CN108315328A - 西瓜粘籽基因snp分子标记及其筛选方法和应用 - Google Patents

西瓜粘籽基因snp分子标记及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种西瓜粘籽基因SNP分子标记及其筛选方法和应用。明确了一种西瓜粘籽基因的SNP位点。设计了一种所述SNP位点的dCAPs分子标记，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。设计了所述SNP位点的dCAPs分子标记的筛选方法和西瓜粘籽基因型的鉴定方法。将所述SNP位点的dCAPs分子标记在鉴定和辅助筛选不同种质类型西瓜中应用。本发明可指导杂交育种亲本选配，以更快速、准确的进行粘籽西瓜的定向遗传改良；可为鉴定西瓜是否为粘籽提供新手段，加速西瓜粘籽特异性状的改良进程，提高育种的准确性和选择效率。

Description

西瓜粘籽基因SNP分子标记及其筛选方法和应用
技术领域
本发明涉及西瓜育种技术领域，具体涉及一种西瓜粘籽基因SNP分子标记及其筛选方法和应用。
背景技术
粘籽西瓜耐干早耐瘠薄且抗性强，尤其具有栽培西瓜所不具有的高抗病毒性状。种子具有极薄的种皮，其种皮厚度仅仅为0.064mm，而普通西瓜的种皮厚度在0.2mm以上；粘籽西瓜种皮相对重量极轻，仅占种子总重的17.7%，其他西瓜都在49%以上，因此粘籽西瓜种子可食率较其他西瓜高30%～40%；粘籽西瓜种子具有较高的含油量，其中不饱和脂肪酸含量较高，具有较高的营养价值。
但是，粘籽西瓜果实的食用性状差，如大部分种质的果实具有苦味、果肉坚硬、白瓤、可溶性固形物含量低等野生或不良性状，粘籽西瓜和栽培西瓜杂交分离后，野生性状遗传较为复杂，并且粘籽与苦味、白瓤、硬果肉等低劣性状紧密连锁，常规的种质创新工作量巨大。
分子标记辅助筛选可以从分子水平上快速准确的分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接筛选，进行分子育种。现有遗传分析表明，粘籽性状主要受1对隐性基因（eg）控制（Gusmini等，2004；谢春立 等，2011）。在粘籽QTL定位研究上，Prothro等（2012）在构建F2群体遗基础上，将粘籽基因定位在第二遗传连锁群的57.8cM处，与最近的分子标记NW0248325距离为5.1 cM。
然而，分子标记辅助选择成功的关键在于所获得的分子标记是否与分析的性状紧密连锁及是否在同一物种的不同材料间具有通用性。但迄今为止，仍未获得在西瓜不同材料中通用的与粘籽西瓜类型相关的分子标记。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能在西瓜不同材料中通用的与粘籽西瓜类型相关的SNP分子标记及其筛选方法应用。以实现对西瓜粘籽基因型的直接筛选，进行分子育种。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
明确了一种西瓜粘籽基因的SNP位点，该位点位于西瓜基因组8号染色体22989189bp处，其碱基由T突变为G。
设计一种所述SNP位点的dCAPs分子标记，命名为Npr372，其上游引物命名为Npr372F，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其下游引物命名为Npr372R，核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
优选的，所述引物酶切反应所用限制性内切酶为Tag I。
设计一种所述SNP位点的dCAPs分子标记的筛选方法，包括以下步骤：
（1）选取不同类型的西瓜材料，进行简化基因组测序；
（2）结合群体多态性的差异确定群体间的受选择区域，获得与粘籽西瓜类型相关的染色体区间；
（3）结合西瓜材料的深度重测序筛选目标染色体区间存在的SNP突变位点，分析SNP位点的酶切信息，获得存在CAPS/dCAPS突变的序列，并设计CAPS/dCAPS分子标记引物，即得所述粘籽西瓜粘籽性状的dCAPs分子标记。
设计一种西瓜粘籽基因型的鉴定方法，包括以下步骤：
a. DNA提取：利用CTAB法提取西瓜叶片总DNA；
b. PCR扩增：
反应体系为：100 ng/μL的西瓜叶片总DNA 1μl、Npr372F 1 μl、Npr372R 1 μl、2×Power Taq PCR MasterMix 12.5 μl、ddH2O 9.5 μl；
反应程序为：94℃ 5 min，35个循环的94℃ 20 s、55℃ 1 min、72℃ 30 s、72℃ 5min；
c. 酶切反应体系和程序：
反应体系为：PCR产物5 μl， Tag I限制性内切酶0.5μl，10×buffer 1.5 μl，ddH2O 8μl；
反应程序为：65℃恒温处理10小时；
d.电泳图谱分析：对所述酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读，找到目标条带，根据所述扩增产物的条带大小及位置关系确定所属基因型，165bp的条带代表粘籽西瓜基因型，184bp的条带代表非粘籽西瓜基因型。
将所述SNP位点的dCAPs分子标记在鉴定和辅助筛选不同种质类型西瓜中应用。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
1. 本发明明确了粘籽西瓜类型特异分子标记，应用该标记进行西瓜分子标记辅助选择育种，还可用于品种资源的鉴定与保存，指导杂交育种亲本选配，以更快速、准确的进行粘籽西瓜的定向遗传改良。
2. 本发明在不同类型的西瓜中进行了应用，其基因型准确率为100%，可为鉴定西瓜是否为粘籽提供新手段，加速西瓜粘籽特异性状的改良进程，提高育种的准确性和选择效率。
3. 本发明西瓜粘籽基因型的鉴定方法为西瓜种子粘籽性状的检测提供了快速、简便、科学实用的检测鉴定技术。
附图说明
图1 粘籽西瓜与野生西瓜标准化的ZZ（Fst）和Z（Pi）图；
图2粘籽西瓜与普通西瓜标准化的ZZ（Fst）和Z（Pi）图；
图3利用NPr372的的引物在部分不同类型西瓜基因组DNA中的扩增结果图；图中，165bp的条带代表粘籽基因型，184bp的条带代表非粘籽基因型。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例一：西瓜籽粒粘籽基因的确定及分子标记的开发
对不同类型的西瓜材料进行简化基因组测序，结合群体多态性的差异确定群体间的受选择区域，获得与粘籽西瓜类型相关的染色体区间，利用粘籽西瓜材料和普通西瓜材料的深度重测序筛选目标染色体区间内的SNP位点，并设计CAPS/dCAPS分子标记引物，再利用CAPS/dCAPS分子标记引物及西瓜基因组DNA进行PCR扩增，最后对扩增产物酶切后利用电泳进行验证。
具体步骤如下：
（1）选取不同类型的西瓜材料，包括粘籽西瓜，普通西瓜和野生西瓜；
（2）利用简化基因组测序的方法检测不同类型西瓜材料全基因组水平的SNP变异，结合多态性的差异得到标准化的Z（Fst）和Z（Pi）（图1和图2），通过比较Z（Fst）和Z（Pi）TOP0.05值的重叠区域获得粘籽西瓜类型的选择候选区域；
（3）结合1份粘籽西瓜和3份普通西瓜材料的深度重测序筛选目标染色体区间存在的SNP突变位点，该位点位于西瓜基因组8号染色体22989189bp处，碱基变化为T突变为G。
（4）分析SNP位点的酶切信息，获得存在CAPS/dCAPS突变的序列，将该粘籽西瓜粘籽类型的特异dCAPS分子标记命名为Npr372，设计CAPS/dCAPS分子标记引物：
正向引物核苷酸序列为Npr372F：TCAGTGAACAAGAAGAAAGT；
反向引物核苷酸序列为Npr372R：TGAGAGATTGAGATTGAGT；
采用的限制性内切酶为Tag I。
实施例二：西瓜DNA分子标记分析
1. 选取5份粘籽西瓜、5份普通西瓜和5份野生西瓜，利用CTAB法提取西瓜叶片总DNA，每个样品设三个平行试验，具体步骤如下：
（1）取1 g新鲜叶片放入研钵，加入液氮研成粉末状，随即转入加有1 ml CTAB 抽取液的离心管中，使二者充分混匀，然后置于65℃恒温水浴60 min，其间颠倒混合2～3次；
（2）从水浴锅取出后，8000 rpm离心1 min；
（3）取上清液置于另一离心管中，加等体积的氯仿：异戊醇（24：1，V/ V），轻轻颠倒使其充分混匀；
（4）10000 rpm离心5 min，取上清液；
（5）加入0.7倍体积的预冷异丙醇混匀后置于-20℃冷冻不超过30 min让DNA析出；取出后10000 rpm离心5 min，留沉淀弃上清液；
（6）用无水乙醇清洗沉淀数次，倒掉浸泡液，打开离心管盖子晾干；
（7）加入200 μl的蒸馏水溶解DNA；用紫外分光光度计测定DNA的浓度，于-20℃冰箱中保存备用。
2. PCR反应体系和程序
反应体系为：西瓜叶片总DNA (100ng/μl) 1μl、Npr372F (10μmol/L) 1 μl、Npr372R(10μmol/L) 1 μl、2×Power Taq PCR MasterMix 12.5 μl、ddH2O 9.5 μl。
PCR反应程序为：94℃ 5分钟，35个循环的94℃ 20秒钟、55℃ 1分钟、72℃ 30秒、72℃ 5分钟。
3. 酶切反应体系和程序
反应体系为：PCR产物5 μl， Tag I限制性内切酶0.5μl，10×buffer 1.5 μl，ddH2O 8μl。
65℃恒温处理10小时。
4. 对酶切产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读。
（1）试剂配制：
A．5×TBE ：取Tris-base 53.9克、EDTA3.72克、硼酸27.5克，用蒸馏水定容至1升。
B. 40%聚丙烯酰胺溶液：取聚丙烯酰胺193.34克、甲叉双丙烯酰胺6.66克，用蒸馏水定容至500毫升。
C. 8%聚丙烯酰胺凝胶：40%聚丙烯酰胺溶液10毫升，5×TBE 5毫升，10% 过硫酸铵（APS）200微升，四甲基乙二胺（TEMED）80微升，蒸馏水22毫升。
D. 银染液：取硝酸银1克、冰醋酸5毫升、无水乙醇50毫升，用去离子水定容至500毫升。
E. 显影液：取氢氧化钠15克、甲醛（37%）2.5毫升，用去离子水定容至500毫升。
（2）凝胶板准备：玻璃板用蒸馏水洗净、晾干后，用浸泡过无水乙醇的脱脂棉球擦拭，晾干。将凹板和平板叠合紧密后放入制胶器中压紧并扣好其两边的夹子。在洗瓶内配置8%聚丙烯酰胺凝胶溶液，混匀后快速注入两板中间的缝隙内，注满后插入有齿的梳子；若此时液面有所下降，可用移液器吸取未凝固的溶液来补充。等待溶液充分凝固。
（3）电泳：将制胶器支架从底座上取下，直接放入配套的电泳槽中，在电泳槽底部及支架上两块玻璃板中间倒入适量的1×TBE缓冲液。在PCR产物中加入0.2倍体积的6×DNALoading Buffer，混匀后取0.8微升加入点样孔内，260伏电泳35分钟。
（4）染色和显影：电泳完成后，从电泳槽中取出玻璃板，撬去凹板，凝胶会贴附于平板上，凝胶面向上将平板放入银染液中，置于脱色摇床上轻摇15分钟，凝胶会自动脱落下来；银染完毕，将凝胶取出放入去离子水中清洗10秒；清洗完毕后将凝胶转入显影液中，轻摇摇床，待条带清晰后取出凝胶，放置在阅片器上肉眼观察条带的位置差异，并拍照保存。
（5）带型判读：将显影后自然干燥好的玻璃板置于阅片台上，肉眼观察两亲本条带的位置差异。
利用Npr372分子标记鉴定西瓜粘籽基因型的结果如图3所示：酶切产物条带为165bp的为粘籽西瓜类型，酶切产物条带为184bp的为非粘籽西瓜类型，即普通西瓜类型或野生西瓜类型。
实施例三：鉴定和辅助筛选西瓜的种质类型
经实施例二进行Npr372分子标记在5份粘籽西瓜，5份野生西瓜和5份普通西瓜的基因型鉴定后，检查Npr372分子标记的两种基因型在93份不同类型西瓜材料中的分布情况。
表1 NPr372在93份不同类型西瓜材料中的鉴定和验证
材料编号 品种名称 种质类型 NPr372
S001 PI 248178 粘籽西瓜 A
S002 PI 494527 粘籽西瓜 A
S003 PI 559992 粘籽西瓜 A
S004 PI 559993 粘籽西瓜 A
S005 PI 559994 粘籽西瓜 A
S006 PI 559996 粘籽西瓜 A
S007 PI 559999 粘籽西瓜 A
S008 PI 560000 粘籽西瓜 A
S009 PI 560001 粘籽西瓜 A
S010 PI 560003 粘籽西瓜 A
S011 PI 560005 粘籽西瓜 A
S012 PI 560006 粘籽西瓜 A
S013 PI 560008 粘籽西瓜 A
S014 PI 560010 粘籽西瓜 A
S015 PI 560019 粘籽西瓜 A
S016 PI 560024 粘籽西瓜 A
S017 PI 494530 粘籽西瓜 A
S018 PI 494528 粘籽西瓜 A
S019 PI 595203 粘籽西瓜 A
S020 B43 粘籽西瓜 A
S021 PI 482252 野生西瓜 B
S022 PI 482282 野生西瓜 B
S023 PI 482293 野生西瓜 B
S024 PI 482315 野生西瓜 B
S025 PI 482326 野生西瓜 B
S026 PI 482342 野生西瓜 B
S027 Grif 15896 野生西瓜 B
S028 PI 295850 野生西瓜 B
S029 PI 532659 野生西瓜 B
S030 PI 596656 野生西瓜 B
S031 PI 596659 野生西瓜 B
S032 PI 596662 野生西瓜 B
S033 PI 596665 野生西瓜 B
S034 PI 596668 野生西瓜 B
S035 PI 296341 野生西瓜 B
S036 神武 普通西瓜 B
S037 PI 629104 普通西瓜 B
S038 郑引65号 普通西瓜 B
S039 菲律宾特早 普通西瓜 B
S040 PI 177325 普通西瓜 B
S041 平壤1号 普通西瓜 B
S042 中生系 普通西瓜 B
S043 PI 612474 普通西瓜 B
S044 夕匕千西瓜 普通西瓜 B
S045 伊吹（黑子） 普通西瓜 B
S046 Paoteque Klondike 普通西瓜 B
S047 太阳西瓜 普通西瓜 B
S048 郑引38号 普通西瓜 B
S049 新富选 普通西瓜 B
S050 新一号 普通西瓜 B
S051 小籽早西瓜 普通西瓜 B
S052 平湖马铃 普通西瓜 B
S053 华来士 普通西瓜 B
S054 PI 379245-1 普通西瓜 B
S055 PI 379247 普通西瓜 B
S056 PI 174103 普通西瓜 B
S057 PI 169300 普通西瓜 B
S058 PI 278013 普通西瓜 B
S059 枕头西瓜 普通西瓜 B
S060 PI 169242 普通西瓜 B
S061 PI 270144 普通西瓜 B
S062 PI 319212 普通西瓜 B
S063 火星 普通西瓜 B
S064 PI 508446 普通西瓜 B
S065 J （96B41） 普通西瓜 B
S066 安长红 普通西瓜 B
S067 美国大花皮 普通西瓜 B
S068 早板 普通西瓜 B
S069 浓友 普通西瓜 B
S070 郑引201 普通西瓜 B
S071 花抗 普通西瓜 B
S072 Cream suika 普通西瓜 B
S073 PI 279462 普通西瓜 B
S074 White Wonder 普通西瓜 B
S075 庆丰 普通西瓜 B
S076 匈牙利1号 普通西瓜 B
S077 匈引2号 普通西瓜 B
S078 美国西瓜 普通西瓜 B
S079 洛宁18日红 普通西瓜 B
S080 新红宝圆选 普通西瓜 B
S081 太原1号 普通西瓜 B
S082 华东24号 普通西瓜 B
S083 葱绿核桃纹 普通西瓜 B
S084 温岭西瓜 普通西瓜 B
S085 河南三白瓜 普通西瓜 B
S086 金包银 普通西瓜 B
S087 特基尔达市 普通西瓜 B
S088 PI 612466 普通西瓜 B
S089 红籽瓜（红大） 普通西瓜 B
S090 神武早 普通西瓜 B
S091 富宝 普通西瓜 B
S092 都锦 普通西瓜 B
S093 红梅 普通西瓜 B
结果如表1所示：分子标记NPr372的基因型在20份粘籽西瓜中全部为A（165bp），在非粘籽类型西瓜材料中，15份野生西瓜全部为B（184bp），58份普通西瓜中，全部为B（184bp）。
分子标记NPr372的基因型为A的20个西瓜材料中，20份为粘籽类型，，而在基因型为B的73份西瓜材料全部是非粘籽类型。其在西瓜不同类型材料中基因型鉴定的准确率为100%。
以上的结果足以说明通过特异分子标记NPr372可以来预测是否为粘籽西瓜类型，可以提高西瓜粘籽性状育种的选择效率，从而加速育种进程。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院郑州果树研究所
<120> 西瓜粘籽基因SNP分子标记及其筛选方法和应用
<130> 2018
<160> 2
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
tcagtgaaca agaagaaagt 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tgagagattg agattgagt 19

Claims (6)

1.一种西瓜粘籽基因的SNP位点，其特征在于，位于西瓜基因组8号染色体22989189bp处，其碱基由T突变为G。
2.一种权利要求1所述SNP位点的dCAPs分子标记，其特征在于，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.依据权利要求2所述SNP位点的dCAPs分子标记，其特征在于，所述引物酶切反应所用限制性内切酶为Tag I。
4.一种权利要求2所述SNP位点的dCAPs分子标记的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）选取不同类型的西瓜材料，进行简化基因组测序；
（2）结合群体多态性的差异确定群体间的受选择区域，获得与粘籽西瓜类型相关的染色体区间；
（3）结合西瓜材料的深度重测序筛选目标染色体区间存在的SNP突变位点，分析SNP位点的酶切信息，获得存在CAPS/dCAPS突变的序列，并设计CAPS/dCAPS分子标记引物，即得所述粘籽西瓜粘籽性状的dCAPs分子标记。
5.一种西瓜粘籽基因型的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
a. DNA提取：利用CTAB法提取西瓜叶片总DNA；
b. PCR扩增：
反应体系为：100 ng/μL的西瓜叶片总DNA 1μl、权利要求2所述上游引物1 μl、权利要求2所述下游引物1 μl、2×Power Taq PCR MasterMix 12.5 μl、ddH2O 9.5 μl；
反应程序为：94℃ 5 min，35个循环的94℃ 20 s、55℃ 1 min、72℃ 30 s、72℃ 5min；
c. 酶切反应体系和程序：
反应体系为：PCR产物5 μl， Tag I限制性内切酶0.5μl，10×buffer 1.5 μl，ddH2O 8 μl；
反应程序为：65℃恒温处理10小时；
d.电泳图谱分析：对所述酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读，找到目标条带，根据所述扩增产物的条带大小及位置关系确定所属基因型，165bp的条带代表粘籽西瓜基因型，184bp的条带代表非粘籽西瓜基因型。
6.权利要求2所述SNP位点的dCAPs分子标记在鉴定和辅助筛选不同种质类型西瓜中的应用。
CN201810391810.2A 2018-04-27 2018-04-27 西瓜粘籽基因snp分子标记及其筛选方法和应用 Active CN108315328B (zh)

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