.78(0.33)B	65.38	4.25(0.26)B	40.98

注：小写字母不同的表示差异显著

(2)TaP5CR的转基因植株盐胁迫后恢复生长能力的观察

转pCAMBIA3301-TaP5CR植株的T2代种子和转pCAMBIA3301对照的种子播在含7mg/L PPT的MS培养基上，4℃生长3天，而后在光照下培养4天，选能成活的生长一致的幼苗转移到含有不同浓度NaCl(50，100，150mM)的MS培养基上生长7天，移栽到土中恢复生长，恢复生长10天拍照的结果如图15所示，图中A为转pCAMBIA3301-TaP5CR的植株；B为转pCAMBIA3301空载体对照。结果表明，转pCAMBIA3301-TaP5CR的拟南芥幼苗在50，100mM NaCl处理7天，移栽到土中后能很快恢复生长，生长速率也比较快，而转pCAMBIA3301空载体对照恢复生长比较慢。在150mM NaCl胁迫处理7天，转pCAMBIA3301-TaP5CR的植株和转pCAMBIA3301对照恢复生长能力没有明显的差别。

(3)盐胁迫下，脯氨酸和丙二醛含量的测定

为了验证TaP5CR基因的高效表达是否和脯氨酸积累及植物的抗逆性相关，进行了不同胁迫处理的脯氨酸和丙二醛含量的测定，具体方法如下：

转pCAMBIA3301-TaP5CR株系中以株系13和16为试材，对照为转pCAMBIA3301空载体植株。在MS培养基上生长10天的拟南芥植株在200mM NaCl，50mM ABA和8％的PEG6000处理18小时；同时以不经胁迫处理的植株作为对照(control)，测定叶片脯氨酸和丙二醛的含量。脯氨酸含量的测定采用茚三酮法(Bates L S.Rapiddetermination of free proline for water stress studies.Plant Soil，1973，39：205-207)，丙二醛的含量测定采用文献(郭庆房，汤章城.NaCl胁迫下小麦突变体和野生型叶片中的一些有机物质积累和基因表达差异.植物生理学报，1999，25：263-268)中描述的丙二醛含量测定方法。结果如图16所示，转pCAMBIA3301-TaP5CR增加转基因拟南芥的脯氨酸合成能力。在非胁迫处理条件下，转pCAMBIA3301-TaP5CR的拟南芥植株叶片合成脯氨酸能力增强，不同的株系增加的幅度不同，株系16(35S：TaP5CR-16)合成脯氨酸能力增加了10倍，而株系13(35S：TaP5CR-13)合成能力仅增加2倍。在NaCl胁迫下，转pCAMBIA3301-TaP5CR植株和转pCAMBIA3301空载体对照(p3301)合成脯氨酸的能力均增强，空载体对照增加了3倍多，而株系16(35S：TaP5CR-16)增加了16倍，株系13增加了4倍。在8％的PEG6000胁迫下，转pCAMBIA3301对照合成脯氨酸的能力增加了2倍，而转pCAMBIA3301-TaP5CR株系16(35S：TaP5CR-16)增加了11倍，转pCAMBIA3301-TaP5CR株系13(35S：TaP5CR-13)增加了3倍。在50mM的ABA胁迫下，转pCAMBIA3301对照脯氨酸合成增加了1.3倍，35S：TaP5CR-16增加了14倍，35S：TaP5CR-13增加了接近3倍。

对丙二醛含量的测定结果表明，正常情况下，转pCAMBIA3301-TaP5CR植株和转pCAMBIA3301对照(p3301)叶片丙二醛含量没有明显差异，在200mM的NaCl胁迫下，转pCAMBIA3301-TaP5CR植株和转pCAMBIA3301对照丙二醛含量都增加，但转pCAMBIA3301对照的丙二醛含量高于转pCAMBIA3301-TaP5CR株系。在8％PEG6000胁迫下，转pCAMBIA3301对照增加了将近2倍，而35S：TaP5CR-13增加了1.4倍，35S：TaP5CR-16没有增加还略有下降。在50mM ABA胁迫下，两个转pCAMBIA3301-TaP5CR株系的丙二醛含量均低于对照，而转pCAMBIA3301植株的丙二醛含量高于对照，但低于盐胁迫和PEG胁迫处理的水平。

脯氨酸合成积累可增加植物抵御逆境胁迫的能力，可以捕捉氧自由基，减少氧自由基对膜的攻击，增加膜的稳定性。丙二醛是膜脂过氧化的产物，是膜伤害的指标。本研究结果表明，TaP5CR基因在拟南芥中的表达增加了脯氨酸的合成能力，减少了氧自由基对膜的攻击，在盐、ABA、PEG等不同的逆境下，丙二醛的含量低于对照。

                                序列表

<160>3

<210>1

<211>1025

<212>cDNA

<213>小麦(Triticum aestivum L.)

<400>1

tagccgccgc gcccctctcc tactccccaa tggcggccgc gcctccccag cccgccgcgc   60

ccgcccccgg ccccgcgaac ggcggcgacg cgttccgcct gggcttcgtc ggcgcgggga  120

acctggccga gagcatcgcg cgcggcgtcg cggcgtcggg cgtcctcccg gcctccgccg  180

tccgcaccgc tccccaccgc cgccccgagc gcggcgccgc cttcgcctcc ctcggcgcca  240

ccatcctcgc ctccaacgcc caggttgtgg acggcagcga tgtgatcgtc atctccgtca  300

agccccagat tgtgaagcag gttctggttg agctcaagcc cttgctgtct gaagaaaagc  360

ttctggtctc catcgctgct ggcatcaaaa tgaaagattt gcaggattgg tctggtcagc  420

gcagaattat tagagtaatg ccaaacaccc cctctgctgt cggacaagca gcatcagtga  480

tgtgtctggg agagacagct actgagaagg atgaaaaccg tgtcaaaagc ttatttagtg  540

ccattggaaa agtttggaca gctgaagaaa aatattttga tgcggttact ggcttgagtg  600

gtagtggtcc ggcctacatt ttcttggcaa tagaggccat ggctgatggt ggagttgctg  660

ctgggcttcc tcgggatctt gctcttggtc ttgcagctca gacagtgcta ggtgctgcaa  720

ccatggttag cgagacgggt aaacatccag ggcagctgaa ggatcaggtc acttcccctg  780

caggaactac catagctggt gttcatgagc tcgagaaggg ttcgtttcgy ggcacactga  840

taaatgccgt tgttgctgcc acaacaagat gccgagagct ctcaaaaaat tagtcctctt  900

ataatcctgg tagccattgt tagttttgct acaattccag aataaaatgg tggacatgat  960

ttatgagatc ttaatctcag actccaaaca agttatcgat aaattttcct ggtctagctg  1020

tgtag                                                              1025

<210>2

<211>2687

<212>DNA

<213>小麦(Triticum aestivum L.)

<400>2

tagccgccgc gcccctctcc tactccccaa tggcggccgc gcctccccag cccgccgcgc  60

ccgcccccgg ccccgcgaac ggcggcgacg cgttccgcct gggcttcgtc ggcgcgggga      120

acctggccga gagcatcgcg cgcggcgtcg cggcgtcggg cgtcctcccg gcctccgccg      180

tccgcaccgc tccccaccgc cgccccgagc gcggcgccgc cttcgcctcc ctcggcgcca      240

ccatcctcgc ctccaacgcc caggtcccaa tctgattcac ctcgcctcac gccctctact      300

ctaagcagcc aacgatctct gtctgtctgt cacgtgttca atcttgacag acactccgag      360

tctcacgtga tgttttcttt ttttacttct cgtctcaggt tgtggacggc agcgatgtga      420

tcgtcatctc cgtcaagccc cagattggta agtgtgctca gtattatttt cagccccccg      480

aaggcaatca atcaaacact gatgggtctc gcaaacgctt gttctagaca tagtaattgc      540

atagtcactg aaagcaatcg ctgaagcctc agattcaacg attcgggctt ttgttttgca      600

cgcttatgag attatgaaat tgcagtgaag caggttctgg ttgagctcaa gcccttgctg      660

tctgaagaaa agcttctggt ctccatcgct gctggcatca aaatgaaaga tttgcaggtc      720

agtcagtcag tctgcattca gggtttacta ggcttgctta accggtgatt cagggtattc      780

actgtatgat ataatatcta tgcatattcc aatagagaag aagccgactg atgccatgtt      840

tcttttttat gggttgagct ggacatgaaa catctcgctt catgcgagct ccttttttct      900

tttctttctt tagatttatt tgcagtatta aatcctgatc ttgattttgc ggcctttgct      960

gatcctggca aaaccaatat tagaatattt ttttaagtaa aacttaccaa gctgatcctc      1020

catttatata gtttgcggag ctatcaatag atttgtaaag ttcaccttac catgtactcc      1080

atttggcaaa ataaaagcag ctaccagaac tagacgtttg taaaattacc ctccatataa      1140

gtaccaaagt tgagccatgc actattttgc ctacctaaga ataagactgc cacttgagtt      1200

actcaacata gtatgactat ttttgtttta tgcttttttt tttgctcttt taatctcagg      1260

attggtctgg tcagcgcaga attattagag taatgccaaa caccccctct gctgtcggac      1320

aagcagcatc aggtaaacat atgcagatct gtcttctgta aacttacttt ttgtcttgta      1380

atctattaac tacactacac acataatgtt gataatattg tgaacctatc agttgaccag      1440

aattgtgtgg tgatctccct ttagtgatac cttaagaaaa aagtgaactc taatttcttt      1500

tctatttcta gtgtctctaa tgaaataaca aggttttcct aattgaaatg tcgaggattt      1560

tatttttaaa atcttcaaaa gtcggtctgc tttattgatt cattattatc tacatatgta      1620

aatttgaatt tgaaacgtgc aacacattat ctacttttgc ttttcccagt aaaatgacta      1680

ccattctgtg atgttatgaa tctctattat tggtagaaat tttgttgcct ggtggaatta      1740

ctaaatgaag gcagtatcac tagaaacatg ccatttttca cacatatgtt tcttgctgat      1800

gttgtttcat gtacttagtg atgtgtctgg gagagacagc tactgagaag gatgaaaacc      1860

gtgtcaaaag cttatttagt gccattggaa aagtttggac agctgaagaa aaatattttg      1920

atgcggttac tggcttgagg tatgtgacat attctatatg aaactttaag gaagcaatgt      1980

caagagtagg ccgggattgg ctcaagaatt aacatgcatt tccatctatt tgaatacagt    2040

ggtagtggtc cggcctacat tttcttggca atagaggcca tggctgatgg tggagttgct    2100

gctgggcttc ctcgggatct tgctcttggt cttgcagctc agacagtacg tatccattcc    2160

atattctgtt attttacgta gtccattggg cattatcttg catagttatt aagctggaat    2220

gtgtatagtt cctttgcgca ttatgattaa ttgcattcta ccatatcaac aattattctg    2280

atctcaagtt tgcagtatcc tgtttgtcat ttgttgacct tctacatttt ctcattacct    2340

ctttttgtca tatgatctgc tgtttaggtg ctaggtgctg caaccatggt tagcgagacg    2400

ggtaaacatc cagggcagct gaaggatcag gtcacttccc ctgcaggaac taccatagct    2460

ggtgttcatg agctcgagaa gggttcgttt cgcggcacac tgataaatgc cgttgttgct    2520

gccacaacaa gatgccgaga gctctcaaaa aattagtcct cttataatcc tggtagccat    2580

tgttagtttt gctacaattc cagaataaaa tggtggacat gatttatgag atcttaatct    2640

cagactccaa acaagttatc gataaatttt cctggtctag ctgtgta                  2687

<210>3

<211>287

<212>PRT

<213>小麦(Triticum aestivum L.)

<400>3

Met Ala Ala Ala Pro Pro Gln Pro Ala Ala Pro Ala Pro Gly Pro Ala

1               5                   10                  15

Asn Gly Gly Asp Ala Phe Arg Leu Gly Phe Val Gly Ala Gly Asn Leu

            20                  25                  30

Ala Glu Ser Ile Ala Arg Gly Val Ala Ala Ser Gly Val Leu Pro Ala

        35                  40                  45

Ser Ala Val Arg Thr Ala Pro His Arg Arg Pro Glu Arg Gly Ala Ala

    50                  55                  60

Phe Ala Ser Leu Gly Ala Thr Ile Leu Ala Ser Asn Ala Gln Val Val

65                  70                  75                  80

Asp Gly Ser Asp Val Ile Val Ile Ser Val Lys Pro Gln Ile Val Lys

                85                  90                  95

Gln Val Leu Val Glu Leu Lys Pro Leu Leu Ser Glu Glu Lys Leu Leu

            100                 105                110

Val Ser Ile Ala Ala Gly Ile Lys Met Lys Asp Leu Gln Asp Trp Ser

        115                 120                 125

Gly Gln Arg Arg Ile Ile Arg Val Met Pro Asn Thr Pro Ser Ala Val

    130                 135                 140

Gly Gln Ala Ala Ser Val Met Cys Leu Gly Glu Thr Ala Thr Glu Lys

145                 150                 155                 160

Asp Glu Asn Arg Val Lys Ser Leu Phe Ser Ala Ile Gly Lys Val Trp

                165                 170                 175

Thr Ala Glu Glu Lys Tyr Phe Asp Ala Val Thr Gly Leu Ser Gly Ser

            180                 185                 190

Gly Pro Ala Tyr Ile Phe Leu Ala Ile Glu Ala Met Ala Asp Gly Gly

        195                 200                 205

Val Ala Ala Gly Leu Pro Arg Asp Leu Ala Leu Gly Leu Ala Ala Gln

    210                 215                 220

Thr Val Leu Gly Ala Ala Thr Met Val Ser Glu Thr Gly Lys His Pro

225                 230                 235                 240

Gly Gln Leu Lys Asp Gln Val Thr Ser Pro Ala Gly Thr Thr Ile Ala

                245                 250                 255

Gly Val His Glu Leu Glu Lys Gly Ser Phe Arg Gly Thr Leu Ile Asn

            260                 265                 270

Ala Val Val Ala Ala Thr Thr Arg Cys Arg Glu Leu Ser Lys Asn

        275                 280                 285

Claims (10)

1、植物抗逆性相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：3；

2)将序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列经过一或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。

2、根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于：所述植物抗逆性相关蛋白是具有序列表中的SEQ ID №：3的氨基酸残基序列的蛋白质。

3、权利要求1或2所述植物抗逆性相关蛋白的编码基因。

4、根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述植物抗逆性相关蛋白的cDNA基因，具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：3蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

5、根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述植物抗逆性相关蛋白的基因组基因，具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：3蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

6、含有权利要求3、4或5所述植物抗逆性相关蛋白的编码基因的表达载体。

7、含有权利要求3、4或5所述植物抗逆性相关蛋白的编码基因的细胞系。

8、含有权利要求3、4或5所述植物抗逆性相关蛋白的编码基因的宿主菌。

9、一种利用权利要求3、4或5所述植物抗逆性相关蛋白的编码基因增强植物抗逆性的方法，是将所述植物抗逆性相关蛋白编码基因插入真核细胞表达载体，得到含有所述植物抗逆性相关蛋白编码基因的重组表达载体，将该重组表达载体导入目的植物，从表达所述植物抗逆性相关蛋白的植株或所述植物抗逆性相关蛋白表达量增加的植株中筛选得到抗逆性增强的植株。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体为将所述植物抗逆性相关蛋白编码基因插入去除GUS基因的pCAMBIA3301得到的pCAMBIA3301-TaP5CR。

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