CN111235304A - 玉米植株铅积累量相关snp分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了玉米植株铅积累量相关SNP分子标记及其应用。本发明提出一个与玉米植株中铅积累量相关的SNP分子，该SNP分子位于玉米1号染色体上，可以用于筛选或培育铅低积累品种，缩短了玉米铅低积累品种选育时间，减少了选育工作量，并为植物铅胁迫相应机理提供了理论基础，对加快玉米的重金属胁迫下铅低积累育种具有重要意义。

Description

玉米植株铅积累量相关SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及玉米植株铅积累量相关SNP分子标记及其应用，属于分子遗传标记技术领域。
背景技术
中国是世界玉米第二大生产国，非生胁迫对玉米的产量及品质影响较大。重金属铅对植物生长有害，作为非生物胁迫对玉米育种易造成不良影响。当前土壤受重金属污染日益严重，而铅污染具有危害大、隐蔽性高等特点。由于铅在植株中存在富集现象，创制和培育铅低积累优质玉米品种至关重要。
研究和生产实践表明，玉米铅积累相关性状是一个复杂的数量性状，植株组织铅积累量作为植株铅积累指标在不同玉米自交系间存在显著的基因型差异。铅胁迫处理下，铅离子在玉米植株中的含量随时间而逐渐积累。玉米中铅响应胁迫机理复杂且目前研究进度缓慢，对育种实践具有较高利用价值的关键基因挖掘工作仍然很少。
全基因组关联分析是一种基于连锁不平衡鉴定自然群体中表型性状与遗传标记之间关系的分析方法，是挖掘优良等位基因的有效途径。目前随着基因测序技术及生物信息学的高速发展，全基因组关联分析成为挖掘和剖析铅胁迫下玉米铅积累相关基因及其遗传基础的有效方法之一。通过在全基因组水平上挖掘玉米铅积累含量相关基因、开发功能标记等可以加快玉米植株铅低积累品种的创制。
发明内容
本发明克服了上述现有技术的不足，提供玉米植株铅积累量相关SNP分子标记及其应用。本发明提出一个与玉米植株中铅积累量相关的SNP分子，可以用于筛选或培育铅低积累品种。
一种玉米植株铅积累量相关SNP分子标记，所述SNP标记位于玉米基因组(参考基因组版本：Maize B73 RefGen_v4)1号染色体299552992位置，变异类型为T/C。
本发明还保护一种用于扩增上述SNP分子标记的特异性PCR引物对，序列如下所示：
上游(F)：5’-GGTCAACCGTCAGTCAGAAG-3’(SEQ ID NO.1)；
下游(R)：5’-TTCAAAGTGTGCATGTCAGTG-3’(SEQ ID NO.2)。
一种检测上述SNP分子标记的试剂盒，包含上述特异性PCR引物对。
上述SNP分子标记、引物对或试剂盒在筛选或检测玉米植株铅积累能力方面的应用。
上述SNP分子标记、引物对或试剂盒在培育铅胁迫下铅低积累玉米植株方面的应用。
一种检测玉米植株铅积累能力的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测玉米植株的基因组DNA；
(2)利用上述引物对将步骤(1)获得的待测玉米植株的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；
(3)对步骤(2)获得的PCR扩增产物进行测序，获得测序结果；
(4)根据步骤(3)获得的测序结果，确定待测玉米植株的所述SNP标记的基因型，预测待测玉米的铅积累能力。
进一步的，上述步骤(2)中所述的PCR扩增的程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s；59℃退火30s；68℃延伸6s；共35个循环；68℃再延伸10min。
进一步的，上述步骤(4)中所述的SNP标记的基因型为C时，玉米植株表现为铅低积累的概率为65.38％。
有益效果：
(1)结合全基因组关联分析和基因表达量与表型关联分析策略，快速精确地检测到与特定性状显著关联的基因组变异位点。
(2)玉米1号染色体上299552992bp位置的SNP位点与玉米重金属铅胁迫后植株铅积累量显著相关，该位点可以作为遗传标记，用于分子育种，缩短了玉米铅低积累品种选育时间，减少了选育工作量，并为植物铅胁迫相应机理提供了理论基础，对加快玉米的重金属胁迫下铅低积累育种具有重要意义。
附图说明
图1不同基因型玉米植株铅积累量差异。
图2不同玉米自交系材料测序比对结果。
具体实施方式
为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。
实施例1：与铅积累性状相关基因Zm00001d034674分子标记的获得。
获得方法如下：
(1)关联群体表型鉴定：本发明收集了中国、美国、墨西哥等地的温带、热带、亚热带玉米自交系305份，在一定浓度铅胁迫处理幼苗后，使用电感耦合等离子体质谱(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)测定植株铅积累量，设置3次生物学重复。联合方差分析表明不同材料间基因型差异显著。
表1：表型联合方差分析
Figure BDA0002428143080000031
(2)关联群体基因型的获取：使用转录组测序获得该群体的基因型。
(3)基因型与表型关联分析：运用Tassel软件MLM模型，在考虑群体结构及亲缘关系来进行全基因组关联分析，最小等位基因频率设置为0.05，在P<1e-6的阈值水平下，判定分子标记与表型关联的显著性。结果检测到以下标记与重金属铅胁迫下玉米地上部分铅积累量显著相关。位置为Chr1:299552992，位点分别位于Zm00001d034674基因上游409bp位置。其等位基因变异类型为T/C突变，显著P值分别为9.51E-08。表型贡献率分别为10.15％。
表2：候选基因关联分析显著位点
Figure BDA0002428143080000032
实施例2：基因表达量与表型关联分析
(1)基因表达量的获取：使用开源软件Kallisto对群体材料的基因及转录本进行表达定量。
(2)基因表达量与表型关联分析：运用R语言，线性回归模型，鉴定基因表达量与表型关联程度。在p<0.05水平下，Zm00001d034674基因的表达量与胁迫下玉米植株铅积累量显著相关，显著P值为0.0032。
结果进一步证实了该基因的表达与重金属铅胁迫下玉米地上部分铅积累量相关。
实施例3：基于标记类型的方差分析
(1)表型分组：基于该标记在不同自交系中的基因型，将试验材料分为两组，其中标记基因型为C的自交系记做A组，标记基因型为T的记做B组。
(2)方差分析：使用Excel软件进行方差分析，结果显示两组组间差异显著，A组均值为66.65，B组均值为89.52。表3。
表3：方差分析
Figure BDA0002428143080000041
如图1，不同基因型植株铅离子含量分布所示，C基因型的材料铅离子含量显著区别于T基因型的材料，且其均值及最大值均小于T基因型材料。
实施例4：本发明在玉米铅积累量中的应用试验
(1)序列扩增：在自然群体中挑选了5份铅高积累及5份铅低积累的材料，以其B73基因组DNA为模板，利用SNP分子标记位点侧翼序列设计特异性引物，引物序列如SEQ IDNO.1、2所示，采用KOD FX Neo高保真聚合酶(东洋纺(上海)生物科技有限公司)进行PCR扩增，程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s；59℃退火30s；68℃延伸6s；共35个循环；68℃再延伸10min。
(2)序列鉴定：将特异性的目的条带用胶回收试剂盒(Omega Bio-Tek)回收纯化，连接平末端克隆载体Peasy-Blunt Cloning Vector(北京全式金生物技术有限公司)测序。
(3)序列分析：利用SnapGene3.2.1软件对测序结果进行比对(见图2)。结果显示该SNP位点成功于挑选的10份玉米待鉴定材料进行基因分型，其中5份铅离子含量低的玉米材料在SNP位点处的基因型为C，另外5份铅离子含量高的玉米材料在该位点处的基因型为T。并且，基因型C和基因型T的表型数据存在显著性差异，表4，表5。
表4：:10份玉米自交系材料铅离子积累量
Figure BDA0002428143080000051
表5：方差分析
Figure BDA0002428143080000052
SEQUENCE LISTING
<110> 四川农业大学
<120> 玉米植株铅积累量相关SNP分子标记及其应用
<130> 2020
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggtcaaccgt cagtcagaag 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttcaaagtgt gcatgtcagt g 21

Claims (7)

1.一种玉米植株铅积累量相关SNP分子标记，其特征在于，所述SNP标记位于玉米基因组1号染色体299552992位置，变异类型为T/C。
2.一种用于扩增如权利要求1所述的SNP分子标记的特异性PCR引物对，其特征在于，序列如下所示：
上游：5’-GGTCAACCGTCAGTCAGAAG-3’；
下游：5’-TTCAAAGTGTGCATGTCAGTG-3’。
3.一种检测如权利要求1所述的SNP分子标记的试剂盒，包含如权利要求2所述的特异性PCR引物对。
4.如权利要求1所述的SNP分子标记、如权利要求2所述的引物对或如权利要求3所述的试剂盒在筛选或检测玉米植株铅积累能力方面的应用。
5.如权利要求1所述的SNP分子标记、如权利要求2所述的引物对或如权利要求3所述的试剂盒在培育铅胁迫下铅低积累玉米植株方面的应用。
6.一种检测玉米植株铅积累能力的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测玉米植株的基因组DNA；
(2)利用如权利要求2所述的引物对将步骤(1)获得的待测玉米植株的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；
(3)对步骤(2)获得的PCR扩增产物进行测序，获得测序结果；
(4)根据步骤(3)获得的测序结果，确定待测玉米植株的所述SNP标记的基因型，
预测待测玉米的铅积累能力。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的PCR扩增的程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s；59℃退火30s；68℃延伸6s；共35个循环；68℃再延伸10min。
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