CN107488666A

CN107488666A - 玉米ZmbZIP54基因在培育耐铅胁迫的植物中的应用

Info

Publication number: CN107488666A
Application number: CN201710695628.1A
Authority: CN
Inventors: 沈亚欧; 张严玲; 张晓祥
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2017-08-15
Filing date: 2017-08-15
Publication date: 2017-12-19
Anticipated expiration: 2037-08-15
Also published as: CN107488666B

Abstract

本发明涉及玉米ZmbZIP54基因在培育耐铅胁迫的植物中的应用。本发明通过qRT‑PCR的检测，发现该ZmbZIP54基因受铅胁迫后诱导表达，并且在五个耐性自交系的根系里的表达量明显高于在敏感自交系根系里的表达量。利用拟南芥同源基因突变体进行研究，发现在铅胁迫下，哥伦比亚野生型的长势明显好于突变体，野生型受抑制程度低于突变体。ZmbZIP54基因坐落在第7号染色体上QTL区段内。表明该基因在植物受到铅胁迫后诱导表达，并对植物响应铅胁迫进行正调控，从而提高植物的耐铅能力。本发明首次明确了玉米ZmbZIP54基因与植物耐盐胁迫的关系，验证了该基因在玉米耐铅应用的重要性。为利用该基因在玉米及其他植物上的应用从而提高抗逆性提供了理论依据和利用价值。

Description

玉米ZmbZIP54基因在培育耐铅胁迫的植物中的应用

技术领域

本发明主要涉及植物对重金属胁迫响应领域，具体的涉及玉米ZmbZIP54基因在培育耐铅胁迫的植物中的应用

背景技术

玉米是世界范围内重要的粮食作物之一。然而随着生态环境的不断恶化，土壤中重金属的含量日益增加，其生长发育和产量品质受到包括重金属在内的非生物胁迫的严重影响，这严重制约了作物产量。挖掘抗逆相关基因,研究其逆境应答机制,培育抗逆性较强的玉米新品种是应对逆境胁迫,提高玉米产量的最有效途径。目前，我国玉米抗逆种质资源十分匮乏，常规育种得到抗逆种质资源不仅使一个非常艰难的过程，而且育种周期也比较长，很难培育出理想的抗性品种。随着现代分子生物学的飞速发展，为解决这个问题提供了一个很好的契机。近些年的研究表明，bZIP转录因子在植物逆境基因表达调控中具有重要作用，其家族成员广泛地参与植物对环境胁迫的应答反应、植物的生长发育、代谢调控等一些列生理生化活动，在玉米中已经受到关注。因此，bZIP基因及其调控的靶基因都是潜在的重要抗逆基因。

在干旱、高盐等逆境条件下，植物能够迅速合成ABA。在内源ABA诱导下，能够通过一系列信号传递到转录因子并将其激活，然后与启动子区域的特定识别序列结合从而启动靶基因的转录表达，或者形成同源或者异源二聚体，或者直接与蛋白质做出一系列的生理生化应答反应，大量胁迫相关的基因被表达，从而参与抗逆反应。目前，在高等植物中共发现了十个大的转录因子家族，bZIP基因家族作为其中之一，除了调控植物的激素信号转导途径以外，还广泛参与了植物的生物胁迫和非生物胁迫应答、糖类合成、器官发育和植物衰老等一系列生理活动。在拟南芥、小麦、玉米中报道了很多关于bZIP转录因子参与干旱、高盐等非生物胁迫，但是迄今为止，bZIP转录因子参与植物抗铅的报道极少。玉米的bZIP转录因子家族在非生物胁迫中的研究还处于初级阶段。目前，发现玉米bZIP 基因与玉米病害及抗盐有关，但无与耐铅性的相关报道。

QTL定位是针对全基因组的QTL扫描，利用玉米IBM syn10DH连锁群体并且利用复合区间作图法对玉米铅胁迫下的表型进行分析，同时利用转录组测序数据，两种方法相互验证大大促进了玉米耐铅基因的解析。

发明内容

本发明目的在于针对上述现有技术的不足，提供玉米ZmbZIP54基因在培育耐铅胁迫的植物中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

首先利用铅耐性玉米自交系178进行铅胁迫，并在铅胁迫0h，24h，48h 以及72h之后取根系进行RNA提取，并做了转录组测序，数据分析得到该基因。进而我们收集了中国、美国、墨西哥等地的温带、热带、亚热带玉米自交系312 份，作为本发明的铅耐性自交系的筛选材料。并且利用3mmol/L的铅含量的营养液进行胁迫，并对其对照和胁迫的根系性状和植物地上表型形状进行观测，筛选到了五个铅耐性自交系以及五个铅敏感自交系。利用qRT-PCR的检测，结果证明ZmbZIP54基因在十个材料中受到铅胁迫后诱导表达，并且在五个耐性自交系的表达量远高于在五个敏感材料的表达量。

进一步，利用拟南芥同源基因突变体SALK_063233(该突变体订购于TAIR 拟南芥突变体库)，进行基因功能研究。首先利用哥伦比亚野生型进行不同浓度的铅胁迫，并且筛选到适合拟南芥的铅的浓度。利用拟南芥同源基因的突变体进行铅胁迫发现，哥伦比亚野生型在铅胁迫下的根系长度明显高于突变植株的根系长度，地上部分的长势也明显好于突变植株地上部分的长势。证实ZmbZIP54基因与植物耐铅胁迫密切相关。

此外，发明人利用已构建的玉米IBM Syn 10DH(B73×Mo17)群体的200 个家系为连锁群体，结合bin marker基因型数据和铅胁迫下根系铅含量以及可检测的所有表型数据，进行QTL定位。结果发现该ZmbZIP54基因基因落在总根数这个性状的一个微效QTL定位的区段里，进一步验证了上述基因在玉米耐铅应用的重要性。

本发明研究表明，玉米ZmbZIP54基因能够提高植物耐铅性，因此，本发明还提供一种培育耐铅性增强的植物的方法，即，将玉米ZmbZIP54基因转入玉米或拟南芥中得到耐铅性增强的转基因植物。采用qRT-PCR检测所述转基因植物中 ZmbZIP54基因表达量，所用引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

本发明具有如下有益效果，首次明确了玉米ZmbZIP54基因与植物耐盐胁迫的关系，验证了该基因在玉米耐铅应用的重要性。为利用该基因在玉米及其他植物上的应用从而提高抗逆性提供了理论依据和利用价值。玉米ZmbZIP54基因在植物抗重金属污染领域，特别是玉米抗土壤铅毒领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。

附图说明

图1为ZmbZIP54基因在五份耐性自交系以及五份敏感自交系中的相对表达量。其中自交系F06、En1824、BS1074、7372以及GP30-1为铅耐性自交系， Dan3130、SH15、10GY6057、06WAM110以及TL98A1709-20为铅敏感自交系。

图2为拟南芥突变体与哥伦比亚野生型在铅胁迫下的长势情况。图左上为哥伦比亚野生型在正常条件下的长势，左下为哥伦比亚野生型在0.15g/L Pb(NO₃)₂胁迫下的长势。右上为拟南芥突变体在正常条件下的长势，右下为拟南芥突变体在0.15g/L Pb(NO₃)₂胁迫下的长势。

图3为哥伦比亚野生型以及突变体分别在正常条件(对照)以及0.15g/L Pb(NO₃)₂胁迫下根系长度对比。

图4为IBMsyn10群体在3mmol/L Pb(NO₃)₂胁迫下对根系总根数进行QTL 定位的LOD值分布图。高于阈值的QTL位点位于7号染色体139～143cM之间。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1.玉米ZmbZIP54基因在铅胁迫下的表达分析

1-1、玉米自交系材料的铅胁迫处理

选择饱满的312份玉米自交系种子用75％乙醇消毒1min，10℅的H₂O₂溶液浸泡15min并且消毒期间不断摇晃，然后用去离子水漂洗3～5次直到将残留的H₂O₂漂洗干净，再用去离子水浸泡4个小时，最后在28℃黑暗条件下用滤纸发芽。大约2-3天后，将发芽的玉米转移到漂浮板上，在28℃光照(16h)/黑暗(8 h)条件下用Hoagland营养液培养进行水培,一周换两次培养液，待幼苗长至三叶期进行胁迫处理。

1-2、铅胁迫处理：

选取6株长势一致的幼苗，去除胚乳后移入装有营养液的塑料容器中。本实验设置2个处理：正常水分供给(即全营养液，CK)和铅胁迫处理(即全营养液+3mmol/L Pb(NO₃)₂，T)。营养液要现用现配，并且使用前将营养液pH调至 6.0左右。每3天换一次营养液，胁迫2周后取样进行性状测量。根据所测性状筛选出五份铅耐性自交系(F06、En1824、BS1074、7372以及GP30-1)以及五份铅敏感自交系(Dan3130、SH15、10GY6057、06WAM110以及TL98A1709-20)。

1-3、极端材料的取样：

利用如1-2相同的方法对上述十种自交系进行处理，并分别在0h,24h,48h 以及72h的根进行取样，其中0h的样品作为对照。

1-4、玉米总RNA的提取

参照Trizol试剂盒(Invitrogen公司)操作手册对2-3中取的样品进行总RNA 的提取。具体步骤如下：(1)用液氮冷却研磨器：将已称量好的材料迅速放入研钵中并快速研磨，直至材料研磨成极细粉末；(2)按照每0.1克材料1ml的用量，将Trizol加入研钵中；(3)20分钟，拆开研钵继续研磨，直至研钵内Trizol呈透明状，其分装到2ml离心管中；(4)在上述离心管中再加入氯仿300μl，颠倒1 分钟充分混匀，并静置5分钟后离心15min(4℃，12000rpm)，小心吸取上清液至另一2ml离心管中；(5)重复第4步加氯仿及之后步骤，再次吸取上清液转至另一1.5ml离心管中；(6)再次吸取上清后，使用北京天恩泽基因科技有限公司的Trizol伴侣提取总RNA。(7)待RNA沉淀晾干后，加入适量DEPC处理水溶解。

1-5、cDNA的获得(利用TakaRa公司的RT reagent Kit(Perfect RealTime))，其中反应体系以及程序如下：

(1)基因组DNA的除去反应(Total RNA用量：最大1μL)

表1基因组DNA的除去反应体系

(2)反转录反应，反应体系见表2。

表2反转录反应体系

1-6、ZmbZIP54基因的时空表达模式分析

1-5处理样品的cDNA为模板，GAPDH作内参基因，通过荧光定量PCR技术对ZmbZIP54基因在铅胁迫条件下的表达进行相对定量分析。ZmbZIP54基因其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。其中反应体系如下：

表3 qRT-PCR扩增体系

反应程序为：95℃30s；95℃5s，Tm(引物最适退火温度)30s，40cycles； 95℃10s；65℃5s，65℃到95℃绘制融解曲线。所用基因定量PCR引物序列如下表所示：

表4 qRT-PCR引物

通过RT-qPCR分析发现，ZmbZIP54基因在根部的表达受到铅胁迫的显著诱导。并且在耐性自交系中的表达远远高于在敏感材料中的表达(结果如图1 所示)。说明在玉米响应铅胁迫过程中，该基因起重要作用。

实施例2.拟南芥同源基因突变体植株耐铅性分析

采用拟南芥同源基因突变体SALK_063233(该突变体订购于TAIR拟南芥突变体库)。首先利用75％无水乙醇对突变体和野生型种子消毒1min，然后用 1％NaClO消毒15min，最后用无菌水清洗3～5遍后播种在1/2MS培养基上培养 7天，然后将野生型植株以及突变体植株分别移植在0g/L以及0.15g/L Pb(NO₃)₂的1/2MS培养基上继续培养，10天后观察植株生长状况，结果如图2和图3所示，在正常条件下突变体植株的生长与野生型相差不大，在铅胁迫条件下，铅胁迫明显抑制了植物根系的生长，但是突变体的生长受到了更明显的抑制。野生型植株被铅胁迫后根系平均长度减少46％，而突变体植株的根系平均长度减少94％。

实验表明，哥伦比亚野生型在铅胁迫下的根系长度明显高于突变植株的根系长度，地上部分的长势也明显好于突变植株地上部分的长势。证实ZmbZIP54基因与植物耐铅胁迫密切相关。

实施例3.QTL定位验证。

利用已构建的玉米IBM Syn 10DH(B73×Mo17)群体的200个家系为连锁群体，处理方法以及表型鉴定同1-2，再结合6618个bin marker基因型数据，进行QTL定位结果如图4所示，在第7号染色体上检测到1个与根系总根数有关 QTL位点，表型贡献率为4.4％，位于区段chr07.1744.5～chr07.1752.5，对应染色体上的物理位置是174.400Mb～175.150Mb(Maize B73RefGen_v3)。ZmbZIP54 基因落在该QTL定位的区段里，进一步验证了该基因在玉米铅胁迫过程中的重要性。

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 玉米ZmbZIP54基因在培育耐铅胁迫的植物中的应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2033

<212> DNA

<213> Zea mays L.

<400> 1

gacccaccta ctaatccagc cagccaatga gtcccccgtt tcatcacgca acgccaaccc 60

acaccaacgc caaccggacc cacccacccc tcccgtccgt cgcataccat cccatcccac 120

ccccgtgcgc cgagttcacg gccgccacca ccaccaccac cacaaccgat tacacaaggc 180

cacgcggctt ctggaagctt cccttgcctt gccttccctc tcaacccaaa tcgccacggc 240

tccctccgcc cgcaagcgcc ctcggcacga ccgccggatt cgcctctggg tggggttggt 300

tttgtctccc ccaccaccca cccacccctc tcctctcctc tcctccaagg cttggcttgc 360

ctcgtgtcgt gtgtccctcc accgcccgcc atgccgacga ggcttgcccc ccaccgccga 420

tcgcacacgg tcatatgatt gcaatgaatc ctgacatggt actactgtct tggaaacaac 480

ttccaccaac ggtcgatcct gtgaaacact aagacacccg ttgccactgg aaaggagaga 540

gcaaagtgat ttgctgtctc ctggcgatcg ttgctcgtga ggcctagtga tggcagatgc 600

tagctcaagg actgacacct caattgtttt agacgacaac gacaagaatc ataggatgga 660

gaatggaagt ggtgcggttg taccttctaa ttcttcagat aggtccgaca ggtctgataa 720

acctttggac caaaagacaa tgcgacggct tgcccaaaat cgtgaggcag caagaaaaag 780

tcggctgagg aaaaaggcat atgtgcagca gctggagagc agtaagctga aacttgcaca 840

actggaacag gaactccaga aagctcgcca gcagggaatc ttcatttcta gctctggaga 900

ccaaacccat gccatgagtg gaaatggagc tttgactttt gacatagaat atgctagatg 960

gctagaggac caaaataagc agataaatga gttgaggact gcagtgaatg ctcatgcaag 1020

tgatagtgat ctacgactta ttgtagatgg cataatggca cactatgatg aaatattcaa 1080

ggtcaaaggt gttgctgcaa aggctgatgt gtttcatata ctttcaggca tgtggaagac 1140

acctgctgaa aggtgcttcc tatggcttgg gggttttcgt ccatctgagc ttttaaagct 1200

cctagcgaat cacctcgagc ctctaactga gcagcaaatg ctgggtttga ccaacctcca 1260

gcaatcttcc caacaagcag aggatgcgtt gtcacagggc atggaagcac tgcagcaatc 1320

tttggcagag actttggctg gatctctcgg tccagcaggt tcttcaggaa atgtggcaaa 1380

ctacatgggt cagatggcca tggccatggg caaactcggg acgctagaga attttcttcg 1440

ccaagccgac aacctgcgac agcagacgtt gcatcaaatg caacgtatcc taacgatccg 1500

acaggcttct cgtgctcttc ttgcaatcca cgactatttt tcacgattgc gcgctttaag 1560

ttctctgtgg cttgctaggc cacgtgaata acgaagggcc gtcagtattt tgagttccct 1620

ctgccttacg gtgctgctgc gtcgttcgca gcgatgcatc acagatcttt ggtggtactg 1680

tttttgttgt acaattactt ttggccgctg cttggtccaa attgtactca ggtgggtgta 1740

caagtaggtc aatataatcc tgtaagttat ggtgatttat gggtgtgtta gcaatgcaat 1800

aataattaga gagggcagga tcagggtttc tgttgtttgt actggttaga gatttagtcc 1860

taatgtaact tcctgggaca tggggggcgg aatgggaaga gagtaacaag aatcttcctt 1920

tggttactgt agtatatgtt ggtattgttg catcccattt tctcattttg ctgttaggag 1980

aatgattatt ctgtccattt gtgtactttt tgattaatgt tgtttgtagc ccc 2033

<210> 2

<211> 333

<212> PRT

<213> Zea mays L.

<400> 2

Met Ala Asp Ala Ser Ser Arg Thr Asp Thr Ser Ile Val Leu Asp Asp

1 5 10 15

Asn Asp Lys Asn His Arg Met Glu Asn Gly Ser Gly Ala Val Val Pro

20 25 30

Ser Asn Ser Ser Asp Arg Ser Asp Arg Ser Asp Lys Pro Leu Asp Gln

35 40 45

Lys Thr Met Arg Arg Leu Ala Gln Asn Arg Glu Ala Ala Arg Lys Ser

50 55 60

Arg Leu Arg Lys Lys Ala Tyr Val Gln Gln Leu Glu Ser Ser Lys Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ala Gln Leu Glu Gln Glu Leu Gln Lys Ala Arg Gln Gln Gly

85 90 95

Ile Phe Ile Ser Ser Ser Gly Asp Gln Thr His Ala Met Ser Gly Asn

100 105 110

Gly Ala Leu Thr Phe Asp Ile Glu Tyr Ala Arg Trp Leu Glu Asp Gln

115 120 125

Asn Lys Gln Ile Asn Glu Leu Arg Thr Ala Val Asn Ala His Ala Ser

130 135 140

Asp Ser Asp Leu Arg Leu Ile Val Asp Gly Ile Met Ala His Tyr Asp

145 150 155 160

Glu Ile Phe Lys Val Lys Gly Val Ala Ala Lys Ala Asp Val Phe His

165 170 175

Ile Leu Ser Gly Met Trp Lys Thr Pro Ala Glu Arg Cys Phe Leu Trp

180 185 190

Leu Gly Gly Phe Arg Pro Ser Glu Leu Leu Lys Leu Leu Ala Asn His

195 200 205

Leu Glu Pro Leu Thr Glu Gln Gln Met Leu Gly Leu Thr Asn Leu Gln

210 215 220

Gln Ser Ser Gln Gln Ala Glu Asp Ala Leu Ser Gln Gly Met Glu Ala

225 230 235 240

Leu Gln Gln Ser Leu Ala Glu Thr Leu Ala Gly Ser Leu Gly Pro Ala

245 250 255

Gly Ser Ser Gly Asn Val Ala Asn Tyr Met Gly Gln Met Ala Met Ala

260 265 270

Met Gly Lys Leu Gly Thr Leu Glu Asn Phe Leu Arg Gln Ala Asp Asn

275 280 285

Leu Arg Gln Gln Thr Leu His Gln Met Gln Arg Ile Leu Thr Ile Arg

290 295 300

Gln Ala Ser Arg Ala Leu Leu Ala Ile His Asp Tyr Phe Ser Arg Leu

305 310 315 320

Arg Ala Leu Ser Ser Leu Trp Leu Ala Arg Pro Arg Glu

325 330

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agcactgcag caatctttgg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cggcttggcg aagaaaattc 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccatcactgc cacacagaaa ac 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aggaacacgg aaggacatac cag 23

Claims

1.玉米ZmbZIP54基因在培育耐铅胁迫的转基因玉米或转基因拟南芥中的应用，所述玉米ZmbZIP54基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述玉米ZmbZIP54基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述ZmbZIP54基因定位于玉米第7号染色体chr07.1744.5～chr07.1752.5之间。

4.一种培育耐铅性增强的植物的方法，其特征是，将玉米ZmbZIP54基因转入玉米或拟南芥中得到耐铅性增强的转基因植物。

5.如权利要求4所述的方法，其特征是，采用qRT-PCR检测所述转基因植物中ZmbZIP54基因表达量，所用引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。