CN100445298C - 植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因与应用。该植物抗逆性相关蛋白，其氨基酸残基序列如序列表中的SEQ ID NO：2所示。将本发明的植物抗逆性相关蛋白的编码基因转入植物中，可增强植物的抗逆性，特别是可以增强对盐、和氧化性的抗性。

Description

植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

土壤盐渍化对农业的威胁是一个全球性的问题，据统计全球盐碱土约有10亿公顷，占世界陆地面积近7.6％。我国是一个发展中的农业大国，全国盐碱土约有0.2亿多公顷占全国耕地面积的1/3。盐分胁迫能显著的抑制植物的生长，甚至导致植物的死亡。在长期的进化过程中，不同植物形成了不同的机制来适应盐分的胁迫，同时其抗盐能力也各不相同。大多数农作物都是甜土植物，对盐分非常敏感，而盐生植物虽然能在高盐条件下生存，但它们的经济价值往往非常有限，提高作物的抗盐能力已经成为我国农业生产和科研中的重要内容。

植物对盐分的抗性是一个多基因控制的复杂性状。盐分对植物的影响涉及到植物体内的各个方面和代谢过程。包括离子毒害，渗透胁迫和氧化胁迫以及光合作用。类胡萝卜素是植物天线系统和反应中心的叶绿素结合蛋白的重要组成部分。它可以通过叶黄素循环参与植物非光化学猝灭，保护植物的光合系统。在植物的叶绿体，线粒体，过氧化物体中在电子传递过程中往往产生活性氧，破坏植物的膜系统和代谢途径。类胡萝卜素可以维护细胞的膜的稳定性。在盐分胁迫下，植物体内的ROS含量增加，因此类胡萝卜素对消除植物在盐胁迫下的ROS发挥了更加重要的作用。同时类胡萝卜素是植物激素ABA和GA的前体，这些激素能够调节细胞在逆境中的基因表达。因此类胡萝卜素对于植物的抗逆机理中占有重要的作用。

目前关于类胡萝卜素在植物抗逆方面的研究还非常有限。Davison等将拟南芥β-胡萝卜素羟化酶基因置于35S启动子下成功转化拟南芥获得转基因植株，检测表明，转基因植株中三种涉及叶黄素循环的类胡萝卜素含量总和比未转化植株提高了2倍，提高了转基因植株对强光合高温的抗性。

等将细菌类胡萝卜素羟化酶基因crtZ转入烟草增加了植株对UV的抗性。

八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase，PSY)是类胡萝卜素生物合成途径中的关键酶。它催化由两分子的GGPP缩合成对称的C₄₀的八氢番茄红素(7，8，11，12，7’，8’，11’，12’-八氢-ψ，ψ-胡萝卜素)。目前NCBI数据库中登录的PSY基因已经达到172个，绝大部分是从细菌等微生物中克隆的，而植物中只有拟南芥，柑桔等几种作物。

通过将欧氏杆菌八氢番茄红素合成酶crtB与油菜种子特异启动子构建成种子特异性表达载体转化油菜，转基因种子中类胡萝卜素的含量增加50倍，其主要类胡萝卜素成分为α-胡萝卜素和β-胡萝卜素(Plant J，20：401-412)。

在盐分胁迫下，甜土植物的光合速率往往由于大量的Na⁺聚集引起氧化胁迫而显著降低。盐角草是一种真盐生植物，与甜土植物不同的是，在200mM NaCl下盐角草的光合速率不仅没有受到抑制，反而显著升高。了解类胡萝卜素在盐角草抗盐机理方面的功能具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的植物抗逆相关蛋白，名称为SePSY，来源于盐角草(Salicornia europaea L.)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。

其中，序列表中的序列1由419个氨基酸残基组成。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述植物抗逆性相关蛋白编码基因(SePSY)也属于本发明的保护范围。

上述植物抗逆性相关蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的DNA；

3)与序列表中SEQ ID №：1的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

其中，序列表中的SEQ ID №：1由1655个脱氧核苷酸组成，自5′端第104-1360位脱氧核苷酸为编码序列。

含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及工程菌均属于本发明的保护范围。

本发明的SePSY基因可用现有的方法构建到现有的植物表达载体中，可在其转录超始核苷酸前加上包括组成型启动子、增强启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、发育阶段特异性启动子在内的任何一种启动子。为了便于对转SePSY基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(Bar基因、GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。携带有本发明的SePSY基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株，获得抗逆性提高的植株。

实验证明，在逆境条件下，转SePSY拟南芥比野生型拟南芥具有较强的抗逆性，特别是具有较强的抗盐性和抗氧化性。转基因拟南芥的光合效率和气孔导度得到了提高，促进了转基因株系的生长。

将本发明的植物抗逆性相关蛋白的编码基因按常规方法转入其他植物中，可增强植物的抗逆性，特别是增强对盐、氧化的抗性。

附图说明

图1为盐角草总RNA

图2为SePSY中间片段的获得

图3为3’-RACE首轮PCR扩增产物

图4为3’-RACE巢式PCR扩增产物

图5为5’-RACE PCR扩增产物

图6为SePSY基因全长PCR扩增产物

图7为SePSY与其他生物八氢番茄红素合成酶氨基酸序列比较图

图8为SePSY蛋白的二级结构分析

图9为不同生物PSY蛋白的二级结构比较

图10为SePSY跨膜预测

图11为SePSY全长的PCR扩增

图12为植物表达载体p35S-1301-SePSY构建过程

图13为转基因拟南芥的GUS染色

图14为转基因拟南芥的PCR鉴定

图15为转基因拟南芥的Southern和Northern分析

图16为不同浓度盐胁迫对SePSY转基因拟南芥根系生长影响

图17为100mM NaCl对SePSY转基因拟南芥幼苗生长的影响

图18为百草枯和NaCl处理野生和转基因拟南芥离体叶片产生的斑点

图19为NaCl胁迫下转基因拟南芥和野生植株中的丙二醛含量

图20为NaCl胁迫下转基因拟南芥和野生植株中的H₂O₂含量

图21为NaCl处理下野生和转基因拟南芥叶片的POD，SOD，CAT活性

图22为SePSY超表达拟南芥植株在100mM NaCl胁迫下光合速率的变化

图23为SePSY超表达拟南芥植株在100mM NaCl胁迫下气孔导度的变化

图24为SePSY超表达拟南芥植株在100mM NaCl胁迫下Fv/Fm的变化

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、SePSY蛋白及其编码基因的获得

拟南芥(Arabidopsis thaliana)，生态型为Columbia，22℃，16hr光照培养。

菌株：大肠杆菌：TOP10，购自北京天根公司。

质粒：pUCm-T载体购自上海生物工程公司，氨卞青霉素(Amp)抗性，用于T/A克隆。

SN1301，由pCAMBIA1301载体的GUS基因上游插入单独的35S启动子序列构建而成，具有卡那霉素(Kanamycin)抗性和潮霉素(Hygromycin)抗性，用于植物表达载体的构建。

一、SePSY基因中间片段的获得

盐角草RNA的提取(Trizol法)：

将盐角草幼苗在液氮冷冻条件下充分研磨，保证材料没有融化，将样品转入预冷的离心管，并称重，保证样品在150-200mg之间，迅速加入1ml Trizol，在涡旋器上迅速混匀(小心防止离心管盖胀开)，在15-30℃放置5min，裂解蛋白复合体。然后加入0.2ml氯仿，上下摇动15sec，在15-30℃放置2-3min，再在4℃，12000rpm离心15min，将水相转入新管后，加入0.5ml异丙醇，充分混匀，在15-30℃放置10min。弃去上清，加入75％乙醇1ml，清洗沉淀。在4℃，7500rpm离心5min。室温干燥5-10min。加入20μl Rnase-free的无菌水溶解沉淀，在55-60℃溶解10min。电泳检测结果表明得到盐角草幼苗的总RNA没有降解(图1)。

将盐角草幼苗的总RNA进行反转录合成第一链cDNA。SuperScript^TMIII ReverseTranscriptase，购自Invitrogen公司，按以下成分调和第一链合成反应液：Adapter primer(AP)1.0μl，Total RNA 6.0μl(5μg)，dNTP 1.0μl，DEPC-H₂O 5.0μl，65℃，5min，冰上冷却，瞬时离心。然后加入5×buffer4.0μl，0.1M DTT 1.0μl，Rnaseout 1.0μl，SuperscriptIII1.0μl，混匀离心，50℃，50min，70℃，15min。迅速冰浴，瞬时离心，加入RnaseH 1.0μl，轻轻混匀，37℃，20min。保存于-20℃。

注：AP序列来自Gibco公司的3’RACE System for Rapid Amplification ofcDNA Ends试剂盒。其序列为：AP：

5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’。反应得到第一链cDNA。

通过对GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中拟南芥，水稻，番茄等12种植物的八氢番茄红素合成酶基因核苷酸序列采用ClustalW生物软件进行多重序列比较，在保守序列处设计简并引物。

PSY-1：5’-GAAGCTTATGAT(C/A)G(T/A)TGTGG-3’

PSY-2：5’-CA(A/T/C)ACCGGCCATCT(A/G)CTAGC-3’

以上述得到的第一链cDNA为模板，以PSY-1和PSY-2为引物，通过RT-PCR进行扩增，扩增反应体系为：cDNA 2.0μl(2.0μg)，H₂O 13.3μl，dNTP 0.5μl(10mM)，10×PCR buffer 2.0μl，ExTaq DNA polymerase 0.2μl(5U/μl)，引物(PSY-1)1.0μl(10μM)，引物(PSY-2)1.0μl(10μM)。

按以下程序进行扩增反应：先94℃5min；然后94℃30sec，46℃30sec，72℃1min，共40个循环；最后72℃10min。电泳检测PCR产物，结果如图2所示，得到一条716bp的cDNA中间片段，图2中泳道M为DL2000分子量标准，泳道1和泳道2为PCR扩增获得的716bp的cDNA中间片段。将该cDNA中间片段连接到pUCm-T载体上，转化大肠杆菌Top10，经测序后在GenBank中进行Blastn比较，结果表明，该cDNA与多种植物PSY基因有较高的同源性，因此推测所扩增的DNA为一个PSY基因片段。

二、SePSY基因全序列的获得

1、3’-RACE扩增

根据步骤一得到的716bp的SePSY中间片段的核苷酸序列，设计3’-RACE引物。

PSY-3：5’-GAAACAGATCAAGCGAGCCAG-3’

AUAP：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’

(AUAP来自Gibco公司3’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒)

以PSY-3和AUAP为引物，以步骤一获得的第一链cDNA为模板，退火温度为50℃，进行PCR扩增，扩增体系同步骤一。按以下程序进行扩增反应：先94℃5min；然后94℃30sec，50℃30sec，72℃1min，40个循环；最后72℃10min。结果获得481bp的基因片段，但是效果不好，结果如图3所示，图3中泳道DL2000为DL2000分子量标准，泳道SePSY为PCR扩增结果。

2、3’-RACE巢式扩增：

由于第一次扩增效果不好，故设计巢式引物PSY-4重新扩增。

PSY-4：5’-GAGCCAGGATGTTCTTTGATG-3’

以PSY-4和AUAP为引物，以上述PSY-3和AUAP扩增得到的3’-RACE扩增产物为模板，退火温度为55℃进行PCR扩增。

扩增体系：PCR产物2.0μl(2.0μg)，H₂O 37.6μl，dNTP 1.0μl(10mM)，10×PCR buffer 5.0μl，ExTaq DNA聚合酶0.4μl(5U/μl)，AUAP  2.0μl(10μM)，Primer(PSY-4)2.0μl(10μM)。

按以下程序进行扩增反应：先94℃5min；再94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，共40个循环；最后72℃10min。电泳检测结果表明经两次PCR扩增获得481bp的基因片段(图4)。图4中，泳道DL2000为DL2000分子量标准，泳道SePSY为PCR扩增获得的481bp的片段(箭头示)。

3、5’-RACE扩增

根据步骤1得到的716bp的SePSY的cDNA中间片段的核苷酸序列，设计5’-RACE引物PSY-5进行反转录。

1)反转录

PSY-5：5’-TGGGGGTCATAAGCTGAGTTC-3’。

按照以下成分调和第一链反应液：PSY-5 1.0μl(10μM)，按照步骤1的方法提取的总RNA  6.0μl(5μg)，dNTP 1.0μl，DEPC-H₂O 5.0μl。

将该第一链反应液在65℃反应5min，然后冰上冷却，瞬时离心。然后加入5×buffer 4.0μl，0.1M DTT 1.0μl，Rnaseout 1.0μl，SuperscriptIII 1.0μl，混匀离心，50℃，50min，70℃，15min。迅速冰浴，瞬时离心，加入RnaseH1.0μl，轻轻混匀，37℃，20min。保存于-20℃。

2)5’-RACE第一链cDNA纯化(使用Gibco回收试剂盒)

向第一链反应物中加入120μl Binding solution。将该溶液转入Glassmaxspin carridge中，13000rpm离心20min。将离心柱从离心管中取出，将离心管中溶液转移到另一个新管中保存，直到确定cDNA已经成功回收。并将柱子放回到离心管中。在柱子中加入0.4ml 4℃预冷的1×washing buffer，13000rpm离心20min。倒掉离心管中溶液，并重复3次。用400μl 4℃预冷的70％乙醇洗涤2次。13000rpm离心1min。以去掉70％乙醇。将柱子转移到另外一个新管中，加入50μl 65℃预热的灭菌蒸馏水，13000g离心20sec，回收cDNA。

3)第一链cDNA的加尾反应

将纯化回收的第一链cDNA 9.5μl(9.5μg)，5×Tailing buffer5.0μl，0.1％BSA2.5μl和2mM dCTP 6.0μl混合均匀后在94℃变性2min，冰上冷却1min。加入TdT 2.0μl，在37℃反应30min，65℃失活10min。

4)5’-RACE第一轮PCR

Abridged anchor promer：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG-3’

第一轮PCR反应体系：第一链cDNA 2.0μl(2.0μg)，H₂O 37.6μl，dNTP 1.0μl(10mM)，10×PCR buffer 5.0μl，ExTaq DNA polymerase 0.4μl(5U/μl)，Abridged anchor promer 2.0μl(10μM)，引物(PSY-5)2.0μl(10μM)。

扩增程序：先94℃5min；然后94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，共40个循环；最后72℃10min。

5)第二轮巢式PCR

由于扩增效果特异性较差，扩增条带弥散，根据引物PSY-5，设计巢式引物PSY-6：5’-ATCAGTCCTCCTACACCACAC-3’

以PSY-6和AUAP为引物，退火温度为55℃进行PCR扩增，扩增体系：5′RACE第一轮PCR产物2.0μl(2.0μg)，H₂O 37.6μl，dNTP 1.0μl(10mM)，10×PCR buffer 5.0μl，ExTaq DNA polymerase 0.4μl(5U/μl)，AUAP 2.0μl(10μM)，引物(PSY-6)2.0μl(10μM)。

按以下程序进行扩增反应：先94℃2min；然后94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，共40个循环；最后72℃10min。4℃保存。电泳检测。

6)第三轮巢式PCR

为了得到更加特异性的目标片段，根据PSY-6设计巢式引物PSY-7：

PSY-7：5’-CTCAGCACAAACTTCACCAC-3’

以PSY-7和AUAP为引物，退火温度为50℃再次进行巢式扩增，扩增体系和程序的其他条件同步骤5)。

最终得到723bp的PSY基因5’序列。第一轮、第二轮和第三轮5’-RACE PCR的产物电泳图分别如图5中A、B、C所示，图5中A、B、C中的泳道DL2000为DL2000分子量标准，图5中C中泳道SePSY为PCR扩增获得的723bp的片段。

4、SePSY全长cDNA片段的扩增

根据测定的SePSY基因5’-RACE，3’-RACE以及中间片段的序列，采用DNAMAN软件进行序列拼接，获得全长为1655bp的核苷酸序列。然后设计引物扩增全长的cDNA片段。

PSY-8：5’-CAGATAGTGGAAGGGTTTGG-3’

PSY-9：5’-GGCGGAAAA GAAAATGTTGC-3’

以PSY-8和PSY-9为引物，以盐角草幼苗的总RNA反转录合成的第一链cDNA为模板进行PCR扩增。

扩增体系为：盐角草幼苗的总RNA反转录合成的第一链cDNA 2.0μl(2.0μg)，H₂O 37.6μl，dNTP 1.0μl(10mM)，10×PCR buffer 5.0μl，ExTaqDNA聚合酶0.4μl(5U/μl)，PSY-82.0μl(10μM)，PSY-92.0μl(10μM)。

按以下程序进行扩增反应：先94℃3min；然后94℃30sec，48℃30sec，72℃1.5min，共40个循环；最后72℃10min。4℃保存。电泳检测结果如图6所示，表明获得1579bp的片段。测序结果表明该1579bp的片段具有由自序列1的5′端的第2至1580位脱氧核苷酸组成的核苷酸序列。

经NCBI检索和许多物种的PSY基因有很高的同源性，推测为盐角草的PSY基因，命名为SePSY。SePSY具有序列表中序列1的核苷酸序列。该序列包括1257bp的开放读码框(open reading fram，ORF)，即自序列1的5′端第104-1360位的核苷酸序列；103个脱氧核苷酸的5′非翻译区(untranslated region，UTR)，即自序列1的5′端第1-103位的核苷酸序列；269个脱氧核苷酸的3′非翻译区(自序列1的5′端第1361-1630位的核苷酸序列)和25个脱氧核苷酸的多聚腺苷酸尾(自序列1的5′端第1631-1655位的核苷酸序列)。此cDNA编码一个419个氨基酸的蛋白质，推测分子量为47.2kDa，等电点为8.92。

5、SePSY蛋白的同源性分析

为了将盐角草的SePSY的蛋白序列和其它细菌、蓝藻和高等植物的PSY基因编码的蛋白进行同源性分析，从NCBI网站上检索到农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens str.C58)，蓝藻(Synechococcus elongatus PCC 7942)，胡萝卜(Daucus carota)，水稻(Oryza sativa)，番茄(Lycopersicon esculentum)，柑桔(Citrus unshiu)，拟南芥(Arabidopsis thalana)等植物同源基因的蛋白序列。通过DNAMAN软件分析结果表明：SePSY蛋白编码的氨基酸序列与它们的同源性分别为20％，46％，65％，68％，72％，72％，73％。说明盐角草PSY蛋白与细菌的同源性最低，在高等植物中它们的同源性都比较高。相比之下，在N端的同源性要明显低于C端(图7)。

6、SePSY基因二级结构分析

植物的PSY在细胞质中合成后，被运输到叶绿体，线粒体以及其它质体中发挥功能，参与类胡萝卜素的合成。免疫定位试验表明在辣椒它主要定位在有色体中。经Chlorop1.1分析软件网上预测(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)，SePSY蛋白在自序列2的氨基端第1-65位氨基酸残基序列为信号肽(图8)。

通过HNN软件包对盐角草，拟南芥，蓝藻和欧文氏菌的二级结构进行预测(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_nn.html)，结果表明盐角草SePSY有419个氨基酸，其中有204个氨基酸形成了α-螺旋，形成多个连续的α-螺旋片段，占氨基酸数目的48.69％(图9中D)；拟南芥中形成α-螺旋的氨基酸占49.53％(图9中C)，而欧文氏菌(Pantoea agglomerans)(图9中A)和蓝藻(Synechococcus elongates)中(图9中B)形成α-螺旋的氨基酸比例相对较低。盐角草，拟南芥和蓝藻在C端有4个相对保守的α-螺旋片段，但在细菌中则没有。图9中

疏水性分析表明SePSY在自序列2的氨基端1-19和242-264氨基酸区域有2个跨膜区(图10)。

实施例2、SePSY及其编码基因的功能验证

一、SePSY基因表达载体的构建

为了鉴定SePSY的功能，在SePSY基因序列的3’和5’非编码区设计了一对引物PSY-10：5’-TTGGATCCATGCCTCTTGCTTTGCTATG-3’(BamHI)，PSY-11：5’-TTGGATCCCTACACCTTTGACATGCTAG-3’(BamHI)。通过RT-PCR得到一条1276bp的DNA序列，该片段具有自序列1的5′端第104-1363位核苷酸序列。将它克隆到pUCm-T载体中，测序结果表明该片段序列包括SePSY编码序列(图11)。

将PCR获得的片段和载体SN1301分别进行BamHI单酶切。为了减少载体和片段自连，酶切的SePSY片段和SN1301载体用碱性磷酸酶去磷酸化，并将片段正向连接到植物表达载体SN1301的35S启动子下，将测序表明正确的重组载体命名为p35S-1301-SePSY(p35S-1301-SePSY的构建流程示意图如图12所示)。

二、转SePSY基因拟南芥的鉴定及其功能分析

1、转SePSY基因拟南芥的获得及筛选

1)潮霉素抗性筛选

将构建的质粒p35S-1301-SePSY转入农杆菌LBA4404，用蘸花侵染法转化拟南芥。转化后得到的T1代种子用10％次氯酸钠消毒后平铺在含潮霉素25mg/L的MS₀培养基(未添加任何激素的MS基本培养基)上，4℃冰箱中春化3d，在培养箱中暗培养4d后检查种子的发芽和生长情况。生长良好且植株高者可初步确定为转基因植株，即T1代转基因植株。将其在光下培养3d后移入花盆中继续培养。T1代转基因植株所结的种子和由该种子长成的植株为T2代，依此类推，T2、T3分别表示转基因植株第2代和第3代。通过筛选得到73株T1代阳性苗。

2)GUS组织化学分析

将73株T1代转p35S-1301-SePSY植株的叶片经GUS组化反应液染色后出现不同程度的显色反应，其中有16株蓝色非常明显，而野生型(WT)叶片则无蓝色，暗示无GUS活性存在，部分T1代转p35S-1301-SePSY植株(P1、P2、P3、P4、P5)叶片的GUS染色结果如图13所示。

3)转基因拟南芥植株的PCR鉴定

以PSY-10，PSY-11为引物，对经GUS染色鉴定为阳性的转p35S-1301-SePSY T1代拟南芥基因组DNA进行PCR检测，以野生型拟南芥(图14中WT)和水(图14中CK)为阴性对照，结果表明所有GUS染色为阳性的转p35S-1301-SePSY T1代拟南芥中均可扩增到1276bp的条带，而野生型植株中没有扩增产物出现，部分转p35S-1301-SePSY单株的PCR产物电泳图片如图14(箭头示)。

4)转基因拟南芥植株的Southern杂交和Northern杂交

将GUS染色和PCR检测为阳性的单株提取DNA，以GUS基因的特异引物GUS-1和GUS-2，以p35S-1301-

为模板扩增得到720bp GUS基因片段为探针进行Southern杂交，α-³²P-dCTP标记探针的制备方法如下所述

设计GUS基因的特异引物为：

GUS-1：5’-GCATGTTACGTCCTGTAGAAACCC-3’

GUS-2：5’-CAAAGCCAGTAAAGTAGAACGGT-3’

按照如下体系盒程序标记探针：10×buffer 5.0μl，dATP、dTTP、dGTP(2.5mmol/L each)3.0μl，30μCiα-³²P dCTP 3.0μl，Gus-1(10mol/L)1.0μl，Gus-2(10μmol/L)1.0μl，模板DNA(0.1μg/μl)1.0μl，Taq polymerase(2.5U/μl)1.0μl，无菌水33μl。

使用PCR产物纯化试剂盒进行纯化(天为时代)

Southern杂交结果表明P1，P2，P4单株表现为单拷贝，P3为双拷贝(图15中A)。

将Southern结果为阳性的转p35S-1301-SePSY拟南芥植株提取RNA，以上述PSY-10，PSY-11为引物，以盐角草幼苗的总RNA反转录合成的第一链cDNA为模板，扩增得到的片段为探针，进行Northern杂交，

探针标记体系为：10×buffer 5.0μl，dATP、dTTP、dGTP(均2.5mmol/L)3.0μl，30μCiα-³²P dCTP 3.0μl，Primer PSY-10(10mol/L)1.0μl，Primer PSY-11(10μmol/L)1.0μl，模板DNA(0.1μg/μl)1.0μl，Taqpolymerase(2.5U/μl)1.0μl，无菌水33μl。

结果表明转p35S-1301-SePSY拟南芥植株P1，P2表现出很强的杂交信号，表明SePSY已经在转基因拟南芥中转录。而对照野生型(WT)拟南芥没有任何杂交信号，部分结果如图15中B所示。

2、功能鉴定

1)盐分对转p35S-1301-SePSY拟南芥幼苗生长的影响

A、盐分对转p35S-1301-SePSY拟南芥植株根系的影响

将PCR鉴定为转p35S-1301-SePSY拟南芥阳性苗的T1代单株收获的种子繁殖T2代，使其后代分离。T2代的种子通过潮霉素筛选得到纯合的T2代单株。纯合的转p35S-1301-SePSY拟南芥株系P1的T2代和野生型的种子经10％次氯酸钠消毒后，均匀的点播到1/2MS₀培养基(未添加任何激素的MS基本培养基)上，发芽7d后的幼苗，选择长势一致的幼苗一部分转移到含有不同浓度(100mM、150mM)盐分的1/2MS₀培养基(未添加任何激素的MS基本培养基)上，一部分继续在1/2MS₀培养基上培养，培养12天后，观察拟南芥根系。

结果如图16所示，结果表明在不加盐的1/2MS₀培养基(未添加任何激素的MS基本培养基)上转p35S-1301-SePSY拟南芥幼苗的根系明显长于对照，虽然根长之间没有明显变化，但转基因植株根系的须根发达，须根的数目和叶面积比对照明显增加。在100mM NaCl下，转p35S-1301-SePSY拟南芥的根系也比对照有所增加，但是在150mM NaCl下则二者没有明显变化，说明转p35S-1301-SePSY拟南芥植株对盐分的耐受性虽然有所提高，但是当浓度达到150mM NaCl时，转p35S-1301-SePSY拟南芥生长也完全被抑制。图16中A为一直在1/2MS₀培养的植株；图16中B为经100mM NaCl处理的植株；图16中C为经150mM NaCl处理的植株。

B、盐分对转p35S-1301-SePSY拟南芥幼苗生长的影响

将野生型(WT)和转p35S-1301-SePSY拟南芥纯合株系P1，P2，P3的T3代种子在不加潮霉素的MS₀培养基上发芽后，选长势一致的幼苗移栽到营养钵中，培养3周后分别用1/4Hoagland溶液(对照)和100mM NaCl(用1/4Hoagland配置)处理幼苗根系。结果如图17所示，结果表明在对照和盐分胁迫下，转p35S-1301-SePSY拟南芥的T3代株系长势都强于野生型(WT)，在100mM NaCl下，转p35S-1301-SePSY拟南芥的T3代株系的优势更加明显，同时不同转p35S-1301-SePSY拟南芥的T3代株系之间也有一定的差别，处理4d后，野生型则开始出现坏死的斑点，且叶片呈萎焉状，转p35S-1301-SePSY拟南芥的T3代株系却没有出现任何胁迫症状。

2)对氧化胁迫的影响

A、不同浓度盐分和百草枯处理对拟南芥离体叶片的影响

百草枯又名甲基紫精，是一种1，1’-双甲基-4，4’-双吡啶化合物，也是目前人们经常使用的一种O₂ ^-源，百草枯在绿色植物体内是以二价阳离子形式存在，它在叶绿体PSI接受一个电子形成蓝色的单价阳离子的百草枯自由基，然后在分子氧的参与下又迅速地复原成原来的二价形式，并伴随O₂ ^-的产生。

采集野生型和转p35S-1301-SePSY拟南芥纯合株系P1，P2，P3的T3代植株相同部位的叶片分别浸泡在蒸馏水，5μM，10μM百草枯和200mM，400mM NaCl溶液中，1-2d后拍照。每个试验设三个重复。

结果如图18所示，结果表明野生型植株的叶片在百草枯处理下仅24hr后叶片即明显出现坏死的斑点，并迅速扩大，叶片逐渐变白。而转p35S-1301-SePSY拟南芥植株的叶片仅在边缘部分有少量斑点出现，大部分叶片仍保持绿色。相比之下转p35S-1301-SePSY拟南芥T3代植株在盐胁迫要经过2d以后才逐渐出现斑点症状，转p35S-1301-SePSY拟南芥株系比野生型对盐胁迫有较强抗性，但转p35S-1301-SePSY拟南芥株系和野生型对照之间的差异远没有氧化胁迫明显。说明转p35S-1301-SePSY拟南芥植株对氧化胁迫的抗性更大。

B、不同盐分对转p35S-1301-SePSY幼苗丙二醛含量的影响

盐分胁迫下，植物体内产生的活性氧将对细胞膜造成严重的伤害。活性氧和细胞膜的多不饱和脂肪酸作用进而生成丙二醛，因此丙二醛是衡量膜脂过氧化强弱的重要指标。

将野生型(WT)和转p35S-1301-SePSY拟南芥植株P1、P2、P3的T3代种子在不加潮霉素的1/2MS₀培养基上发芽后，选长势一致的幼苗移栽到营养钵中，培养3周后分别用1/4Hoagland和100mM NaCl(用1/4Hoagland配制)处理幼苗根系。5天后，称取0.7g植株叶片，加入7ml 5％三氯乙酸(TCA)溶液在研钵中研磨，匀浆在3000rpm离心10min，取上清2ml加入2ml 0.5％的硫代巴比妥酸溶液，摇匀，沸水浴30min。立即将试管放入冷水中。冷却后，3000rpm离心15min，取上清液并量其体积，以0.5％硫代巴比妥酸溶液为空白测吸光度A₄₅₀，A₅₃₂和A₆₀₀。提取液中MDA的含量(μM)＝6.45(A₅₃₂-A₆₀₀)-0.56A₄₅₀，并进一步算出其在植物组织中的含量。结果如图19所示，表明在不加盐的条件下(1/4Hoagland处理)，野生型和转基因植株的丙二醛含量没有显著的的差别，但是在100mM NaCl下，野生型植株丙二醛含量显著高于转p35S-1301-SePSY拟南芥植株P1、P2、P3的T3代植株。在100mM NaCl下野生型植株丙二醛含量分别是P1、P2、P3的T3代植株的1.28，1.12，1.19倍。说明转基因植株中丙二醛的含量明显降低，对膜脂的过氧化作用的防护显著提高。

C、不同盐分对转p35S-1301-SePSY幼苗H₂O₂含量的影响

盐分胁迫往往造成植株体内活性氧含量增加，从而对植株造成氧化胁迫。H₂O₂是植物体内的一种主要的活性氧。植物PSI形成的O₂ ^-既可以进入类囊体膜外的基质并通过酶促和非酶促的歧化反应生成H₂O₂，也可以在过剩的光强下，参与PSII捕光叶绿素复合蛋白的紫黄质转化为玉米黄质的过程，并将来自PSI的O₂ ^-在SOD催化下转化为H₂O₂。

按照上述方法，用1/4Hoagland和100mM NaCl(用1/4Hoagland配制)处理野生型(WT)和转p35S-1301-SePSY拟南芥植株P1、P2、P3的T3代幼苗根系，然后，测定H₂O₂含量。拟南芥幼苗中H₂O₂含量测定是参照Patterson等(1984)(AnalBiochem，139(2)：487-492)的方法。称取3g新鲜的拟南芥叶片加入10ml冷丙酮，3000×g离心15min，取上清液3ml，加入0.2ml 0.2M TiSO₄，0.4ml浓氨水，3000×g离心10min，弃上清液，沉淀用冷丙酮悬浮洗涤3次。最后在沉淀中加入10.0ml 2.0M H₂SO₄溶解。于415nm处测定光吸收值。

结果如图20所示，结果表明，转p35S-1301-SePSY拟南芥植株在1/4Hoagland和100mM NaCl处理下，植株体内的H₂O₂含量皆比野生型显著降低。在1/4Hoagland下，转p35S-1301-SePSY拟南芥植株中H₂O₂含量比野生型下降了33-65％，而在100mM NaCl处理下，则下降了5-30％。

D、不同盐分对转p35S-1301-SePSY拟南芥植株幼苗POD，CAT，SOD酶活的影响

按照上述方法，将野生型(WT)和转p35S-1301-SePSY拟南芥植株P1、P2、P3的T3代幼苗用100mM的NaCl处理，然后，按照如下方法检测POD，CAT，SOD活性：

SOD活性的测定：将2.0g样品加提取介质10ml(50mM，pH＝7.8磷酸缓冲液，内含1％PVP)，在冰上研磨成匀浆，4℃，13000rpm离心30min，上清液为酶提取液。取20μM核黄素溶液(以含0.1mM EDTA的50mM pH＝7.8磷酸缓冲液配制)0.3ml、750μM的硝基四唑蓝0.3ml，130mM蛋氨酸0.3ml和酶提取液0.1ml于试管中，在3000Lux灯下放置15min，然后立即遮光停止反应，在560nm波长处测OD值，以0.01ml 50mM Ph＝7.8的磷酸缓冲液作空白。酶活力，即SOD活力(U/g FW)＝((D1-D2)×V)/(D1×Vt×W×50％)，式中D₁为空白对照吸光值，D2为测定样品的吸光值，ΔA：为A₀与加入酶反应液的吸光值差，W：为样品鲜重，V：为酶提取液的总体积，Vt：为加入酶液的体积。

POD活性的测定：准确称取2.0g样品，加入10ml 200mmol/L的磷酸缓冲液(pH＝6.4)，将样品于冰上研磨成匀浆，13000rpm，4℃离心30min，上清液即为酶提取液，保存在冷处备用。取酶提取液0.1ml，0.1％愈创木酚2ml于比色杯中30℃5min，加0.08％过氧化氢1ml。在470nm波长下测OD值，每隔10sec读数1次，以反应混合液中加0.1ml 200mM的磷酸缓冲液(pH＝6.4)为空白对照。酶活性以每分钟吸光度变化值表示。

CAT活性的测定：准确称取2.0g样品，加入10ml 50mM磷酸缓冲液(pH＝7.0)，将样品于冰上研磨成匀浆，13000rpm，4℃离心30min，轻轻吸取上清即为酶提取液。取0.2ml酶提取液，加入2.8ml 40mmol/L H₂O₂，10sec后在240nm扫描1min内吸光值的变化，间隔10sec。计算CAT的活性。

结果如图21所示，结果表明，在盐胁迫下，野生型和转p35S-1301-SePSY拟南芥株系的细胞保护酶表现出不同的变化趋势。野生型和转p35S-1301-SePSY拟南芥植株在1/4Hoagland下POD的活性无显著变化，但是在100mM NaCl下转p35S-1301-SePSY拟南芥植株的POD活性比野生型明显升高。在100mM NaCl下转p35S-1301-SePSY拟南芥植株P1、P2、P3的T3代植株的POD活性分别是野生型的1.88，1.84，1.07倍(图21中A)。

转p35S-1301-SePSY拟南芥植株在1/4Hoagland下SOD活性比野生型植株显著升高，在100mM NaCl下它们的差异却并不显著。野生型植株在100mM NaCl比1/4Hoagland下SOD的活性显著提高，但加盐对转p35S-1301-SePSY拟南芥植株SOD活性变化不大(图21中C)。

无论野生型还是转p35S-1301-SePSY拟南芥植株CAT的活性100mM NaCl下均比1/4Hoagland下有所提高，但是在两种条件下之间的差异并不明显。转p35S-1301-SePSY拟南芥株系在盐胁迫下CAT的活性比野生型略有升高，但差异也不显著(图21中B)。

3)盐分胁迫对转p35S-1301-SePSY拟南芥光合作用的影响

A、盐分对转p35S-1301-SePSY拟南芥幼苗光合速率和气孔导度的影响

将野生型(WT)和转p35S-1301-

拟南芥植株L1，L4的T3代种子在不加潮霉素的1/2MS₀培养基上发芽后，选长势-致的幼苗移栽到营养钵中，培养3周后分别用1/4Hoagland和100mM NaCl(用1/4Hoagland配制)处理幼苗根系。5天后，用Li-6400光合测定系统及其配备的拟南芥叶室(Li-COR公司，美国)测定不同处理的野生型(WT)和转p35S-1301-SePSY拟南芥植株P1、P2、P3的T3代幼苗叶片的光合速率和气孔导度。早上9:00-11:00进行，温室中幼苗的叶片在强光下照射30min后测定。每个样品设三个重复，每个重复测5个数据。

结果如图22、23所示，结果表明气孔导度变化和光合速率变化趋势基本同步。无论是野生型还是转p35S-1301-SePSY植株，其光合效率和气孔导度在100mM NaCl下均比1/4Hoagland下显著下降。但是转p35S-1301-SePSY植株在100mM NaCl和1/4Hoagland下的光合速率均比野生型显著提高，其中在1/4Hoagland下转p35S-1301-SePSY拟南芥植株P1、P2、P3的T3代株系光合速率分别比野生型提高了0.69，1.20，1.18倍，在100mM NaCl下转p35S-1301-SePSY拟南芥植株P1、P2、P3的T3代株系光合速率分别比野生型提高了1.25，0.92，1.32倍，(图22)。而在盐胁迫下转p35S-1301-SePSY拟南芥植株P1、P2、P3的T3代植株气孔导度则比野生型分别提高了2.33，0.88，0.61倍(图23)。

B、盐分对转p35S-1301-SePSY拟南芥幼苗荧光特性的影响

用FMS₂型脉冲调制荧光仪(英国Hansatech公司)于晴天测定叶绿素荧光。将不同浓度NaCl处理的拟南芥幼苗叶片暗适应20min后，分别测定叶片的Fo，Fm，Fv和Fv/Fm。Fo：初始荧光强度，它是已经暗适应的光合机构全部PSII中心都开放时的荧光强度。Fm：黑暗中最大荧光强度，它是已经暗适应的光合机构全部PSII中心都关闭时的荧光强度。Fv：黑暗中最大可变荧光强度，Fv＝Fm-Fo，表明潜在的PSII的光化学效率。Fv/Fm：没有遭受环境胁迫并经过充分暗适应的植物叶片PSII最大的量子效率指标。

结果如图24所示，结果表明无论在100mM NaCl还是1/4Hoagland下转p35S-1301-SePSY拟南芥植株P1、P2、P3的T3代株系均比野生型的Fv/Fm值均显著提高。在100mM NaCl下，野生型植株的Fv/Fm值和无盐相比显著下降，而转p35S-1301-SePSY拟南芥植株变化并不显著。

SePSY在拟南芥中过量表达提高了植物的光合效率机理

类胡萝卜素是植物体内最广泛的一种天然色素，在光合作用中发挥了重要的作用。它不仅作为植物捕光色素，存在于植物捕光色素蛋白复合体中。每个LHCII单体中含有2个类胡萝卜素分子和2个叶黄素分子。它能够吸收400和500nm波长的光，并将它传递给中心色素叶绿体分子。两个胡萝卜素结合到光系统II核心复合体的D2蛋白上，能淬灭光合作用过程中产生的三线激发态叶绿素分子，单线氧等活性氧分子。同时作为植物光系统的组成成分，稳定捕光色素蛋白系统和类囊体膜系统。实验表明SePSY转基因株系在1/2MS培养基上幼苗的根系比野生型发达，叶片面积增大(图16)。转基因拟南芥植株的幼苗在1/4Hoagland和100mM NaCl条件下幼苗的长势都明显好于野生型，同时叶色变绿(图17)。在1/4Hoagland和100mM NaCl条件下，SePSY转基因拟南芥株系的光合速率和气孔导度都比野生型显著提高(图22)。说明过量表达SePSY促进了植株的光合作用。这可能是由于SePSY基因的表达促进了体内类胡萝卜素的合成，造成体内类胡萝卜素含量增加，类胡萝卜素作为植物的捕光色素促进了植物光合作用，同时防止植物的光系统II和细胞的膜系统不受伤害。无论在100mM NaCl还是1/4Hoagland下转基因株Fv/Fm值均比野生型显著提高说明转基因株系的光系统II伤害较轻(图24)。同时在盐胁迫下转基因株系中丙二醛的含量显著低于野生型，表明膜系统脂质过氧化伤害程度低(图19)。

SePSY在拟南芥中过量表达诱导体内抗氧化保护酶活性的提高的机理实验表明转SePSY基因拟南芥在100mM NaCl下POD活性比野生型明显升高。同时SOD活性在加盐和不加盐条件下都保持较高的水平。说明SePSY基因在35S启动子下组成型表达促进了转基因拟南芥体内抗氧化保护酶活性的提高。这可能是与转基因植株体内的ABA的调节有关。在胡萝卜素的合成途径中，PSY催化两个GGPP分子缩合产生八氢番茄红素，这是催化类胡萝卜素合成的第一步，也是胡萝卜素合成的关键步骤。八氢番茄红素经过两次β-环化进而生成β-胡萝卜素，而β-胡萝卜素是植物激素ABA的前体物质。ABA作为植物的逆境激素在许多不同的环境胁迫下调节植物的生理代谢过程。许多证据表明ABA主要是诱导植物细胞和组织中活性氧的产生(Nature，406：731-734；Planta，223：57-68)和抗氧化酶基因的表达，提高植株的抗氧化防卫能力(Plant Sci 138：27-34；Planta，223：57-68)。Zhang等研究表明ABA处理提高了植株体内H₂O₂的含量，诱导MAPK的活性，进而调节诱导抗氧化酶CAT，APX，SOD和GR酶活的提高，降低植物体内的活性氧，使植物体内活性氧的含量和抗氧化酶的活性维持在一个平衡状态。SOD是植物体内最重要的一种抗氧化物酶，在不加盐的情况下植株体内SOD比野生型显著提高(图21)，从而使植物体内活性氧维持在一个较低的水平，从而促进植物的生长。实验表明在SePSY转基因拟南芥植株中H₂O₂的水平明显降低(图20)。

SePSY转基因拟南芥主要通过增加抗氧化胁迫能力来提高对盐分的抗性

转SePSY基因拟南芥植株的叶片在百草枯处理下抗氧化能力明显强于野生型。野生型拟南芥植株的叶片在百草枯处理下仅24hr后叶片即明显出现坏死的斑点，并迅速变白。转基因植株的叶片转基因株系的叶片仅在边缘部分有少量斑点出现。相反，SePSY转基因株系叶片在不同浓度的NaCl处理下和野生型相比，虽有一定抗性，但远没有氧化胁迫明显(图18)。这可能是由于类胡萝卜素对氧化胁迫的提高是直接效应。高盐能够产生过量的活性氧而造成氧化胁迫，SePSY转基因株系提高了体内的类胡萝卜素含量，增强了对氧化胁迫的抗性，这样间接的提高了植物对盐分适应能力。但是植物对盐分的抗性是一个由多个基因控制的复杂性状，涉及到植物体内的各个生理代谢过程。清除ROS只是增加植物对盐分适应性的一个方面。

同时过量表达SePSY基因拟南芥对植物生长的促进作用是有限的。而在1/4Hoagland处理下，转基因拟南芥植物的长势明显强于野生型，在1/2MS培养基上次生根更加发达，而且叶面积增大(图16)。植株的光合速率，气孔导度和SOD的活性比野生型升高。这可能是类胡萝卜素作为植物的捕光色素和光系统反应中心组分，高浓度的类胡萝卜素促进了植株的光合作用。但随着盐分的增加，转基因植物由于受到胁迫后叶绿素降解，从而抑制植物生长。在甜椒中，光强从150μmol m^-2s^-1升高到280μmol m^-2s^-1时，类胡萝卜素光氧化的速率已经超过了自身的合成速率(J Plant Physiol.2003；160(5)：439-43.)。因此转基因拟南芥株系在150mM NaCl下，植株的根系和野生型没有明显差别(图16)。

序列表

<160>2

<210>1

<211>1655

<212>DNA

<213>盐角草(Salicornia europaea L.)

<400>1

ccagatagtg gaagggtttg gttttttgag gattgttata ttcaattgaa aattgagctg      60

aaagaggaga ggagaataca ctagtttttt ttttaataag accatgcctc ttgctttgct     120

atgggttgtg accccaagca cagaggtatg cagtggttta ggtgtcactg attcattggt     180

tggtcgttcc atttccaatg ggaggtctaa aaggatatct aagaagcaag aaaacttgaa     240

ttcttggaga ttgaatgttg caaaaccaaa aaacagatca gaaagatatc cagtactttc     300

gagcatggta gcgaatccaa cgggagagat ggcggttttg tcatccgagc aaagggtgta     360

tgatgtggtg ttgaagcagg cagctttggt gaacagggaa ttgaagaagc gagaggatct     420

ggatcttgat gtaaagccgg atattgcagt tccggggact ctaagcttgc ttggagaggc     480

ttatgatagg tgtggtgaag tttgtgctga gtatgccaag actttttatt tgggaactca     540

gcttatgacc cccacaagaa gaaaggctat ttgggctata tatgtgtggt gtaggaggac     600

tgatgagctt gttgatgggc ctaatgcttc ccatataaca cctactgcct tggataggtg     660

ggaagcgagg ttggaggacc ttttcagtgg ccgtcccttt gatatgcttg acgccgcctt     720

atgtgacact gtcactaggt ttcctattga tatccagcca ttcaaagata tgattgaagg     780

gatgaggctg gatcttagga agtctagata caagaacttc gatgagctgt acctatattg     840

ttattatgtt gctggaactg ttggattgat gagtgttcct gttatgggta tagcacctga     900

atcaaaagcg cctacggaaa gtgtctacaa cgctgcttta gctttaggga ttgcaaatca     960

gcttactaac atattaagag atgttggcga agattcaagg agagggcggg tttatttgcc    1020

ccaagacgaa ttggcacagg caggtctttc agatgaagac atatttactg gaaaagttac    1080

agataaatgg agaaatttca tgaagaaaca gatcaagcga gccaggatgt tctttgatga    1140

agcagaaaaa ggagtttcag agctcagtgc agctagcaga tggccggttt gggcatcatt    1200

gcttctctac cgtgaaatac tagacgaaat tgaagcgaat gactacaata acttcactaa    1260

gagggcttac gtaagcaaag cgaagaagct gctagcattg ccgattgctt atgcaaaggc    1320

aaagcttcca cctcgatcga tttctagcat gtcaaaggtg tagagttcat gcatagaagt    1380

aatgaccaga gtagtggatt aaattgtaaa gcatgaggtg tatatacact gaaaatacat    1440

ataatatgtc tattcatatt gctactaaaa ttcttttacc aggaaagtta atgcaatttt    1500

gttcgaaacc ctcgtctagc ttgtagtgaa atcatgttgt aggattaaaa aggaaatcag    1560

caacattttc tttttccgcc aaaaaattgt tgctctgatc agcaattgta acaagaactt    1620

tttaaggatg aaaaaagaaa aaaaaaaaaa aaaaa                               1655

<210>2

<211>419

<212>PRT

<213>盐角草(Salicornia europaea L.)

<400>2

Met Pro Leu Ala Leu Leu Trp Val Val Thr Pro Ser Thr Glu Val Cys

1               5                   10                  15

Ser Gly Leu Gly Val Thr Asp Ser Leu Val Gly Arg Ser Ile Ser Asn

            20                  25                  30

Gly Arg Ser Lys Arg Ile Ser Lys Lys Gln Glu Asn Leu Asn Ser Trp

        35                  40                  45

Arg Leu Asn Val Ala Lys Pro Lys Asn Arg Ser Glu Arg Tyr Pro Val

    50                  55                  60

Leu Ser Ser Met Val Ala Asn Pro Thr Gly Glu Met Ala Val Leu Ser

65                  70                  75                  80

Ser Glu Gln Arg Val Tyr Asp Val Val Leu Lys Gln Ala Ala Leu Val

                85                  90                  95

Asn Arg Glu Leu Lys Lys Arg Glu Asp Leu Asp Leu Asp Val Lys Pro

            100                 105                 110

Asp Ile Ala Val Pro Gly Thr Leu Ser Leu Leu Gly Glu Ala Tyr Asp

        115                 120                 125

Arg Cys Gly Glu Val Cys Ala Glu Tyr Ala Lys Thr Phe Tyr Leu Gly

    130                 135                 140

Thr Gln Leu Met Thr Pro Thr Arg Arg Lys Ala Ile Trp Ala Ile Tyr

145                 150                 155                 160

Val Trp Cys Arg Arg Thr Asp Glu Leu Val Asp Gly Pro Asn Ala Ser

                165                 170                 175

His Ile Thr Pro Thr Ala Leu Asp Arg Trp Glu Ala Arg Leu Glu Asp

            180                 185                 190

Leu Phe Ser Gly Arg Pro Phe Asp Met Leu Asp Ala Ala Leu Cys Asp

        195                 200                 205

Thr Val Thr Arg Phe Pro Ile Asp Ile Gln Pro Phe Lys Asp Met Ile

    210                 215                 220

Glu Gly Met Arg Leu Asp Leu Arg Lys Ser Arg Tyr Lys Asn Phe Asp

225                 230                 235                 240

Glu Leu Tyr Leu Tyr Cys Tyr Tyr Val Ala Gly Thr Val Gly Leu Met

                245                 250                 255

Ser Val Pro Val Met Gly Ile Ala Pro Glu Ser Lys Ala Pro Thr Glu

            260                 265                 270

Ser Val Tyr Asn Ala Ala Leu Ala Leu Gly Ile Ala Asn Gln Leu Thr

        275                 280                 285

Asn Ile Leu Arg Asp Val Gly Glu Asp Ser Arg Arg Gly Arg Val Tyr

    290                 295                 300

Leu Pro Gln Asp Glu Leu Ala Gln Ala Gly Leu Ser Asp Glu Asp Ile

305                 310                 315                 320

Phe Thr Gly Lys Val Thr Asp Lys Trp Arg Asn Phe Met Lys Lys Gln

                325                 330                 335

Ile Lys Arg Ala Arg Met Phe Phe Asp Glu Ala Glu Lys Gly Val Ser

            340                 345                 350

Glu Leu Ser Ala Ala Ser Arg Trp Pro Val Trp Ala Ser Leu Leu Leu

        355                 360                 365

Tyr Arg Glu Ile Leu Asp Glu Ile Glu Ala Asn Asp Tyr Asn Asn Phe

    370                 375                 380

Thr Lys Arg Ala Tyr Val Ser Lys Ala Lys Lys Leu Leu Ala Leu Pro

385                 390                 395                 400

Ile Ala Tyr Ala Lys Ala Lys Leu Pro Pro Arg Ser Ile Ser Ser Met

                405                 410                 415

Ser Lys Val

Claims (9)

1、一种植物抗逆性相关蛋白，其氨基酸残基序列如序列表中的SEQ ID NO：2所示。

2、根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于：所述抗逆性是抗盐性和/或抗氧化性。

3、权利要求1或2所述植物抗逆性相关蛋白的编码基因。

4、根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述植物抗逆性相关蛋白编码基因的编码序列为自SEQ ID NO：1的5′端第104-1360位脱氧核苷酸。

5、根据权利要求3或4所述的编码基因，其特征在于：所述植物抗逆性相关蛋白的cDNA基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

6、含有权利要求3-5任一所述基因的重组表达载体。

7、含有权利要求3-5任一所述基因的转基因细胞系。

8、含有权利要求3-5任一所述基因的工程菌。

9、权利要求3-5任一所述基因在培育抗逆性植物中的应用，所述抗逆性是抗盐性和/或抗氧化性。

Images