CN114381544B - 西瓜叶片黄化致死主效基因及鉴定该主效基因的dCAPS分子标记和应用 - Google Patents

Abstract

西瓜叶片黄化致死主效基因及鉴定该主效基因的dCAPS分子标记和应用，涉及生物技术领域。公开了与西瓜叶片黄化致死基因紧密连锁的SNP位点，SNP位点位于西瓜基因组1号染色体34859242bp位置，碱基变化为T→C，通过在F2群体以及资源群体的验证，表明该dCAPS分子标记可有效鉴定西瓜黄化致死这一性状，本发明方法可快速、精准定位西瓜黄化致死性状基因，为西瓜种质资源叶片黄化突变类型鉴定和分子标记辅助育种研究提供新手段。

Description

西瓜叶片黄化致死主效基因及鉴定该主效基因的dCAPS分子 标记和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及西瓜叶片黄化致死主效基因及鉴定该主效基因的dCAPS分子标记和应用。

背景技术

西瓜作为为夏季水果之王，深受人们的喜爱。世界各地都有着广泛的栽培，中国是西瓜的生产和消费的第一大国。西瓜在长期的生产栽培过程中，叶片颜色常常会发生突变，一般表现为白化致死、黄绿、延迟变绿、黄斑驳、斑点等类型。叶色突变体是研究光合作用、叶绿素合成以及叶绿体发育的理想材料，同时也是遗传和育种研究中重要的基础材料。

植物叶片颜色与叶绿素的生物合成过程紧密相关，叶绿素的合成自谷氨酰-tRNA开始，经过了19步反应，，期间由27个基因编码了15个酶参与，最终生成叶绿素a、叶绿素b。在这些过程中，任何一步出现问题都有可能对叶绿素的合成产生影响，从而导致叶色发生变异。如拟南芥中通过图位克隆验证乙烯原叶绿素酯8–乙烯基还原酶基因(DVR)突变造成黄绿叶表型；黄瓜黄金叶(YP)突变体中发现编码镁螯合酶的CHLI亚基保守序列发生单核苷酸突变导致氨基酸替换和黄金叶表型。可见同为叶色黄化突变体有时我们并不能用肉眼轻易识别出是否受同一基因控制，只能在分子水平上对突变基因进行鉴定，并挖掘基因功能，培育高光效植物，进行分子辅助育种。

西瓜叶色突变体在20世纪80年代就有报道，如黄叶Yl基因；幼龄白化基因ja；苍白叶色基因pl；叶片后绿基因dg及黄斑点基因Sp等，但是大部分停留在表型观察、遗传分析以及生理特性研究上，将叶色突变定位到染色体基因上的却很少。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一个西瓜叶片黄化致死主效基因以及一种鉴定该基因的dCAPS分子标记方法，可快速、精准定位西瓜黄化致死性状基因，为西瓜种质资源黄化突变类型的鉴定和分子标记辅助育种的研究提供新手段，具体地，通过以下技术方案实现：

西瓜叶片黄化致死主效基因，包括与西瓜叶片黄化致死基因(简称ed基因)紧密连锁的SNP位点，所述SNP位点位于西瓜基因组1号染色体34859242bp位置，碱基变化为T→C。

鉴定西瓜叶片黄化致死主效基因的dCAPS分子标记，利用SNP位点开发的dCAPS分子标记，dCAPS分子标记的引物对为:

ed-F:5’-ATGGATCTTTTCTAAGACCA-3’。

ed-R:5’-GATTGAGAGGAGACATAGTG-3’。

优选地，dCAPS分子标记开发的步骤为：

(1)选取供试西瓜材料，供试西瓜材料包括母本、父本、F1、F2群体以及资源群体；

(2)确定供试西瓜材料中的叶片黄化致死植株、叶片黄绿植株、叶片正常绿植株；

(3)将F2群体中的叶片正常绿叶和叶片黄绿中间类型植株构建极端混池，进行混池测序，并以黄化致死材料为母本，以正常绿叶材料为父本进行亲本重测序，利用测序信息筛选目标变异位点，获得候选SNP位点；

(4)在父本、母本、F1和F2群体中验证候选SNP位点，并结合资源群体验证分析，获得与西瓜叶片黄化致死基因紧密连锁的dCAPS标记。

优选地，上述步骤(1)中父本为叶片正常绿西瓜材料；母本为叶片黄化致死西瓜材料；F1为所述父本和所述母本杂合的西瓜材料；F2群体为F1自交获得的西瓜材料；资源群体为西甜瓜中期库核心种质资源西瓜材料。

优选地，上述步骤(2)中采用直接观察法确定供试西瓜材料中的叶片黄化致死植株、叶片黄绿植株、叶片正常绿植株。

优选地，采用dCAPS分子标记鉴定西瓜叶片黄化致死基因的方法，步骤为：

(1)DNA的提取：采用植物基因组DNA提取试剂盒提取西瓜叶片总DNA；

(2)PCR扩增：利用引物对ed-F、ed-R对待测样品进行PCR扩增；

(3)酶切PCR产物：利用限制性内切酶NlaIII对扩增出的PCR产物进行酶切；

(4)电泳图谱分析：对上述酶切产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读，得到135bp产物的是黄化致死植株，得到115bp产物的是正常绿叶株，同时得到135bp和115bp两条带产物的是叶片黄绿杂合株。

本发明提供西瓜叶片黄化致死主效基因在鉴定西瓜种质资源叶片黄化突变类型中的应用。

本发明提供dCAPS分子标记在快速、精准定位西瓜黄化致死性状基因以及和分子标记辅助育种中的应用。

与现有技术相比，本发明提供西瓜叶片黄化致死主效基因及其dCAPS分子标记和应用，具有下述的有益效果：

(1)：本发明以黄化致死材料和正常绿叶材料为亲本，以黄绿中间类型为F1，并以F1自交构建F2群体，通过BSA-seq将西瓜叶片黄化致死基因进行初步定位；利用测序信息，对初步定位基因区间全部SNP位点进行与ed基因的连锁分析，获取与ed基因紧密连锁的SNP位点，并将与ed基因连锁的候选SNP位点结合F2群体验证分析，获取与目的基因紧密连锁的dCAPS标记，可应用于快速、精准定位西瓜黄化致死性状基因，为西瓜种质资源黄化突变类型的鉴定和分子标记辅助育种的研究提供新手段。

(2)：本发明利用资源群体检测dCAPS分子标记的准确性，利用本发明设计的特异dCAPS分子标记，可用于筛选和鉴定西瓜种质资源中的黄化突变类型以及分子标记辅助育种等研究。

附图说明

图1为本发明所述实施例中西瓜叶片黄化致死材料的照片图，其中黄化致死、黄绿叶、绿叶表型特征明显。

图2为本发明所述实施例中引物对ed-F和ed-R对黄化致死材料母本、父本、F1代、F2群体的PCR扩增反应条带，及该PCR扩增产物利用NlaIII酶切后的结果电泳图。

图3为本发明所述实施例中引物对ed-F和ed-R对西瓜资源群体的PCR扩增反应条带，及该PCR扩增产物利用NlaIII酶切后的结果电泳图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

实施例一：包括与西瓜叶片黄化致死基因紧密连锁的SNP位点，所述SNP位点位于西瓜基因组1号染色体34859242bp位置，碱基变化为T→C。本实施例给出了一种dCAPS标记的开发方法，包括：

以西瓜叶片黄化致死材料和正常绿叶材料为亲本，黄绿中间类型材料为F1，F1自交得到F2群体材料；通过BSA-seq将西瓜叶片黄化致死基因进行初步定位；利用测序信息，对F2群体材料初步定位目标基因区间的候选SNP位点进行与叶片黄化致死性状的连锁分析；结合分离群体验证分析及资源群体验证分析，获得与西瓜叶片黄化致死性状紧密连锁的dCAPS标记。

实施例二：在实施例1的基础上，本实施例进一步给出一种优选的所述dCAPS标记的开发方法，包括：

(1)选取供试西瓜材料：供试西瓜材料包括母本、父本、F1、F2群体以及资源群体；其中，父本为叶片正常绿西瓜材料sugarLee；母本为叶片黄化致死西瓜材料；F1为父本和母本杂合的西瓜材料；F2群体为F1自交获得的西瓜材料；资源群体为西甜瓜中期库24份种质资源西瓜材料包括叶片后绿西瓜材料和叶片正常绿西瓜材料(详见表1)，上述各个供试材料均为中国农业科学院郑州果树研究所中国西瓜甜瓜中期库保存的种质资源材料；

(2)供试材料叶片黄化致死性状的确定：采用直接观察法确定供试西瓜材料中的叶片黄化致死植株、叶片黄绿植株、叶片正常绿植株；

(3)与ed基因连锁的SNP位点的获取：将F2群体中的叶片正常绿叶和叶片黄绿中间类型植株构建极端混池，进行混池测序，并以黄化致死材料为母本，以正常绿叶材料为父本进行亲本重测序，利用测序信息筛选目标变异位点，获得候选SNP位点；

(4)在父本、母本、F1和F2群体中验证所述候选SNP位点，并结合资源群体验证分析，获得与西瓜叶片黄化致死基因紧密连锁的dCAPS标记。

对西瓜叶片黄化致死基因dCAPS标记的设计开发，分别对父本、母本、F1、F2群体的基因组DNA进行PCR扩增，得到各供试西瓜材料的PCR扩增产物。PCR扩增所用引物包括引物对ed-F、ed-R，引物ed-F的核苷酸碱基序列为5’-ATGGATCTTTTCTAAGACCA-3’，引物ed-R的核苷酸碱基序列为5’-GATTGAGAGGAGACATAGTG-3’。

表1西瓜种质材料及表型

实施例三：在实施例一的基础上，本实施例对dCAPS标记的开发及应用方法做详细的描述。

dCAPS标记具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的核苷酸碱基序列。SEQ ID NO:1为引物对ed-F、ed-R对叶片正常绿西瓜材料特异性扩增的核苷酸序列，具体见核苷酸序列表，共135个碱基。SEQ ID NO:2为引物对ed-F、ed-R对叶片黄化致死西瓜材料特异性扩增的核苷酸序列，具体见核苷酸序列表，共135个碱基。dCAPS标记的开发方法，具体包括以下步骤：

A、供试材料选取

所述供试材料包括父本、母本、F1代、F2群体、资源群体。其中，

所述的父本为：正常绿叶材料sugarLee(ZXG0261)。

所述的母本为：突变体中的黄化致死材料sugarLee-ED，该材料其子叶刚出土便为黄化苗，子叶不能正常转绿，出土一周左右自然枯死，即本发明所述的叶片黄化致死。

所述的F1为：以上述突变体材料中的黄绿叶西瓜材料sugarLee-YG。

所述的F2群体为：该F1代自交获得的F2群体。

所述的资源群体材料为中国西瓜甜瓜中期库中24份种质资源，包括叶片后绿和叶片正常绿西瓜材料(详见表1)。

上述各个供试材料均为中国农业科学院郑州果树研究所中国西瓜甜瓜中期库保存的种质资源材料。

B、供试材料叶片黄化致死性状的确定

采用直接观察法确定叶片黄化致死西瓜植株，西瓜叶片黄化致死性状其子叶刚出土便为黄化苗，子叶不能正常转绿，出土一周左右自然枯死；黄绿中间类型性状植株从幼苗开始颜色变一直介于黄色与绿色之间，新叶偏黄，老叶黄绿；正常绿性状植株叶片抽生即为绿色，因此，叶片黄化致死与正常绿幼苗植株以及黄绿中间类型植株有明显的区别，可以确保试验结果的准确性。

对正常绿叶亲本sugarLee(父本)、叶片黄化致死sugarLee-ED(母本)、黄绿叶sugarLee-YG(F1代)的单株以及107个F2分离群体单株进行表型鉴定，结果表明：107个单株中有33个叶片黄化致死植株、50个表现为黄绿叶性状的植株、24个叶片正常绿单株。经卡方检测，符合1：2：1的孟德尔遗传分离比例(χ2＝1.97，p-value＝0.37)。综合上述双亲、F1、107个F2分离群体单株黄化致死性状鉴定结果，得出西瓜叶片黄化致死基因为单基因控制的不完全显性性状。

C、与ed基因紧密连锁的SNP位点的获得

将所述F2群体中的叶片正常绿和黄绿性状的植株构建极端混池，进行基因组混池测序，正常绿和黄化致死植株进行亲本重测序，通过对等位基因频率的差异进行分析，初步定位目标基因区间并获得候选SNP位点；目标区间初步筛选到5个snp位点分别分布在1号，2号，5号，9号染色体上，后经过在亲本，F1中验证，最终定位到西瓜基因组1号染色体的Cla97C01G023430基因上。所述的SNP位点为西瓜基因组1号染色体碱基位置为34859242bp处，碱基变化为T→C。

D、dCAPS标记的获得

利用http://cucurbitgenomics.org/公布的西瓜基因组数据，针对所述的候选SNP位点设计所述的dCAPS标记，dCAPS标记是通过在线分析软件利用在线分析软件dCAPSFinder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)获得，并在所述父本、母本、F1、F2群体中验证所述的候选SNP位点，获得与西瓜叶片黄化致死基因ed连锁的dCAPS标记。

E、dCAPS标记的筛选及验证

利用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)提取所述西瓜材料父本、母本、F1代、F2群体各自的叶片总DNA。并进行PCR扩增反应，得到各自的PCR扩增产物；再对上述各自的PCR扩增产物进行酶切反应，得到各自的酶切产物，如图2所示。

在所述的PCR扩增反应中，上、下游引物为以下核苷酸碱基序列：

ed-F，即上游引物：5’-ATGGATCTTTTCTAAGACCA-3’；

ed-R，即下游引物：5’-GATTGAGAGGAGACATAGTG-3’。

在所述的PCR扩增反应中，反应程序为：阶段1：94℃预变性5min；阶段2：94℃、20s；53℃、1min；72℃、30s，共循环35次；阶段3：72℃延伸5-10min；阶段4：4℃保持。

在所述的PCR扩增反应中，PCR扩增反应体系为10μL，包括5μL2×TaqPCRMasterMix，1μL模板DNA，正、反向引物各0.5μL和3μL ddH₂O。

在所述的PCR扩增反应中，酶切反应体系为10μL，包括0.2μL限制酶、1μL buffer、6.8μL ddH2O和2μL PCR产物，之后再37℃酶切过夜。

用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色并在X线胶片观察灯上显影观察，检测多态性，对带型进行判读，检查所属基因型，拍照统计。图2为本实施例中引物对ed-F和ed-R对西瓜叶片黄化致死和西瓜叶片正常绿亲本、F1代以及F2群体的PCR扩增反应条带，及该PCR扩增产物利用NlaIII酶切后的结果电泳图。其中泳道1为分子量Marker，泳道2、3、4分别黄化致死母本、正常绿叶父本和F1代，其他泳道为F2分离群体部分株系PCR产物及dCAPS酶切产物。根据所述酶切产物的带型判断西瓜叶片黄化致死性状的等位基因型，如图2所示，扩增片段经NlaIII酶切，西瓜叶片黄化致死纯合子得到135bp的条带，西瓜叶片正常绿纯合子酶切成115bp的条带，西瓜叶片黄绿杂合子得到135bp和115bp的两条带。

本实施例中引物对ed-F和ed-R对西瓜F2群体的PCR扩增反应条带，及该PCR扩增产物利用NlaIII酶切后的结果电泳图，如图2所示。基因型与表型统计结果如表2所示。表中，母本基因型为A，父本基因型记为B，杂合基因型为H；叶片黄化致死为h，叶片正常绿为L,黄绿叶片为hL。结果显示叶片黄化致死鉴定结果与标记检测结果呈现出共分离。

表2 dCAPS分子标记在F2群体中的鉴定和验证

F、利用所述dCAPS标记对所述资源群体进行鉴定

利用所述的资源群体进一步验证所述的dCAPS标记与西瓜叶片黄化致死基因ed的连锁关系。以所述资源群体的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，得到资源群体的PCR特异片段；再将所述PCR特异片段进行酶切反应，得到资源群体酶切产物，如图3所示。

具体的操作同E中所述。经过引物对ed-F和ed-R扩增后，利用NlaIII限制酶酶切，结果显示24份资源群体材料的标记检测均与叶片正常绿鉴定相符，并没有发现黄化致死或者黄绿杂合的带型，统计该dCAPS标记对资源鉴定符合率为100％。进一步证实了所设计的dCAPS分子标记在鉴定西瓜黄化致死基因上的准确性。

综上所述，本发明提供了一个西瓜叶片黄化致死主效基因以及一种鉴定该基因的dCAPS分子标记方法，可快速、精准定位西瓜黄化致死性状基因，为西瓜种质资源黄化突变类型的鉴定和分子标记辅助育种的研究提供新手段。

结合优选实施方案具体展示和介绍了本发明，具体实现该技术方案方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，但所属领域的技术人员应该明白，在不脱离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围内，在形式上和细节上可以对本发明做出各种变化，均为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 西瓜叶片黄化致死主效基因及鉴定该主效基因的dCAPS分子标记和应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3 .5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 西瓜（人工序列）

<400> 1

ATGGATCTTTTCTAAGACCA

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 西瓜（人工序列）

<400> 2

GATTGAGAGGAGACATAGTG

<210> 3

<211> 135

<212> DNA

<213> 西瓜（Citrullus lanatus）

<400> 3

ATGGATCTTTTCTAAGACCATGTCTTAAGCAGTTAGGAATGACGGTAGCTATGTCCTCAGCAGCAACTTTATCCCTTCCCTTTAGAGCTGCAAGAGCCTTTGCAGCTCTATTTGTCACTATGTCTCCTCTCAATC

<210>4

<211> 135

<212> DNA

<213> 西瓜（Citrullus lanatus）

<400> 4

ATGGATCTTTTCTAAGACCACGTCTTAAGCAGTTAGGAATGACGGTAGCTATGTCCTCAGCAGCAACTTTATCCCTTCCCTTTAGAGCTGCAAGAGCCTTTGCAGCTCTATTTGTCACTATGTCTCCTCTCAATC

Claims (5)

1.鉴定西瓜叶片黄化致死主效基因的dCAPS分子标记，其特征在于，利用与西瓜叶片黄化致死基因紧密连锁的SNP位点开发获得,所述SNP位点位于西瓜基因组1号染色体34859242bp位置，碱基变化为T→C；

扩增所述dCAPS分子标记的引物对为：

ed-F:5’-ATGGATCTTTTCTAAGACCA-3’;

ed-R:5’-GATTGAGAGGAGACATAGTG-3’。

2.根据权利要求1所述dCAPS分子标记，其特征在于，所述dCAPS分子标记开发的步骤为：

（1）选取供试西瓜材料，所述供试西瓜材料包括母本、父本、F1、F2群体以及资源群体；

（2）确定所述供试西瓜材料中的叶片黄化致死植株、叶片黄绿植株、叶片正常绿植株；

（3）将F2群体中的叶片正常绿叶和叶片黄绿中间类型植株构建极端混池，进行混池测序，并以黄化致死材料为母本，以正常绿叶材料为父本进行亲本重测序，利用测序信息筛选目标变异位点，获得候选SNP位点；

（4）在所述父本、母本、F1和F2群体中验证所述候选SNP位点，并结合资源群体验证分析，获得与西瓜叶片黄化致死基因紧密连锁的dCAPS标记。

3.根据权利要求2所述的dCAPS分子标记，其特征在于，步骤（1）中所述父本为叶片正常绿西瓜材料；所述母本为叶片黄化致死西瓜材料；所述F1为所述父本和所述母本杂合的西瓜材料；所述F2群体为所述F1自交获得的西瓜材料；所述资源群体为西甜瓜中期库核心种质资源西瓜材料。

4.根据权利要求3所述的dCAPS分子标记，其特征在于，步骤（2）中采用直接观察法确定所述供试西瓜材料中的叶片黄化致死植株、叶片黄绿植株、叶片正常绿植株。

5.一种权利要求1所述dCAPS分子标记鉴定西瓜叶片黄化致死的方法，其特征在于，步骤为：

（1）DNA的提取：采用植物基因组DNA提取试剂盒提取西瓜叶片总DNA；

（2）PCR扩增：利用权利要求1所述引物对ed-F、ed-R对待测样品进行PCR扩增；

（3）酶切PCR产物：利用限制性内切酶NlaIII对扩增出的PCR产物进行酶切；

（4）电泳图谱分析：对上述酶切产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读，得到135bp产物的是黄化致死植株，得到115bp产物的是正常绿叶株，同时得到135bp和115bp两条带产物的是叶片黄绿杂合株。