CN103849605A - 一种培育抗性植物的方法及其专用蛋白和基因 - Google Patents

一种培育抗性植物的方法及其专用蛋白和基因 Download PDF

Info

Publication number
CN103849605A
CN103849605A CN201210506489.0A CN201210506489A CN103849605A CN 103849605 A CN103849605 A CN 103849605A CN 201210506489 A CN201210506489 A CN 201210506489A CN 103849605 A CN103849605 A CN 103849605A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
sequence
plant
protein
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201210506489.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103849605B (zh
Inventor
吴家和
庞金环
夏桂先
田颖川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Microbiology of CAS
Original Assignee
Institute of Microbiology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Microbiology of CAS filed Critical Institute of Microbiology of CAS
Priority to CN201210506489.0A priority Critical patent/CN103849605B/zh
Publication of CN103849605A publication Critical patent/CN103849605A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103849605B publication Critical patent/CN103849605B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y111/00—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11)
    • C12Y111/01—Peroxidases (1.11.1)
    • C12Y111/01006—Catalase (1.11.1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y115/00—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C12Y115/01—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15) with NAD or NADP as acceptor (1.15.1)
    • C12Y115/01001—Superoxide dismutase (1.15.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种培育抗性植物的方法及其专用蛋白和基因。本发明提供的GhSOD1蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列3自N末端第85-236位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）将（a）所述蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗性相关的由序列3衍生的蛋白质。本发明提供的GhCAT1蛋白，是如下（c）或（d）：（c）由序列4自N末端第85-576位氨基酸残基组成的蛋白质；（d）将（c）所述蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗性相关的由序列4衍生的蛋白质。本发明克隆了棉花的SOD1基因和CAT1基因，并利用拟南芥THI1基因的叶绿体信号肽序列构建成嵌合基因，在棉花中过量表达，培育出高抗盐抗旱抗病的转基因棉花。本发明对植物抗逆和抗病育种具有重要的意义。

Description

一种培育抗性植物的方法及其专用蛋白和基因
技术领域
本发明涉及一种培育抗性植物的方法及其专用蛋白和基因，具体涉及一种抗盐、抗旱和抗病的植物的方法及其专用蛋白和基因。
背景技术
棉花是重要的经济作物，在我国，常年种植棉花的面积在650万公顷左右。
棉花是一种具有一定抗逆性的作物，但随着土壤干旱、盐碱化、低温冻害出现的频率和程度加大，其本身的抗逆性已经不足以抵抗，导致产量和品质大幅度下降。
同时棉花是一个易遭受病原菌危害的植物，每年因病害造成棉花产量和质量均大幅下降。每年仅黄萎病的危害面积在我国就达到200万公顷，为我国棉花种植面积的30%以上。
植物经常处于逆境中，由于其不能通过运动来趋避这些逆境，所以进化出一套对这些逆境具有适应的系统。其中植物体内一套清除活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的系统。植物在生物和非生物逆境下，会产生大量的ROS，包括超氧根离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)和氢氧根离子(OH-)；这些ROS过量地产生会对植物产生损害乃至死亡。这些逆境主要包括高光强、高温、低温、干旱、水涝、盐碱、重金属以及病虫害，这些逆境产生ROS能够和植物色素、蛋白、脂类和一些儿高分子化合物进行反应，从而破坏植物的正常代谢，使植物受害或死亡。
植物拥有一套复杂的ROS清除代谢系统，从而维持植物细胞内氧化还原动态平衡。清除系统主要包含一系列的ROS清除酶，包括超氧化酶歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化酶(APX)、过氧化物酶、过氧化氢酶（CAT）和一些小分子的抗氧化物。叶绿体在进行光合作用时同时会产生大量的ROS，这些ROS产物大部分会在叶绿体内被叶绿体内的SOD、APX等酶清除，这样会保持叶绿体内氧化还原状态的平衡。然而当植物在逆境情况下，细胞会产生大量的ROS，使整个细胞内的ROS上升。因此叶绿体内的清除酶就不能满足清除叶绿体内的ROS，尤其APX酶在逆境下还存在失活现象，结果导致叶绿体受到伤害，造成光合作用的下降和停止，植物可能受害死亡。
发明内容
本发明的目的是提供一种培育抗性植物的方法及其专用蛋白和基因。
本发明提供的GhSOD1蛋白，来自棉花（Gossypium hirsutum L.），是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列3自N末端第85-236位氨基酸残基组成的蛋白质；
（b）将（a）所述蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗性相关的由序列3衍生的蛋白质。
本发明提供的GhCAT1蛋白，来自棉花（Gossypium hirsutum L.），是如下（c）或（d）：
（c）由序列表中序列4自N末端第85-576位氨基酸残基组成的蛋白质；
（d）将（c）所述蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗性相关的由序列4衍生的蛋白质。
本发明还保护融合蛋白甲，自上游至下游依次包括信号肽和所述GhSOD1蛋白。所述信号肽可为叶绿体信号肽，具体可为序列表的序列3自N末端第1至82位氨基酸残基组成的多肽。所述融合蛋白具体可为GhtSOD1蛋白。
所述GhtSOD1蛋白，是如下（e）或（f）：
（e）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（f）将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗性相关的由序列3衍生的蛋白质。
本发明还保护融合蛋白乙，自上游至下游依次包括信号肽和所述GhCAT1蛋白。所述信号肽可为叶绿体信号肽，具体可为序列表的序列4自N末端第1至82位氨基酸残基组成的多肽。
所述融合蛋白具体可为GhtCAT1蛋白。
所述GhtCAT1蛋白，是如下（g）或（h）：
（g）由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（h）将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗性相关的由序列4衍生的蛋白质。
为了使（a）或（c）或（e）或（g）中的蛋白质便于纯化，可在所述蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述（b）或（d）或（f）或（h）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）或（d）或（f）或（h）中的蛋白质的编码基因可通过将所述蛋白的编码序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述GhSOD1蛋白的基因也属于本发明的保护范围（该基因命名为GhSOD1基因）。
所述GhSOD1基因是如下1）至4）中任一所述的DNA分子：
1）序列表中序列1自5’端第253至第708位核苷酸所示的DNA分子；
2）序列表中序列1自5’端第253至第711位核苷酸所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子；
4）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子。
编码所述GhCAT1蛋白的基因也属于本发明的保护范围（该基因命名为GhCAT1基因）。
所述GhCAT1基因是如下5）至8）中任一所述的DNA分子：
5）序列表中序列2自5’端第253至第1728位核苷酸所示的DNA分子；
6）序列表中序列2自5’端第253至第1731位核苷酸所示的DNA分子；
7）在严格条件下与5）或6）限定的DNA序列杂交且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子；
8）与5）或6）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子。
编码所述GhtSOD1蛋白的基因也属于本发明的保护范围（该基因命名为GhtSOD1基因）。
所述GhtSOD1基因是如下9）至12）中任一所述的DNA分子：
9）序列表中序列1自5’端第1至第708位核苷酸所示的DNA分子；
10）序列表中序列1所示的DNA分子；
11）在严格条件下与9）或10）限定的DNA序列杂交且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子；
12）与9）或10）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子。
编码所述GhtCAT1蛋白的基因也属于本发明的保护范围（该基因命名为GhtCAT1基因）。
所述GhtCAT1基因是如下13）至16）中任一所述的DNA分子：
13）序列表中序列2自5’端第1至第1728位核苷酸所示的DNA分子；
14）序列表中序列2所示的DNA分子；
15）在严格条件下与13）或14）限定的DNA序列杂交且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子；
16）与13）或14）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子。
以上任一所述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。
含有所述GhSOD1基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
含有所述GhtSOD1基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
含有所述GhCAT1基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
含有所述GhtCAT1基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因（GhSOD1基因、GhtSOD1基因、GhCAT1基因或GhtCAT1基因）的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
所述重组表达载体具体可为将所述基因（GhSOD1基因、GhtSOD1基因、GhCAT1基因或GhtCAT1基因）插入pBin438载体的多克隆位点得到的重组质粒。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将基因甲和基因乙同时导入目的植物中，得到抗性高于所述目的植物的转基因植物；所述基因甲为所述GhSOD1基因或所述GhtSOD1基因；所述基因乙为所述GhCAT1基因或所述GhtCAT1基因。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述基因甲和基因乙可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体为棉花，如棉花品种“中棉所35”。所述抗性为抗盐和/或抗旱和/或抗病。所述抗病可为抗黄萎病。所述抗病可为抗大丽轮枝菌引起的植物病害。所述大丽轮枝菌具体可为大丽轮枝菌V592生理小种。
本发明还保护所述蛋白质（GhSOD1蛋白、GhtSOD1蛋白、GhCAT1蛋白和GhtCAT1蛋白中的至少一种），所述基因（GhSOD1基因、GhtSOD1基因、GhCAT1基因和GhtCAT1基因中的至少一种），所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育抗性植物中的应用。所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体为棉花，如棉花品种“中棉所35”。所述抗性为抗盐和/或抗旱和/或抗病。所述抗病可为抗黄萎病。所述抗病可为抗大丽轮枝菌引起的植物病害。所述大丽轮枝菌具体可为大丽轮枝菌V592生理小种。
本发明的发明人克隆了棉花的SOD1基因和CAT1基因，并利用拟南芥THI1基因的叶绿体信号肽序列构建成嵌合基因，在棉花中过量表达，培育出高抗盐抗旱抗病的转基因棉花。本发明对植物抗逆和抗病育种具有重要的意义。
附图说明
图1为重组质粒pBSOD和重组质粒pBCAT的元件结构示意图。
图2为实施例3中的PCR鉴定电泳图。
图3为实施例3中的Southern杂交分析图谱。
图4为实施例3中目的基因表达量分析的电泳图谱。
图5为实施例3中目的基因表达量分析的结果。
图6为实施例3中表型鉴定的照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
棉花品种“中棉所35”：属于陆地棉，产量高的品种，全国推广种植面积较大；参考文献：李汉华.中棉所35特征特性及栽培技术.新疆农业科技，2002，1：11~12。
pBin438载体(二元表达载体)：含有由带双增强子的CaMV35S启动子（DE35S）、TMV-RNA cDNA的Ω片段—来自pBR322载体的BamH I-Sal I片段及Nos转录终止序列组成的外源基因表达框架；参考文献：李太元,田颖川,秦晓峰,莽克强,李文谷,何永刚,沈蕾.高效抗虫转基因烟草的研究.中国科学,B辑,1994,24(3):276~282）。
根癌农杆菌LBA4404：Invitrgen,Chicago,USA;Cat.No:18313-015。
实施例中所用的黄萎病致病菌为大丽轮枝菌（Verticillium dahlae）V592生理小种：为来自于新疆棉区落叶型生理小种（在文献中的描述为“The defoliating V.dahliae isolate V592[31],originated from an infected cotton plant in Xinjiangdistrict of China,was used for cotton infection.”）；参考文献：Fuxin Wang,Yinping Ma,Chunl in Yang,Piming Zhao,Yuan Yao,Guiliang Jian,Yuanming Luo,Guixian Xia.Proteomic analysis of the sea-island cotton roots infected by wiltpathogen Verticillium dahliae.Proteomics，2011,11(22):4296~4309。
实施例1、棉花GhSOD1蛋白及其编码基因、GhCAT1蛋白及其编码基因的发现
一、棉花总RNA的提取和EST目的片段的扩增
1、材料和试剂
棉花材料为棉花品种“中棉所35”，由河南科润生物技术有限公司刘正德先生惠赠。大肠杆菌DH5α、5’-Full RACE Kit、3’-Full RACE Kit以及SYBR Premix ExTaq均购自TaKaRa公司。pGEM-T Easy Vector System购自Promega公司。RevertAidH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司。Gen Clean柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司。
2、棉花总RNA的提取和EST目的片段的扩增
将棉花品种“中棉所35”的种子用无菌水浸泡，然后置于28℃的光照培养箱中处理48h（光周期为12h光照/12h黑暗），等种子露白后种于蛭石和营养土（1:1）混合的培养土中，放置于温室中出苗（28℃，自然光照）。棉花苗生长3周左右出现1-2片真叶时，取幼嫩的叶片、茎和根三种组织立即进行液氮冷冻贮备待用。根据改良的CTAB法分别从上述三种组织中提取棉花的总RNA。
选取棉花叶片总RNA为实验材料，根据棉花盐胁迫筛选有关GhSOD1基因和GhCAT1基因的EST序列，GhSOD1基因的EST序列为序列表1中311-619位核苷酸，GhCAT1基因的EST序列为序列表2中731-1283位核苷酸。设计特异性引物进行RT-PCR扩增。用于扩增GhSOD1基因的EST序列的引物对：P1：5’-CTCACAGGATGGAGAGGG-3’，P2：5’-CCGGATCAGC ATGGACAAC-3’。用于扩增GhCAT1基因的EST序列的引物对：P1：5’-CCAACCCTAAGTCCCATATTC-3’，P2：5’-CGAGTCTGGAGCAACTTATC-3’。回收扩增产物并测序，测序验证所获得序列和上述的棉花盐胁迫的EST序列一致。
二、棉花GhSOD1基因和GhCAT1基因的克隆
1、cDNA第一链的合成
分别以步骤一所得的总RNA为模板，利用TaKaRa公司的5’-Full RACE Kit、3’-Full RACE Kit以及逆转录反应试剂盒Revert Aid H Minus First Strand cDNASynthesis Kit分别合成5’RACE Ready cDNA第一链和3’RACE Ready cDNA第一链。
2、引物的设计与合成
根据步骤一所得的EST序列。分别设计GhSOD1基因的EST序列的2条5’-RACE反义引物：SOD-R1、SOD-R2和2条3’-RACE正义引物SOD-F1、SOD-F2。分别设计GhCAT1基因的EST序列的2条5’-RACE反义引物：CAT-R1、CAT-R2和2条3’-RACE正义引物CAT-F1、CAT-F2。
SOD-F1：5’-CAATCCTGCTGGAAAAGGGC-3’（序列1第441-450位）；
SOD-F2：5’-GGAAATGTCACTGTTGGTGCTG-3’（序列1第502-523位）；
SOD-R1：5’-TGAAGTGAGGTCCTGTTGAC-3’（序列1第423-443位的反向互补序列）；
SOD-R2：5’-CATGCAAACCCTGCAGGCCGG-3’（序列1第368-388位的反向互补序列）。
CAT-F1：5’-ACCCTCTTGATGTGACTAAGAC-3’（序列2第1106-1127位）；
CAT-F2：5’-TGCAGCCTGTTGGCCGCTTG G-3’（序列2第1151-1171位）；
CAT-R1：5’-CTGTAATCTTGTGGAACACC-3’（序列2第832-851位的反向互补序列）；
CAT-R2：5’-CAAGCTCTCAGGATGGTGTG-3’（序列2第782-801位的反向互补序列）。
上述引物均由北京三博远志生物技术有限公司合成。
3、RACE法克隆GhSOD1和GhCAT1基因
分别以步骤1合成的5’RACE Ready cDNA第一链和3’RACE Ready cDNA第一链为模板，利用步骤2设计合成的5’-RACE反义引物和3’-RACE正义引物进行扩增，从而获得未知基因的5’端序列和3’端序列。
对获得PCR扩增产物进行凝胶回收，分别连接到pGEM-T载体上，转化大肠杆菌感受态DH5α，进行蓝白斑筛选，挑取白斑，菌落PCR检测后，将阳性克隆测序。测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。测序结果进行序列拼接获得全长GhSOD1和GhCAT1基因。
GhSOD1基因的开放阅读框如序列表的序列1自5’末端第253-711位核苷酸所示（459bp），编码序列表的序列3自N末端第85-236位氨基酸残基组成的GhSOD1蛋白（152aa）。GhCAT1基因的开放阅读框如序列表的序列25’末端第253-1731位核苷酸所示（1479bp），编码序列表的序列4自N末端第85-576位氨基酸残基组成的GhCAT1蛋白（492aa）。
实施例2、重组质粒的构建
一、重组质粒pBSOD的构建
将人工合成的序列表的序列1所示的双链DNA分子插入pBin438载体的BamH I和Sal I酶切位点之间，得到重组质粒pBSOD。
将序列表的序列1所示的双链DNA分子命名为GhtSOD1基因，编码序列表的序列3所示的GhtSOD1蛋白（序列3中，自N末端第1至82位氨基酸残基组成叶绿体信号肽，第85-236位氨基酸残基组成GhSOD1蛋白）。
重组质粒pBSOD的元件结构示意图见图1A（RB：右边界；NPT II：硫酸新霉素基因；DE-35SP：双增强子的CaMV35S启动子；Nos：终止子；LB：左边界；TP：叶绿体信号肽）。
二、重组质粒pBCAT的构建
将人工合成的序列表的序列2所示的双链DNA分子插入pBin438载体的BamH I和Sal I酶切位点之间，得到重组质粒pBCAT。
将序列表的序列2所示的双链DNA分子命名为GhtCAT1基因，编码序列表的序列4所示的GhtCAT1蛋白（序列4中，自N末端第1至82位氨基酸残基组成叶绿体信号肽，第85-576位氨基酸残基组成GhCAT1蛋白）。
重组质粒pBCAT的元件结构示意图见图1B（RB：右边界；NPT II：硫酸新霉素基因；DE-35SP：双增强子的CaMV35S启动子；Nos：终止子；LB：左边界；TP：叶绿体信号肽）。
实施例3、转基因棉花的获得和鉴定
一、转基因棉花的获得
1、将重组质粒pBSOD通过电击法导入根癌农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌甲。
2、转GhtSOD1基因植株的获得
将重组农杆菌甲通过农杆菌介导下胚轴的方法导入棉花品种“中棉所35”，RB和LB之间的片段通过同源重组整合到棉花基因组中，得到T0代转GhtSOD1基因植株。T0代植株自交产生的种子及由它所长成的植株用T1代表示。
农杆菌介导下胚轴的方法即将棉花品种“中棉所35”的下胚轴切断并与重组农杆菌甲同培养，具体参见文献：Wu Horch RB.A simple and general method fortransferring genes into plants.Science,1985,227:1229～1231。
转GhtSOD1基因植株的PCR鉴定方法如下：以植株的基因组DNA为模板，用PTP和PSOD组成的引物对进行PCR鉴定，PTP对应叶绿体信号肽的编码序列，PSOD对应GhSOD1基因的编码序列，靶序列约为536bp的片段。
PTP：5′-CTTCC ATGGCTCAGC CATCTC-3′；
PSOD：5′-CGACCGCTCT TCCAATAATG-3′。
PCR扩增条件：95℃预变性3min；94℃变性50s、58℃退火50s、72℃延伸50s，32个循环；72℃延伸5min，16℃保存。
PCR鉴定电泳图见图2A（M：分子量标记；WT:棉花品种“中棉所35”；P：重组质粒pBSOD；1-8为PCR鉴定阳性的植株）。
对于某一T0代植株，如果该植株及其T1代植株PCR鉴定均为阳性，该植株为纯合的转GhtSOD1基因植株，该植株及其自交后代为一个转GhtSOD1基因株系。共得到8个转GhtSOD1基因株系（分别命名为ST1-ST8株系）。
3、将重组质粒pBCAT通过电击法导入根癌农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌乙。
4、转GhtCAT1基因植株的获得
将重组农杆菌乙通过农杆菌介导下胚轴的方法导入棉花品种“中棉所35”，RB和LB之间的片段通过同源重组整合到棉花基因组中，得到转GhtCAT1基因植株。方法同步骤2。
转GhtCAT1基因植株的PCR鉴定方法如下：以植株的基因组DNA为模板，用PTP和PCAT组成的引物对进行PCR鉴定，PTP对应叶绿体信号肽的编码序列，PCAT对应GhCAT1基因的编码序列，靶序列约为562bp的片段。
PTP：5′-CTTCC ATGGCTCAGC CATCTC-3′；
PCAT：5’-CTTCACTGCAAAACCACGAG-3’。
PCR扩增条件：95℃预变性3min；94℃变性50s、58℃退火50s、72℃延伸50s，32个循环；72℃延伸5min，16℃保存。
PCR鉴定电泳图见图2B（M：分子量标记；WT:棉花品种“中棉所35”；P：重组质粒pBCAT；1-8为PCR鉴定阳性的植株）。
对于某一T0代植株，如果该植株及其T1代植株PCR鉴定均为阳性，该植株为纯合的转GhtCAT1基因植株，该植株及其自交后代为一个转GhtCAT1基因株系。共得到8个转GhtSOD1基因株系（分别命名为CT1-CT8株系）。
5、Southern杂交分析检测
将步骤2和4得到的各个转基因株系的T0代植株分别进行Southern杂交鉴定，方法为：提取植株的基因组DNA，用限制性内切酶BamH I酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，然后用序列为NPT II基因的探针杂交。
结果见图3（M：分子量标记；WT:棉花品种“中棉所35”；P：pBin438载体；1-6为转GhtSOD1基因植株；13-18为转GhtCAT1基因植株）。转基因植株均有杂交条带显示，大小在2.5-9.2kb之间，而棉花品种“中棉所35”没有杂交条带，正对照有一条大小为13kb的带。结果表明，转GhtSOD1基因植株中GhtSOD1基因已经整合到棉花基因组中，转GhtCAT1基因植株中GhtCAT1基因已经整合到棉花基因组中。在pBin438载体的RB和LB之间只有一个BamH I酶切位点，所以在不考虑串联重复的情况下，可以认为每个杂交条带代表一个拷贝数。因此，转GhtSOD1基因植株中有3株为单拷贝插入（ST1、ST2和ST4），3株为双拷贝插入（ST3、ST5和ST6），转GhtCAT1基因植株中由3株为单拷贝插入（CT2、CT3和CT4），3株为双拷贝插入（CT1、CT5和CT6）。
6、目的基因表达量的分析
将步骤2和4得到的各个转基因株系的T0代植株分别进行半定量RT-PCR，方法为：提取植株的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，用PTP和PSOD组成的引物对鉴定GhtSOD1基因的表达量，用PTP和PCAT组成的引物对鉴定GhtCAT1基因的表达量，用GhUBI-F和GhUBI-R组成的引物对鉴定棉花GhUBI基因（内参基因）。
GhUBI-F：5’-ctgaatcttcgctttcacgttatc-3’；
GhUBI-R：5’-gggatgcaaatcttcgttaagac-3’。
转GhtSOD1基因植株的结果见图4（P：重组质粒pBSOD；WT:棉花品种“中棉所35”；1-6为转GhtSOD1基因植株）。ST5株系的植株中GhtSOD1基因的表达量较低，其余5个株系的植株中GhtSOD1基因的表达量均较高，
转GhtCAT1基因植株的结果见图5（P：重组质粒pBCAT；WT:棉花品种“中棉所35”；1-6为转GhtCAT1基因植株）。CT1株系、CT2株系和CT6株系的植株中GhtCAT1基因表达量较低，其余3个株系的植株中GhtCAT1基因的表达量均较高。
以上结果表明，转GhtSOD1基因植株中GhtSOD1基因已整合到基因组中并进行了转录表达，转GhtCAT1基因植株中GhtCAT1基因已整合到基因组中，并进行了转录表达。
7、转GhtSOD1和GhtCAT1两个基因叠加的棉花植株的获得
（1）将ST2株系的T1代植株（母本）和CT3株系的T1代植株（父本）进行人工杂交，得到F1代植株。
（2）将F1代植株进行两代自交，获得F2代植株和F3代植株。
将F2代植株和F3代植株进行PCR鉴定，鉴定方法见步骤2和步骤4，
对于某一F2代植株，如果该植株及其F3代植株的GhtSOD1基因鉴定均为阳性且GhtCAT1基因的PCR鉴定均为阳性，该植株为纯合的转GhtSOD1基因和GhtCAT1基因植株，该植株及其自交后代为一个转GhtSOD1基因和GhtCAT1基因株系（命名为SCT纯合系）。
二、转空载体棉花的获得
1、将pBin438载体通过电击法导入根癌农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌丙。
2、转空载体植株的获得
将重组农杆菌丙通过农杆菌介导下胚轴的方法导入棉花品种“中棉所35”，RB和LB之间的片段通过同源重组整合到棉花基因组中，得到T0代转空载体植株。T0代植株自交产生的种子及由它所长成的植株用T1代表示。
三、转基因棉花的抗性鉴定
随机取一个SCT纯合系，即SCT3-1纯合系，进行步骤二的各个抗性鉴定。
1、抗盐性
将F3代SCT3-1纯合系植株（用SCT表示）、T1代转空载体植株（用CK2表示）和棉花品种“中棉所35”（用CK1表示）分别进行如下鉴定：
每个株系取20粒种子，灭菌后用无菌水浸泡，然后种植于花盆（装有等质量混合的蛭石和营养土；口径30cm，盆深30cm）中，将花盆放置于温室中，28℃自然光照培养3周，各个种子均发育为具有1-2片真叶的幼苗。
将每个株系的幼苗随机分为两组，每组10株，分别进行如下处理：
第一组：用水浇灌并培育5周；
第二组：用100mM NaCl水溶液浇灌1周，然后用150mM NaCl水溶液浇灌1周，然后用200mM NaCl水溶液浇灌3周；
分组处理完成后，拍照，测量植株地上部分的高度、植株地上部分的干重和植株地下部分的干重。
干重的测量方法：取整个植株的地上部分或地下部分，轻轻抖去浮土，用流水冲洗干净，自然晾干，在烘箱内80℃烘烤2个小时后称重。
照片见图6。
植株地上部分的高度、地上部分的干重和地下部分的干重的测量结果见表2。
表2植株地上部分的高度、植株地上部分的干重和植株地下部分的干重（平均值）
Figure BDA00002500494900111
注：I、II、III表示三次重复实验。
第一组中，各个株系的棉花的生长状况没有显著差异。
SCT3-1纯合系的棉花表现出较高的抗盐性能，在不断增加的盐浓度情况下，仍然能够正常生长，而非转基因棉花（CK1）和转空载体棉花（CK2）在盐处理5周后表现为株型矮小、生长慢。盐处理5周后，SCT3-1纯合系的棉花的株高极显著高于CK1和CK2，其地上和地下部分的生物量也极显著高于两个对照。结果表明，SCT3-1纯合系的棉花具有较高的抗盐能力。
2、抗旱性
将F3代SCT3-1纯合系植株（用SCT表示）、T1代转空载体植株（用CK2表示）和棉花品种“中棉所35”（用CK1表示）分别进行如下鉴定：
每个株系取30粒种子，灭菌后用无菌水浸泡，然后种植于花盆（装有等质量混合的蛭石和营养土；口径30cm，盆深30cm）中，将花盆放置于温室中，28℃自然光照培养3周，各个种子均发育为具有1-2片真叶的幼苗，然后连续12天不浇水（第12天第一次统计存活率），然后恢复正常浇水5天（第5天第二次统计存活率）。
存活率统计见表3。
表3棉花抗旱实验植株存活情况统计
Figure BDA00002500494900121
注：I、II、III表示三次重复实验。
SCT3-1纯合系的棉花表现出较高的抗旱性能，在连续干旱处理的情况下，仍然能够正常生长，虽然有些植株发生严重的萎蔫，但是在恢复浇水的全部能够恢复生长。而非转基因棉花（CK1）和转空载体棉花（CK2）在连续干旱到第8天时大部分植株发生严重萎蔫，干旱到12天时绝大部分植株出现明显死亡症状，恢复浇水后只有少部分植株恢复生长。结果表明，SCT3-1纯合系的棉花具有较高的抗旱能力。
3、黄萎病抗性
将F3代SCT3-1纯合系植株（用SCT表示）、T1代转空载体植株（用CK2表示）和棉花品种“中棉所35”（用CK1表示）分别进行如下鉴定：
每个株系取30粒种子，灭菌后用无菌水浸泡，然后种植于花盆（装有等质量混合的蛭石和营养土；口径30cm，盆深30cm）中，将花盆放置于温室中，28℃自然光照培养3周，各个种子均发育为具有1-2片真叶的幼苗，接种大丽轮枝菌V592生理小种（即在每个花盆中浇灌50mL浓度为106个/mL的孢子悬浮液），从接种开始计时，培养15天后观察棉花的发病情况，并采用石磊岩等进行棉苗黄萎病分级方法（石磊岩,孙文姬.棉花黄萎病苗期鉴定方法[J].植物保护,1987,13(1):42.）进行分级。
黄萎病分级方法：
0级：健株，叶片无病状；
1级：0.1%-25%的叶片表现病状；叶肉变为淡黄色或有不规则形的黄色病斑；
2级：26%-50%的叶片显病状，病斑颜色大部分变为黄色或黄褐色，叶片边略有卷枯；
3级：51%-75%的叶片表现病状，有少数叶片凋落；
4级：76%以上叶片发病，多为褐色掌状枯斑，叶片有的脱落成光杆，严重时甚至整株枯死。
病情指数=(Σ各级病株数×相应病级)/(总株数×最高病级)×100。
结果见表4。
表4棉花对黄萎病菌抗性情况统计
Figure BDA00002500494900131
注：I、II、III表示三次重复实验。
SCT3-1纯合系的棉花表现出高的抗病性能，在接菌后15天植株仍然能够生长，叶片没有脱落。而非转基因棉花（CK1）和转空载体对照（CK2）表现为严重感病，叶片脱落严重。结果表明，SCT3-1纯合系的棉花较高的抗病能力。
Figure IDA00002500495900011
Figure IDA00002500495900021
Figure IDA00002500495900041
Figure IDA00002500495900071

Claims (10)

1.GhSOD1蛋白，是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列3自N末端第85-236位氨基酸残基组成的蛋白质；
（b）将（a）所述蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗性相关的由序列3衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因，是如下1）至4）中任一所述的DNA分子：
1）序列表中序列1自5’端第253至第708位核苷酸所示的DNA分子；
2）序列表中序列1自5’端第253至第711位核苷酸所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子；
4）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子。
3.GhCAT1蛋白，是如下（c）或（d）：
（c）由序列表中序列4自N末端第85-576位氨基酸残基组成的蛋白质；
（d）将（c）所述蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗性相关的由序列4衍生的蛋白质。
4.编码权利要求3所述蛋白的基因，是如下5）至8）中任一所述的DNA分子：
5）序列表中序列2自5’端第253至第1728位核苷酸所示的DNA分子；
6）序列表中序列2自5’端第253至第1731位核苷酸所示的DNA分子；
7）在严格条件下与5）或6）限定的DNA序列杂交且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子；
8）与5）或6）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子。
5.融合蛋白甲，自上游至下游依次包括信号肽和权利要求1所述蛋白。
6.编码权利要求5所述融合蛋白甲的基因。
7.融合蛋白乙，自上游至下游依次包括信号肽和权利要求3所述蛋白。
8.编码权利要求7所述融合蛋白的基因。
9.含有权利要求2或4或6或8所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
10.一种培育转基因植物的方法，是将基因甲和基因乙同时导入目的植物中，得到抗性高于所述目的植物的转基因植物；所述基因甲为权利要求2或6所述基因；所述基因乙为权利要求4或8所述基因。
CN201210506489.0A 2012-11-30 2012-11-30 一种培育抗性植物的方法及其专用蛋白和基因 Expired - Fee Related CN103849605B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210506489.0A CN103849605B (zh) 2012-11-30 2012-11-30 一种培育抗性植物的方法及其专用蛋白和基因

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210506489.0A CN103849605B (zh) 2012-11-30 2012-11-30 一种培育抗性植物的方法及其专用蛋白和基因

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103849605A true CN103849605A (zh) 2014-06-11
CN103849605B CN103849605B (zh) 2016-08-03

Family

ID=50857729

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201210506489.0A Expired - Fee Related CN103849605B (zh) 2012-11-30 2012-11-30 一种培育抗性植物的方法及其专用蛋白和基因

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103849605B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107723301A (zh) * 2016-08-09 2018-02-23 新疆农业大学 一种棉花抗旱基因及其表达载体与应用
CN110256549A (zh) * 2019-07-29 2019-09-20 九圣禾种业股份有限公司 植物抗病蛋白GhWRKY40与编码基因及其应用
CN112266419A (zh) * 2020-10-29 2021-01-26 中国科学院微生物研究所 一种人工合成的抗除草剂蛋白

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102250896A (zh) * 2010-08-30 2011-11-23 山东农业大学 一种提高种子抗氧化能力及种质改良的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102250896A (zh) * 2010-08-30 2011-11-23 山东农业大学 一种提高种子抗氧化能力及种质改良的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HU,G.H. ET AL.: "putative cytosolic copper/zinc superoxide dismutase [Gossypium hirsutum]", 《GENBANK: ABE01089.1》 *
HU,G.H. ET AL.: "putative cytosolic copper/zinc superoxide dismutase [Gossypium hirsutum]", 《GENBANK: ABE01089.1》, 24 July 2008 (2008-07-24) *
MENQ JIAU TSENG ET AL.: "Enhanced tolerance to sulfur dioxide and salt stress of transgenic Chinese cabbage plants expressing both superoxide dismutase and catalase in chloroplasts", 《PLANT PHYSIOLOGY AND BIOCHEMISTRY》 *
NI,W., ET AL.: "RecName: Full=Catalase isozyme 1", 《NCBI UNIPROTKB/SWISS-PROT: P17598.2》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107723301A (zh) * 2016-08-09 2018-02-23 新疆农业大学 一种棉花抗旱基因及其表达载体与应用
CN110256549A (zh) * 2019-07-29 2019-09-20 九圣禾种业股份有限公司 植物抗病蛋白GhWRKY40与编码基因及其应用
CN112266419A (zh) * 2020-10-29 2021-01-26 中国科学院微生物研究所 一种人工合成的抗除草剂蛋白

Also Published As

Publication number Publication date
CN103849605B (zh) 2016-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101173002B (zh) 植物耐逆性相关转录因子GmWRKY54及其编码基因与应用
CN101906155A (zh) 一种植物抗旱、耐盐相关蛋白ErNAC7及其编码基因和应用
CN102532287B (zh) 苔藓植物耐逆蛋白PpLEA3-17及其编码基因与应用
CN107557368A (zh) 非生物胁迫耐性提高的植物和方法
CN105017393A (zh) 与植物抗逆性相关的蛋白BhDNAJC2及其编码基因与应用
CN104725495B (zh) 棉花GhWRKY51转录因子及其编码基因与应用
CN102399268B (zh) 植物耐逆性相关转录因子GmNAC11及其编码基因与应用
CN102584965B (zh) 苔藓植物耐逆蛋白PpLEA3-20及其编码基因与应用
CN107974459A (zh) 提高植物非生物胁迫耐性的构建体和方法
CN103849605A (zh) 一种培育抗性植物的方法及其专用蛋白和基因
CN103288943B (zh) bHLH13蛋白及其编码基因和其应用
CN104140462A (zh) 植物耐盐性相关蛋白GhSnRK2-6及其编码基因与应用
CN107987139A (zh) 一种Dof转录因子及其在提高植物耐盐方面的应用
CN101704884A (zh) 一种植物抗旱、耐盐相关蛋白EeABF6及其编码基因和应用
CN102911262B (zh) 植物耐逆性相关蛋白及其编码基因和应用
CN102477089B (zh) 与植物耐低温性相关的蛋白及其编码基因与应用
CN103993020A (zh) 一种植物强耐盐基因SseNHX1及其编码蛋白和应用
CN102731640A (zh) 植物耐逆相关蛋白TaMYB30及其编码基因和应用
CN103254299B (zh) 一种获得抗真菌病害植物的方法
CN104341492B (zh) 植物耐旱性相关蛋白OsERF71及其编码基因与应用
CN103288937B (zh) 一种培育抗逆植物的方法及其专用蛋白和基因
CN102140133A (zh) 一种植物抗旱、耐盐相关蛋白ErABF1及其编码基因和应用
CN102477088B (zh) 与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因与应用
CN106868039A (zh) 一种表达载体及其在培育转基因植物中的应用
CN101993479A (zh) 植物耐逆性相关转录因子TaWRKY1及其编码基因与应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20160803

Termination date: 20161130