CN105755038A - EdHP1蛋白在提高植物对重金属铅的抗性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种EdHP1蛋白在提高植物对重金属铅的抗性中的应用。本发明所提供的应用具体为EdHP1蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下1)或2)中的应用：1)调控植物对重金属铅的抗性；2)选育对重金属铅的抗性增强的植物品种。EdHP1基因能够提高转基因烟草对重金属铅胁迫的抗性。因此，EdHP1基因在作物抗重金属铅的遗传改良方面具有重要的应用价值。

Description

EdHP1蛋白在提高植物对重金属铅的抗性中的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，涉及一种EdHP1蛋白在提高植物对重金属铅的抗性中的应用。
背景技术
随着人类社会的不断进步和工业化进程的加快，土壤重金属污染日益突出。因其污染范围广、持续时间长、污染隐蔽、不可逆性等原因已为人们广为关注。若重金属在植物体内积累过多，会对植物产生毒害作用，使植物体内的代谢过程发生紊乱，直接影响植物生长发育，乃至造成植株死亡。铅作为一种主要的重金属污染源，其对植物引起危害的问题，已引起人们的高度重视，这方面的研究也日趋活跃。因此，培育抗重金属胁迫的植物新品种，如培育抗重金属铅胁迫的植物新品种，已经迫在眉睫。
H+焦磷酸化酶(H+-pyrophosphatase，H+-PPase)是一种H+转运酶，广泛存在于植物和少数藻类、原生动物、细菌以及原始细菌中。在液泡膜上，H+-PPase能够把无机焦磷酸(PPi)水解产生的自由能和H+跨膜转运相耦联，在将PPi水解为2个Pi的同时，将细胞质中的H+经液泡膜进入液泡内，起质子泵的作用，H+-PPase与液泡膜H+-ATPase一起形成H+跨液泡膜电化学梯度，为各种溶质(如阳离子、阴离子、氨基酸和糖类等)分子跨液泡膜的次级主动运输提供驱动力。自1975年Karlsson(BiochimBiophysActa，1975)从甜菜(Betavulgaris)根中分离到钾激活的H+-PPase以来，近几十年，此酶的研究已经取得了长足的进展，并对其生理生化性质逐步达成共识。随着分子生物学研究的不断深入，人们已经成功地从拟南芥、大麦、甜菜、烟草、水稻、绿豆等众多生物体中分离到H+-PPase的cDNA。此酶的结构和特性，特别是它在植物耐盐、抗旱中的作用和调节植物生长方面的功能已经逐渐成为众多研究者关注的焦点。研究发现，H+-PPase的底物实际上是Mg2+和PPi所形成的一种络合物(Mg2PPi)。同时，游离Mg2+是H+-PPase的一个基本的辅助因子，与酶结合后，在保持酶的活性和稳定性中发挥着重要的作用。除受Mg2+激活外，H+-PPase还可能受K+和NH4 +等激活。在细胞中，H+-PPase通常定位于液泡膜上，但是越来越多的研究发现，很多生物细胞内的其它一些细胞器中也有H+-PPase活性，如细胞质膜，不同细胞器中的H+-PPase蛋白在调节细胞生理活动中可能发挥着不同的功能。
披碱草是禾本科披碱草属多年生优质牧草，具有极强的抗环境胁迫能力。来源于披碱草(ElymusdahuricusTurcz.)的H+焦磷酸化酶蛋白EdHP1受干旱、高盐、低磷和低钾等非生物胁迫的诱导，过表达EdHP1基因能够提高转基因烟草对干旱、高盐、低磷和低钾胁迫的抗性(参见申请公布号为CN102311488A的中国专利申请)。然而，截止到目前为止尚未有EdHP1蛋白抗重金属铅的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供源于披碱草(ElymusdahuricusTurcz.)的EdHP1蛋白在提高植物对重金属铅的抗性中的应用。
本发明提供了如下A-C的应用：
A.EdHP1蛋白在如下(1)或(2)中的应用：
(1)调控植物对重金属铅的抗性；
(2)选育对重金属铅的抗性增强的植物品种。
B.EdHP1蛋白的编码基因在如下(1)或(2)中的应用：
(1)调控植物对重金属铅的抗性；
(2)选育对重金属铅的抗性增强的植物品种。
C.含有EdHP1蛋白的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下(1)或(2)中的应用：
(1)调控植物对重金属铅的抗性；
(2)选育对重金属铅的抗性增强的植物品种。
其中，所述重组载体可为重组克隆载体，也可为重组表达载体。所述表达盒由启动子、所述EdHP1蛋白的编码基因和转录终止序列组成。
在本发明中，以上(2)中的所述选育对重金属铅的抗性增强的植物品种的方法，具体可包括将所述EdHP1蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。
在本发明中，以上(1)中，所述调控植物对重金属铅的抗性为提高植物对重金属铅的抗性。
本发明还提供了培育对重金属铅的抗性增强的转基因植物的方法。
本发明所提供的培育对重金属铅的抗性增强的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：向受体植物中导入EdHP1蛋白的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对重金属铅的抗性增强。
在上述应用或方法中，所述EdHP1蛋白可为如下(a)或(b)所示的蛋白质：
(a)氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白；
(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物对重金属铅的抗性相关的由序列1衍生的蛋白质。
为了使(a)中的EdHP1便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下所示的标签。
上述(b)中的EdHP1蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的EdHP1蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上如上所示的标签的编码序列得到。
其中，序列1所示的EdHP1蛋白共由770个氨基酸残基组成，含有14个跨膜区，是一个典型的膜蛋白，同时包含三个保守区(CS1、CS2和CS3)。氨基酸同源性比较发现，EdHP1与来自大麦等10种高等植物的焦磷酸化酶基因的同源性大于86％，与大麦焦磷酸化酶基因的同源性更是高达98％，可见H+-PPase在高等植物中是高度保守的。
在上述应用或方法中，所述EdHP1蛋白的编码基因(即EdHP1基因)可为如下1)或2)或3)的DNA分子：
1)序列表中序列2所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述EdHP1蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码所述EdHP1蛋白的编码基因的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
其中，序列2所示的EdHP1基因即为完整的开放阅读框，共由2313个核苷酸组成。
在所述方法中，所述EdHP1蛋白的编码基因是通过含有所述EdHP1蛋白的编码基因的重组表达载体导入所述受体植物中的。
所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pBI121、pCAMBIA-1300-221、pGreen0029、pCAMBIA3301、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
在本发明中，所述重组表达载体中启动所述EdHP1蛋白的编码基因转录的启动子为35S启动子。
更为具体的，所述重组表达载体为将pBI121载体的多克隆位点BamHI和SacI之间的小片段替换为所述EdHP1蛋白的编码基因(序列2)后得到的重组质粒。
在上述方法中，将携带有所述EdHP1基因的所述重组表达载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
在上述应用或方法中，所述植物既可为双子叶植物，也可为单子叶植物。所述双子叶植物具体如烟草；所述单子叶植物具体如披碱草。
在本发明的实施例中，所述重金属铅为Pb2+，更加具体的为Pb(CH3COO)2。
实验证明，在烟草中过表达EdHP1基因，所得转基因植株与未经转基因的野生型烟草植株相比，对重金属铅(Pb2+)的抗性显著增强。经重金属铅的胁迫处理后，未经转基因的野生型烟草的存活率仅为20％，相比之下过表达EdHP1基因的转基因烟草植株的存活率近90％。表明EdHP1基因能够提高转基因烟草对重金属铅胁迫的抗性。因此，EdHP1基因在作物抗重金属铅的遗传改良方面具有重要的应用价值。
附图说明
图1为披碱草中EdHP1基因对重金属Pb2+的响应分析结果。
图2为T0代部分EdHP1转基因阳性植株的PCR检测结果。1：DNAMarker，DL2000；2：CK(H2O)；3：CK(W38)；4：pBI121-EdHP1(阳性对照)；5-11：T0阳性植株。
图3为T2代纯合EdHP1转基因烟草株系VP1-11和VP1-32的RT-PCR分子鉴定结果。
图4为EdHP1转基因植物在重金属铅的胁迫下的表型。A为重金属铅处理前的植株表型；B为经16mmol/lL的Pb(CH3COO)2处理4天后的植株表型；C为经16mmol/L的Pb(CH3COO)2处理40天后的植株表型。存活的转基因植株生长旺盛，心叶浓绿，个体较大，存活的野生型烟草叶色较淡和个体较小。
图5为EdHP1转基因植物经重金属铅胁迫处理40天后存活率统计情况。野生型株系存活率为20％，相比之下，T2代纯合转基因株系VP1-11的存活率为87％，T2代纯合转基因株系VP1-32的存活率为27％，均显著高于野生型株系的存活率。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
披碱草的种子采集于内蒙古野外。披碱草(ElymusdahuricusTurcz.)属于禾本科(Gramineae)，披碱草属(Elymus)。披碱草由中国农业科学院作物科学研究所保证向公众提供；参考文献：王博.披碱草[J].现代农业,2004,04.25。
农杆菌C58C1由中国农业科学院作物科学研究所保证向公众提供；参考文献：任海英,方丽,李岗,茹水江,王汉荣.农杆菌介导的甜瓜蔓枯病菌遗传转化体系的建立.生物工程学报,26(6):802-808,2010。
烟草(NicotianatabacumL.)W38由中国农业科学院作物科学研究所保证向公众提供；参考文献：耿飒，麻密，李国凤，叶和春，ipt基因定位表达对转基因烟草育性的影响.植物学报,42(2):217-220,2000。
pBI121载体由中国农业科学院作物科学研究所保证向公众提供；参考文献：张俊莲,王蒂,张金文,陈正华.pBI121载体酶切位点添加及拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白基因表达载体的构建.分子植物育种,2006(6):811-818。
实施例1、披碱草中EdHP1基因对重金属Pb2+的响应分析
一、植物材料的准备
将披碱草的种子在4℃春化三天，然后播种在花盆中，取生长三周后的苗子进行Pb2+(200mmo1·L-1Pb(NO3)2)处理，处理不同时间(0h、1h、5h、12h和24h)后将处理后的苗子在液氮中冷冻后-70℃保存用于基因表达分析。
二、Northernblot
1、电泳
①准备MOPS/甲醛变性凝胶：在一个DEPC水处理过的配胶瓶中加入适量琼脂糖(1.2％的琼脂糖)，加热溶解琼脂糖，冷却到55℃，加入10×MOPS和甲醛，倒胶。
②准备RNA样品上样：
55℃水浴15min，放在冰上，加入10μl5×RNALoadingbuffer，点样。
③电泳：先加1×MOPSbuffer覆盖凝胶约1mm，4-5v/cm预电泳5min，补加1×MOPSbuffer浸没凝胶，4-5v/cm电泳，直到溴酚蓝指示剂移出约8cm，将凝胶从电泳槽中取出放入瓷盘中，用DEPC水轻轻搅动15min，倒掉水，加入灭过菌的10×SSC轻轻搅动15min去甲醛，重复一次。
10×MOPSBuffer(500ml)：
2-(N-吗啡)乙基磺酸(MOPS)20.6g终浓度为0.2M
乙酸钠(NaAc)3.28g终浓度为80mM
乙二胺四乙酸二钠(EDTA)2.047g终浓度为11mM
加400mlDEPC水，溶解后用NaOH溶液调pH＝7，定容到500ml，高压灭菌。
20×SSC(1000ml)：
柠檬酸三钠88.23g
氯化钠175.32g
加入800mlDEPC水，溶解后调pH＝7-8，定容到1000ml，高压灭菌。
2、转膜
①剪适当大小的杂交膜，在10×SSC中预湿，加一半体积10×SSC到瓷盘中，放一块玻璃板，剪三层滤纸，将两头浸入10×SSC中；
②放上切掉点样孔的凝胶，背面朝上，赶走气泡，用Parafilm膜封住凝胶的四周；
③将杂交膜放到凝胶上赶走气泡，将浸湿的三层滤纸放在杂交膜上，赶走气泡；
④放纸塔约5cm高，压重物不超过750g；
⑤转膜过夜后，卸下转膜装置，用铅笔标记膜号及点样顺序；
⑥紫外交联3min；如果膜要长期保存需干燥。
3、探针的制备
根据RT-PCR引物，PCR扩增基因片段做探针。
PCR体系(25μl)：ddH2O17.7μl，10×PCRbuffer2.5μl，dNTP(2.5mM)2μl，Primer-F(10μM)0.8μl，Primer-R(10μM)0.8μl，rTaq(5U/μl)0.2μl，模板1.0μl。
PCR条件：94℃3min，30×(94℃30s，56℃45s，72℃1min)，72℃10min。
4、探针的标记
探针的标记(使用TakaRaRandomPrimerDNALabelingKit)。
①取1.5ml的离心管，加入回收探针24μl、RandomPrimer4μl和ddH2O5μl，95℃变性3min，迅速放在冰上5min；
②再依次加入以下试剂：10×buffer5μl、dNTP5μl、α-32P-dCTP(10μCi/μl)5μl和Exo-freeKlenowFragment2μl，37℃温育30min，65℃加热5min，95℃变性3min，放在冰上3min。
5、杂交
①将杂交膜先放在水中预湿，将膜卷成筒状，RNA一面朝里，避免膜重叠用纱布隔开，放入杂交管中；
②在杂交管中倒入少量的预杂交液，沿一定方向转动杂交管；
③倒掉预杂交液再加25ml/管预杂交液，65℃预杂交30min；
④加入标记好的变性探针25μl/管，65℃杂交过夜。
6、洗膜及压磷屏
用洗液I(2×SSC/0.1％SDS)洗两次，每次10min，测信号，决定是否继续洗，若信号太强，再用洗液II(1×SSC/0.1％SDS)洗两次，每次10min，然后将杂交膜放入磷屏中压4-5天。
7、杂交膜上探针的去除
将0.1％SDS溶液加热沸腾，把杂交膜放在里面10min，再放到2×SSC溶液中，探测同位素信号直到探测不到信号为止。
取不同胁迫条件下处理的披碱草材料，提取总RNA，进行Northernblot分析，用EdHP1基因为探针进行杂交，结果表明EdHP1基因对重金属Pb2+没有响应(图1)。
实施例2、EdHP1转基因植物的获得和鉴定
本实施例中所涉及的EdHP1基因来源于披碱草(ElymusdahuricusTurcz.)，其编码区序列为序列表中序列2。序列2即为完整的开放阅读框，共由2313个核苷酸组成，编码序列表中序列1所示的蛋白质(即EdHP1蛋白)。序列1共由770个氨基酸组成。
一、重组表达载体的构建
1、特异性引物对的设计
设计特异性引物(两端分别加BamHⅠ和SacⅠ酶切位点)如下：
Primer-F：5’-CGGGATCCATGGTGGCGGCGGCGATCCT-3’；
Primer-R：5’-CGAGCTCCTAAAGGTATTTGAAGAGGA-3’。
2、基因的克隆
提取披碱草的RNA，将其反转录为cDNA。以cDNA为模板，用Primer-F和Primer-R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收2300bp左右的目的片段(EdHP1基因)。
PCR体系(25μl)：ddH2O17.7μl、10×PCRbuffer2.5μl、dNTP(2.5mM)2μl、Primer-F(10μM)0.8μl、Primer-R(10μM)0.8μl、PFU(5U/μl)0.2μl、模板1.0μl。PCR条件：94℃3min，30×(94℃30s，64℃45s，72℃3min)，72℃10min。
3、重组表达载体的构建
①用限制性内切酶BamHⅠ和SacⅠ双酶切步骤2的目的片段，回收酶切产物。
②用限制性内切酶BamHⅠ和SacⅠ双酶切pBI121载体(Clontech公司，产品编号：6018-1)，回收载体骨架。
③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架利用T4DNA连接酶连接，得到连接产物。
④将连接产物热激转入E.coliDH5α(宝生物工程(大连)有限公司，产品编号：D9052)，通过PCR、酶切筛选阳性克隆，并对阳性克隆进行测序验证。
测序结果表明，得到了重组质粒pBI121-EdHP1(骨架载体为pBI121，将其酶切位点BamHⅠ和SacⅠ之间的小片段替换为序列表的序列2所示的EdHP1基因)。
二、转基因烟草的获得
1、重组农杆菌的获得
(1)电击农杆菌感受态的制备
①挑取农杆菌C58C1，接种于5mlLB液体培养基(含50mg/L利福平)中，28℃、200r/mim培养过夜。
②取2ml培养物于LB液体培养基(含50mg/L利福平)中继续培养，直至OD800为0.5左右。
③将培养物置冰浴中30min，4℃、5000r/min、离心5min，弃去上清液。
④用10ml冷的0.1mol/LNaCl水溶液悬浮菌液，4℃、5000r/min，离心5min，弃去上清液。
⑤用1ml冷的CaCl2(20mmol/L)水溶液悬浮(电击农杆菌感受态)，分装成50μl/管，液氮中冷冻后至-80℃保存。
(2)电击转化农杆菌
①在无菌条件下将1μl重组质粒pBI121-EdHP1加入20μl电击农杆菌感受态中，轻轻旋转，混和均匀；整个过程在冰浴中进行。
②将混合物加在电极杯的中央，注意不要产生气泡。
③在电击槽中加满冰水混合物，然后把电极杯放入槽孔中。
④调电压为380V，电击混合物。
⑤将混合物吸出，加入600μl的SOC培养基，28℃，200rpm复苏2h。
⑥从混合物中吸出5μl，铺在LB平板(含100mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素和50mg/L利福平)上，涂匀，28℃生长2-3天。
⑦用灭菌的牙签挑取单克隆进行PCR鉴定，得到含有pBI121-EdHP1的重组农杆菌。
2、转基因烟草的获得和分子鉴定
(1)转基因烟草的获得(叶盘法)
①接种重组农杆菌单菌落于2mlYEB液体培养基(含100mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素和50mg/L利福平)中，28℃培养1-2天，转接入20mlYEB液体培养基中，28℃继续培养至OD600约0.5，然后MS液体培养基稀释20倍，得到重组农杆菌菌液；
②取无菌烟草W38叶片去除主叶脉，剪成0.5cm×0.5cm大小，放入重组农杆菌菌液中，浸泡10-15min，其间不断轻摇几次；
③取出材料，用无菌纸吸去多余菌液，于MS固体培养基中28℃暗培养两天；
④用无菌水清洗材料一次，把材料转入分化培养基(含500mg/L羧苄青霉素、1.0mg/L6-BA、0.1mg/LIAA、100mg/L卡那霉素的MS培养基)中，25℃光照培养，分化出愈伤组织，直至长出芽；
⑤将长出1cm以上的芽转入生根培养基(含500mg/L羧苄青霉素、100mg/L卡那霉素的pH＝5.8的1/2MS培养基)上诱导生根。
得到T0代阳性植株。
(2)转基因烟草的PCR分子鉴定
①CTAB法提取阳性植株的基因组DNA。
②以基因组DNA为模板，用EdHP1基因特异性引物P1和P2进行PCR扩增。
P1：5’-CGACTTCTTTGAGGTGAAGGAGGTCG-3’(forward)；
P2：5’-CCAATTGCAAAACCCTTTCCGATGGC-3’(reverse)。
PCR体系(25μl)：ddH2O17.7μl，10×PCRbuffer2.5μl，dNTP(2.5mM)2μl，P1(10μM)0.8μl，P2(10μM)0.8μl，rTaq(5U/μl)0.2μl，模板(DNA)2.0μl。
PCR应条件：94℃3min，30×(94℃30s，58℃45s，72℃1min)，72℃10min。
具有针对EdHP1基因的600bp的预期条带的阳性植株为转EdHP1基因烟草(T0代)。部分植株的鉴定结果见图2。获得30株T0代转EdHP1基因烟草。从30株T0代转EdHP1基因烟草中随机选取2株，记为VP1-11和VP1-32。
(3)转基因烟草的RT-PCR分子鉴定
将步骤(2)获得的T0代转基因烟草VP1-11和VP1-32自交2次，获得T2代纯合株系。鉴定转基因株系纯合体方法：随机选取100粒种子在含有50μg/L卡那霉素的筛选培养基中鉴定抗生素抗性，发现95％的种子具有卡那霉素抗性，证明转基因株系为纯合体。
分别提取T2代纯合转基因烟草VP1-11、VP1-32以及未经转基因的烟草W38的RNA，将其反转录为cDNA。以cDNA为模板，采用上游引物5’-CTGCTGCCATCGGAAAGGGT-3’和下游引物5’-CCCCGATGGTGTCGCCGATC-3’进行半定量RT-PCR扩增。同时以Actin为内参，用于扩增内参的上游引物5’-AGAGGTTCCGTTGCCCAGAAGT-3’和下游引物5’-GCTAGGAGCCAAAGCCGTGATT-3’。
结果如图3所示，可见T2代纯合转基因烟草VP1-11和VP1-32均扩增得到大小约为600bp的目的条带(即EdHP1基因)，且T2代纯合转基因烟草VP1-11中目的基因EdHP1的表达量较高，T2代纯合转基因烟草VP1-32中目的基因EdHP1的表达量相对较低。而未经转基因的烟草W38没有扩增出目的条带。
实验同时设置用pBI121载体代替重组质粒pBI121-EdHP1，其它同步骤二，得到T2代转空载体烟草的对照。
实施例3、EdHP1转基因植物对重金属铅的抗性研究
以实施例2获得的T2代纯合转基因烟草VP1-11和VP1-32，T2代转空载体烟草，以及未经转基因的烟草W38为实验材料。将各实验材料在MS0培养基上生长到4片叶时，移栽到沙盘上，在沙盘上生长一周，选生长一致的烟草苗，移栽到营养小花盆内，每个小盆内只种一个苗，再在小盆内生长7天，选长势好，大小一致的各实验材料进行处理，采用含有16mmol/L的Pb(CH3COO)2的水溶液进行铅处理(每次每盆浇200毫升，每周浇1次)。试验中，定期观察各实验材料的植株表型，并于铅处理40天后(以第一次浇含有16mmol/L的Pb(CH3COO)2的水溶液作为第一天计算)统计各实验材料的存活率。实验中，每种实验材料至少选择15株进行实验。实验设置三次重复，定量结果取均值。
结果如图4和图5所示，从图4中可看出在处理4天后野生型的植株大部分都萎蔫，相比之下，实施例2获得的T2代纯合转基因烟草VP1-11和VP1-32萎蔫的相对少些，特别是VP1-11株系心叶均未萎蔫。从图5中可看出铅处理40天后野生型株系存活率为20％，T2代纯合转基因株系VP1-11的存活率为87％，转基因株系VP1-32的存活率为27％，均显著高于野生型株系的存活率。而T2代转空载体烟草的植株表型和存活率均与未经转基因的烟草W38基本一致，无显著差异。
另外，结合图3的结果，可见转基因烟草中EdHP1基因的表达量越高，植株对重金属铅的抗性越强。

Claims (10)

1.EdHP1蛋白在如下(1)或(2)中的应用：
(1)调控植物对重金属铅的抗性；
(2)选育对重金属铅的抗性增强的植物品种。
2.EdHP1蛋白的编码基因在如下(1)或(2)中的应用：
(1)调控植物对重金属铅的抗性；
(2)选育对重金属铅的抗性增强的植物品种。
3.含有EdHP1蛋白的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下(1)或(2)中的应用：
(1)调控植物对重金属铅的抗性；
(2)选育对重金属铅的抗性增强的植物品种。
4.培育对重金属铅的抗性增强的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入EdHP1蛋白的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对重金属铅的抗性增强。
5.根据权利要求1-3中任一所述的应用或权利要求4所述的方法，其特征在于：所述EdHP1蛋白为如下(a)或(b)所示的蛋白质：
(a)氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白；
(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物对重金属铅的抗性相关的由序列1衍生的蛋白质。
6.根据权利要求1-3和5中任一所述的应用，其特征在于：步骤(1)中，所述调控植物对重金属铅的抗性为提高植物对重金属铅的抗性。
7.根据权利要求1-6中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述EdHP1蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：
1)序列表中序列2所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述EdHP1蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码所述EdHP1蛋白的编码基因的DNA分子。
8.根据权利要求4或5或7所述的方法，其特征在于：所述EdHP1蛋白的编码基因是通过含有所述EdHP1蛋白的编码基因的重组表达载体导入所述受体植物中的。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述EdHP1蛋白的编码基因转录的启动子为35S启动子。
10.根据权利要求1-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物；
具体的，所述双子叶植物为烟草；所述单子叶植物为披碱草。
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