CN109338008B - 黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物及品种分子鉴定方法 - Google Patents

黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物及品种分子鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物及品种分子鉴定方法。本发明中多态性标记引物的序列为：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.24。基于提供的多态性标记引物，通过常规PCR扩增、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和DNA指纹图谱分析，可以对黄秋葵品种进行亲缘关系分析。同时，利用提供的多态性标记引物对黄秋葵品种PCR扩增、电泳检测，获得特定黄秋葵品种四个特异性DNA序列，基于这些特异性DNA序列，可以实现目标黄秋葵品种的分子鉴定。本发明所述的多态性引物及其应用方法能够反映黄秋葵品种细胞质基因组的遗传信息，提供了关于黄秋葵细胞核DNA之外的其他物质用于鉴定黄秋葵的种质资源的方法，解决了黄秋葵资源鉴定中的不全面问题。

Description

黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物及品种分子鉴定方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物及品种分子鉴定方法。
背景技术
黄秋葵(Abelmoschus esculentus L.)是锦葵科秋葵属一年生草本植物，又名秋葵、黄葵、补肾草、羊豆角、羊芝麻、咖啡葵等。其原产于非洲，现普遍栽培与热带和亚热带地区。黄秋葵嫩果富含蛋白质、纤维素、不饱和脂肪酸及铁、锰、锌、钙和钾等矿物质，具有很高的食用价值，其果荚润滑柔嫩，可清炒、凉拌、做汤、加工、制罐等。另外，还富含多糖、黄酮、花青素及萜类等多种生物活性成分，具有助消化、抗癌、抗肿瘤、消炎、保肝及增强人体免疫力等功效。因此，黄秋葵是集食、药、工业加工于一身的兼用型植物。黄秋葵品种较多，对黄秋葵种质资源的准确区分和鉴定是进行良种选育和遗传改良的重要基础。
微卫星分子标记(Simple Sequence Repeat，SSR)是指基因组中由1-6个核苷酸为基本重复单位构成的一段DNA序列。微卫星DNA在真核生物基因组中的含量非常丰富，并且广泛分布于基因组中的不同位置。该标记已经被广泛应用于生物的种质鉴定、遗传多样性评价和亲缘关系分析研究中。目前，SSR在黄秋葵中的应用研究主要是针对细胞核DNA。但是，由于植物细胞中，除了细胞核遗传外，还具有细胞质遗传，而目前，尚未有关于黄秋葵细胞核DNA之外的其他物质用于鉴定黄秋葵的种质资源。为了解决现有技术在黄秋葵资源鉴定中的不全面问题，迄今为止，也尚未有关于黄秋葵叶绿体微卫星分子标记开发及应用的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于，提供黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物及品种分子鉴定方法。本发明提供了关于黄秋葵细胞核DNA之外的其他物质用于鉴定黄秋葵的种质资源的方法，解决了黄秋葵资源鉴定中的不全面问题。
本发明的技术方案：黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物，包括12对引物，其引物序列信息如下：
AEcpSSR1正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；
AEcpSSR1反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；
AEcpSSR3正向引物如序列表中SEQ ID NO.3所示；
AEcpSSR3反向引物如序列表中SEQ ID NO.4所示；
AEcpSSR4正向引物如序列表中SEQ ID NO.5所示；
AEcpSSR4反向引物如序列表中SEQ ID NO.6所示；
AEcpSSR10正向引物如序列表中SEQ ID NO.7所示；
AEcpSSR10反向引物如序列表中SEQ ID NO.8所示；
AEcpSSR11正向引物如序列表中SEQ ID NO.9所示；
AEcpSSR11反向引物如序列表中SEQ ID NO.10所示；
AEcpSSR12正向引物如序列表中SEQ ID NO.11所示；
AEcpSSR12反向引物如序列表中SEQ ID NO.12所示；
AEcpSSR15正向引物如序列表中SEQ ID NO.13所示；
AEcpSSR15反向引物如序列表中SEQ ID NO.14所示；
AEcpSSR22正向引物如序列表中SEQ ID NO.15所示；
AEcpSSR22反向引物如序列表中SEQ ID NO.16所示；
AEcpSSR24正向引物如序列表中SEQ ID NO.17所示；
AEcpSSR24反向引物如序列表中SEQ ID NO.18所示；
AEcpSSR27正向引物如序列表中SEQ ID NO.19所示；
AEcpSSR27反向引物如序列表中SEQ ID NO.20所示；
AEcpSSR28正向引物如序列表中SEQ ID NO.21所示；
AEcpSSR28反向引物如序列表中SEQ ID NO.22所示；
AEcpSSR31正向引物如序列表中SEQ ID NO.23所示；
AEcpSSR31反向引物如序列表中SEQ ID NO.24所示。
上述的黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物，利用黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物进行黄秋葵品种亲缘关系分析的方法，按下述步骤进行：
(1)提取被测黄秋葵品种的基因组DNA；
(2)将所述的黄秋葵多态性标记引物和所述基因组DNA混合并进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3)将所述扩增产物经采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染检测和拍照采集电泳图像，在同一电泳迁移位置上，若有DNA扩增条带记为“1”，若无DNA扩增条带记为“0”，统计结果；
(4)对所述结果进行亲缘关系分析。
前述的黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物，所述PCR扩增体系包括：1μL 10×Buffer[200mM Tris–HCl(pH 8.8)，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgCl2，1％TritonX-100]，0.8μL dNTPs(10mmol/L)，上、下游引物各1μL，0.5μL Taq酶(2U/μL),1μL模板DNA(50ng/μL)，4.7μL ddH2O；所述PCR扩增体系的总体积为10μL。
前述的黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物，所述PCR扩增的步骤包括：
94℃预变性5min；
94℃变性45s，不同引物Tm值复性45s，72℃延伸1.5min，35个循环；
72℃延伸10min。
前述的黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物，所述非变性聚丙烯酰胺凝胶的质量分数为8％。
前述的黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物，所述亲缘关系的分析方法是将整理好的0/1原始矩阵数据输入NTSYS-pc 2.10e软件，计算不同黄秋葵品种样品之间的遗传相似系数，基于非加权组平均法构建遗传关系聚类树图，进行亲缘关系分析。
前述的黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物的黄秋葵品种分子鉴定的方法，所述方法包括：
(1)提取被测相似黄秋葵品种的样品总基因组DNA；
(2)以步骤(1)中提取的样品DNA为模板，以多态性标记引物为PCR扩增引物，进行PCR扩增；
(3)对步骤(2)的PCR产物进行8％非变性聚丙烯凝胶电泳检测，获得待测样品的DNA指纹图谱；
(4)对步骤(3)中样品的DNA指纹图谱进行带型统计，通过特定电泳条带的比对判定，进行被测黄秋葵品种的快速鉴定。
前述的黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物的黄秋葵品种分子鉴定的方法，所述的相似黄秋葵品种包括‘丹指’、‘小露丝’、‘翠指’、‘白果全叶’和‘纤指’5个品种。
前述的黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物的黄秋葵品种分子鉴定的方法，所述的12对多态性标记引物中有4对引物扩增出了2个黄秋葵品种的特异性DNA电泳条带，依据这些特异性电泳条带即可进行目标黄秋葵品种的快速分子鉴定，具体包括：
(1)所述的多态性标记引物AEcpSSR11为扩增引物，对5个相似黄秋葵品种进行PCR扩增，扩增出了‘丹指’品种的特异性DNA条带，其分子量分别为150bp，命名为AEcpSSR11-150；
(2)所述的多态性标记引物AEcpSSR28为扩增引物，对5个相似黄秋葵品种进行PCR扩增，扩增出了‘丹指’品种的特异性DNA条带，其分子量分别为187bp，命名为AEcpSSR28-187；
(3)所述的多态性标记引物AEcpSSR31为扩增引物，对5个相似黄秋葵品种进行PCR扩增，扩增出了‘丹指’品种的特异性DNA条带，其分子量分别为165bp，命名为AEcpSSR31-165；
(4)所述的多态性标记引物AEcpSSR15为扩增引物，对5个相似黄秋葵品种进行PCR扩增，扩增出了‘纤指’品种的特异性DNA条带，其分子量分别为192bp，命名为AEcpSSR15-192；
上述多态性标记引物分别扩增出了特定黄秋葵品种的特异性DNA条带，而在其他黄秋葵品种中同一迁移位点处没有电泳条带出现；依据这些特异性DNA条带即可完成目标黄秋葵品种的快速分子鉴定。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明利用黄秋葵叶绿体基因组序列开发的cpSSR分子标记探索了黄秋葵种内叶绿体DNA的多态性。叶绿体是植物细胞质中特有的细胞器，所以叶绿体基因组的序列变异有助于区分开不同植物细胞质基因型，基于黄秋葵叶绿体基因组上的DNA序列筛选出来的叶绿体微卫星分子标记，具有细胞核基因组微卫星分子标记的共显性、高度变异和多态性等特点。多态性引物cpSSR标记主要分布于叶绿体基因组的非编码区，而叶绿体DNA的非编码区序列在种类或种群间也存在遗传变异，由于叶绿体基因组DNA的单亲遗传模式、且不易发生重组的特点，使cpSSR标记具有结构简单、多拷贝及分子量小等特点，使得该黄秋葵叶绿体微卫星分子标记的多态性引物能够全面的反映黄秋葵的遗传信息，可用于黄秋葵的种质资源亲缘关系分析、品种鉴定等相关研究，由此提供了关于黄秋葵细胞核DNA之外的其他物质用于鉴定黄秋葵的种质资源的方法，解决了黄秋葵资源鉴定中的不全面问的问题，可以对黄秋葵种质资源的准确区分和鉴定，进行良种选育和遗传改良。
附图说明
图1是5个黄秋葵品种(‘丹指’、‘小露丝’、‘翠指’、‘白果全叶’和‘纤指’)的UPGMA聚类树图；
图2运用黄秋葵cpSSR多态性标记引物AEcpSSR11对5个相似黄秋葵品种的20个样品进行PCR扩增，获得的具有‘丹指’品种特异性DNA条带的电泳图(箭头所指的条带是‘丹指’品种样品特有的DNA条带，分子量为150bp，命名为AEcpSSR11-150)。其中，M为DNA分子量标准20bp DNA ladder(TAKARA)，相应长度大小(bp)已在左侧标出；通道1～4：‘丹指’；5～8：‘小露丝’；9～12：‘翠指’；13～16：‘白果全叶’；17～20：‘纤指’；
图3运用黄秋葵cpSSR多态性标记引物AEcpSSR28对5个相似黄秋葵品种的20个样品进行PCR扩增，获得的具有‘丹指’品种特异性DNA条带的电泳图(箭头所指的条带是‘丹指’品种样品特有的DNA条带，分子量为187bp，命名为AEcpSSR28-187)。其中，M为DNA分子量标准20bp DNA ladder(TAKARA)，相应长度大小(bp)已在左侧标出；通道1～4：‘丹指’；5～8：‘小露丝’；9～12：‘翠指’；13～16：‘白果全叶’；17～20：‘纤指’；
图4运用黄秋葵cpSSR多态性标记引物AEcpSSR31对5个相似黄秋葵品种的20个样品进行PCR扩增，获得的具有‘丹指’品种特异性DNA条带的电泳图(箭头所指的条带是‘丹指’品种样品特有的DNA条带，分子量为165bp，命名为AEcpSSR31-165)。其中，M为DNA分子量标准20bp DNA ladder(TAKARA)，相应长度大小(bp)已在左侧标出；通道1～4：‘丹指’；5～8：‘小露丝’；9～12：‘翠指’；13～16：‘白果全叶’；17～20：‘纤指’；
图5运用黄秋葵cpSSR多态性标记引物AEcpSSR15对5个相似黄秋葵品种的20个样品进行PCR扩增，获得的具有‘纤指’品种特异性DNA条带的电泳图(箭头所指的条带是‘纤指’品种样品特有的DNA条带，分子量为192bp，命名为AEcpSSR15-192)。其中，M为DNA分子量标准20bp DNA ladder(TAKARA)，相应长度大小(bp)已在左侧标出；通道1～4：‘丹指’；5～8：‘小露丝’；9～12：‘翠指’；13～16：‘白果全叶’；17～20：‘纤指’。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
实施例1：黄秋葵叶绿体微卫星分子标记多态性引物(cpSSR)获得：
(1)叶绿体微卫星分子标记序列筛选
从GenBank数据库中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载黄秋葵(Abelmoschus esculentus)叶绿体基因组全序列(NC_035234)，对黄秋葵叶绿体基因组全序列进行分析，筛选叶绿体微卫星分子序列。利用MISA perl脚本软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)搜索黄秋葵叶绿体基因组中分布的SSR位点(simple sequencerepeats,SSR)，参数设定分别为：单核苷酸重复序列(mononucleotide)，重复单元大于等于10；二核苷酸重复序列(dinucleotides)，重复单元大于等于5；三核苷酸重复序列(trinucleotides)，重复单元大于等于4；四(tetranucleotide)、五(pentanucleotide)、六(hexanucleotide)核苷酸重复序列，重复单元大于等于3。在每个微卫星分子位点的上下游侧翼序列各为150bp。
(2)叶绿体微卫星分子标记的引物设计及多态性引物筛选
基于上述所获得的叶绿体微卫星分子序列，利用Primer Premier 3软件进行cpSSR引物设计，引物设计参数原则：引物长度为18–24个碱基，优选22个碱基，退火温度为55℃±5℃，预期扩增产物大小尽可能集中在100–300bp左右。设计合成出32对黄秋葵cpSSR引物，并在这32对引物中筛选出本发明的12对多态性引物。如表1所示。
表1黄秋葵叶绿体微卫星分子标记的多态性引物信息
Figure BDA0001894584870000081
Figure BDA0001894584870000091
采用该黄秋葵cpSSR分子标记的多态性引物进行黄秋葵遗传多样性分析和分子鉴定时，采用了包括5个黄秋葵品种的20份样品材料。具体信息见表2。
表2供试的黄秋葵品种样品材料信息
品种名称 样品编号 取样数量 形态学特征
丹指 丹指-1～丹指4 4 红色果实，正常叶
小露丝 小露丝-1～小露丝-4 4 红色果实，矮生，裂叶
翠指 翠指-1～翠指-4 4 翠绿色果实，正常叶
白果全叶 白果全叶-1～白果全叶-4 4 浅绿色果实，全叶
纤指 纤指-1～纤指-4 4 绿色果实，正常叶
PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)扩增
PCR扩增体系包括：1μL 10×Buffer[200mM Tris–HCl(pH 8.8)，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgCl2，1％TritonX-100]，0.8μL dNTPs(10mmol/L)，上、下游引物各1μL，0.5μL Taq酶(2U/μL),1μL模板DNA(50ng/μL)，4.7μL ddH2O。所述PCR扩增体系的总体积为10μL。扩增产物在Eppendorf AG22331 Hamburg型PCR扩增仪上进行PCR扩增反应。
PCR程序为：94℃预变性5min；35个循环(94℃变性45s；不同引物Tm值复性45s；72℃延伸1.5min)；最后72℃延伸10min。
电泳检测：PCR扩增产物采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳(PAGE)进行检测，具体操作步骤如下：
①玻璃板清洗及组装
首先用去污剂反复擦洗玻璃板，之后用流水冲洗玻璃板，然后用无尘纸擦拭干净备用。随后，用夹子固定对应两块平口与凹口玻璃板，凹口玻璃板朝外，水平置于凝胶板上。
②胶液制备
以做两块胶为例，40％丙烯酰胺储备液(丙烯酰胺190g，亚甲双丙烯酰胺10g，定容500mL)80mL，5×TBE 80mL，ddH2O 240mL，10％过硫酸铵800μL，TEMED 100μL。将上述试剂按比例加入烧杯中，用磁力搅拌器搅拌均匀。
③灌胶
将均匀的聚丙烯酰胺胶液，沿凹口与平口玻璃板口处缓缓倒入，若灌入的胶液不小心出现气泡，可以专用的针头驱赶。待胶液在两块玻璃板间分布均匀时，在凹口与平口玻璃板间轻轻插入梳子，平口玻璃板朝下水平放置，直到聚丙烯酰胺胶液完全凝固。
④点样与电泳
a.在胶液完全凝固后，松开夹子，将胶连同玻璃板移至电泳槽上。然后，用夹子夹紧，于电泳槽里加上预先稀释好的1×TBE电泳缓冲液。拔掉梳子，并用专用枪头清理点样孔附近的碎胶，然后进行预电泳，180V恒压电泳10min。
b.将PCR产物与适量6×Loading buffer(36％蔗糖、30mM EDTA、0.05％溴酚蓝、0.05％二甲苯青FF)混匀后，每个点样孔加入5μL左右样品。在样品点样孔两端预留两个点样孔，加入3μL标准DNAmarker(20bp DNA ladder,TAKARA)。然后，180V恒压电泳，待PCR产物中含有的二甲苯青FF跑至凝胶板3/4处时，停止电泳。
⑤银染与显色
电泳结束后，从胶板上部一侧小心剥开平口和凹口两块玻璃板，将附着胶的玻璃板放入事先准备好的去离子水中，利用水的浮力与胶自身的重力使凝胶从玻璃板上滑落，用去离子水漂洗约5–10min。之后将凝胶放于1000mL染色液(0.1％AgNO3)的染色盘中，于水平摇床上轻轻震荡染色8–10min。将银染后的凝胶，放于盛有ddH2O的漂洗盘中清洗，大约持续10s，立即放入1000mL的显色液(15gNaOH、0.190g四硼酸钠和1.25mL甲醛)。水平摇床轻轻摇至黄色条带清晰出现；将胶放入1000mL去离子水中漂洗3min。拍照记录。
数据统计：统计每一个样品扩增的DNA条带数量及其多态性，利用Quantity one软件及人工辅助判读的方法进行电泳图拷带。在同一电泳迁移位置上，有DNA扩增条带记作“l”，无条带记作“0”。同时，参照DNA marker片段大小，判断扩增产物的DNA片段大小。
(3)引物多态性分析结果
通过PCR扩增，发现12对叶绿体微卫星分子标记的引物具有多态性，如序列表中SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.24所示的黄秋葵叶绿体微卫星分子标记的多态性引物。引物PCR扩增产物的片段位于140-400bp之间，引物的平均多态性百分比51.92％。引物的具体多态性条带信息见表3。
表3为12对cpSSR引物的遗传多态性统计
Figure BDA0001894584870000111
叶绿体微卫星分子标记主要分布于叶绿体基因组的非编码区，在种内或种群间存在较好的遗传变异，其结构简单、多拷贝及分子量小，不但有细胞核基因组微卫星分子标记的共显性、高度变异和多态性等特点，还具有叶绿体基因组DNA的单亲遗传模式、且不易发生重组的特点。因此，本发明提供的黄秋葵叶绿体微卫星分子标记的多态性引物能够全面的反映黄秋葵的遗传信息，可用于黄秋葵的种质资源亲缘关系分析、品种鉴定等相关研究。
实施例2：本实施例提供一种利用实施例1提供的叶绿体微卫星分子标记的多态性引物进行黄秋葵品种亲缘关系分析的方法，具体如下：
样品：在本发明实施例1提供的5个黄秋葵品种的20份样品材料，并提取20份供试样品的总基因组DNA，以检测黄秋葵叶绿体微卫星分子标记的多态性引物在黄秋葵不同品种中的通用性。
以实施例1提供的黄秋葵叶绿体微卫星分子标记的多态性引物为PCR扩展引物，对20个样品的总基因组DNA进行PCR扩增。将扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝聚电泳分离，在同一位点上有DNA电泳条带记为“1”，若无DNA电泳条带记为“0”，将统计结果在excel表格中形成0,1矩阵。将整理好的0/1原始矩阵数据输入NTSYS-pc2.10e软件，计算样品间的遗传相似系数(SM，simple matching coefficie)，基于非加权组平均法(UPGMA，unweightedpair group method with an arithmetic mean)进行聚类分析。
结果表明，12对黄秋葵叶绿体微卫星分子标记的多态性引物在5个黄秋葵品种的20份样品材料中进行扩增，均获得了多态性条带，说明这些黄秋葵叶绿体微卫星分子标记的多态性引物在黄秋葵品种中具有较好的通用性，可以用于黄秋葵品种的相关研究。
结果又表明，基于UPGMA的聚类树图(见图1)，在遗传相似性系数0.65处，20份样品可以聚类为2大类。其中组I包括‘丹指’的所有样品；组II相对比较复杂，又可以分为4个亚组(II-1，II-2，II-3和II-4)，其中II-1包含‘小露丝’的所有样品，组II-2包括了‘翠指’的所有样品，II-3包含‘白果全叶’的所有样品，‘纤指’的4个样品则聚为II-4组。由图1可见，来自同一种黄秋葵品种的所有样品倾向于聚在一起。另外，‘丹指’品种与其他四个黄秋葵品种的亲缘关系较远，‘白果全叶’与‘纤指’的亲缘关系最近。因此，根据聚类树图(见图1)可以判断不同黄秋葵品种之间的亲缘关系。这一结果为黄秋葵的分子辅助育种奠定了重要基础。
本发明利用黄秋葵叶绿体微卫星分子标记的多态性引物进行黄秋葵品种亲缘关系的鉴定。叶绿体微卫星分子标记不但具有和基因组SSR标记的共显性、多态性高、等位点多等优点，同时还具备叶绿体基因组的进化速度慢、分子量小、相对保守、结构简单和单亲遗传等特点。因此，本发明提供的鉴定黄秋葵品种亲缘关系的方法能够全面地反映不同黄秋葵品种的亲缘关系。当然，也可将叶绿体微卫星分子标记与细胞核DNA分子标记综合运用，能够更进一步全面、准确、客观反映物种细胞质和细胞核内的亲缘关系。
实施例3：本实施例提供一种利用实施例1提供的黄秋葵叶绿体微卫星分子标记的多态性引物进行黄秋葵品种分子鉴定的方法。具体如下：
(1)提取被测黄秋葵品种的样品总基因组DNA；
(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，以实施例1提供的黄秋葵叶绿体微卫星分子标记的多态性引物为PCR扩增引物分别进行PCR扩增；
(3)对步骤(2)的PCR产物进行8％非变性聚丙烯凝胶电泳检测，获得待测样品的DNA指纹图谱；
(4)对步骤(3)中样品的DNA指纹图谱进行带型统计，通过特定电泳条带的比对判定，即可鉴定待测黄秋葵品种。
结果发现，有4对cpSSR引物扩增出了特定黄秋葵品种样品的特异性扩增条带，而在其他黄秋葵品种中同一迁移位点处没有电泳条带出现。其中，AEcpSSR11、AEcpSSR28和AEcpSSR31引物分别扩增出了‘丹指’品种的特异性DNA条带，其分子量分别为150bp、187bp和165bp，分别命名为AEcpSSR11-150(见图2箭头所示)、AEcpSSR28-187(见图3箭头所示)和AEcpSSR31-165(见图4箭头所示)，另外，AEcpSSR15引物扩增出了长度为192bp的‘纤指’品种的特异性DNA条带，命名为AEcpSSR15-192(见图5箭头所示)。
上述cpSSR多态性标记引物(AEcpSSR11、AEcpSSR28、AEcpSSR31和AEcpSSR15)分别扩增出了特定黄秋葵品种(‘丹指’和‘纤指’)的特异性DNA条带，而在其他黄秋葵品种中同一位点处没有DNA电泳条带出现。依据这些特异性DNA条带即可完成目标黄秋葵品种的快速分子鉴定。
12对黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物序列信息：
SEQ ID NO.1
AEcpSSR1F：5’-TCCAATAAAACGAAATCAAACTCA-3’
SEQ ID NO.2
AEcpSSR1R：5’-AAAGGAGCAATAACCAATTTCTTG-3’
SEQ ID NO.3
AEcpSSR3F：5’-AAAAGTGGAATACTCGGCCA-3’
SEQ ID NO.4
AEcpSSR3R：5’-GGGACGAATTTGGTATTTGG-3’
SEQ ID NO.5
AEcpSSR4F：5’-GGAAGAAAAAGCCTCAATAAGAA-3’
SEQ ID NO.6
AEcpSSR4R：5’-CGGGTTATTTGAAGATGCAAG-3’
SEQ ID NO.7
AEcpSSR10F：5’-TCGAAGTGGATTTCTCGACC-3’
SEQ ID NO.8
AEcpSSR10R：5’-CCTCCCCCTCCATCAACTA-3’
SEQ ID NO.9
AEcpSSR11F：5’-CCCGCCAACAGTCAAGTAAT-3’
SEQ ID NO.10
AEcpSSR11R：5’-CGGATCGACTTCCAGATCAT-3’
SEQ ID NO.11
AEcpSSR12F：5’-GGGGATACACGACAGAAGGA-3’
SEQ ID NO.12
AEcpSSR12R：5’-ACAGAGATGGTGCGATTTGA-3’
SEQ ID NO.13
AEcpSSR15F：5’-GCTCTTAGATCCGTGCGACT-3’
SEQ ID NO.14
AEcpSSR15R：5’-TTGGTGAGACTTCTTCCGGT-3’
SEQ ID NO.15
AEcpSSR22F：5’-TGCTGAAGGTTCAAAATCCA-3’
SEQ ID NO.16
AEcpSSR22R：5’-TGGACCTTTTGAATAACAGTCG-3’
SEQ ID NO.17
AEcpSSR24F：5’-CGAAATGGAGTGGCCTTTTA-3’
SEQ ID NO.18
AEcpSSR24R：5’-GAGTTACGGGGCGTAAAACA-3’
SEQ ID NO.19
AEcpSSR27F：5’-GCGTCGATTGGCTCTATTTC-3’
SEQ ID NO.20
AEcpSSR27R：5’-GAACAGGGAGTATCTCATTCCA-3’
SEQ ID NO.21
AEcpSSR28F：5’-CGCTCAATGAGAAAATGGGT-3’
SEQ ID NO.22
AEcpSSR28R：5’-ATCAATCCCTTTCCTTTGCC-3’
SEQ ID NO.23
AEcpSSR31F：5’-CGTCGACCAATCCTTCCTAA-3’
SEQ ID NO.24
AEcpSSR31R：5’-TTTCTTGTCTTTCCTGACCGA-3’
Figure BDA0001894584870000161
Figure BDA0001894584870000171
Figure BDA0001894584870000181
Figure BDA0001894584870000191
Figure BDA0001894584870000201
Figure BDA0001894584870000211
Figure BDA0001894584870000221
Figure BDA0001894584870000231
Figure BDA0001894584870000241
Figure BDA0001894584870000251
Figure BDA0001894584870000261

Claims (9)

1.黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物，其特征在于，包括12对引物，其引物序列信息如下：
AEcpSSR1正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；
AEcpSSR1反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；
AEcpSSR3正向引物如序列表中SEQ ID NO.3所示；
AEcpSSR3反向引物如序列表中SEQ ID NO.4所示；
AEcpSSR4正向引物如序列表中SEQ ID NO.5所示；
AEcpSSR4反向引物如序列表中SEQ ID NO.6所示；
AEcpSSR10正向引物如序列表中SEQ ID NO.7所示；
AEcpSSR10反向引物如序列表中SEQ ID NO.8所示；
AEcpSSR11正向引物如序列表中SEQ ID NO.9所示；
AEcpSSR11反向引物如序列表中SEQ ID NO.10所示；
AEcpSSR12正向引物如序列表中SEQ ID NO.11所示；
AEcpSSR12反向引物如序列表中SEQ ID NO.12所示；
AEcpSSR15正向引物如序列表中SEQ ID NO.13所示；
AEcpSSR15反向引物如序列表中SEQ ID NO.14所示；
AEcpSSR22正向引物如序列表中SEQ ID NO.15所示；
AEcpSSR22反向引物如序列表中SEQ ID NO.16所示；
AEcpSSR24正向引物如序列表中SEQ ID NO.17所示；
AEcpSSR24反向引物如序列表中SEQ ID NO.18所示；
AEcpSSR27正向引物如序列表中SEQ ID NO.19所示；
AEcpSSR27反向引物如序列表中SEQ ID NO.20所示；
AEcpSSR28正向引物如序列表中SEQ ID NO.21所示；
AEcpSSR28反向引物如序列表中SEQ ID NO.22所示；
AEcpSSR31正向引物如序列表中SEQ ID NO.23所示；
AEcpSSR31反向引物如序列表中SEQ ID NO.24所示。
2.根据权利要求1所述的黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物，其特征在于，利用黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物进行黄秋葵品种亲缘关系分析的方法，按下述步骤进行：
(1)提取被测黄秋葵品种的基因组DNA；
(2)将所述的黄秋葵多态性标记引物和所述基因组DNA混合并进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3)将所述扩增产物经采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染检测和拍照采集电泳图像，在同一电泳迁移位置上，若有DNA扩增条带记为“1”，若无DNA扩增条带记为“0”，统计结果；
(4)对所述结果进行亲缘关系分析。
3.根据权利要求2所述的黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物，其特征在于，所述PCR扩增体系包括：1μL 10×Buffer[200mM Tris–HCl(pH 8.8)，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgCl2，1％TritonX-100]，0.8μL dNTPs(10mmol/L)，上、下游引物各1μL，0.5μL Taq酶(2U/μL),1μL模板DNA(50ng/μL)，4.7μL ddH2O；所述PCR扩增体系的总体积为10μL。
4.根据权利要求2所述的黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物，其特征在于，所述PCR扩增的步骤包括：
94℃预变性5min；
94℃变性45s，不同引物Tm值复性45s，72℃延伸1.5min，35个循环；
72℃延伸10min。
5.根据权利要求2所述的黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物，其特征在于，所述非变性聚丙烯酰胺凝胶的质量分数为8％。
6.根据权利要求2所述的黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物，其特征在于，所述亲缘关系的分析方法是将整理好的0/1原始矩阵数据输入NTSYS-pc 2.10e软件，计算不同黄秋葵品种样品之间的遗传相似系数，基于非加权组平均法构建遗传关系聚类树图，进行亲缘关系分析。
7.根据权利要求1所述的黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物的品种分子鉴定方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提取被测相似黄秋葵品种的样品总基因组DNA；
(2)以步骤(1)中提取的样品DNA为模板，以多态性标记引物为PCR扩增引物，进行PCR扩增；
(3)对步骤(2)的PCR产物进行8％非变性聚丙烯凝胶电泳检测，获得待测样品的DNA指纹图谱；
(4)对步骤(3)中样品的DNA指纹图谱进行带型统计，通过特定电泳条带的比对判定，进行被测黄秋葵品种的快速鉴定。
8.根据权利要求7所述的黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物的品种分子鉴定方法，其特征在于，所述的相似黄秋葵品种包括‘丹指’、‘小露丝’、‘翠指’、‘白果全叶’和‘纤指’5个品种。
9.根据权利要求7所述的黄秋葵叶绿体微卫星多态性标记引物的品种分子鉴定方法，其特征在于，所述的12对多态性标记引物中有4对引物扩增出了2个黄秋葵品种的特异性DNA电泳条带，依据这些特异性电泳条带即可进行目标黄秋葵品种的快速分子鉴定，具体包括：
(1)所述的多态性标记引物AEcpSSR11为扩增引物，对5个相似黄秋葵品种进行PCR扩增，扩增出了‘丹指’品种的特异性DNA条带，其分子量分别为150bp，命名为AEcpSSR11-150；
(2)所述的多态性标记引物AEcpSSR28为扩增引物，对5个相似黄秋葵品种进行PCR扩增，扩增出了‘丹指’品种的特异性DNA条带，其分子量分别为187bp，命名为AEcpSSR28-187；
(3)所述的多态性标记引物AEcpSSR31为扩增引物，对5个相似黄秋葵品种进行PCR扩增，扩增出了‘丹指’品种的特异性DNA条带，其分子量分别为165bp，命名为AEcpSSR31-165；
(4)所述的多态性标记引物AEcpSSR15为扩增引物，对5个相似黄秋葵品种进行PCR扩增，扩增出了‘纤指’品种的特异性DNA条带，其分子量分别为192bp，命名为AEcpSSR15-192；
上述多态性标记引物分别扩增出了特定黄秋葵品种的特异性DNA条带，而在其他黄秋葵品种中同一迁移位点处没有电泳条带出现；依据这些特异性DNA条带即可完成目标黄秋葵品种的快速分子鉴定。
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