CN103288937B

CN103288937B - 一种培育抗逆植物的方法及其专用蛋白和基因

Info

Publication number: CN103288937B
Application number: CN201210042222.0A
Authority: CN
Inventors: 吴家和; 庞金环; 王江英; 夏桂先; 田颖川
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2012-02-22
Filing date: 2012-02-22
Publication date: 2014-11-26
Anticipated expiration: 2032-02-22
Also published as: CN103288937A

Abstract

本发明公开了一种与植物抗逆性相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白为下述1)或2)：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物抗逆性相关的由1)衍生的蛋白质。实验证明，在烟草中过量表达该蛋白能够提高烟草的抗坏血酸(维生素C)的含量；在多种逆境胁迫下，如高盐和低温等，过量表达的转入该蛋白编码基因的烟草能够产生高抗性。因此利用本发明所提供的蛋白及其编码基因培育抗逆植物，在植物环境适应性和种植范围的扩大等应用中将会有广阔的前景。

Description

一种培育抗逆植物的方法及其专用蛋白和基因

技术领域

本发明涉及一种与植物抗逆性相关的蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种来源于棉花的与植物抗盐抗低温相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

棉花是重要的经济作物，在我国，常年种植棉花面积在一亿亩左右。棉花是一种具有一定抗逆性的作物，但随着土壤干旱、盐碱化、低温冻害出现的频率和程度加大，其本身的抗逆性已经不足以抵抗，导致产量和品质大幅度下降。

上述逆境对棉花产生危害的主要原因是大量活性氧产生(刘金定，叶武威，樊宝相.我国棉花抗逆研究及其利用[J].中国棉花，1998，25(3)：5-6.)。L-抗坏血酸(L-ascorbicacid，AA)，也即维生素C的主要化学形式，是一种抗氧化剂，它能直接捕获活性氧，调节活性氧的水平，AA参与细胞生长、分裂和程序性死亡的过程，能保护植物体免受活性氧的危害(Mittler R.Oxidative stress，antioxidants and stress tolerance[J].TrendsPlant Sci，2002，7(9)：405-410.)。维生素C能够协同相关作用酶清除植物在正常生理状态、干旱、盐渍等逆境胁迫中产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，保护机体免受氧化损伤，从而赋予植物较强的抗逆性。

综上所述，如果能够发现棉花中存在与维生素C密切相关的新基因，这将对提高棉花的抗逆性具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种与植物抗逆性相关的蛋白质及其编码基因与应用。

本发明所提供的蛋白质来源于棉花(Gossypium hirsutum L.)，命名为GhGME，为下述1)或2)：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物抗逆性相关的由1)衍生的蛋白质。

为了使上述1)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH

FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。

编码上述GhGME蛋白的基因(命名为GhGME)也属于本发明的保护范围。

所述GhGME基因为如下a)-c)中任一所述的基因：

a)编码序列是序列表中序列1的自5′末端第90-1220位；

b)核苷酸序列是序列表中的序列1；

c)在严格条件下与a)或b)的基因杂交，且编码所述GhGME蛋白的基因。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列1由1466个核苷酸组成，第90-1220位为编码序列，编码序列表中序列2所示的蛋白质。序列2由376个氨基酸组成。

含有所述GhGME基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体中启动所述GhGME基因转录的启动子可为35S启动子。

在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体具体为在pBin438质粒的多克隆位点处插入序列表中序列1的第90-1220位所示的DNA分子得到的重组质粒。

所述表达盒由能够启动所述GhGME基因表达的启动子，所述GhGME基因，以及转录终止序列组成。

所述GhGME蛋白，或所述GhGME基因，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下a1)或a2)中的应用也属于本发明的保护范围：

a1)调控植物抗逆性；

a2)调控植物维生素C含量。

在本发明的一个实施例中，所述调控植物抗逆性具体为提高植物的抗逆性；所述调控植物维生素C含量具体为提高植物维生素C的含量。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗逆性提高和/或维生素C含量提高的转基因植物的方法。

本发明所提供的方法包括将所述GhGME基因导入目的植物，得到表达所述GhGME基因的转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，抗逆性提高，和/或维生素C含量提高。

所述GhGME基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述目的植物中，得到所述转基因植物。

在本发明的一个实施例中，所述抗逆性具体表现为抗盐性和/或抗低温性。

所述植物可为双子叶和单子叶植物，如烟草、棉花和玉米。在本发明的一个实施例中，所述植物具体为烟草品种SR1(Nicotiana tabacum cv.SR1)。

本发明根据棉花盐胁迫相关的EST序列设计特异性引物，利用3′，5′-RACE技术，从棉花叶片中克隆出GhGME基因。利用荧光定量Real-time PCR方法对棉花根、茎、叶和三种处理下，GhGME基因的表达特性进行分析，结果表明GhGME基因在根、茎中高水平表达，在叶中表达量较低。在4℃低温和200mmol/L NaCl处理下该基因表达上调，然而用100μmol/L GA₃处理则表现为下调表达。在烟草中过量表达GhGME基因能够提高烟草的抗坏血酸的含量(维生素C)。在多种逆境胁迫下，如高盐和低温等，过量表达的转GhGME基因烟草能够产生高的抗性。因此利用本发明的抗逆蛋白GhGME及GhGME基因来培育抗逆植物，在植物环境适应性和种植范围的扩大等应用中将会有广阔的前景。

附图说明

图1为棉花根、茎和叶片的总RNA电泳图谱和RT-PCR检测GhGME基因在棉花叶片中表达的电泳图。其中，A为棉花根、茎和叶片的总RNA电泳图；B为RT-PCR检测GhGME基因在棉花叶片中表达的电泳图。A中，泳道1为棉花根；泳道2为棉花茎；泳道3为棉花叶。B中，泳道M为DL 2000 DNA Marker；泳道1为棉花叶片中RT-PCR的扩增结果。

图2为GhGME基因5’-RACE和3’-RACE的PCR扩增结果以及GhGME基因T载体阳性克隆鉴定。其中，A为GhGME基因5’-RACE和3’-RACE的PCR扩增结果；B为GhGME基因5’-RACE产物的克隆鉴定；C为GhGME基因3’-RACE产物的克隆鉴定。A中，泳道M为DL 1Kb DNA Marker；泳道1为5’-RACE产物；泳道2为3’-RACE产物。B中，泳道M为1Kb DNA Marker；泳道1-4为GhGME基因5’-RACE产物的克隆鉴定。C中，泳道M为1Kb DNA Marker；泳道1-4为3’-RACE产物的克隆鉴定。

图3为RT-PCR检测GhGME基因在棉花不同组织中的特异行表达。其中，1表示根；2表示茎；3表示叶。

图4为RT-PCR检测GhGME基因在低温、盐胁迫和GA3处理下的表达。其中，A为RT-PCR检测GhGME基因在低温处理下的表达；B为RT-PCR检测GhGME基因在盐胁迫处理下的表达；C为RT-PCR检测GhGME基因在GA3处理下的表达。A-C中，横坐标的数值表示相应处理的时间，单位为h。

图5为重组表达载体pBGME的构建流程图。

图6为转GhGME基因烟草植株(TG1、TG3、TG5-TG9)的PCR扩增检测结果。其中，泳道M为1kb DNA Marker；泳道P为重组表达载体pBGEM(阳性对照)的结果；泳道CK为转入pBin438空载体的烟草植株(阴性对照)的结果；TG1、TG3、TG5-TG9这7个泳道代表转GhGME基因烟草植株的结果。

图7为转GhGME基因烟草植株(TG1、TG3、TG5-TG9)的Southern杂交检测结果。其中，泳道M为Marker；泳道P为重组表达载体pBGEM(阳性对照)的结果；泳道CK为转入pBin438空载体的烟草植株(阴性对照)的结果；TG1，TG3，TG5-TG9这7个泳道代表转GhGME基因烟草植株的结果。

图8半定量RT-PCR检测转GhGME基因烟草植株(TG1-TG10)中GhGME的转录表达。其中，泳道P为重组表达载体pBGEM(阳性对照)的结果；泳道CK为转入pBin438空载体的烟草植株(阴性对照)的结果；TG1-TG10这10个泳道代表转GhGME基因烟草植株的结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、棉花GhGME基因的克隆和表达分析

下述所有基因操作方法均参照《分子克隆》(Sambrook J等人，1989)所述进行；有关试剂盒使用参照所购试剂盒的应用说明；所用限制性内切酶和其它工具酶均购自NEB公司。

1、棉花总RNA的提取和GhGME基因EST目的片段的扩增

(1)材料和试剂

棉花材料为中棉所35，由河南科润生物技术有限公司刘正德研究员惠赠。大肠杆菌DH5α、5’-Full RACE Kit、3’-Full RACE Kit以及SYBR Premix Ex Taq均购自TaKaRa公司，pGEM-T Easy Vector System购自Promega公司，Revert Aid H Minus First StrandcDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司，Gen Clean柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司。

(2)棉花总RNA的提取和GhGME基因EST目的片段的扩增

将棉花品种中棉所35的种子用无菌水浸泡，置于25℃的光照培养箱中处理48h，光周期为12h光照/12h黑暗，等种子露白后种于蛭石和营养土(1∶1)混合的培养土中，放置于温室中出苗，温度27℃，自然光照。棉花苗生长3周左右出现1-2片真叶时，取幼嫩的叶片、茎和根三种组织立即进行液氮冷冻贮备待用。根据改良的CTAB法分别从上述三种组织中提取棉花的总RNA(胡根海，喻树迅.利用改良的CTAB法提取棉花叶片总RNA[J].棉花学报，2007，19(1)：19，69-70.)。

采用琼脂糖凝胶电泳，对提取的棉花根、茎和叶片的总RNA分别进行RNA完整性检测。结果显示：棉花根、茎和叶片的总RNA电泳图谱均呈现28S、18S两条完整的带，这表明三种组织中所提取的RNA均完好，均可以用于反转录和PCR扩增(如图1中A所示)。

选取中棉所35的棉花叶片总RNA为实验材料，根据棉花盐胁迫EST序列，设计特异性引物进行RT-PCR扩增，并将扩增产物进行凝胶回收，进而与T载体连接测序，测序发现所述扩增产物上含有长为582bp的上述棉花盐胁迫EST序列。另外，RT-PCR扩增结果表明该扩增产物在棉花叶片中有一定的表达水平(如图1中B所示)。

2、棉花GhGME基因的克隆

(1)cDNA第一链的合成

分别以步骤1所得总RNA为模板，利用TaKaRa公司的5’-Full RACE Kit、3’-FullRACE Kit以及逆转录反应试剂盒Revert Aid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit分别合成5’RACE Ready cDNA第一链和3’RACE Ready cDNA第一链。

(2)引物的设计与合成

根据步骤1所述的棉花盐胁迫EST序列，分别设计2条5’-RACE反义引物：GME-R1、GME-R2和2条3’-RACE正义引物GME-F1、GME-F2。引物设计结果如下：

GME-F1：5’-CCGTGAGCCTGTGAACATCGGAAGTG-3’(序列1的第875-900位)

GME-F2：5’-TGAATGTCGCATTGGAAGGTTCCAC-3’(序列1的第668-692位)

GME-R1：5’-CACAATCTCCGCCATCTCGTTCATG-3’(序列1的第914-938位的反向互补序列)

GME-R2：5’-ACTTCCGATGTTCACAGGCTCACGG-3’(序列1的第875-899位的反向互补序列)

上述引物均由北京三博远志生物技术有限公司合成。

(3)RACE法克隆GhGME基因

分别以步骤(1)合成的5’RACE Ready cDNA第一链和3’RACE Ready cDNA第一链为模板，利用步骤(2)设计合成的5’-RACE反义引物和3’-RACE正义引物进行扩增，从而获得未知基因的5’端序列和3’端序列。

经2％琼脂糖凝胶电泳检测，可以看到5’-RACE和3’-RACE产物均有一条清楚的条带(图2中A)，且5’-RACE产物(5’端片段)大小约为900bp，3’-RACE产物(3’端片段)大小约为592bp。在紫外灯下将两个目的片段割胶回收，分别连接到DGEM-T载体上，转化大肠杆菌感受态DH5α，进行蓝白斑筛选，挑取白斑，菌落PCR检测后，将阳性克隆(图2中B)测序。测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。测序结果表明，上述5’-RACE产物(5’端片段)长度为900bp，3’-RACE产物长度为592bp。将这两个片段进行拼接获得未知基因的全长序列，为1466bp，将其命名为GhGME。GhGME基因序列如序列表中序列1所示，第90-1220位为其开放阅读框(1131bp)，编码序列表中序列2所示蛋白质(376个氨基酸，分子量为42.396KDa，等电点pI＝6.291)。

3、棉花GhGME基因在不同组织及不同处理条件下的表达分析

(1)样品的采集和处理设置

将棉花品种中棉所35的种子用无菌水浸泡，置于25℃的光照培养箱中处理48h，光周期为12h光照/12h黑暗，等种子露白后种于蛭石和营养土(1∶1)混合的培养土中放置于温室中出苗，温度27℃，自然光照。棉花苗生长3周左右出现1-2片真叶时，按照如下两方面进行操作：

一方面，取正常棉花植株幼嫩的叶片、茎和根立即进行液氮冷冻贮备待用，根据改良的CTAB法提取总RNA(胡根海，喻树迅.利用改良的CTAB法提取棉花叶片总RNA[J].棉花学报，2007，19(1)：19，69-70.)，并通过反转录PCR获得棉花叶片、茎和根三种组织的cDNA，供下述步骤(2)RT-PCR检测GhGME基因在棉花根、茎、叶三种不同组织中的表达情况。每种组织取9份样品(每次试验取样3份，三次生物学重复)。

另一方面，对幼苗进行下述三方面的处理：a)整株低温处理：4℃分别处理0h和8h，每个处理9株；b)根部浇灌盐处理：200mmol/L NaCl分别处理0h、2h、4h和8h，同时每个时间段均设置水处理对照，每个处理9株；c)叶片喷洒激素处理：100μmol/L水溶的GA₃分别处理0h、4h和8h，同时每个时间段均设置水处理对照，每个处理9株。处理后，取幼嫩的叶片立即进行液氮冷冻贮备待用，根据改良的CTAB法提取总RNA(胡根海，喻树迅.利用改良的CTAB法提取棉花叶片总RNA[J].棉花学报，2007，19(1)：19，69-70.)，并通过反转录PCR获得棉花叶片组织的cDNA，供下述步骤(2)RT-PCR检测GhGME基因在棉花经低温、盐胁迫和GA3处理后的表达情况。

(2)RT-PCR检测GhGME基因在棉花不同组织及不同处理条件下的表达情况

利用Quantitative Real time PCR方法，检测GhGME在棉花根、茎、叶中的表达情况及其在低温诱导、激素诱导和盐诱导后的不同时段的表达情况。GhGME扩增的一对引物为GME-F：5’-CTACAATGAGGTTGAAGGATG-3’(序列1的第1048-1068位)；GME-R：5’-CCTACCACCTTAGATGATCCG-3’(序列1的第1145-1165位的反向互补序列)。以棉花ubiquitin基因(登录号：AY189972)作为内标基因，扩增棉花ubiquitin基因的一对引物为Ubi-F：5’-AAGACCTACACCAAGCCCAAG-3’；Ubi-R：5’-ACACTCCGCATTAGGACACTC-3’。ubiquitin与目的基因同机分管扩增。Quantitative Real time PCR所用的反应体系为25μl，其中模板是定量稀释后的0.5μlcDNA(步骤(1)制备所得)。扩增条件为：95℃ 1min；95℃ 5s，59℃ 30s，72℃ 30s，40个循环；78℃、82℃和85℃各读板一次，绘制溶解曲线。

对GhGME基因在棉花不同组织中表达情况的分析：运用比较Ct法(Roche LightCycler system)求得GhGME基因在棉花根、茎、叶中的相对表达量，其中计算公式为：Y＝10^ΔCt/3×100％(ΔCt是内标基因Ct和目的基因Ct的差值，即ΔCt＝Ct_ubiquitin-Ct_GhGME)(Li X B，Fan X P，Wang X L，Cai L，Yang WC.The cotton ACTIN1 gene isfunctionally expressed in fibers and participates in fiber elongation[J].The Plant cell2005，17(3)：859-875)。

对GhGME基因在不同处理条件下表达情况的分析：运用Opticon Monitor 2软件计算样品的Ct值，并采用2^-ΔΔCt计算方法求得不同处理下样品的相对表达量，此后再运用Sigma Plot 11.0对数据进行统计分析并绘图。

对于GhGME基因组织特异表达分析的结果如图3所示，GhGME基因在棉花根、茎、叶三种组织中均有转录表达，但是所表达的RNA水平不同。GhGME在根和茎中的表达量较高，在叶中的表达量最低，仅为根中表达量的50％左右。

对于GhGME基因在低温、盐胁迫和GA3处理下的表达分析的结果如图4所示，生长至3周左右的棉花幼苗在低温胁迫8h后，叶片中GhGME基因表达量上升(图4中A)。盐胁迫2h，4h，8h后，叶片中GhGME基因表达量不断上升(图4中B)，水处理对照组没有变化。激素GA₃诱导处理4h和8h后，叶片中GhGME基因的表达量不断下降，8h的表达量下降到0h的40％左右，水对照组的表达量没有变化(图4中C)。

实施例2、转GhGME基因烟草植株的获得及性能验证

下述所有基因操作方法均参照《分子克隆》(Sambrook J等人，1989)所述进行；所用限制性内切酶和其它工具酶均购自NEB公司。

二元表达载体pBin438，含有由带双增强子的CaMV35S启动子(DE35S)、TMV-RNA cDNA的Ω片段-来自pBR322载体的BamH I-Sal I片段及Nos转录终止序列组成的外源基因表达框架(李太元，田颖川，秦晓峰，莽克强，李文谷，何永刚，沈蕾.高效抗虫转基因烟草的研究.中国科学，B辑，1994，24(3)：276～282)。

一、转GhGME基因烟草植株的获得

1、含有GhGME基因的重组表达载体pBGME的构建

把GhGME基因(序列1)克隆到T载体上，在设计克隆基因引物时在5’端加上了BamHI酶切位点，在3’端加上了Sal I酶切位点，扩增该基因的CDS序列，其中，扩增引物为cGMEf：5’-ggatccatgggaagtactgatggg-3’(下划线部分为BamH I酶切位点的识别序列)和cGMEr：5’-gtcgactcattctttgccgtcagcag-3’(下划线部分为Sal I酶切位点的识别序列)，然后将扩增产物(1143bp)连接到pGME-T载体上，将所得重组克隆载体命名为pGME。用限制性内切酶BamH I和Sal I酶切pGME和二元表达载体pBin438，将切下的GhGME的CDS序列插到pBin438的BamH I和Sal I位点之间构建成重组表达载体pBGME，其构建过程如图5所示(RB：右边界；NPT II：硫酸新霉素基因；DE-35SP：双增强子的CaMV35S启动子；Nos：终止子；LB：左边界)。

将构建的重组表达载体pBGME转化大肠杆菌DH5α(Invitrgen，Chicago，USA；Cat.No：11319-019)后，挑选抗卡那霉素Kanamycin的阳性克隆，进行BamH I和Sal I酶切以及测序鉴定，结果表明pBGME在BamH I和Sal I位点间的核苷酸序列是序列表中的序列1中自90位核苷酸至1220位核苷酸，即基因GhGME的CDS序列。

2、重组表达载体pBGME转化根癌土壤杆菌

对步骤1构建所得的重组植物表达载体pBGME或空载体pBin438用电击法(Dower WJ，Miller JF，Ragsdale CW.High efficiency transformation of E.coli by highvoltage electroporation.Nucleic Acids Res，1988，16(13)：6 127-6 145)转化到根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA；Cat.No：183 13-015)中，经卡那霉素筛选，挑选阳性克隆，进行BamH I和Sal I酶切验证，结果表明重组表达载体pBGME结构完全正确。将经鉴定表明转入pBGME载体的农杆菌名为pBGME/LBA4404；将转入空载体pBin438的农杆菌名为pBin438/LBA4404。

3、转GhGME基因烟草植株的获得及分子检测

(1)转GhGME基因烟草植株的获得

按照(Horch RB.A simple and general method for transferring genes intoplants.Science，1985，227：1229～1231)所述的叶盘法，将无菌培养的烟草SR1(Nicotianatabacum cv.SR1)(Chuanfeng Zhu，Yixue Wang，Yuanbao Li，Khizar Hayat Bhatti，Yingchuan Tian，Jiahe Wu*.2011.Overexpression of a cotton cyclophilin gene(GhCyp 1)intransgenic tobacco plants confers dual tolerance to salt stress and Pseudomonas syringae pv.tabaci infection.Plant Physiology and Biochemistry，49(2011)1264-1271)叶片与含有pBGME载体的根癌土壤杆菌(pBGME/LBA4404)共培养，将重组表达载体pBGME中的T-DNA(包括nptII基因和GhGME基因)转入到烟草染色体组中，获得抗卡那霉素的转入nptII基因和GhGME基因的烟草再生植株，将其中的10株依次编号为TG1-TG10。同时设置转入农杆菌pBin438/LBA4404的空载体对照。

(2)转入GhGME基因烟草植株的验证

1)PCR扩增检测

以步骤(1)获得的转GhGME基因烟草植株(TG1、TG3、TG5-TG9)为材料，按Paterson AH等(Paterson AH，Curt LB，Wendel JF.A rapid method for extrac-tion ofcotton(Gossypium spp.)genomic DNA suitable for RFLP and PCR analysis.Plant Mol BilRep，1993，11：112-117)所述方法提取其基因组DNA。设计扩增GhGME基因部分片段的PCR特异引物，其序列为：P1：5′-GGAAGTACTGATGGGACC-3′(序列表中序列1的第93-110位)和P2：5′-CTCCAAGCCGTAAGCATC-3′(序列1的第600-617位的反向互补序列)，引物由北京三博远志生物有限责任公司合成，这一对引物的扩增产物应为525bp左右的片段。

PCR扩增条件是：95℃预变性3min；94℃变性50s，58℃退火50s，72℃延伸50s，32个循环；72℃延伸5min，16℃保存。同时以转入pBin438空载体的烟草植株作为阴性对照；以重组表达载体pBGME作为阳性对照。

琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物结果如图6所示，步骤(1)所获得的部分抗卡那霉素的再生植株(TG1、TG3、TG5-TG9)的检测结果与作为阳性对照的pBGME一致，均扩增出大小约为525bp的目的片段；而转入pBin438空载体的阴性对照没有扩增出目的条带。这一结果表明，步骤(1)所获得的部分抗卡那霉素的再生植株(TG1、TG3、TG5-TG9)中GhGME基因已整合到所检测的烟草植株的染色体组中。

2)Southern杂交分析检测

A：植物DNA的提取

取2克步骤(1)获得的转入GhGME基因的烟草植株(TG1、TG3、TG5-TG9)的幼嫩叶片在液氮中研磨成粉后，按Paterson AH等(Paterson AH，Curt LB，Wendel JFA rapid method for extrac-tion of cotton(Gossypium spp.)genomic DNA suitable for RFLPand PCR analysis.Plant Mol Bil Rep，1993，11：112-117)报导的方法提取细胞核DNA。DNA的定量用紫外测定法，即1OD₂₆₀＝50μg/ml或在Agarose电泳后用EB染色比较确定。

B：植物DNA的酶解和电泳

取20μgDNA加入60单位的HindIII和5μl 10×限制性内切酶缓冲液，加无菌重蒸水至总体积为50μl，37℃保温过夜。取出5μl酶切液点样，观察是否酶切完整，结果表明酶切完全，在剩余的酶切液中加入5μl上样缓冲液进行点样，在0.8％ Agarose胶上以2V/cm的电压进行电泳分离DNA。

C：DNA的转膜、探针标记和杂交反应

电泳完成后，进行变性、转膜等过程均参照分子克隆一书(Sambrook et al，1989)所述进行，所用探针为用α-³²P-dCTP(北京福瑞公司)和Ready To Go DNA标记试剂盒(Takara；Cat：6045)标记的步骤1中GhGME基因扩增产物片段(525bp，对应序列1的第92-617位)。

以没有转入任何基因的野生型植株作为阴性对照，以重组表达载体pBGME作为阳性对照。

Southern杂交结果如图7所示，转基因植株均有杂交条带显示，大小在3.5-6.2kb之间，而转基因阴性对照没有杂交条带。这一结果表明步骤(1)获得的转入GhGME基因的烟草植株(TG1、TG3、TG5-TG9)中，GhGME基因已经整合到烟草染色体中，而且所检测的植株中单拷贝插入有株(TG3，TG5-8)，TG1为双拷贝插入，TG9为多拷贝插入(由于在整个植物表达载体的T-DNA区只有一个Hind III酶切位点，所以在不考虑串联重复的情况下，可以认为每个杂交条带代表一个拷贝数)。

3)转基因烟草中GhGME转录表达分析

采用半定量RT-PCR检测转基因烟草中GhGME的转录表达，具体如下：根据改良的CTAB法(胡根海，喻树迅.利用改良的CTAB法提取棉花叶片总RNA[J].棉花学报，2007，19(1)：19，69-70.)提取转基因烟草(TG1-TG10)和转入pBin438空载体烟草叶片中总RNA，并进行逆转录获得第一链cDNA。然后利用步骤1)所述的方法进行PCR扩增。以烟草actin基因(GenBank accession number：GQ281246)为内参基因，引物为ACT-F：5’-caatgaacttcgtgtggctcc-3’和ACT-R：5’-cggaatctctcagcaccaatg-3’。

用琼脂糖凝胶电泳检测半定量RT-PCR结果，结果显示：转入转入pBin438空载体的烟草植株无GhGME基因的表达；转GhGME基因烟草植株TG9的外源基因(GhGME基因)的表达量较低，其余9个转GhGME基因烟草植株中GhGME基因的表达量均较高，具体如图8所示。这一结果表明，步骤(1)所获得的部分抗卡那霉素的再生植株中GhGME基因已整合到所检测的烟草植株的染色体组中。

二、转GhGME基因烟草植株的性能检测

1、转GhGME基因烟草植株的抗坏血酸含量检测

(1)所用试剂

1％草酸溶液：称取1g草酸溶于100mL蒸馏水。

标准抗坏血酸溶液(0.1mg/mL)：准确称取50.0mg纯抗坏血酸(应为洁白色，如变为黄色则不能用)溶于1％草酸溶液中，并稀释至500mL，贮于棕色瓶中，冷藏。最好临用前配制。

0.1％ 2，6-二氯酚靛酚钠溶液：称取250mg 2，6-二氯酚靛酚钠溶于250mL的水中，贮于棕色瓶中4℃冷藏，约可保存一周。每次临用时，以标准抗坏血酸溶液标定。

(2)转GhGME基因烟草植株的抗坏血酸含量的测定

1)维生素C的提取

取步骤一所得转GhGME基因烟草苗叶片，用纱布或吸水纸吸干表面水分，然后称取1g左右，加入10～20mL 1％草酸，研磨成浆状，抽滤，合并滤液，滤液总体积定容至50mL。或者研磨后以1％草酸洗涤离心(4000r/min，10min)2～3次，合并上清液于50mL容量瓶中，用白陶土(不吸附维生素C)洗3次，使得滤液澄清，定容至容量瓶刻度。同时设置未经任何转基因的野生型SR1烟草对照(CK1)和转入pBin438空载体的烟草植株对照(CK2)。实验设三次重复。

2)标准液滴定

准确吸取标准抗坏血酸溶液1mL置50mL锥形瓶中，加9mL 1％草酸，以0.1％ 2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至粉色，并保持15秒不褪色，即达终点；取10mL 1％草酸作空白对照CK，按以上方法滴定。由所用染料(0.1％ 2，6-二氯酚靛酚溶液)的体积计算出1mL染料相当于多少毫克抗坏血酸，即滴定度。

式中：C为标准抗坏血酸溶液的浓度(0.1mg/mL)；

V为标准抗坏血酸溶液的体积(1mL)；

V1为滴定标准抗坏血酸溶液所用染料的体积；

V2为滴定空白对照溶液所用染料的体积。

3)样品滴定

准确吸取步骤1)制备滤液两份，每份10mL，分别放入2个锥形瓶内，滴定方法同前。另取10mL 1％草酸作空白对照滴定。

4)计算

式中：V_A为滴定样品所耗用的染料的平均毫升数；

V_B为滴定空白对照所耗用的染料的平均毫升数；

C为样品提取液的总毫升数(步骤1)中定容后体积，50ml)；

D为滴定时所取的样品提取液毫升数(步骤3)中所用体积，10ml)；

T为1mL染料能氧化抗坏血酸毫克数(由操作二计算出)；

W为待测样品的重量(单位：g)。

5)转GhGME基因烟草植株维生素C的含量

1ml标准抗坏血酸+9ml 1％草酸滴定至粉色，重复3次，0.1％ 2，6-二氯酚靛酚钠用量分别为：311μl、314μl、312μl。

10ml 1％草酸(空白对照实验)：滴定至粉色，重复3次，0.1％ 2，6-二氯酚靛酚钠用量分别为：16μl、15μl、14μl。

根据步骤2)公式计算：滴定度T(mg/ml)＝0.336mg/ml。进而根据步骤4)公式计算各待测样品中维生素C的含量。结果显示：转GhGME基因烟草中的10个植株(TG1-TG10)中，除TG9外，其他9个转GhGME基因烟草植株的维生素C含量均显著高于非转基因对照和空载体对照(非转基因对照与空载体对照无显著差异)(见表1)。这说明过量表达GhGME能够促进棉花细胞内维生素C，即抗坏血酸的合成。

表1 转基因烟草植株的维生素C含量

2、转GhGME基因烟草的抗逆性检测实验

(1)转GhGME基因烟草对盐处理的抗性检测

将步骤一获得的转GhGME基因的烟草植株(TG1-TG10)、非转基因烟草植株SR1(CK1)和转入pBin438空载体的转基因烟草植株(CK2)种子灭菌后，用无菌水浸泡，种植在平板上，置于25℃的光照培养箱中，光周期为12h光照/12h黑暗，等苗长到1cm高度时移栽到于蛭石和营养土(1∶1)混合的培养土中，盆栽苗放置于温室中，温度25℃，自然光照。苗生长3周左右出现1-2片真叶时，进行盐处理实验。用先用100mM的NaCl处理7天，再用150mM的NaCl处理7天，最后再用200mmol/LNaCl处理2周，然后用自来水洗盐。其间观察并统计各转基因株系植株的存活情况。实验设三次重复，每次重复选取10株。

结果如表2所示：步骤一获得的转GhGME基因的烟草植株(TG1-TG10)除了TG9外，其余9个株系均表现出高的抗盐性能，在不断增加的盐浓度情况下，直到四周绝大部分植株仍然能够恢复正常生长，而非转基因烟草植株SR1(CK1)和空载体对照(CK2)在盐处理4周后即全部死亡(CK1和CK2无显著差异)。由此证明，步骤一获得的转GhGME基因的烟草植株(除TG9外)具有较高的抗盐能力，与步骤一3(2)3)所述的GhGME的表达量，以及步骤1中维生素含量C含量的检测结果是一致的，即GhGME表达量和维生素C积累水平高的转GhGME基因的植株(TG1-TG8、TG10)具有较高的抗盐能力，这也使得筛选具有高抗盐性的转GhGME植株更为容易，这对抗盐育种的研究具有很高的应用价值。

表2 转GhGME基因烟草抗盐实验植株存活情况统计

注：I、II、III表示三次重组。“盐处理后2周植株存活数”所对应的统计植株存活率的时间点为150mM NaCl处理7天后。“盐处理后4周植株存活数”所对应的统计植株存活率的时间点为200mM NaCl处理2周后。

(2)转GhGME基因烟草对低温处理的抗性检测

将步骤一获得的转GhGME基因的烟草植株(TG1-TG6、TG9)、非转基因烟草植株SR1(CK1)和转入pBin438空载体的转基因烟草植株(CK2)种子灭菌后，用无菌水浸泡，种植在平板上，置于25℃的光照培养箱中，光周期为12h光照/12h黑暗，等苗长到1cm高度时移栽到于蛭石和营养土(1∶1)混合的培养土中，盆栽苗放置于温室中，温度25℃，自然光照。苗生长2周左右，进行低温处理实验。用4℃低温分别处理24，48，72，96h，再恢复25℃，3天后观察苗生长和成活情况。实验设三次重复，每次重复选取6株。

结果如表3所示：步骤一获得的转GhGME基因的烟草植株(TG1-TG6、TG9)除了TG9外，其余6个株系均表现出高的抗低温性能，在低温处理96h后恢复常温情况下绝大部分植株仍然能够恢复正常生长，而非转基因烟草植株SR1对照(CK1)和空载体对照(CK2)在低温处理72h后即全部死亡(CK1和CK2无显著差异)。由此证明，步骤一获得的转GhGME基因的烟草植株(TG1-TG6)具有较高的抗盐能力，与步骤一3(2)3)所述的GhGME的表达量，以及步骤1中维生素含量C含量的检测结果是一致的，即GhGME表达量和维生素C积累水平高的转GhGME基因的植株(TG1-TG6)具有较高的抗低温能力，这也使得筛选具有高抗低温性的转GhGME植株更为容易，这对抗低温育种的研究具有很高的应用价值。

表3 转GhGM基因烟草抗低温实验植株存活情况统计

注：I、II、III表示三次重组。

3、GhGME基因在转GhGME基因植株中的遗传性检测

为了解目的基因GhGME在转GhGME基因植株中的能否进行稳定遗传，对步骤一获得的三个转GhGME基因的烟草植株(TG3、TG5、TG6)的自交一代进行GhGME基因的PCR扩增，以及卡那霉素抗性检测。具体如下：

取步骤一获得的三个转GhGME基因的烟草植株(TG3、TG5、TG6)自交一代的种子(T1)，按照无菌苗的操作方法，将灭菌后的种子转移到含有200mg/ml卡那霉素的MS平板培养基上，置光照培养箱内培养，待幼苗长出一对真叶后不抗卡那霉素的植株很快变为白色，而抗卡那霉素的小苗仍保持绿色，计各个株系的绿苗数和白苗数，统计卡那霉素抗性的分离比。同时对子代植株(T1)进行PCR扩增目的基因GhGME，方法具体同步骤一3(2)1)所述，统计目的基因GhGME在子一代(T1)的分离情况。实验设3次重复，结果取3次重复的平均值。

结果如表4所示：三个转GhGME基因烟草植株(TG3、TG5、TG6)的子一代(T1)卡那霉素抗性分离比均为3∶1，这表明由重组表达载体pBGME带到烟草染色体组中的nptII基因(卡那霉素抗性基因)在转GhGME基因烟草植株子一代(T1)中是按单基因分离规律进行遗传的。三个转GhGME基因烟草植株(TG3、TG5、TG6)的子一代(T1)GhGME基因(与卡那霉素抗性基因nptII紧密连锁)分离比也均为3∶1。这表明GhGME基因在转GhGME基因烟草植株后代可以稳定遗传。

表4 转GhGME基因烟草植株后代目的基因和抗卡那霉素的分离情况

注：Kan^R、Kan^S分别表示抗卡拉霉素和对卡拉霉素敏感反应。

Claims

1.蛋白质，为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下a)或b)所述的基因：

a)编码序列是序列表中序列1的自5′末端第90-1220位；

b)核苷酸序列是序列表中的序列1。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的表达盒。

6.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

7.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为35S启动子。

9.权利要求1所述的蛋白质，或权利要求2或3所述的基因，或权利要求4或7或8所述的重组载体，或权利要求5所述的表达盒，或权利要求6所述的重组菌，在如下a1)或a2)中的应用：

a1)调控植物抗逆性；

a2)调控植物维生素C含量；

所述抗逆性为抗盐性和/或抗低温性。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述植物为烟草。

11.一种培育抗逆性提高和/或维生素C含量提高的转基因植物的方法，包括将权利要求2或3所述基因导入目的植物，得到表达所述基因的转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，抗逆性提高，和/或维生素C含量提高；

所述抗逆性为抗盐性和/或抗低温性。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述植物为烟草。