CN111041126B

CN111041126B - 用于鉴别新陆中系列棉花品种的多态性分子标记及其应用

Info

Publication number: CN111041126B
Application number: CN202010046584.1A
Authority: CN
Inventors: 薛飞; 李婧慧; 金彦龙; 孙杰; 刘峰; 张新宇; 王静
Original assignee: Shihezi University
Current assignee: Shihezi University
Priority date: 2020-01-16
Filing date: 2020-01-16
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2040-01-16
Also published as: CN111041126A

Abstract

本发明涉及一种用于鉴别新陆中系列棉花品种的多态性分子标记及其应用，属于分子检测技术领域，该发明利用筛选的29对多态性鉴别引物，实现了80种新陆中系列棉花品种的指纹图谱构建和分子鉴定，该29对引物具有多态性高、稳定性好、操作简单、准确性高、通用性好等优点；本发明仅需19对核心引物即可鉴别80种新陆中系列棉花品种。

Description

用于鉴别新陆中系列棉花品种的多态性分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，尤其涉及一种用于鉴别新陆中系列棉花品种的多态性分子标记及应用。

背景技术

棉花是富含纤维的重要经济作物，新疆是我国棉花的主要产区，以50％左右的种植面积贡献了近3/4的产量，在保障我国棉花生产安全中占有举足轻重的地位。近年来，随着棉花产业的快速发展，棉花种子市场“多、乱、混、杂”的现象日益严重，棉花品种同质化、品种套牌等问题突出，严重影响棉花产业的健康发展。此外，骨干亲本的反复利用及转基因技术在棉花育种中的应用导致品种间遗传差异越来越小，仅依据传统形态学手段鉴定品种的纯度和真实性耗时长、成本高、时效性差，且易受环境因素影响，难以满足品种鉴定需求。因此，加强检测技术创新，为种子质量鉴定提供高效技术手段极为必要。

分子标记技术的飞速发展成为品种鉴定和种子纯度真实性检测的新选择，以分子标记技术为基础的DNA指纹图谱，不仅可以鉴别棉花品种的真假，还可以分析棉花种质资源遗传多样性及亲缘关系等。目前关于新疆陆地棉品种指纹图谱的研究大多针对特早熟和早熟棉花品种，早中熟陆地棉品种的指纹图谱构建还有待完善。本发明选用80个新陆中棉花品种材料，利用SSR和InDel分子标记构建其指纹图谱，为今后棉花品种DNA指纹鉴定提供技术支持。

SSR(Simple Sequence Repeats，简单重复序列)标记是指：均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由2-6个核苷酸的串联重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富。InDel(Insertion-Deletion，插入缺失)标记是指：两种亲本中在全基因组中存在差异，相对另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失，从而根据基因组中插入缺失位点，设计一些扩增这些插入缺失位点的PCR引物。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题，而提供一种用于鉴别新陆中系列棉花品种的多态性分子标记及应用，以构建获得能够鉴别新陆中系列棉花品种的DNA指纹图谱，为新陆中系列棉花品种的分子检测和育种提供新的实用标记和方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明提供了一种鉴别新陆中系列棉花品种的多态性分子标记，所述多态性分子标记为由29对多态性鉴别引物中的一种或多种的组合引物组成，所述29对多态性鉴别引物的序列如下所示：

作为本发明进一步的优化方案，所述新陆中系列棉花品种为新陆中1-12、14-22、25-30、32-50、54-69、71-88号品种，对应的多态性分子标记为多态性标记特征引物或多态性标记组合引物，具体为：

鉴别新陆中1号品种的多态性标记组合引物为W01、HAU2786、NAU1233；

鉴别新陆中2号品种的多态性标记特征引物为DPL0757；

鉴别新陆中3号品种的多态性标记组合引物为HAU0732、W01；

鉴别新陆中4号品种的多态性标记特征引物为NAU1221；NAU1042；NAU1269；

鉴别新陆中5号品种的多态性标记组合引物为HAU0732、W01；HAU0732、JESPR0101；

鉴别新陆中6号品种的多态性标记组合引物为BNL3442、HAU2786；BNL3442、W01；

鉴别新陆中7号品种的多态性标记组合引物为JESPR0101、DPL0542；

鉴别新陆中8号品种的多态性标记特征引物为JESPR0065；

鉴别新陆中9号品种的多态性标记组合引物为DPL0542、NAU1233、MUCS0101；

鉴别新陆中10号品种的多态性标记组合引物为DPL0542、Lc_A07G2334；DPL0542、NAU5433；

鉴别新陆中11号品种的多态性标记组合引物为DPL0542、BNL3442；DPL0542、MUCS0101；

鉴别新陆中12号品种的多态性标记组合引物为JESPR0101、HAU2786、DPL0542、NAU1233；

鉴别新陆中14号品种的多态性标记组合引物为Lc_A07G2334、SWU1259、okra-195；

鉴别新陆中15号品种的多态性标记组合引物为NAU1103、NAU1233；HAU2786、NAU1233；

鉴别新陆中16号品种的多态性标记组合引物为NAU1167、W01、NAU5433、SWU1259；

鉴别新陆中17号品种的多态性标记组合引物为DPL0542、JESPR0101、W01；

鉴别新陆中18号品种的多态性标记组合引物为NAU1103、HAU2786；NAU1103、DPL0542；

鉴别新陆中19号品种的多态性标记组合引物为Lc_A07G2334、W01；

鉴别新陆中20号品种的多态性标记组合引物为NAU1103、W01；

鉴别新陆中21号品种的多态性标记组合引物为HAU2786、JESPR0101；HAU2786、DPL0542；

鉴别新陆中22号品种的多态性标记组合引物为W01、HAU2786、NAU1167；

鉴别新陆中25号品种的多态性标记组合引物为okra-195、NAU1167、HAU2786；

鉴别新陆中26号品种的多态性标记组合引物为JESPR0101、DPL0542、NAU1233；

鉴别新陆中27号品种的多态性标记组合引物为NAU1103、HAU2786；NAU1103、W01；

鉴别新陆中28号品种的多态性标记组合引物为W01、HAU0732；HAU2786、NAU1233；

鉴别新陆中29号品种的多态性标记组合引物为JESPR0101、okra-195、NAU1233；

鉴别新陆中30号品种的多态性标记组合引物为W01、HAU2786、Lc_A07G2334；

鉴别新陆中32号品种的多态性标记组合引物为W01、HAU2786；NAU1103、NAU1233；

鉴别新陆中33号品种的多态性标记特征引物为NAU2277；

鉴别新陆中34号品种的多态性标记组合引物为NAU1167、DPL0542；NAU1167、NAU1233；

鉴别新陆中35号品种的多态性标记组合引物为W01、Lc_A07G2334；

鉴别新陆中36号品种的多态性标记组合引物为W01、HAU2786、Lc_A07G2334；

鉴别新陆中37号品种的多态性标记组合引物为HAU2786、Lc_A07G2334；HAU2786、NAU5433；

鉴别新陆中38号品种的多态性标记组合引物为DPL0542、JESPR0101、okra-195；

鉴别新陆中39号品种的多态性标记组合引物为HAU2786、DPL0542、Lc_A07G2334；

鉴别新陆中40号品种的多态性标记组合引物为NAU1233、HAU2786、okra-195；

鉴别新陆中41号品种的多态性标记组合引物为NAU5433、JESPR0101；NAU5433、BNL3442；

鉴别新陆中42号品种的多态性标记组合引物为JESPR0101、okra-195、NAU0990；

鉴别新陆中43号品种的多态性标记组合引物为JESPR0101、NAU1103；

鉴别新陆中44号品种的多态性标记特征引物为DPL0542；

鉴别新陆中45号品种的多态性标记组合引物为NAU5120、NAU2697、HAU0732、NAU0990；

鉴别新陆中46号品种的多态性标记组合引物为HAU2786、okra-195、MUCS0101；

鉴别新陆中47号品种的多态性标记组合引物为DPL0542、NAU5099、HAU2786、Lc_A07G2334；

鉴别新陆中48号品种的多态性标记组合引物为okra-195、NAU1167、NAU1233；

鉴别新陆中49号品种的多态性标记组合引物为JESPR0101、DPL0542、HAU2786；

鉴别新陆中50号品种的多态性标记特征引物为fgGh_G0105；HAU2786；

鉴别新陆中54号品种的多态性标记组合引物为JESPR0101、HAU2786、W01；

鉴别新陆中55号品种的多态性标记组合引物为HAU2786、NAU1233、W01；

鉴别新陆中56号品种的多态性标记组合引物为JESPR0101、DPL0542、BNL3442；

鉴别新陆中57号品种的多态性标记组合引物为Lc_A07G2334、DPL0542；JESPR0101、HAU2786；

鉴别新陆中58号品种的多态性标记特征引物为NAU6094；

鉴别新陆中59号品种的多态性标记组合引物为DPL0542、Lc_A07G2334、HAU2786；

鉴别新陆中60号品种的多态性标记组合引物为Lc_A07G2334、okra-195、NAU1042；

鉴别新陆中61号品种的多态性标记组合引物为Lc_A07G2334、okra-195；

鉴别新陆中62号品种的多态性标记特征引物为Lc_A07G2334；

鉴别新陆中63号品种的多态性标记特征引物为NAU1369；

鉴别新陆中64号品种的多态性标记组合引物为Lc_A07G2334、NAU1103；

鉴别新陆中65号品种的多态性标记组合引物为HAU2786、DPL0542、okra-195；

鉴别新陆中66号品种的多态性标记组合引物为NAU1167、DPL0542、HAU2786；

鉴别新陆中67号品种的多态性标记组合引物为NAU1233、HAU2786、W01；

鉴别新陆中68号品种的多态性标记组合引物为NAU1233、okra-195、HAU27866；

鉴别新陆中69号品种的多态性标记特征引物为NAU2697；

鉴别新陆中71号品种的多态性标记组合引物为DPL0542、HAU0732、NAU1042、HAU2786；

鉴别新陆中72号品种的多态性标记组合引物为Lc_A07G2334、HAU2786、DPL0542、NAU5099；

鉴别新陆中73号品种的多态性标记组合引物为Lc_A07G2334、HAU2786、NAU1103；

鉴别新陆中74号品种的多态性标记组合引物为Lc_A07G2334、W01、NAU1042；

鉴别新陆中75号品种的多态性标记组合引物为Lc_A07G2334、W01、NAU1233；

鉴别新陆中76号品种的多态性标记组合引物为Lc_A07G2334、HAU2786、W01、NAU1167；

鉴别新陆中77号品种的多态性标记特征引物为NAU1369；JESPR0251；

鉴别新陆中78号品种的多态性标记特征引物为HAU2349；

鉴别新陆中79号品种的多态性标记特征引物为Lc_A07G2334；BNL3442；

鉴别新陆中80号品种的多态性标记组合引物为Lc_A07G2334、HAU2786、okra-195、W01；

鉴别新陆中81号品种的多态性标记组合引物为Lc_A07G2334、JESPR0101；

鉴别新陆中82号品种的多态性标记组合引物为Lc_A07G2334、BNL3442；

鉴别新陆中83号品种的多态性标记组合引物为Lc_A07G2334、HAU2786；Lc_A07G2334、NAU5433；

鉴别新陆中84号品种的多态性标记组合引物为Lc_A07G2334、HAU2786、NAU5433；

鉴别新陆中85号品种的多态性标记组合引物为Lc_A07G2334、HAU2786、DPL0542；

鉴别新陆中86号品种的多态性标记组合引物为W01、Lc_A07G2334、MUCS0101；

鉴别新陆中87号品种的多态性标记特征引物为NAU1042；

鉴别新陆中88号品种的多态性标记组合引物为SWU1259、HAU2786；SWU1259、NAU1233。

本发明还提供了一种利用上述多态性分子标记鉴别80种新陆中系列棉花品种的方法，步骤包括：

(1)提取棉花DNA；

(2)利用所述多态性分子标记对棉花DNA进行PCR扩增，若为多态性组合引物，则按照组合引物中的先后顺序进行扩增，获得PCR产物；

(3)电泳检测PCR产物；

(4)结果鉴别：将具有特征引物带型或组合引物特征信息的品种与其他品种区分开，最终鉴别出相对应的品种。

上述结果鉴别的方式包括两种情况，分别为应用组合引物和应用特征引物进行PCR扩增、电泳后对结果进行鉴别，其中：

应用多态性标记特征引物进行PCR扩增、电泳后对结果进行鉴别的具体方法是：应用多态性标记特征引物对新陆中系列14个棉花品种DNA进行扩增、电泳，对特征引物电泳结果进行分析比较，将具有特征引物带型的新陆中品种与其他棉花品种区分开，最终鉴别出相对应的新陆中系列棉花品种；

应用多态性标记组合引物进行PCR扩增、电泳后对结果进行鉴别的具体方法是：按照组合引物中的先后顺序对新陆中系列66个棉花品种DNA进行扩增、电泳，对组合引物电泳结果进行分析比较，将具有组合引物特征信息的新陆中系列棉花品种与其他品种区分开，最终鉴别出相对应的新陆中系列棉花品种。

本发明还提供了一种利用上述多态性分子标记构建80种新陆中系列棉花品种指纹图谱的方法，包括以下步骤：

步骤一：提取80种新陆中系列棉花品种种子基因组DNA；

步骤二：利用多态性鉴别引物对80份棉花种子基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR产物；

步骤三：聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物；

步骤四：根据电泳检测结果分析获得各品种的指纹代码和唯一二维码，得到所述指纹图谱。

作为本发明进一步的优化方案，所述步骤四中，构建指纹图谱的方法包括：根据各多态性鉴别引物在各新陆中系列棉花品种中的带型，将相同带型进行归类，并用数字编码，获得各品种的数字指纹代码，即构建获得所述指纹图谱。

作为本发明进一步的优化方案，所述多态性鉴别引物为19对核心引物，分别为：HAU2786-DPL0542-W01-NAU1233-Lc_A07G2334-okra-195-NAU1103-NAU5433-BNL3442-JESPR0101-NAU1167-HAU0732-NAU1042-MUCS0101-SWU1259-NAU5099-NAU0990-NAU2697-NAU5120，可利用数字(如1-7)或字母等编码各引物的带型，获得该80个品种在19对核心引物下的指纹代码。

按照上述核心引物顺序，利用数字1-7编码各引物的带型，获得如下所示的80份新陆中系列棉花品种在上述19对核心引物下的十进制数字指纹代码：

本发明还提供了一种上述多态性分子标记在鉴别80份新陆中系列棉花品种中的应用。

本发明还提供了一种上述指纹代码在鉴别80份新陆中系列棉花品种中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种鉴别新陆中系列棉花品种的多态性分子标记及其应用，具体利用SSR和InDel分子标记技术来鉴别不同棉花品种，该技术不仅具备时效性强、操作简单、灵敏性强、DNA能够长久保存等优点，而且InDel标记准确性高、通用性强、变异稳定，避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊，本发明最少用19对核心引物即可鉴别出80个新陆中系列棉花品种。

附图说明

图1是引物HAU2786在80份新陆中系列棉花品种中的扩增结果，1-80分别代表新陆中1-12、14-22、25-30、32-50、54-69、71-88号品种，箭头所指为引物HAU2786在80份新陆中系列棉花品种中扩增出的不同等位基因位点，共扩增出6种不同的基因型，HAU2786标记为新陆中50号品种的特征引物；

图2是引物DPL0542在80份新陆中系列棉花品种中的扩增结果，1-80分别代表新陆中1-12、14-22、25-30、32-50、54-69、71-88号品种，箭头所指为引物DPL0542在80份新陆中系列棉花品种中扩增出的不同等位基因位点，共扩增出7种不同的基因型，DPL0542为新陆中44号的特征引物；

图3是引物NAU5433在80份新陆中系列棉花品种中的扩增结果，1-80分别代表新陆中1-12、14-22、25-30、32-50、54-69、71-88号品种，箭头所指为引物NAU5433在80份新陆中系列棉花品种中扩增出的不同等位基因位点，共扩增出4种不同的基因型。

具体实施方式

下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。

实施例1

1、材料

本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。

2、方法

本发明利用筛选出的多态性高、稳定性好、鉴别能力强的核心引物，以80份新陆中系列棉花品种为试验材料(表1)，构建新陆中系列棉花品种DNA指纹图谱，得到可用于鉴别80份新陆中系列棉花品种的分子标记。共计获得14个新陆中品种的特征引物(表2)、66个品种的组合引物(表3)。最少采用19对核心引物可将80个新陆中系列棉花品种完全区分，并构建出80个新陆中系列棉花品种在19对核心引物下的十进制数字指纹代码(表4)。

表1.80份新陆中系列棉花品种的名称、系谱来源、选育单位及选育时间

14种新陆中系列棉花品种的特征引物如下表2所示：

表2.14种新陆中系列棉花品种的特征引物

66种新陆中系列棉花品种的组合引物如下表3所示：

表3.66种新陆中系列棉花品种的组合引物

2.1、应用上述多态性分子标记鉴别80份新陆中系列棉花品种的具体方法如下：

2.1.1、棉花DNA提取

一、采用改良的SDS法进行棉花种子DNA的提取并进行浓度检测和质量检测

(1)剥壳：剥去棉种种皮外壳放入2mL离心管中并加入500μL ddH₂O浸泡6小时后将水倒去。

(2)研磨：加入150μL，65℃水浴后的SDS提取液(成分:1％SDS，0.01mol·L^-1 EDTA，0.705mol·L^-1NaCl，0.05mol·L^-1Tris，0.5％山梨醇，1％PVP，1％β-巯基乙醇)，每个离心管加入两个无锈钢珠并用漩涡振荡仪(转速：30r/s时间：40s)研磨打碎，粉碎后加入650μL水浴后的SDS提取液。

(3)核裂解：将离心管放入水浴锅中水浴，每隔10min振荡1次，共3次。用吸铁石吸出钢珠，将样品放入冰盒冰浴10min。取出、摇匀放入4℃离心机中12000rpm·min^-1离心10min。

(4)除蛋白：取650μL的上清转移至新的2mL离心管中，并加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，混匀至不分层，4℃12000rpm·min^-1离心10min，再取上清液与2mL离心管中，加入等体积的氯仿混匀至不分层，12000rpm·min^-1离心10min。

(5)沉淀DNA：转移上清液至新的1.5mL离心管，加等体积的预冷异丙醇，缓慢颠倒数次，可见清晰DNA絮状沉淀，静置5min于4℃冰箱中，12000rpm·min^-1离心6min，弃上清液。

(6)洗涤：用100μL 75％乙醇洗涤沉淀2次，每次离心5min，最后用100μL无水乙醇洗涤

(7)溶解：倒去乙醇后，将DNA自然晾干，加200μL ddH₂O溶解备用。

二、PCR扩增

应用上述29对核心引物对80份新陆中系列棉花品种DNA进行PCR扩增，PCR扩增体系如下：

选用20μL的PCR反应体系，包括10×Taq buffer(含有Mg²⁺)2.0μL，2.5mM dNTPs1.6μL，10μmol·L^-1上下游引物各1μL，Taq DNA聚合酶0.2μL(5U·μL^-1)，模板DNA 2.0μL，最后用ddH₂O补足。

PCR扩增过程在梯度PCR仪中进行，程序为：

94℃预变性3min；94℃变性处理30s、50-60℃退火处理30s和72℃延伸处理45s，共33个循环；72℃延伸10min；PCR扩增产物保存于4℃冰箱内备用。

应用组合引物与特征引物鉴别新陆中系列棉花品种的方法不同：应用组合引物鉴别，需要按照文中所述的组合引物的先后顺序进行PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析电泳结果，不断鉴别，最终才能得到鉴别出的对应的新陆中系列棉花品种；而应用特征引物鉴别，只需单独使用特征引物对新陆中系列棉花品种进行扩增、电泳，分析结果，就可以鉴别出相应的新陆中系列棉花品种。

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染检测

(1)相关试剂的配置：

10×TBE：

Tris：108g，

硼酸：55g，

EDTA：7.44g，

加1000mLddH₂O充分溶解。

8％原胶溶液：

丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺40％溶液(37.5:1)：200mL，

10×TBE：100mL，

ddH₂O：700mL。

10％APS(Ammonium persulfate)：

10g的过硫酸铵溶于100mL ddH₂O中，4℃保存备用。

电泳缓冲液(1×TBE)：

将100mL10×TBE加ddH₂O稀释至1000mL。

PAGE胶凝固液：

将400μL10％APS和40μL TEMED与40mL的8％原胶溶液混匀。

(2)8％非变性PAGE凝胶电泳：

1)制板：将水洗干净的方板和耳朵板平放好，用浸湿75％乙醇的脱脂棉花团擦拭玻璃板，待晾干后，将两块玻璃板扣在一起，并用胶带在玻璃板底部固定，用夹子夹紧。最后插进梳子并利用夹子来调节两块玻璃板合扣的松紧度，调整好后将梳子拔出放置于一旁；

2)灌胶：以单板胶为例：将比例为400μL 10％APS、40μL TEMED、40mL 8％PAGE胶溶液混匀后，缓慢倒入玻璃板中，倒胶时要严防出现气泡，平直插入梳子，等待胶液凝固；

3)点样：在20μL PCR扩增产物中加入4μL 5×Loading buffer轻轻震荡混匀；

4)电泳：电泳槽(JY-SPDT)上部缓冲液(1×TBE缓冲液)要覆盖凝胶但不宜过多，电泳槽底部倒入缓冲液。150V恒压电泳60-90min。

(3)银染

电泳结束后，进行染色。银染流程如下：

1)固定:胶板在摇床(TS-20000)上用固定液(10％C₂H₅OH、0.5％CH₃COOH)固定5-6min；

2)染色:胶板在摇床上用银染液(0.2％AgNO₃)染色6-8min；

3)水洗:ddH₂O水洗，不超过30s；

4)显影:将胶板置于显影液(1.5％NaOH、0.4％HCHO)中，并在摇床缓慢摇动直至条带显现；

5)水洗:ddH₂O水洗；

6)观察:胶片观察灯(ZHGP-70)统计带型并照相。

四、鉴别

利用所述分子标记构建80份新陆中系列棉花品种指纹图谱，用于鉴别。

本发明通过SSR标记和InDel标记技术，构建新陆中系列棉花品种DNA指纹图谱，利用NTSYS-pcV2.10软件，采用Jaccard系数计算出不同试验材料的遗传相似系数，并进行遗传多样性分析，寻求适用于鉴别新陆中系列棉花品种的一套条带清晰、多态性好、重复性高、辨别能力强的核心引物，为棉花分子检测和分子育种提供实用标记和理论依据，规范棉花种子市场，进而推动棉花产业健康发展。

以多态性分子标记HAU2786为例，按照上述步骤中的方法进行操作，得到电泳扩增图见图1：箭头所指的为引物HAU2786在80份新陆中系列棉花品种中扩增出的不同等位基因型：其中新陆中1、8、15、19、20、28、39、46、57、68、79、83、86、88号的指纹信息为000010011；新陆中2、37、40号的指纹信息为100100010；新陆中3、4、5、7、9、11、12、16、17、18、26、29、30、34、35、41、42、43、48、62、66、72、77、80、82、84、85号的指纹信息为100001001；新陆中6、21、32、55、58、63、65、78、87号的指纹信息为101001101；新陆中10、14、22、25、27、33、36、38、44、45、47、49、54、56、59、60、61、64、67、69、71、73、74、75、76、81号的指纹信息为001000001；新陆中50号的指纹信息为010000011。

不难得出，HAU2786标记引物电泳扩增结果图说明它可在80个新陆中系列棉花品种中扩增出6种不同等位基因型，且HAU2786对应的新陆中50号的指纹信息是唯一的，HAU2786为新陆中50号的特征引物。

其它引物等位基因型的确定及指纹信息读取方法与标记HAU2786的方法相同。例如图2所示，为另一引物DPL0542在80个新陆中系列棉花品种中的扩增结果，DPL0542对应的新陆中44号的指纹信息是唯一的，标记DPL0542为新陆中44号的特征引物；如图3所示，为另一引物NAU5433在80个新陆中系列棉花品种中的扩增结果。各引物对应的品种的指纹信息组成这80个新陆中系列棉花品种的指纹图谱。

鉴别80个新陆中系列棉花品种的方法按引物的不同可分为：应用组合引物或特征引物进行扩增、电泳进行鉴别两种。

组合引物的鉴别方法如下：

以鉴别新陆中1号品种为例。

其多态性标记组合引物为：W01、HAU2786、NAU1233。

第一步将提取的80个新陆中系列棉花品种的DNA样品分别加入编号为1-80的PCR扩增管，按如下PCR扩增体系进行PCR扩增。

PCR扩增体系

选用20μL的PCR反应体系：

10×Taq buffer(含有Mg²⁺)2.0μL，

2.5mM dNTPs 1.6μL，

10μmol·L^-1上下游引物各1μL，

Taq DNA聚合酶0.2μL(5U·μL^-1)，

模板DNA 2.0μL，

最后用ddH₂O补足。

PCR扩增程序：

在梯度PCR仪中进行

94℃预变性3min；94℃变性处理30S、53℃退火处理30s和72℃延伸处理45s，共33个循环；72℃延伸10min；降至16℃后，PCR扩增产物保存于4℃冰箱内备用

电泳步骤：

PCR扩增结束后对扩增产物采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离，电泳后分离开的扩增产物经银染显色后读取相应引物的PCR扩增条带并记录各DNA样品在相同引物下扩增产物的条带。

用W01引物对80个新陆中系列棉花品种进行的PCR扩增，其产物的电泳结果是以扩增条带分子量大小的不同为依据，可将80份新陆中系列棉花材料分为4类，第一类包括新陆中1、5、15、22、28、30、32、35、36号其扩增条带为110001(0代表为相应位置未扩增出条带，1代表相应位置扩增出条带)，第二类包括新陆中2、3、9、10、11、12、14、18、21、25、33、38、42、43、45、47、49、50、54、57、59、60、61、62、63、64、67、69、71、73、74、79、82、84、87号其扩增条带为000011，第三类包括新陆中4、7、8、16、17、19、26、29、34、37、39、40、41、44、46、48、55、56、58、65、66、68、72、76、77、80、81、83、85号其扩增条带为011001，第四类包括新陆中6、20、27、75、78、86、88号其扩增条带为000101。这样就可将新陆中1、5、15、22、28、30、32、35、36号先从80个新陆中系列棉花品种中区分开。

第二步将提取的新陆中1、5、15、22、28、30、32、35、36号的DNA样品分别加入编号为1-9的扩增管，采用与第一步中相同的方法进行扩增和电泳，只需将引物换为HAU2786，扩增程序的温度调为58℃，其他方法及步骤与第一步相同。分析电泳结果，新陆中1、15、28号扩增条带为000010011，新陆中5、30、35号扩增条带为100001001，新陆中32号扩增条带为101001101，新陆中22和36号为扩增条带001000001。这样就可将新陆中1、15、28号与其他新陆中系列棉花品种区分开。

第三步将提取的新陆中1、15、28号的DNA样品分别加入编号为1-3的扩增管，采用与第一步中相同的方法进行扩增和电泳，只需将引物换为NAU1233，扩增程序的温度调为53℃，其他方法及步骤与第一步相同。分析电泳结果可将两个新陆中品种分开，新陆中1号扩增条带0011，新陆中15号其扩增条带0101，新陆中28号其扩增条带0111。这样就可将新陆中1号与其他79份新陆中系列棉花品种区分开。

特征引物的鉴别方法如下：

以新陆中2号品种为例，其多态性标记特征性引物为DPL0757。将提取80个新陆中系列棉花品种的DNA样品分别加入编号为1-80的扩增管，采用与上述步骤中相同的方法进行PCR扩增和电泳，只需使用引物DPL0757，扩增程序的温度调为57℃，其他方法及步骤与上述步骤相同。分析电泳结果：使用引物DPL0757扩增后，电泳结果可将80个新陆中系列棉花品种区分为6类，第一类包括新陆中1、4、5、7、8、17、18、21、22、25、26、27、28、29、30、32、33、34、35、36、39、40、42、43、44、45、46、47、48、49、55、56、58、59、64、65、66、67、68、69、71、72、73、74、75、76、77、78、80、82和85号其扩增条带010(0代表为相应位置未扩增出条带，1代表相应位置扩增出条带)，第二类只有新陆中2号其扩增条带111，第三类包括新陆中3、6、9、10、11、12、14、15、16、19、20、37、38、41、50、54、57、60、61、62、63、79、81、83、84、86、87和88号其扩增条带001，这样就可最终确定出新陆中2号。

其他新陆中系列棉花品种的鉴定方法同上，只需将鉴别引物及其对应的扩增温度进行调换，其他步骤及方法同上。

五、编码

根据每对引物对不同新陆中系列品种DNA扩增带型，将相同带型归为一类，并用数字编码。例如标记引物HAU2786可在80个新陆中系列棉花品种中扩增出6种不同等位基因型，其中：新陆中1、8、15、19、20、28、39、46、57、68、79、83、86和88号的指纹信息为000010011，为HAU2786的第一种带型，利用数字1编码该带型；新陆中2、37和40号的指纹信息为100100010，为HAU2786的第二种带型，利用数字2编码该带型；新陆中新陆中3、4、5、7、9、11、12、16、17、18、26、29、30、34、35、41、42、43、48、62、66、72、77、80、82、84和85号的指纹信息为100001001，为HAU2786的第三种带型，利用数字3编码该带型；新陆中6、21、32、55、58、63、65、78和87号的指纹信息为101001101，为HAU2786的第四种带型，利用数字4编码该带型；新陆中10、14、22、25、27、33、36、38、44、45、47、49、54、56、59、60、61、64、67、69、71、73、74、75、76和81号的指纹信息为001000001，为HAU2786的第五种带型，利用数字5编码该带型；新陆中50号的指纹信息为010000011，为HAU2786的第六种带型，利用数字6编码该带型。

其它引物的带型确定及其编码方式同编码HAU2786的方法，且不同引物之间用“-”隔开，建立获得80个新陆中系列品种的指纹代码，即为80个新陆中系列品种的指纹图谱。

2.2、应用核心引物构建新陆中系列棉花品种核心引物指纹图谱，用于鉴别80个新陆中系列棉花品种的方法为：

2.2.1、核心引物的筛选

从上述29对多态性鉴别引物中选取扩增条带清晰、带型简单、多态性好的引物，作为构建80个新陆中系列棉花品种指纹图谱的核心引物。

共筛选获得19对核心引物，包括：

HAU2786-DPL0542-W01-NAU1233-Lc_A07G2334-okra-195-NAU1103-NAU5433-BNL3442-JESPR0101-NAU1167-HAU0732-NAU1042-MUCS0101-SWU1259-NAU5099-N AU0990-NAU2697-NAU5120。

2.2.2、核心引物PCR及电泳检测

依次用上述19对核心引物对80个新陆中系列棉花品种进行PCR扩增和电泳检测。

2.2.3、80个新陆中系列棉花品种核心引物特征指纹图谱的构建

对电泳结果进行分析，利用NTSYS-pcV2.10软件进行数据分析，选择清晰可辨的电泳条带，样品有带记为1，无带记为0，获得该引物对应的各品种的指纹信息；利用Jaccard系数计算出不同试验材料的遗传相似系数，并进行遗传多样性分析。

得到每对引物对应的80个新陆中系列棉花品种的带型，将相似带型进行归类，并用数字编码，且不同引物之间用“-”隔开，建立获得80个新陆中系列棉花品种的核心基因的指纹代码。

如本实施例中，按照引物顺序：

HAU2786-DPL0542-W01-NAU1233-Lc_A07G2334-okra-195-NAU1103-NAU5433-BNL34 42-JESPR0101-NAU1167-HAU0732-NAU1042-MUCS0101-SWU1259-NAU5099-NAU0990-NAU2697-NAU5120进行编码获得的各品种核心引物的指纹代码如下表所示，得到的指纹代码即为该品种的核心指纹图谱，如下表4所示。

表4.80份新陆中系列棉花品种的19对核心引物的十进制数字指纹代码

由上表可以看出，任意两个品种的DNA指纹图谱都不相同，差异引物数目均在1个以上，可用于鉴别80种新陆中系列棉花品种，且所对应的指纹代码是该品种所特有的。

本发明通过SSR标记和InDel标记的结合，构建新陆中系列棉花品种DNA指纹图谱，以寻求适用于新陆中系列棉花品种的一套条带清晰、多态性好、重复性高、辨别能力强的核心引物，为棉花分子检测和分子育种提供实用标记和理论依据，规范棉花种子市场，进而推动棉花产业健康发展。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种鉴别新陆中棉花品种的多态性分子标记，其特征在于，所述多态性分子标记的鉴别引物为以下的29对，所述鉴别引物的序列具体为：

2.根据权利要求1所述的一种鉴别新陆中棉花品种的多态性分子标记，其特征在于，所述新陆中系列棉花品种为新陆中1-12、14-22、25-30、32-50、54-69、71-88号品种，对应的多态性分子标记的鉴别引物具体为：

鉴别新陆中2号品种的多态性标记特征引物为DPL0757；

鉴别新陆中3号品种的多态性标记组合引物为HAU0732、W01；

鉴别新陆中4号品种的多态性标记特征引物为NAU1221或NAU1042或NAU1269；

鉴别新陆中5号品种的多态性标记组合引物为HAU0732、W01或HAU0732、JESPR0101；

鉴别新陆中6号品种的多态性标记组合引物为BNL3442、HAU2786或BNL3442、W01；

鉴别新陆中8号品种的多态性标记特征引物为JESPR0065；

鉴别新陆中10号品种的多态性标记组合引物为DPL0542、Lc_A07G2334或DPL0542、NAU5433；

鉴别新陆中11号品种的多态性标记组合引物为DPL0542、BNL3442或DPL0542、MUCS0101；

鉴别新陆中15号品种的多态性标记组合引物为NAU1103、NAU1233或HAU2786、NAU1233；

鉴别新陆中18号品种的多态性标记组合引物为NAU1103、HAU2786或NAU1103、DPL0542；

鉴别新陆中19号品种的多态性标记组合引物为Lc_A07G2334、W01；

鉴别新陆中20号品种的多态性标记组合引物为NAU1103、W01；

鉴别新陆中21号品种的多态性标记组合引物为HAU2786、JESPR0101或HAU2786、DPL0542；

鉴别新陆中27号品种的多态性标记组合引物为NAU1103、HAU2786或NAU1103、W01；

鉴别新陆中28号品种的多态性标记组合引物为W01、HAU0732或HAU2786、NAU1233；

鉴别新陆中32号品种的多态性标记组合引物为W01、HAU2786或NAU1103、NAU1233；

鉴别新陆中33号品种的多态性标记特征引物为NAU2277；

鉴别新陆中34号品种的多态性标记组合引物为NAU1167、DPL0542或NAU1167、NAU1233；

鉴别新陆中35号品种的多态性标记组合引物为W01、Lc_A07G2334；

鉴别新陆中37号品种的多态性标记组合引物为HAU2786、Lc_A07G2334或HAU2786、NAU5433；

鉴别新陆中41号品种的多态性标记组合引物为NAU5433、JESPR0101或NAU5433、BNL3442；

鉴别新陆中44号品种的多态性标记特征引物为DPL0542；

鉴别新陆中50号品种的多态性标记特征引物为fgGh_G0105或HAU2786；

鉴别新陆中57号品种的多态性标记组合引物为Lc_A07G2334、DPL0542或JESPR0101、HAU2786；

鉴别新陆中58号品种的多态性标记特征引物为NAU6094；

鉴别新陆中62号品种的多态性标记特征引物为Lc_A07G2334；

鉴别新陆中63号品种的多态性标记特征引物为NAU1369；

鉴别新陆中69号品种的多态性标记特征引物为NAU2697；

鉴别新陆中77号品种的多态性标记特征引物为NAU1369或JESPR0251；

鉴别新陆中78号品种的多态性标记特征引物为HAU2349；

鉴别新陆中79号品种的多态性标记特征引物为Lc_A07G2334或BNL3442；

鉴别新陆中83号品种的多态性标记组合引物为Lc_A07G2334、HAU2786或Lc_A07G2334、NAU5433；

鉴别新陆中87号品种的多态性标记特征引物为NAU1042；

鉴别新陆中88号品种的多态性标记组合引物为SWU1259、HAU2786或SWU1259、NAU1233。

3.一种利用如权利要求2所述的多态性分子标记鉴别新陆中1-12、14-22、25-30、32-50、54-69、71-88号80种新陆中系列棉花品种的方法，其特征在于，步骤包括：

(1)提取棉花DNA；

(2)利用所述多态性分子标记的鉴别引物对棉花DNA进行PCR扩增，若为多态性组合引物，则按照组合引物中的先后顺序进行扩增，获得PCR产物；

(3)电泳检测PCR产物；

(4)结果鉴别：将具有特征引物带型或组合引物特征信息的品种与其他品种区分开，最终鉴别出相对应的品种；

应用多态性标记特征引物进行PCR扩增、电泳后对结果进行鉴别的具体方法是：应用多态性标记特征引物对新陆中2、4、8、33、44、50、58、62、63、69、77-79、87号14个棉花品种DNA进行扩增、电泳，对特征引物电泳结果进行分析比较，将具有特征引物带型的新陆中品种与其他品种区分开，最终鉴别出相对应的新陆中系列棉花品种；

应用多态性标记组合引物进行PCR扩增、电泳后对结果进行鉴别的具体方法是：按照组合引物中的先后顺序对新陆中1、3、5-7、9-12、14-22、25-30、32、34-43、45-49、54-57、59-61、64-68、71-76、80-86、88号66个棉花品种DNA进行扩增、电泳，对组合引物电泳结果进行分析比较，将具有组合引物特征信息的新陆中系列棉花品种与其他品种区分开，最终鉴别出相对应的新陆中系列棉花品种。

4.一种利用如权利要求2所述的多态性分子标记构建新陆中1-12、14-22、25-30、32-50、54-69、71-88号80种新陆中系列棉花品种指纹图谱的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：提取80种新陆中系列棉花品种基因组DNA；

步骤二：利用多态性鉴别引物对80份棉花基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR产物；

步骤三：电泳检测PCR扩增产物；

步骤四：根据电泳检测结果分析获得各品种的指纹代码或其唯一二维码，得到所述指纹图谱。

5.根据权利要求4所述的一种利用多态性分子标记构建新陆中1-12、14-22、25-30、32-50、54-69、71-88号80种新陆中系列棉花品种指纹图谱的方法，其特征在于，所述步骤二中，多态性鉴别引物为19对核心引物：HAU2786-DPL0542-W01-NAU1233-Lc_A07G2334-okra-195-NAU1103-NAU5433-BNL3442-JESPR0101-NAU1167-HAU0732-NAU1042-MUCS0101-SWU1259-NAU5099-NAU0990-NAU269 7-NAU5120。

6.根据权利要求4所述的一种利用多态性分子标记构建新陆中1-12、14-22、25-30、32-50、54-69、71-88号80种新陆中系列棉花品种指纹图谱的方法，其特征在于，所述步骤四中，构建指纹图谱的方法包括：根据各多态性鉴别引物在各新陆中系列棉花品种中的带型，将相同带型进行归类，并用数字或字母编码，获得各品种的指纹代码，即构建获得所述指纹图谱。

7.根据权利要求6所述的一种利用多态性分子标记构建新陆中1-12、14-22、25-30、32-50、54-69、71-88号80种新陆中系列棉花品种指纹图谱的方法，其特征在于，所述新陆中系列棉花品种为新陆中1-12、14-22、25-30、32-50、54-69、71-88号品种，所述多态性标记鉴别引物为19对核心引物，HAU2786-DPL0542-W01-NAU1233-Lc_A07G2334-okra-195-NAU1103-NAU5433-BNL3442-JESPR0101-NAU1167-HAU0732-NAU1042-MUCS0101-SWU1259-NAU5099-NAU0990-NAU2697-NAU5120，利用数字1-7编码各引物对应的80种新陆中系列棉花品种中的带型，获得该80种新陆中系列棉花品种在所述19对核心引物下的十进制数字指纹代码；

按照所述核心引物顺序，80种新陆中系列棉花品种的十进制数字指纹代码为：

8.一种如权利要求2所述的多态性分子标记在鉴别新陆中1-12、14-22、25-30、32-50、54-69、71-88号80份新陆中系列棉花品种中的应用。

9.一种如权利要求6所述的指纹代码在鉴别新陆中1-12、14-22、25-30、32-50、54-69、71-88号80份新陆中系列棉花品种中的应用。