CN112575105B - 一种利用ssr引物鉴定西兰花品种的方法 - Google Patents

一种利用ssr引物鉴定西兰花品种的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112575105B
CN112575105B CN202011470941.3A CN202011470941A CN112575105B CN 112575105 B CN112575105 B CN 112575105B CN 202011470941 A CN202011470941 A CN 202011470941A CN 112575105 B CN112575105 B CN 112575105B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bro
variety
broccoli
varieties
ssr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011470941.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112575105A (zh
Inventor
郑强
邵伟伟
李金枝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lishui University
Original Assignee
Lishui University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lishui University filed Critical Lishui University
Priority to CN202011470941.3A priority Critical patent/CN112575105B/zh
Publication of CN112575105A publication Critical patent/CN112575105A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112575105B publication Critical patent/CN112575105B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B50/00—ICT programming tools or database systems specially adapted for bioinformatics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Bioethics (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种利用SSR引物鉴定西兰花品种的方法，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测与荧光电泳分型检测法，对芸薹属875对SSR引物进行多态性筛选，最终确定了28对引物作为西兰花品种真实性鉴定的核心SSR引物。在此基础上，构建了48份国内外重要西兰花品种的DNA指纹图谱库。该图谱库以西兰花品种编号、扩增位点名称以及“0”、“1”阵列为基础制得，其中“0”代表在相应扩增位点无扩增条带，“1”代为在相应扩增位点有扩增条带，每一西兰花品种均有包含28个位点信息的指纹代码，具有唯一性，每一个指纹代码可作为一个品种的标识。西兰花品种的真实性鉴定可采用DNA指纹图谱库法或对照品种比对法。

Description

一种利用SSR引物鉴定西兰花品种的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用SSR分子标记鉴定西兰花品种的真实性的方法。
背景技术
目前，农作物的品种鉴定方法主要包括形态学鉴定法、物理化学鉴定法、生化鉴定法和DNA分子标记法等。形态学鉴定法耗时长，易受环境条件的影响，且鉴定结果具有一定的主观性；物理化学鉴定法与生化鉴定法在应用范围上有较大的局限，对于遗传相近的品种往往难以区分；DNA分子标记法通过直接分析不同品种在DNA水平的差异来进行品种鉴定，具有快速、高效、准确、易实现自动化等众多优点，因此越来越受到重视。DNA分子标记技术包括AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)、RFLP(Restriction FragmentLength Polymorphism)、RADP(Random Amplified Polymorphic DNA)、SSR(SimpleSequence Repeats)、ISSR(Inter-Simple Sequence Repeats)、SRAP(Sequenced-relatedamplified polymorphism)和SNP(Single Nucleotide Polymorphism)等。尽管上述这些分子标记技术在物种遗传多样性分析、指纹图谱构建、连锁图绘制、分子辅助育种等领域均有广泛应用，但多数并不适用于亲缘关系较近的不同栽培种之间的品种真实性的快速鉴定：如RFLP标记技术操作复杂、难度大，且需使用放射性同位素；AFLP操作要求与实验成本都很高，且受欧洲专利保护，限制了该技术的应用；RAPD为显性遗传，不能有效区分杂合子与纯合子，且结果重复性较差；ISSR同样为显性遗传，且PCR扩增中非特异性条带多，对结果判断有较大的干扰。
SSR(Simple Sequence Repeats)又称为微卫星DNA，是由几个(多为1-6个)核苷酸串联重复成数十至数百碱基大小的DNA片段，DNA复制过程中，因碱基错配而产生一个或几个重复单位的变化，从而导致等位变异的产生。由于SSR两侧是保守的碱基序列，因此可设计引物进行PCR扩增，进而获取这些重复序列的多态性信息，用于不同物种的区分。SSR标记具有多态性丰富、共显性遗传、稳定性与重复性好、技术简单易用操作等特点，因而在指纹图谱的构建与品种真实性鉴定方面得到广泛应用。
国内已经建立了水稻、玉米、马铃薯及甘蓝型油菜等重要经济作物的基于SSR分子标记进行品种鉴定的技术标准，为不同产区来源与不同经销来源的种子提供了一套统一的标准化规范操作，为解决争议、保护育种权益、规范市场奠定了良好的基础。但目前尚未见基于SSR分子标记法对西兰花进行真实性鉴定的技术标准，也未见可用于西兰花真实性鉴定的SSR核心引物组合的相关报道，因此，筛选出一组SSR核心引物组合并开发一套西兰花品种真实性鉴定的SSR分子标记技术标准或规程，代替繁琐、耗时的田间种植与形态鉴定的传统方法，用于西兰花品种真实性的快速、高效、准确鉴定，具有重要意义。
发明内容
本发明要解决上述现有技术存在的问题，提供了一种利用SSR分子标记鉴定西兰花品种的真实性的方法，筛选一组西兰花SSR核心引物组合并开发一套西兰花品种真实性鉴定的SSR分子标记技术标准或规程，代替繁琐、耗时的田间种植与形态鉴定的传统方法，用于西兰花品种真实性的快速、高效、准确鉴定。
本发明解决其技术问题采用的技术方案：这种利用SSR引物鉴定西兰花品种的方法，包括48份西兰花品种，利用分散在西兰花9对染色体上的28对核心SSR引物组合对西兰花品种的真实性进行鉴定的SSR分子标记技术，主要包括有西兰花核心SSR引物的筛选、西兰花品种指纹图谱库的构建和西兰花品种的SSR鉴定方法，
所述西兰花品种的SSR鉴定方法包括DNA指纹图谱库法和对照品种对比法两种方案，利用所述28对核心SSR引物组合扩增获得西兰花品种的DNA指纹信息数据，根据DNA指纹图谱库法或对照品种比对法对待测品种的真实性进行鉴定。
为了进一步完善，所述分散在西兰花9对染色体上的28对核心SSR引物组合包括BoGMS1162、BoE041、Na10H03c、BoSF239、BoSF2725、BoGMS0665、BnEMS0287、CB10057、BoE718、MR049B、BRMSo71、CB10288、BoE891、BoSF259、BoGMS0949、CB10526、CB10234、Na12A02、BoE723、BoE875、OL11Bo5、CNU400、CB10028、CB10139、CB10064、BoSF2206、BoSF2686、BoGMS0847。
进一步完善，所述DNA指纹图谱库法的主要步骤如下：
步骤1、利用试剂盒法提取待鉴定西兰花品种的基因组DNA；
步骤2、以28对核心SSR引物对其进行PCR扩增，利用荧光电泳分型检测平台分析该品种在28个扩增位点的扩增信息，以品种编号、扩增位点名称以及“0”、“1”阵列为基础表征该品种的指纹信息数据；
步骤3、将待鉴定品种的DNA指纹信息数据与48份西兰花品种的DNA指纹图谱库进行搜索比对，若待鉴定品种的DNA指纹信息数据与西兰花DNA指纹图谱库中的某个品种信息一致，则可判断待鉴定品种与指纹图谱库中的该品种为同一品种；若待鉴定品种的DNA指纹信息数据与西兰花DNA指纹图谱库中的48份西兰花品种的指纹信息均不一致，则可判断待鉴定品种不属于48份西兰花品种中的任一品种。
进一步完善，所述对照品种对比法的主要步骤如下：
步骤1、利用试剂盒法分别提取待鉴定西兰花品种与对照品种的基因组DNA；
步骤2、以28对核心SSR引物对两者进行PCR扩增，利用荧光电泳分型检测平台分析待鉴定品种与对照品种在28个扩增位点的扩增信息，以品种编号、扩增位点名称以及“0”、“1”阵列为基础表征待鉴定品种与对照品种的指纹信息数据；
步骤3、将待鉴定品种与对照品种的DNA指纹信息数据进行比较，若两者的指纹信息数据相同，则可判定待鉴定品种与对照品种为相同品种；若两者的指纹信息数据不同，则判定待鉴定品种与对照品种为不同品种。
进一步完善，所述西兰花核心SSR引物的筛选的主要步骤如下：
步骤1、按照芸薹属SSR数据库网站提供的芸薹属引物信息合成SSR引物875对，作为备选SSR引物；
步骤2、以12份遗传差异性较大的西兰花品种作为筛选材料，利用试剂盒法从12份西兰花种子中提取基因组DNA；
步骤3、采用降落式PCR程序，以875对引物对12份西兰花筛选材料进行扩增，通过6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合硝酸银快速染色法进行检测，从中初步筛选出扩增带型清晰、多态性丰富的候选核心引物；
步骤4、采用荧光PCR，以步骤3中的候选核心引物对48份西兰花品种材料进行扩增，通过荧光电泳分型检测平台，从候选核心引物中进一步复筛得到最终的核心SSR引物。
进一步完善，所述西兰花品种指纹图谱库的构建的主要步骤如下：
步骤1、利用试剂盒法从48份西兰花品种种子中提取相应的基因组DNA，利用DNA分析仪检测其纯度及浓度，并稀释至合适浓度；
步骤2、以28对核心SSR引物对48份西兰花品种基因组DNA进行PCR扩增，利用荧光电泳分型检测平台分析48份西兰花品种的材料在28个扩增位点的扩增信息；
步骤3、以西兰花品种编号、扩增位点名称以及“0”、“1”阵列为基础构建48份西兰花品种的指纹图谱库，其中“0”代表在相应扩增位点无扩增条带，“1”代为在相应扩增位点有扩增条带，每一西兰花品种均有包含28个位点信息的指纹代码，具有唯一性，每一个指纹代码可作为一个品种的标识。
进一步完善，利用所述28对核心SSR引物组合对48份西兰花品种的样品进行扩增，获得48份西兰花品种的DNA指纹图谱库。将待鉴定品种的DNA指纹信息数据与48份西兰花品种的DNA指纹图谱库进行比对，若待鉴定品种的DNA指纹信息数据与西兰花DNA指纹图谱库中的某个品种信息一致，则可判断待鉴定品种与指纹图谱库中的该品种为同一品种；若待鉴定品种的DNA指纹信息数据与西兰花DNA指纹图谱库中的48份西兰花品种的指纹信息均不一致，则可判断待鉴定品种不属于48份西兰花品种中的任一品种。
进一步完善，所述48份国内外重要西兰花品种的DNA指纹图谱库以西兰花品种编号、扩增位点名称以及“0”、“1”阵列为基础制得，其中“0”代表在相应扩增位点无扩增条带，“1”代为在相应扩增位点有扩增条带，每一西兰花品种均有包含28个位点信息的指纹代码，具有唯一性，每一个指纹代码可作为一个品种的标识。
进一步完善，利用所述28对核心SSR引物组合分别扩增待鉴定品种与对照品种，获得相应的DNA指纹信息数据，并将两者的DNA指纹信息数据进行比较，若两者的指纹信息数据相同，则可判定待鉴定品种与对照品种为相同品种；若两者的指纹信息数据不同，则判定待鉴定品种与对照品种为不同品种。
进一步完善，所述步骤3中的丙烯酰胺凝胶的配制方法为取16ml水、6ml5XTBD、8ml丙烯酰胺、300μl过硫酸铵、10μlTEMED溶液配制聚丙烯酰胺胶液，吹打混匀，防止气泡的产生，配制好所需要的非变性聚丙烯酰胺凝胶试剂后，制作胶板并进行电泳银染检测。
进一步完善，所述48份西兰花品种的品种编号为Bro-1，Bro-2，Bro-3，Bro-4，Bro-5，Bro-6，Bro-7，Bro-8，Bro-9，Bro-10，Bro-11，Bro-12，Bro-13，Bro-14，Bro-15，Bro-16，Bro-17，Bro-18，Bro-19，Bro-20，Bro-21，Bro-22，Bro-23，Bro-24，Bro-25，Bro-26，Bro-27，Bro-28，Bro-29，Bro-30，Bro-31，Bro-32，Bro-33，Bro-34，Bro-35，Bro-36，Bro-37，Bro-38，Bro-39，Bro-40，Bro-41，Bro-42，Bro-43，Bro-44，Bro-45，Bro-46，Bro-47，Bro-48。
本发明有益的效果是：要填补目前西兰花SSR分子鉴定领域的空白，筛选一组西兰花SSR核心引物组合并开发一套西兰花品种真实性鉴定的SSR分子标记技术标准或规程，解决其技术问题采用的技术方案包括西兰花核心SSR引物的筛选、西兰花品种指纹图谱库的构建与西兰花品种的SSR鉴定方法，代替繁琐、耗时的田间种植与形态鉴定的传统方法，用于西兰花品种真实性的快速、高效、准确鉴定。
附图说明
图1为本发明的西兰花基因组DNA凝胶检测图；
图2为本发明的降落式PCR扩增产物的凝胶检测图；
图3为本发明的SSR扩增产物的聚丙烯酰胺银染图(部分)；
图4为本发明的引物BoE718扩增产物SSR分型图(4个等位基因)；
图5为本发明的引物BoE718对四份西兰花品种的扩增产物的SSR分型图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明：
参照附图：
实施例1
步骤1：试剂盒法提取西兰花种子基因组DNA
(1)称取西兰花种子约1g放入研钵，加入液氮盖过种子，迅速将种子研磨至粉末状，之后称取种子粉末约200mg放入1.5ml离心管中；
(2)向离心管中加入500ul 65℃预热缓冲液GP1和3ulβ-巯基乙醇，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴30-40min,水浴过程中隔5-10min颠倒离心管以混合样品数次；
(3)加入500ul氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min后取上清液约450ul，两管合并后约900ul上清液。
(4)再次加入500ul氯仿，取上清约700ul。
(5)向离心管中加入700ul缓冲液GP2，充分混匀。
(6)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，8000rpm离心1min，弃掉废液(吸附柱的容积为700ul，需分两次加入)
(7)向吸附柱CD3中加入500ul缓冲液GD(使用前请检查是否已加入无水乙醇)8000rpm离心1min，倒掉废液，将CB3放入收集管中。
(8)向吸附柱CD3中加入600ul漂洗液PW(使用前请检查是否已加入无水乙醇)8000rpm离心1min，倒掉废液，将CB3放入收集管中。
(9)重复步骤8：向吸附柱CD3中加入600ul漂洗液PW(使用前请检查是否已加入无水乙醇)8000rpm离心1min，倒掉废液，将CB3放入新的离心管中。
(10)再次放入离心机里离心30s，之后将CB3转移到新的离心管，常温环境下，敞开晾干10分钟。
(11)向吸附膜的中间部位悬空滴加150ul洗脱缓冲液TE，室温放置5分钟，12000rpm，离心2分钟，收集所得溶液，利用凝胶电泳进行检测(如图1所示)，并测定其浓度及A260/A280值。
步骤2：降落式PCR扩增
PCR扩增是SSR引物筛选的基础技术，扩增过程的稳定性与可靠性对于引物筛选非常关键。普通的PCR扩增中需要按照某一对引物的退火温度设定固定的退火程序，不利于SSR引物的大规模筛选。降落式PCR在扩增过程中设置退火温度呈梯度式降低，满足不同引物有不同退火温度的要求，这样就可实现单次PCR筛选不同退火温度的引物。
降落式PCR具体扩增程序如下：反应体系为20μL，其中包括ddH2O 14.5μL、10XBuffer缓冲液2μL、Mg2+(25mM)1.2μL、dNTP Mixture(25mM)0.2μL、Taq酶(5U/μL)0.2μL、DNA模板(40ng/μL)1μL、上下游引物(10μmol/L)各0.5μL。降落式PCR程序为：94℃预变性2min，94℃变性40s，62.5℃退火30s，72℃延伸45s，每循环降1℃，共10个循环；94℃变性40s，52.5℃退火30s，72℃延伸45s，共28个循环；72℃延伸5min，4℃保存。采用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增情况进行初步验证，如图2所示，通过降落式PCR程序，不同退火温度的引物能够在同一批PCR反应中清晰扩增得到不同西兰花品种相应的SSR条带，适合于西兰花SSR引物的筛选。
步骤3：西兰花SSR引物的初筛
(1)利用12份西兰花品种为初筛材料，以875对SSR引物对其进行降落式PCR扩增，具体扩增程序按照实施例2进行；
(2)采用聚丙烯酰胺银染法对电泳产物进行检测，具体流程如下：
1配制凝胶：取16ml水、6ml5XTBD、8ml丙烯酰胺、300μl过硫酸铵、10μlTEMED溶液配制聚丙烯酰胺胶液，吹打混匀，防止气泡的产生。配制好所需要的非变性聚丙烯酰胺凝胶试剂后，制作胶板并进行电泳银染检测。
2取两块干净的玻璃板，用凡士林涂抹两侧防止胶液渗出，对称盖好后，用书夹夹住两侧，然后将胶板固定在胶板架子上。
3灌胶：在胶板缝隙处均匀加入聚丙烯酰胺凝胶液，在灌胶过程中注意气泡的产生，当胶板加满后立即插上梳子。待其凝固后从胶板夹上取下，取下后将胶板置于流水中冲洗干净。
4电泳：准备好的胶版放入电泳机中，以1XTBD溶液为缓冲溶液，用移液枪取0.5μLPCR扩增产物，加入染液混合均匀，在200V恒压电流下电泳约1.5h左右，观察蓝色条带跑到适宜位置后停止电泳。
5银染：电泳完成后取下胶板，在水流的冲洗下取出凝胶，凝胶经过纯水漂洗1min后，用0.1％硝酸银溶液染色5～10min，再漂洗15s，保证清洗干净后，再往染色盒内加入1％NaOH(含1％甲醛)盖上盖子，显色到条带能够清晰可见之后漂洗凝胶，观察条带(如图3所示)。
6.从中筛选出扩增结果稳定、扩增条带清晰稳定、多态性较丰富的引物共60对，作为候选核心SSR引物。
步骤4：西兰花核心SSR引物的筛选
在上述60对候选核心SSR引物的基础上，合成相应的含有FAM标记的荧光引物，按照实施例2中的程序对48份西兰花品种(见表1)进行PCR扩增，并利用SSR分型仪(ABI3730xl)对PCR产物进行荧光电泳分型检测。与凝胶电泳检测技术相比，荧光电泳分型可分辨出仅有1-2bp大小差异的片段，分辨率与检测精度均有质的提升。如图4为引物BoE718对48份西兰花品种扩增产物的荧光电泳分型图，该引物对48份西兰花品种的扩增产物的峰型清晰易辨、扩增多态性良好，扩增的等位基因数目为4个，其片段大小分别为194、200、206与218，符合核心SSR引物的特征要求。
通过对60对候选核心SSR引物荧光电泳分型结果的比较，最终筛选出28对引物作为核心SSR引物，详见表2。这些核心SSR引物扩增信号清晰、扩增结果稳定、扩增多态性良好，均匀分布于西兰花的9对染色体上，可作为西兰花品种SSR分子鉴定的核心SSR引物。
步骤5：48份西兰花指纹图谱库的构建
利用28对核心SSR荧光引物对48份西兰花品种进行PCR扩增(具体扩增程序与实施例4相同)，并利用SSR分型仪(ABI 3730xl)对PCR产物进行荧光电泳分型检测。根据分型结果，以西兰花品种编号、扩增位点名称以及“0”、“1”阵列为基础构建48西兰花品种的DNA指纹图谱库，以Excel表格的形式进行储存，其中“0”代表在相应扩增位点无扩增条带，“1”代为在相应扩增位点有扩增条带，每一西兰花品种均有包含28个位点信息的指纹代码，具有唯一性，每一个指纹代码可作为一个品种的标识。表3为48份西兰花品种在10个扩增位点上的DNA指纹图谱信息。以BoE718引物为例，其DNA指纹信息为四位数组成，表示BoE718在48份西兰花上扩增出的等位基因数为4，其片段大小分别为194、200、206与218(见图4)。BoE718/Bro-1的指纹信息为1000，表示该引物在Bro-1品种上可扩增得到条带大小为194的片段，见图5-a；BoE718/Bro-2的指纹信息为0001，表示该引物在Bro-2品种上可扩增得到条带大小为218的片段，见图5-b；BoE718/Bro-3的指纹信息为1001，表示该引物在Bro-2品种上可扩增得到条带大小为194与218的两种片段，见图5-c；BoE718/Bro-11的指纹信息为1100，表示该引物在Bro-11品种上可扩增得到条带大小为194和200的片段，见图5-d；BoE718/Bro-28的指纹信息为0011，表示该引物在Bro-28品种上可扩增得到条带大小为206和218的片段，见图5-e；其它指纹信息以此类推。
按此方法，最终构建得到48份西兰花品种在28个扩增位点上的“0”、“1”阵列DNA指纹图谱库，详见表4。
步骤6：DNA指纹图谱库法鉴定3份西兰花品种
利用DNA指纹图谱库法对3份西兰花品种进行鉴定，其编号分别为Sam-1、Sam-2与Sam-3。按照步骤1中的方法提取3份待鉴定的西兰花品种的基因组DNA，按照步骤2中的PCR扩增方法，以步骤4中的28对核心SSR引物组合对其进行扩增，并按照步骤5中的方法构建相应的DNA指纹信息，如表5所示。利用DNA指纹图谱库Excel表格中“搜索”引擎，将3份DNA指纹信息与DNA指纹图谱库中的所有DNA指纹信息进行比对，搜索结果显示：Sam-1的DNA指纹信息与DNA指纹图谱库中Bro-16项的指纹信息完全一致，判断Sam-1与Bro-16为同一品种(曼陀绿)；Sam-2的DNA指纹信息与DNA指纹图谱库中Bro-47项的指纹信息完全一致，判断Sam-2与Bro-47为同一品种(台绿3号)；Sam-3的DNA指纹信息与DNA指纹图谱库中48项指纹信息均不一致，判断Sam-3不属于表1中列出的48份西兰花品种，但具体品种名称无法判断。
实施例2
步骤1-5参照实施例1中的步骤1-5；
步骤6：对照品种比对法鉴定西兰花品种
利用对照品比对法对西兰花待测品种A(其对照品种为B)的真实性进行鉴定：按照步骤1的方法分别提取A与B的基因组DNA，按照步骤2中的PCR扩增方法，以步骤4中的28对核心SSR引物组合分别对其进行扩增，并按照步骤5中的方法构建A与B的DNA指纹信息，如表6所示。通过比对待测品种A与对照品种B的DNA指纹信息，可知两者在三个扩增位点上有明显差异(粗体及下划线)，因此判断西兰花品种A与对照品种B为不同品种。
表1、48份西兰花品种信息
Figure BDA0002833851480000091
Figure BDA0002833851480000101
表2、28对SSR核心引物序列信息
Locus Forwardprimer Reverseprimer
BoGMS1162 AAATCTGACAAAGGCGAAA AGAGAGAAAGGAGAGCCAA
BoE041 CTTGGCTAGGGTTTTGGTAT ACTAGTCCCGAGGTTATTGTTT
Na10H03c GAGCTGGCTCATTCAACTCC CACAATTTCTCAGACAAAACGG
BoSF239 TGTGTGGAACAGTGTTTGGAA TCTCTGGCTCTCTTTCGCTC
BoSF2725 CGATTGTTGGGTCTCAAGGT CGCAAAGGCAAGATTTTGAT
BoGMS0665 TCAGAGATGAACAAGAAGCAC GCGAACCTTTCCCAACCT
BnEMS0287 TCATTTCTACGGAGGAGTTG GGAGGAGAAGAATCTAGGGA
CB10057 CTAGGCTAAGGAAGATTGTCA TAGTTTCTTCCTCCTGCTATC
BoE718 CAAGAAACGGACGTGGTGAAAG TCTCGCGTATGGGGCTGTCT
MR049B AATGGGAAGCTCGTCGAA AATTATGCCAACATCCTACGG
BRMSo71 CAAAGCGAGAAAGTGCAGTTGAGAG TCCACGAAACTACTGCAGATTGAAA
CB10288 GCAATGCATATCGACCTT AACCGCGCTATCAAGAAT
BoE891 CCTCTTTCCTCCCTTCCTTCATCT AGGGGCGGTAGTAATTGGAGTAAC
BoSF259 GTGGTTGGAAATATCGACGC TGAAGCTCACAAATCGCAAG
BoGMS0949 CTCCTCCTCCTTTCATCTTC TTCGTCTCCCTTCTCTGTAA
CB10526 TTCTTCTTTCCACCACCA ACTCGGCGGTTAGAGAAT
CB10234 TCTGTTGTTTCTCTCGCC CTGATGGACTAGGACCCC
Na12A02 AGCCTTGTTGCTTTTCAACG AGTGAATCGATGATCTCGCC
BoE723 CGTTGAGGCCGAGAGTGAGAG ATGGACGCCGGAAATGAGAA
BoE875 CCGACAATGGCTGGAGTAGG GATAAGCCGGTAGAGCATAAGGAG
OL11Bo5 TCGCGACGTTGTTTTGTTC ACCATCTTCCTCGACCCTG
CNU400 CGAGTTTTTGTGTGTACGTATAGTAAT CCAAAGTGCGTAAAGGAAGG
CB10028 CTGCACATTTGAAATTGGTC AAATCAACGCTTACCCACT
CB10139 TCTCAAAAGGATATGCGTGAA CAAAACTCATCAGGGTTGTAG
CB10064 CTCTCTCATCATATTCGGTG TAGCAGAAAGAGTAAGAGGG
BoSF2206 CCTCTGTCCGCATATTTGGT CTCTTGGACATATCTCCGGC
BoSF2686 AACATACTTCCCCTCGGGAT GGGCGAAGTGGTTAAAGTGA
BoGMS0847 CTCATCTTCCCTCTTCCTCT GGTTCTGCTTGCTTACTTGA
表3、48份西兰花品种的DNA指纹图谱(含10个扩增位点)
Figure BDA0002833851480000111
Figure BDA0002833851480000121
表4、48份西兰花品种的DNA指纹图谱库
Figure BDA0002833851480000122
Figure BDA0002833851480000131
表5、3份待鉴定西兰花品种的DNA指纹信息
Sam-1 '0101010101110010001000100010100010100000101110010101010100101001010000001001011110000110000011'
Sam-2 '1000100111110110001010100011000011001110101101010101101001100101010010100011010100110001001001'
Sam-3 '0101000101111011000011110000010111100010010100111101101001101011010010011001001100101001001001'
表6、西兰花待测品种A与对照品种B的DNA指纹信息
A '10100011111000100<u>0100</u>11000101<u>0001</u>110000010010011110110100110101101101010001100110001001100<u>1001</u>'
B '10100011111000100<u>0101</u>11000101<u>0011</u>110000010010011110110100110101101101010001100110001001100<u>0011</u>'
虽然本发明已通过参考优选的实施例进行了图示和描述，但是，本专业普通技术人员应当了解，在权利要求书的范围内，可作形式和细节上的各种各样变化。

Claims (5)

1.一种利用SSR引物鉴定西兰花品种的方法，包括48份西兰花品种，其特征是：利用分散在西兰花9对染色体上的28对核心SSR引物组合对西兰花品种的真实性进行鉴定的SSR分子标记技术，主要包括有西兰花核心SSR引物的筛选、西兰花品种指纹图谱库的构建和西兰花品种的SSR鉴定方法；
所述西兰花品种的SSR鉴定方法包括DNA指纹图谱库法或对照品种对比法两种方案，利用所述28对核心SSR引物组合扩增获得西兰花品种的DNA指纹信息数据，根据DNA指纹图谱库法或对照品种比对法对待测品种的真实性进行鉴定；
所述分散在西兰花9对染色体上的28对核心SSR引物组合包括BoGMS1162、BoE041、Na10H03c、BoSF239、BoSF2725、BoGMS0665、BnEMS0287、CB10057、BoE718、MR049B、BRMSo71、CB10288、BoE891、BoSF259、BoGMS0949、CB10526、CB10234、Na12A02、BoE723、BoE875、OL11Bo5、CNU400、CB10028、CB10139、CB10064、BoSF2206、BoSF2686、BoGMS0847；
所述DNA指纹图谱库法的主要步骤如下：
步骤1、利用试剂盒法提取待鉴定西兰花品种的基因组DNA；
步骤2、以28对核心SSR引物对其进行PCR扩增，利用荧光电泳分型检测平台分析该品种在28个扩增位点的扩增信息，以品种编号、扩增位点名称以及“0”、“1”阵列为基础表征该品种的指纹信息数据；
步骤3、将待鉴定品种的DNA指纹信息数据与48份西兰花品种的DNA指纹图谱库进行搜索比对，若待鉴定品种的DNA指纹信息数据与西兰花DNA指纹图谱库中的某个品种信息一致，则可判断待鉴定品种与指纹图谱库中的该品种为同一品种；若待鉴定品种的DNA指纹信息数据与西兰花DNA指纹图谱库中的48份西兰花品种的指纹信息均不一致，则可判断待鉴定品种不属于48份西兰花品种中的任一品种；
所述对照品种对比法的主要步骤如下：
步骤1、利用试剂盒法分别提取待鉴定西兰花品种与对照品种的基因组DNA；
步骤2、以28对核心SSR引物对两者进行PCR扩增，利用荧光电泳分型检测平台分析待鉴定品种与对照品种在28个扩增位点的扩增信息，以品种编号、扩增位点名称以及“0”、“1”阵列为基础表征待鉴定品种与对照品种的指纹信息数据；
步骤3、将待鉴定品种与对照品种的DNA指纹信息数据进行比较，若两者的指纹信息数据相同，则可判定待鉴定品种与对照品种为相同品种；若两者的指纹信息数据不同，则判定待鉴定品种与对照品种为不同品种；
48份西兰花品种信息如下：
Figure FDA0003698706230000021
48份西兰花品种的DNA指纹图谱，包含10个扩增位点，信息如下：
Figure FDA0003698706230000022
Figure FDA0003698706230000031
48份西兰花品种的DNA指纹图谱库，信息如下：
Figure FDA0003698706230000041
Figure FDA0003698706230000051
。
2.根据权利要求1所述的一种利用SSR引物鉴定西兰花品种的方法，其特征是：所述西兰花核心SSR引物的筛选的主要步骤如下：
步骤1、按照芸薹属SSR数据库网站提供的芸薹属引物信息合成SSR引物875对，作为备选SSR引物；
步骤2、以12份遗传差异性较大的西兰花品种作为筛选材料，利用试剂盒法从12份西兰花种子中提取基因组DNA；
步骤3、采用降落式PCR程序，以875对引物对12份西兰花筛选材料进行扩增，通过6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合硝酸银快速染色法进行检测，从中初步筛选出扩增带型清晰、多态性丰富的候选核心引物；
步骤4、采用荧光PCR，以步骤3中的候选核心引物对48份西兰花品种材料进行扩增，通过荧光电泳分型检测平台，从候选核心引物中进一步复筛得到最终的核心SSR引物。
3.根据权利要求2所述的一种利用SSR引物鉴定西兰花品种的方法，其特征是：所述西兰花品种指纹图谱库的构建的主要步骤如下：
步骤1、利用试剂盒法从48份西兰花品种种子中提取相应的基因组DNA，利用DNA分析仪检测其纯度及浓度，并稀释至合适浓度；
步骤2、以28对核心SSR引物对48份西兰花品种基因组DNA进行PCR扩增，利用荧光电泳分型检测平台分析48份西兰花品种的材料在28个扩增位点的扩增信息；
步骤3、以西兰花品种编号、扩增位点名称以及“0”、“1”阵列为基础构建48份西兰花品种的指纹图谱库，其中“0”代表在相应扩增位点无扩增条带，“1”代为在相应扩增位点有扩增条带，每一西兰花品种均有包含28个位点信息的指纹代码，具有唯一性，每一个指纹代码可作为一个品种的标识。
4.根据权利要求2所述的一种利用SSR引物鉴定西兰花品种的方法，其特征是：所述步骤3中的丙烯酰胺凝胶的配制方法为取16ml水、6ml5XTBD、8ml丙烯酰胺、300μl过硫酸铵、10μlTEMED溶液配制聚丙烯酰胺胶液，吹打混匀，防止气泡的产生，配制好所需要的非变性聚丙烯酰胺凝胶试剂后，制作胶板并进行电泳银染检测。
5.根据权利要求1所述的一种利用SSR引物鉴定西兰花品种的方法，其特征是：所述48份西兰花品种的品种编号为Bro-1，Bro-2，Bro-3，Bro-4，Bro-5，Bro-6，Bro-7，Bro-8，Bro-9，Bro-10，Bro-11，Bro-12，Bro-13，Bro-14，Bro-15，Bro-16，Bro-17，Bro-18，Bro-19，Bro-20，Bro-21，Bro-22，Bro-23，Bro-24，Bro-25，Bro-26，Bro-27，Bro-28，Bro-29，Bro-30，Bro-31，Bro-32，Bro-33，Bro-34，Bro-35，Bro-36，Bro-37，Bro-38，Bro-39，Bro-40，Bro-41，Bro-42，Bro-43，Bro-44，Bro-45，Bro-46，Bro-47，Bro-48。
CN202011470941.3A 2020-12-14 2020-12-14 一种利用ssr引物鉴定西兰花品种的方法 Active CN112575105B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011470941.3A CN112575105B (zh) 2020-12-14 2020-12-14 一种利用ssr引物鉴定西兰花品种的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011470941.3A CN112575105B (zh) 2020-12-14 2020-12-14 一种利用ssr引物鉴定西兰花品种的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112575105A CN112575105A (zh) 2021-03-30
CN112575105B true CN112575105B (zh) 2022-08-19

Family

ID=75135847

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011470941.3A Active CN112575105B (zh) 2020-12-14 2020-12-14 一种利用ssr引物鉴定西兰花品种的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112575105B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114736977B (zh) * 2022-02-24 2023-05-23 广东省农业科学院环境园艺研究所 一种墨兰ssr引物组及应用该引物组构建墨兰品种指纹图谱的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5784194B1 (ja) * 2014-07-18 2015-09-24 みかど協和株式会社 根こぶ病抵抗性を有するブロッコリー個体の識別方法と、根こぶ病抵抗性ブロッコリーの育種方法
CN107604094B (zh) * 2017-11-10 2020-10-27 福建省农业科学院作物研究所 基于转录组测序开发的花椰菜ssr引物
CN112029825B (zh) * 2020-09-18 2022-12-09 上海市农业科学院 花菜类ssr分子标记引物的筛选方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112575105A (zh) 2021-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108998550B (zh) 用于水稻基因分型的snp分子标记及其应用
Satturu et al. DNA fingerprinting for identification of rice varieties and seed genetic purity assessment
CN110846429A (zh) 一种玉米全基因组InDel芯片及其应用
CN108642208A (zh) 一种樟属及其近缘属植物通用ssr分子标记及其开发方法和应用
CN110106279B (zh) 基于老芒麦基因组序列开发的单位点ssr引物组及其应用
CN112575105B (zh) 一种利用ssr引物鉴定西兰花品种的方法
CN111041126A (zh) 用于鉴别新陆中系列棉花品种的多态性分子标记及其应用
KR101961653B1 (ko) 고구마 품종 판별용 ｓｎｐ 분자 마커 및 이의 용도
CN115852022A (zh) 基于全基因组重测序和kasp技术开发的烟草核心snp标记及其应用
CN110527743B (zh) 用于鉴别新疆彩色棉品种的多态性分子标记及应用
CN117089644A (zh) 用于芦竹品种鉴定的mnp标记位点、引物组合物和试剂盒及其应用
CN113528620A (zh) 用于玉米自交系shl03品种保护的分子标记引物组、试剂盒及其应用
CN108866225B (zh) 一种遗传修饰水稻遗传背景的筛查方法
CN108315396B (zh) 一种简单便捷检测snp的新方法
CN114058724B (zh) 鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’的多重ssr标记引物及方法
CN113481313B (zh) 鉴别三种香榧品种的多重荧光ssr标记引物及方法
CN113718049B (zh) 鉴别香榧品种玉山鱼榧、大丁香和磐大榧的多重标记引物
CN114058725B (zh) 鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’品种的引物及方法
CN115029452B (zh) 一种军团菌属的mnp标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用
KR102380784B1 (ko) 식방풍 유전자원 판별용 분자마커 및 이의 용도
CN113151493B (zh) 一种长白山东方蜜蜂ssr标记引物组、pcr鉴定方法以及应用
CN116426677B (zh) 高卢蜜环菌多态性微卫星分子标记及其引物与应用
CN113528693B (zh) 鉴别香榧品种玉山鱼榧、大丁香和磐大榧的引物及方法
CN113493852B (zh) 鉴别玉山鱼榧、细香榧、大香榧和磐大榧的引物及方法
CN117757979B (zh) 一种用于鉴定大豆品种的引物组、试剂盒及鉴定方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant