CN104805062B - 一种植物抗性基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物抗性基因及其应用，所述抗性基因编码的氨基酸序列含有水稻OsO3L2或OsO3L3蛋白质序列的截短序列，所述截短序列至少含有一个N‑乙酰转移酶催化结构域，所述N‑乙酰转移酶催化结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。上述基因的转基因植株都表现出对镉、二酰胺、砷和氯化钠的耐受性增加，并且在根茎和稻米中镉积累量显著低于对照。同时还发现植物体内重要元素如锰、铁、铜和锌的含量并未受到影响。此类基因同样可以在水稻幼苗中降低镉累积，因此它们也可能在叶菜和牧草或其他作物的品种改良中使用，以降低人们通过食物链的镉摄入量。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种植物抗性基因及其应用。
背景技术
镉(Cd)是一种高毒性的重金属。研究表明它可以导致肺癌(Nawrot等, 2006)、胰腺癌(Kriegel等, 2006)、乳腺癌(McElroy等, 2006)和子宫癌(Akesson等, 2008)。除了已经明确可以致癌之外，镉也会引起肾小管损伤、鼻炎、肺气肿、软骨病和骨折(Nawrot等,2006; Bertin等, 2006)，以及早期动脉粥样硬化(Messner等, 2009)和引起心血管疾病(Alissa和Ferns, 2011)的高血压(Gallagher和Meliker, 2010)等病症。因为镉在人体内可以累积，特别是肝和肾，所以即使低剂量的长期累积也会导致严重的疾病(Pennemans等,2011)。
镉处理会抑制植物的很多生理过程，比如光合作用、细胞延长、固氮和矿物营养吸收等(Zhang等, 2003; Hassan等, 2005; Wojcik等, 2005; di Toppi和Gabbrieli,1999)。尽管对植物的影响主要表现在可以导致生长抑制(Ranieri等, 2005)，比如引起作物产量损失，但是人们更多关注的是来自食物镉摄入。 比如由于水稻是世界上半数人口的主要食物，水稻已经成为他们主要的镉摄入来源(Cheng等, 2006; Watanabe等, 2004)。2013年广东省分布的报告指出，广东抽验的近半数样品的镉含量超过国家标准。其中来自湖南省部分地区的大米污染比较严重（《广州日报》，2013年5月24日）。2014年，国土资源部发布的分布的调查报告显示，我国耕地的19.4%受到了污染，其中的82.8%为无机物污染，污染最严重的前3位分别是镉、镍和砷（中华人民共和国国土资源部，2014年4月17日）。这些资料显示，镉污染已经对我国人民的健康造成直接的威胁。除了直接摄入大米中的镉，稻草也成为另外一个镉污染源。在一些地区，稻草作为饲料喂养家畜。人们通过消费动物产品（尤其是富集镉的动物肝脏和肾脏），进一步摄入镉。因此，研发具有低镉积累的水稻或其他作物已经成为包括我国在内的镉污染国家的当务之急。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种可提高植物抗性的氨基酸序列以及编码该氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明的另一个目的在于提供上述氨基酸序列或核苷酸序列在培育高抗性和/或低金属积累植物中的应用。
本发明的另一个目的在于提供上述氨基酸序列或核苷酸序列在高抗性和/或低金属积累植物辅助育种中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种提高植物抗性的氨基酸序列，其含有水稻OsO3L2或OsO3L3蛋白质序列的截短序列，所述截短序列至少含有一个N-乙酰转移酶催化结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述N-乙酰转移酶催化结构域含一侧的完整序列以及对侧的32～35个氨基酸残基。
更进一步地，所述OsO3L2蛋白质序列的截短序列含有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，或者是SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的序列。
更进一步地，所述OsO3L3蛋白质序列的截短序列含有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，或者是SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的序列。
编码以上所述氨基酸序列的核苷酸序列。
进一步地，编码OsO3L2截短序列的核苷酸序列，其含有如SEQ ID NO.3所示的序列。
进一步地，编码OsO3L3截短序列的核苷酸序列，其含有如SEQ ID NO.5所示的序列。
含有以上所述的核苷酸序列的重组载体、重组菌或转基因细胞系。
以上所述的氨基酸序列或核苷酸序列或含有核苷酸序列的重组载体、重组菌或转基因细胞系在培育高抗性和/或低金属积累植物中的应用，所述高抗性选自抗盐碱、抗镉、抗砷中的至少一项；所述低金属积累植物是指低镉积累植物和/或低砷积累植物。
一种转基因植物的培育方法，包括将上述可降低植物镉积累氨基酸序列的编码核苷酸序列导入受体植物中，得到转基因植物；所述转基因植物与受体植物相比，其抗性提高和/或金属积累降低；所述抗性选自抗盐碱、抗镉、抗砷中的至少一项；所述金属是指镉或砷。
以上所述的氨基酸序列或核苷酸序列在高抗性和/或低金属积累植物辅助育种中的应用，所述高抗性选自抗盐碱、抗镉、抗砷中的至少一项；所述低金属积累植物是指低镉积累植物和/或低砷积累植物。
本发明的有益效果是：本发明筛选到了水稻两个OXS3基因（OsO3L2和OsO3L3）的截短版本序列2B和3D。2B和3D的转基因株系都表现出对镉、二酰胺、砷和氯化钠的耐受性增加，并且在根茎和稻米中镉积累量显著低于对照。同时还发现植物体内重要元素如锰、铁、铜和锌的含量并未受到影响。2B和3D可以在水稻幼苗中降低镉累积，因此它们也可能在叶菜和牧草或其他作物的品种改良中使用，以降低人们通过食物链的镉摄入量。
附图说明
图1为用于水稻转化的载体示意图（A-D：在pCAMBIA1301分别插入受 CaMV35S 或RD29B 驱动的2B或3D基因的载体示意图，Nos-T:胭脂碱合成酶基因终止子; LB, RB: T-DNA 左右边界）。
图2为CaMV35S::OsO3L2 转基因T1植株的Western杂交结果（每个泳道上样量为10μg总蛋白；泳道 1，5，6，8，12，25，28和30 来自生长良好并结实的植株；泳道4，7和15来自3-4周死亡的植株；使用抗FLAG抗体检测，对照为Col-0）。
图3为在拟南芥中表达 OsO3L2和OsO3L3后植株的表型（RD29B::OsO3L2 和RD29B::OsO3L3 转化株系表现出对氧化胁迫的耐受性，野生型和不同T2转基因系在附加2mM二酰胺的MS培养基上生长10天）。
图4为转OsO3L2植株对Cd和diamide的耐受性测试结果（耐受性表示: -, 无菌落;+, ++, +++, ++++：分别表示在稀释度1, 10-1, 10-2和10-3 下生长出菌落；数字表示氨基酸残基位置；黑色框表示推断的N-乙酰转移酶催化结构域）。
图5为转OsO3L3植株对Cd和diamide的耐受性测试结果（耐受性表示: -, 无菌落;+, ++, +++, ++++：分别表示在稀释度1, 10-1, 10-2和10-3 下生长出菌落；数字表示氨基酸残基位置；黑色框表示推断的N-乙酰转移酶催化结构域）。
图6为转基因植株对Cd、diamide、As和NaCl的耐受性分析（负对照：空载体pART1；正对照：AtOXS3；三角表示10倍梯度稀释，起始浓度为0.5 OD600）。
图7为水稻OsO3L2和OsO3L3蛋白质序列比对图。
图8为T2植株的Southern杂交结果（使用Sac I酶切T2植株的基因组DNA并用32P标记的hpt探针杂交）。
图9为过表达2B和3D 序列的T1植株根和茎秆中的镉累积情况。
图10为过表达2B和3D 序列的T2种子的镉累积情况。
图11为表达2B和3D的T2水稻株系表现对镉的抗性增强（幼苗在营养液中生长7天后转入含20 μM CdCl2中在生长14天，茎秆和根的长度统计，对照为中花11WT，标准差来自8个生物学重复，p < 0.01）。
图12为表达2B和3D的T2水稻株系表现对镉的抗性增强（幼苗在营养液中生长7天后转入含20 μM CdCl2中在生长14天后的表型）。
图13为表达2B和3D的T2水稻株系表现对镉的抗性增强（幼苗在营养液中生长21天后，转人含或者不含镉的土壤中长至成熟，收获的茎秆和根被烘干后分别称量其质量，对照为EV和中花11（WT），标准差来自5个生物学重复，p < 0.01）。
图14为T2成熟植株的茎秆和根中的镉含量。
图15为T2成熟植株的总镉含量。
图16为T3种子中的镉含量。
图17为T3幼苗中的镉含量。
图18为T3植株中OsO3L2 或OsO3L3的mRNA丰度。
图19为T3植株中OsO3L2和2B或OsO3L3 和3D序列的mRNA丰度。
图20为T3植株中2B或3D序列的mRNA丰度。
图21为OsO3L2, OsO3L3 及其截短版本与H2A互作并共定位（酵母双杂实验，使用pAD-组蛋白和pBD-OsO3L2或pBD-OsO3L3共转化酵母，转化子长至相同浓度后点到缺陷培养基上，三角形代表倍比稀释，起始浓度为0.5 OD600 ）。
图22为OsO3L2, OsO3L3 及其截短版本与H2A互作并共定位（表达融合蛋白H2A::GFP的载体和表达融合蛋白2B::DsRed或3D::DsRed的载体共转化洋葱表皮细胞，分别拍摄GFP和DsRed通道的图像后合并，图表表示20µm）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
本发明的前期工作研究了水稻9个OXS3 (oxidative stress 3)同源基因对裂殖酵母在胁迫耐受方面所起的作用。结果表明，在测试的9个基因中，OsO3L2（Gene Bank ID：Os06g0559400）和OsO3L3（Gene Bank ID：Os02g0227100）表现出最强的对镉、二酰胺和叔丁基过氧化氢的耐受性，而对锌不具有耐受性。综合以上结果，我们决定重点研究OsO3L2和OsO3L3。OsO3L2编码一个230个氨基酸残基的蛋白质（分子量为24千道尔顿），OsO3L3编码一个199个氨基酸残基的蛋白质（分子量为20千道尔顿）。
一、植物材料
水稻在培养室中种植，保持16 h/8h（光/暗）的光周期，并保持恒定的28℃。种子萌发后，先在营养液中生长7天(Shimo等, 2011)，随后转入含有特定浓度的CdCl2 (Sigma-Aldrich)的营养液中进行处理。对于RT-qPCR分析，植物被转入含或者不含20 μM CdCl2的营养液中培养12小时。对于镉耐受性测试以及苗期镉积累分析，随后苗被转入含0，20 μM或30 μM CdCl2的营养液中再生长14天。对于土壤种植，土壤取自华南植物园水稻试验田。镉添加量为1.5 mg镉/kg干土。水稻被种植于含土壤的塑料盆中并放置与温室，在自然条件下生长至成熟期。
二、实验方法
1、重组DNA载体构建
使用PrimeScriptTM RT Regent Kit试剂盒（TAKARA BIO INC.），将提取自粳稻品种“中花11”（Oryza sativa var. japonica cv. Zhonghua 11）的叶片mRNA拟转录为cDNA并加上酶切位点（引物见表1），以便连接入pART1。基因的截短版本利用PCR方法进行并在必要的时候加入起始或终止密码子以形成完整的阅读框。对于GFP和DsRED的融合蛋白表达，首先我们PCR克隆出2B和3D的基因（各含有一个内含子）。使用引物为如表1所示。利用引入的酶切位点，随后将其分别导入到pEZS-NL载体中，形成与DsRed融合。利用类似的方法，构建H2A融合GFP蛋白表达载体。使用引物克隆H2A并将其导入到改造的pEZS-NL载体中（其中DsRed被替换为GFP基因）（Blanvillain等, 2009）。
表1 用于克隆水稻OXS3基因的引物组
2、酵母胁迫耐受分析
cDNA被导入裂殖酵母质粒pART1后，被用于电激法转化酵母菌株JS23（h+ ura4.294 leu 1.32）（Bio-Rad）。在EMM（Edinburg minimal medium）筛选转化子，并利用PCR验证。对于倍比稀释法分析，首先转化子在EMM（添加.2 mg/l亮氨酸）长到0.5 OD600，然后每个稀释浓度点3μl到固体平板上长3-5天（30℃）。培养的琼脂平板含有用于筛选的化合物（Sigma-Aldrich）：CdCl2 (1.0 mM), ZnSO4 (7.5 mM), 二酰胺(2.0 mM), t-BOOH (2.5mM), sodium arsenate (0.2 mM)或NaCl (0.4 mM)。对于NBT（nitro blue tetrazolium）染色，表达OsO3L2或OsO3L3的JS23，已经含有空载体的对照，在EMM培养基上长至0.5 OD600，然后用2 mM diamide处理2小时（30℃）（Nathan等, 1969）。样品的制备、染色和测量采用Blanvillain等 (2009)的方法。
3、植物转化
利用浸花法转化拟南芥（Clough和Bent, 1988）。所用质粒为pCAMBIA1300，在其多克隆位点上插入如何了FLAG标签的OsO3L2 或OsO3L3基因。水稻转化采用Hiei等 (1994)的农杆菌介导法，载体构建详见图1。再生植株在含每升100毫克潮霉素的培养基上选择。转基因植株通过PCR扩增一段转基因和其3’末端一段特异边侧序列来鉴别。在幼苗转入土壤种植前，在幼苗中确认报告基因GUS的表达。实验所使用的空载体对照来自一个含单拷贝插入pZH37质粒的转化株系，该质粒在pCambia1300的骨架上带有各一份actin1和actin2启动子驱动的hpt和gus基因（由中国科学院华南植物园韩志国博士提供）。
4、RT-qPCR分析
使用HiPure Plant RNA Mini Kit试剂盒 (Magen, http:// www.magentec.com.cn)提取水稻RNA，并利用PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNAEraser (TaKaRa, Japan)逆转录出cDNA。再使用GoTaq® qPCR Master Mix (Promega,USA)定量分析基因的表达丰度。
OsO3L2的特异扩增引物为：
o2F：5’-GCGCAGCTTCCTCTCAGGAC-3’（SEQ ID NO.17）；o2R：5’-AGCACCTCGTCGCCTTCTTC-3’（SEQ ID NO.18）。
OsO3L3的特异扩增引物为：
o3F：5’-ATCGGGTCGTCGTGCTCAT-3’ （SEQ ID NO.19）；o3R：5’-GTAATAGTTGGACAGCCCTCTCCTGA-3’ （SEQ ID NO.20）。
OsO3L2 和2B的共同扩增引物为：
bF：5’-GTCGAGCCTGACCGACGAT-3’ （SEQ ID NO.21）；bR：5’-CGACTCCGACGAACACGAAA-3’ （SEQ ID NO.22）。
OsO3L3 和3D的共同扩增引物为：
dF：5’-CGTCATCGTCGTCGTCATCA-3’ （SEQ ID NO.23）；dR：5’-GTTGGACAGCCCTCTCCTGA-3’ （SEQ ID NO.24）。
RD29B::2B的特异扩增引物为：
o2F：5’-GCGCAGCTTCCTCTCAGGAC-3’（SEQ ID NO.17；bsR：5’-TCCTTGTAATCGATGTCGTGATCC-3’ （SEQ ID NO.25）。
RD29B::3D的特异扩增引物为：
dsF：5’-AAGCAGCACCAGCCTCCTGT-3’ （SEQ ID NO.26）；dsR：5’-AAGACCGGCAACAGGATTCAA-3’ （SEQ ID NO.27）。
使用水稻组蛋白H3基因作为内参：5'-GGTCAACTTGTTGATTCCCCTCT-3'（SEQ IDNO.28） 和5'-AACCGCAAAATCCAAAGAACG-3'（SEQ ID NO.29）。
5、元素分析
脱壳的大米（糙米）、茎秆和根在收获后分别在80℃的烘箱中干燥过夜。干燥的材料随后被研磨成粉末（幼苗样品制备无需研磨），然后置入硝酸溶液中放入微波消解仪器中消解（Multiwave3000, Anot Paar, Austria）。利用ICP-MS (Agilent 7700X, AgilentTechnologies) 测量消解好的样品的金属元素含量。
三、实验结果
1、拟南芥中组成型过表达OsO3L2或OsO3L3基因导致植株幼苗致死
为了测试OsO3L2 和OsO3L3基因在高等植物中的功能，我们构建了组成型植物表达载体。首先在编码区上游插入CaMV 35S启动子，并在每个基因的下游融合一个FLAG标签序列后，将其插入pCAMBIA1300。 利用潮霉素选择T1植株。在定植到土壤的前7天，大量推断的转化植株死亡（OsO3L2植株死亡率为27%±2%；OsO3L3植株死亡率为24%±3%）。大约30天后，又有一批苗死亡(OsO3L2植株死亡率为8%±2%；OsO3L3植株死亡率为15%±2%)。余下存活的植株生长正常。为了鉴定转基因的表达，我们提取了那些存活的植株和垂死的植株的总蛋白并利用抗FLAG抗体进行检测，结果仅仅在垂死的植株中检测出转基因的表达（图2）。这一结果暗示在拟南芥中组成型过表达OsO3L2和OsO3L3一定产生了有害的结果，从而导致幼苗死亡。
2、胁迫诱导下的OsO3L2和OsO3L3表达增强拟南芥耐受性
因为无法获得组成型表达的拟南芥转基因植株，我们尝试使用诱导型启动子。上面述及的载体中，启动子被置换为胁迫诱导表达的拟南芥启动子RD29B。与组成型表达不同，诱导型表达的T1转基因植株中，没有出现幼苗致死现象。通过测试潮霉素抗性（抗：不抗=3:1分离比）确定了单转基因插入位点的T2植株。随后随即抽取数个株系鉴定了其对氧化剂的耐受性。结果与野生型相比，这些转基因株系都表现出对氧化胁迫的不同程度的耐受性（图3）。
3、截短基因增强酵母对胁迫的抗性
上述实验结果表明，OsO3L2和OsO3L3基因内部的某些结构域很可能导致了致死现象。如果是这样，通过分离出耐受性结构域，就能绕开致死结构域的伤害。第一步，我们利用裂殖酵母来寻找耐受性结构域。OsO3L2被分别从5’或3’末端截短，产生3个片段，2A、2B和2C。这三个片段分别含有aa1-85 (2A)、 aa1-175 (2B)和aa86-230 (2C) (图4)。利用相似的方法，OsO3L2被分成aa1-54（3A）, aa1-141（3B）, aa51-141（3C）, aa51-199（3D）和aa125-199（3E）(图5)。在截短的片段中，按照需要补齐起始密码子和终止密码子，以确保蛋白质的翻译。酵母中的分析表明，2B和2C与OsO3L2全长的耐受性效果相当；而3B和3D与OsO3L3全长的效果相当。这4个截短基因都含有推断的N-乙酰转移酶催化结构域，因此我们认为这一结构域对于氧化胁迫耐受性是必须的，那些不含有这一结构域的截短基因（2A,3A和3E）都不能增强对镉和二酰胺的耐受性。除了镉和二酰胺之外，2B和3D还表现出对砷和氯化钠的耐受性（图6）。水稻OsO3L2和OsO3L3蛋白质序列比对如图7所示，2B和3D分别为蓝色和绿线下划线标示，序列比对使用 ClustalW程序。
N-乙酰转移酶催化结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2：LL/IAQLPL/IRT/RGLSK/NYYQGKSQSFTSL/IC/S
SEQ ID NO.2第2位的氨基酸可以为亮氨酸（L）或异亮氨酸（I）；第7位的氨基酸可以为亮氨酸（L）或异亮氨酸（I）；第9位的氨基酸可以为苏氨酸（T）或精氨酸（R）；第13位的氨基酸可以为赖氨酸（K）或天冬酰胺（N）；第25位的氨基酸可以为亮氨酸（L）或异亮氨酸（I）；第26位的氨基酸可以为半胱氨酸（C）或丝氨酸（S）。
2B的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3D的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4、在水稻中过表达2B和3D
因为诱导型启动子RB29B在拟南芥中表达OsO3L2和OsO3L3的结果已经证明了在高等植物中表达这两个基因的可行性，所以我们继续进行其在水稻中的研究。在拟进行使用诱导型启动子的同时，我们也希望研究可能存在于基因内部的潜在“致死结构域”是否可以被去除。我们利用pCAMBIA1301最终构建了4个载体：CaMV35S::2B, RD29B::2B, CaMV35S::3D和RD29B::3D（如图1所示），用来转化粳稻“中花11”。经过潮霉素筛选获得抗性愈伤并再生出转基因苗。PCR确认了转基因在再生苗中的存在。同时检测了报告基因GUS的表达。
每一个载体都获得了62到205个T0转化体（表2）。虽然所有的组成型启动子CaMV35S相关的T0植株中并没有出现苗期致死的情况，但是大约1%的植株出现了不育表型，另外3%左右的植株出现其它异常表型，比如白化和矮化现象。这些在水稻转化过程中并不罕见，因此我们丢弃了这些T0植株。根据T1植株的GUS染色分离比，我们分别鉴定出10到19个T0。这些T0植株可能含有单一位点的转基因整合。为了节省时间，我们需要对T1植株进行了初步评估。但是对于T1植株的选择，必须依赖于T2代的分离比数据，即如果T2代不分离出GUS负染色的植株，我们就推断其相应的T1为纯合体。为此，我们将T1植株种植于含镉的土壤中（1.5毫克镉/千克干土）。这样浓度在土壤中属于高度污染，但是一般不会影响结实。在2013年秋季我们收获了T2种子，随后每一个T1株系约40株系的T2幼苗被用于研究分离比。由此我们确定了T1纯合体，这些在含镉土壤中生长的T1纯合体植株及其T2种子被用于随后的化学元素分析。
表2.本研究中使用的转基因株系
*经过潮霉素选择的T0植株再经过PCR验证转化基因，随后验证gus基因表达。
** 通过对T2幼苗的GUS染色鉴定T1纯合体植株。
5、T1纯合体植株及其T2种子分析结果
由于对于T1植株的分析只能得到初步的结果，我们在使用相对昂贵的ICP-MS进行分析时，对于每个载体我们仅选取了两个独立的T1纯合体植株作为材料。对一些材料的Southern杂交显示，这些T植株很可能只含有一个单拷贝的转基因（图8）。镉含量的测定显示，T1植株的根或者茎秆或者二者中都含有更低的镉（图9）。在分析糙米（去壳的米）样品时，我们发现在所分析的8个样品中，糙米镉的含量都显著低于对照（只有对照的2.7到9.3分之一）（图10）。在CaMV35S::2B的一个T1植株中（A48.1），录得的镉含量几乎只有对照的十分之一。这一意外的结果，促使我们对其下一世代进行进一步的分析研究。
6、T2纯合体植株及其T3种子分析结果
对于来源于T1纯合母本的T2植株，我们首先研究了其是否在镉耐受性方面有差异。T2种子在萌发后首先在营养液(Shimo等, 2011)中生长7天，随后部分被转入含镉的营养液处理14天。在每个处理条件下，每个株系选取了8株T2幼苗进行分析。在无镉胁迫的条件下，所有根茎的生长数据都没有差异（图11）；而在有镉处理条件下，所有株系都表现出生长抑制。然而与野生型相比，T2植株生长得更健康，很少发生脱绿现象，并且在茎生长相对较长（图12）。
为了研究镉积累，我们在2014年春季萌发了另外一批种子进行双盲试验。与以前一样，在营养液（无镉）中生长21天的T2植株被移入含镉土壤（1.5毫克镉/千克干土），对照包括中花11和一个空载体对照（含潮霉素抗性以及GUS基因）。在水稻收获之后，植株被烘干进行元素分析。生物量分析表明，转基因株系无论在茎秆还是根质量都显著高于野生型和空载对照（图13）。而且无论是否有镉处理，这一趋势都存在。但是，转基因系与对照间的稻米产量没有差异，每株的总产量约为4.8克，每10粒糙米约重19.7毫克。这一数据在转基因和对照中一致，且不收镉处理的影响。我们分析很可能是因为镉胁迫的强度还不足以导致产量的差异。比如在水培的条件下，因为相对于土壤镉的有效浓度大大提高，我们可以观察到明显的表型差异（图12）。这个结果与我们在韶关一个重镉污染区（1.48毫克镉/千克干土）的观察一致。在合适的栽培条件下，这一地区的水稻产量并无太大影响。然而，如果在更高的浓度下测试，很可能观察到产量的降低。
在镉累积方面，所有的转基因系根和茎秆部分镉含量都相对较低（图14）。考虑到2B和3D的转基因系在生物量方面都高于对照平均约25%（图13），每株的绝对镉含量数据显示（根、茎秆和稻米镉含量总和），半数的转基因系中的总镉量都低于对照（图15）。对于我们的研究，稻米镉的含量更为重要。测定结果表明，T3糙米中平均镉浓度只有对照的约四分之一（2.1到6.8分之一）（图16）。
由于镉在植物中并没有已知的生理功能，由此假定植物中不存在镉特异的转运蛋白（Palmgren等, 2008），所以植物可能利用其它必须元素（钙、铁、锰和锌等）的转运蛋白从土壤中吸收镉。如果这样的话，我们希望知道2B和3D在降低镉累积的同时，是否也抑制了其他必须元素的累积。为此我们利用同样的材料另外测定了锰、铁、锌和铜的含量。对稻米、茎秆和根的单独分析都表明，在转基因系和对照之间没有显著性差异（表3）。
表3.大米、茎秆和根中的元素分析
7、低镉累积也发生在植物发育早期
上述镉累积研究的结果都来自成熟植株，我们也希望了解植物早期发育阶段的镉累积情况。我们选用了两个来自CaMv35S::2B和RD29B::2B株系进行研究。T3株系在营养液中生长7天后被转入含(20 或30 mM镉的营养液中生长至第21天。植株被干燥后进行镉含量分析。结果显示，植株中镉含量与营养液中的镉浓度正相关。但与成熟植株类似，T3植株比对照中镉含量更低（图17）。这一结果揭示这个低镉累积现象在植物发育早期就已经开始。因此对于终端产品为幼苗的叶菜和家畜饲料等领域，使用这类基因，很可能有利于减少镉进入食物链，进而减少人类摄入镉。
8、T3植株的基因表达
为了研究镉积累与基因表达的关系，我们对相关基因进行了表达分析。在营养液中生长7天的幼苗，被转入含20mM氯化镉的营养液中处理12小时。使用OsO3L2 和OsO3L3基因的特异性引物（不扩增来自2B和3D的部分），我们可以特异研究这两个基因的表达。处理前，OsO3L2 mRNA在根中的含量显著高于茎秆；而OsO3L2 mRNA刚好相反（图18）。处理后，OsO3L2 和OsO3L3基因在茎秆中的表达没有显著变化，但是在根中的表达下调。在转基因系和对照之间OsO3L2和OsO3L3的mRNA丰度并无根本差异，因此我们认为全长基因的表达并未受到转基因的影响。
另外一套引物被用于一起扩增转基因和它的供体基因，结果测得相应的mRNA丰度大大提高，相对于对照的提高幅度从10.6到41倍不等（图19）。在存在CaMV 35S启动子的株系，没有观察到目的基因受到镉诱导而上调。而在RB29B启动子的转化体中，镉处理显著上调了其驱动的基因表达。利用转基因特异的引物研究发现，在2个转基因系RD29B::2B(B25.4.2.1) 和RD29B::3D (D69.1.1.1)，基因表达模式分别与图19中C和D中的结果一致（图20）。综上，我们可以推断，图19中的高mRNA丰度应该是转基因特异表达的结果。
9、OsO3L2h和 OsO3L3与组蛋白H2A互作且共定位于亚细胞核区
酵母双杂结果显示，OsO3L2和OsO3L3特异性地与H2A互作，而不与H2B、H3或者H4互作（图21）。通过构建载体瞬时转化洋葱表皮细胞，我们还发现2B和3D都可以与H2A共定位于亚细胞核区（图22）。这些结果揭示出这些水稻OXS3基因在亚细胞核定位和互作蛋白方面的保守性。
以上实验数据表明，利用水稻OsO3L2和OsO3L3基因的截短序列进行基因工程育种可望获得低镉累积的作物，以降低人们通过食物链的镉摄入量。
以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
<110> 中国科学院华南植物园
<120> 一种植物抗性基因及其应用
<130>
<160> 29
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 78
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 1
ctgmtrgcsc agcttcctmt caggasaggg ctrtccasct aytaccaagg raartcccaa 60
tcmttcacat cgmtmtsy 78
<210> 2
<211> 26
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<220>
<221> 可替换的氨基酸
<222> (2)..(2)
<223> 亮氨酸（L）可被替换为异亮氨酸（I）
<220>
<221> 可替换的氨基酸
<222> (7)..(7)
<223> 亮氨酸（L）可被替换为异亮氨酸（I）
<220>
<221> 可替换的氨基酸
<222> (9)..(9)
<223> 苏氨酸（T）可替换为精氨酸（R）
<220>
<221> 可替换的氨基酸
<222> (13)..(13)
<223> 赖氨酸（K）可替换为天冬酰胺（N）
<220>
<221> 可替换的氨基酸
<222> (25)..(25)
<223> 亮氨酸（L）可被替换为异亮氨酸（I）
<220>
<221> 可替换的氨基酸
<222> (26)..(26)
<223> 半胱氨酸（C）可替换为丝氨酸（S）
<400> 2
Leu Leu Ala Gln Leu Pro Leu Arg Thr Gly Leu Ser Lys Tyr Tyr Gln
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Gly Lys Ser Gln Ser Phe Thr Ser Leu Cys
20 25
<210> 3
<211> 528
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 3
atgggcggga tagctcgacg acgaggagga ggagatcaag gtggtgttgc tgctgctgcc 60
ggcggcgacg gcgaggcggc ggcgtccggg ttctccagcg gcgattcgtc ggcgacgacg 120
acgctgcggt cgccggcgtc gtcgagcctg accgacgatg gcggcgaggt gacgtcgtgg 180
acgtcggctg acggtggtgg tggtggtgac tactgctcgt tttcgtgttc gtcggagtcg 240
gagttggagt tggagtcaga cgacgacgac gacgaggagg aggaggagat gatgcagctg 300
gatggtggcg ggcacgccgc cggcgggccg ctctacgagc tggcggcgcc gctgctggcg 360
cagcttcctc tcaggacagg gctatccaag tactaccaag ggaagtccca atccttcaca 420
tcgctctgca acgccaggtg cgtccaagac cttgcaaaga agacaacccc ttacatcacc 480
aggatgaagc tgcagctgcg cagaggccat ggagtcgtgg atcggtag 528
<210> 4
<211> 175
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 4
Met Gly Gly Ile Ala Arg Arg Arg Gly Gly Gly Asp Gln Gly Gly Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ala Gly Gly Asp Gly Glu Ala Ala Ala Ser Gly Phe Ser
20 25 30
Ser Gly Asp Ser Ser Ala Thr Thr Thr Leu Arg Ser Pro Ala Ser Ser
35 40 45
Ser Leu Thr Asp Asp Gly Gly Glu Val Thr Ser Trp Thr Ser Ala Asp
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Asp Tyr Cys Ser Phe Ser Cys Ser Ser Glu Ser
65 70 75 80
Glu Leu Glu Leu Glu Ser Asp Asp Asp Asp Asp Glu Glu Glu Glu Glu
85 90 95
Met Met Gln Leu Asp Gly Gly Gly His Ala Ala Gly Gly Pro Leu Tyr
100 105 110
Glu Leu Ala Ala Pro Leu Leu Ala Gln Leu Pro Leu Arg Thr Gly Leu
115 120 125
Ser Lys Tyr Tyr Gln Gly Lys Ser Gln Ser Phe Thr Ser Leu Cys Asn
130 135 140
Ala Arg Cys Val Gln Asp Leu Ala Lys Lys Thr Thr Pro Tyr Ile Thr
145 150 155 160
Arg Met Lys Leu Gln Leu Arg Arg Gly His Gly Val Val Asp Arg
165 170 175
<210> 5
<211> 453
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 5
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<213> Oryza sativa
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20 25 30
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<213> 人工序列
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<211> 44
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<213> 人工序列
<400> 14
cgcggtaccg tcgacgccga gttaatatgc atttgtacat cttt 44
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gaggacacgc tcgagcgacg taccagatta cgctca 36
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cgcggtaccg tcgacgcttg cggggttttt cagtatc 37
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gcgcagcttc ctctcaggac 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
agcacctcgt cgccttcttc 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
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atcgggtcgt cgtgctcat 19
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<212> DNA
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<400> 20
gtaatagttg gacagccctc tcctga 26
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gtcgagcctg accgacgat 19
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cgactccgac gaacacgaaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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cgtcatcgtc gtcgtcatca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gttggacagc cctctcctga 20
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tccttgtaat cgatgtcgtg atcc 24
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
aagcagcacc agcctcctgt 20
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<211> 21
<212> DNA
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aagaccggca acaggattca a 21
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<211> 23
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ggtcaacttg ttgattcccc tct 23
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
aaccgcaaaa tccaaagaac g 21
Claims (6)
1.一种可提高植物抗性的多肽，其特征在于，所述多肽为水稻OsO3L2或OsO3L3蛋白质序列的截短序列，所述OsO3L2蛋白质序列的截短序列如SEQ ID NO.4所示；所述OsO3L3蛋白质序列的截短序列如SEQ ID NO.6所示。
2.一种核酸，其编码权利要求1所述的多肽。
3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，编码SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。
4.含有权利要求2或3所述核酸的重组载体、重组菌或转基因细胞系。
5.权利要求1所述多肽、权利要求2或3所述核酸、权利要求4所述的重组载体、重组菌或转基因细胞系在培育抗盐碱和/或低镉积累植物中的应用。
6.一种转基因植物的培育方法，包括将权利要求2或3所述的核酸导入受体植物中，得到转基因植物；所述转基因植物与受体植物相比，其抗盐碱性提高和/或镉积累降低。
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| OXIDATIVE STRESS 3 is a chromatin-associated factor involved in tolerance to heavy metals and oxidative stress;Robert Blanvillain et al.;《The Plant Journal》;20081124;第57卷;摘要，第654页右栏最后1段-第656页左栏倒数第2段,第657页右栏第2段，第663页右栏第2段，图1-2，表1 * |
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