CN114058724B - 鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’的多重ssr标记引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’品种的分子特征性多重荧光SSR标记引物组及方法。所述分子特征性多重荧光SSR引物如下：引物Cg_U213：上游引物Cg_U213F：5′‑FAM‑AAGAGAAAGGGAGACCGAGC‑3′，下游引物Cg_U213R：5′‑CTCTCCCTCTCACGTTCCAG‑3′；引物CT02：上游引物CT02F：5′‑HEX‑ACGGTGCGTTTTGAGGTAAG‑3′，下游引物CT02R：5′‑TGACTGTTGGATTTGGGATG‑3′；本发明所述的分子特征性多重荧光SSR引物可利用幼叶DNA对特早熟玉环柚‘早玉文旦’进行快速的早期鉴别，同时也可对柚类品种葡萄柚、红心柚、早香柚和玉环文旦进行鉴别，方法简单、快捷、准确，是传统方法即在挂果后根据果实形态学特征鉴别柚类品种所不能替代的高效分子手段。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种快速鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’优良品种的分子特征性多重荧光SSR标记引物及方法。
(二)背景技术
中国是柚类起源中心之一，栽培历史悠久，种质资源丰富，形成了包括福建、浙江、中国台湾的东南沿海柚产区，和以广西及广东为主的华南柚区和以四川、重庆、湖南、贵州为主的西南柚区。浙江省作为东南沿海柚区重要组成之一，舟山、丽水、台州、温州等地具有许多特征明显的地方资源。
早熟玉环柚‘早玉文旦’是玉环县近年来出现的一个优良栽培品种，相比普通玉环柚可以提早一个半月上市，含糖高、化渣好，酸甜适中、丰产性和适应性强，2015年普通玉环柚平均每斤1.9元，特早熟玉环柚每斤 8元；2016年普通玉环柚平均每斤4.5元，特早熟玉环柚每斤12元，且供不应求。农户经营特早熟玉环柚获得的经济效益相比经营普通玉环柚更好。目前特早熟玉环柚和普通玉环柚间的种质差异需等到挂果后才可以鉴别，很大程度上影响了玉环柚苗木的繁育周期和品种间鉴定。
柚类种质和品种资源繁多，现有的鉴别方法包括从叶片或果实形态学和生物化学方法对柚类品种(系)的鉴定和识别过程较为困难和复杂，准确度不高，成本较高且耗时耗力。尽管高光谱成像技术可用于柚类品种的鉴别，但数据波段数众多，数据量大，建模的计算工作量繁琐，直接影响建模的速度，而且光谱间存在强相关性，冗余信息多，影响建模的精度和稳定性。因此这些方法并不真正适合于柚类品种的鉴别。
自2000年以来，基于PCR的分子标记技术如RAPD(随机扩增多态性DNA)、SRAP(相关序列扩增多态性)和SSR(简单重复序列；或 Microsatellite，微卫星)相继用于了柚类品种的亲缘关系和遗传多样性分析。SNP(单核昔酸多态性)基因分型技术也用于了柚类品种鉴定。RAPD 和SRAP分子标记所采用的均为通用引物，需经大工作量的多态性筛选，而且PCR扩增图谱复杂、重复性较差，引物的特异性不高。利用SNP基因分型技术鉴定柚类品种存在的问题是SNP位点的获得较难，且单个 SNP分子标记的多态信息含量较低。基于SNP的等位基因特异性PCR法 (AS-PCR)在操作过程中对反应条件比较敏感，易发生非特异性扩增导致假阳性，易产生大量引物二聚体导致PCR失败；基于SNP的高分辨率熔解曲线法(HRMA)分析仪器昂贵，试剂成本较高。因此这些分子生物学技术也不是柚类品种鉴定的理想选择。
荧光SSR标记的开发是基于DNA测序平台的毛细管电泳检测方法，是以不同颜色的荧光基团(如FAM、HEX、TAMRA等)来标记一对SSR 引物中的一个引物末端，利用荧光检测器对产物检测，达到自动识别扩增产物的大小，克服了传统银染法聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的不足，具有快速、高效、精确、灵敏等技术优势。荧光多重SSR标记技术则进一步结合了多重PCR(Multiplex PCR)与荧光SSR标记二项技术的优点，可以在一个PCR反应体系中加入多对SSR引物组合，同时检测出多个基因型，从而解决了在进行大批量、多批次检测时的费时费力以及成本高的缺陷。因此，利用荧光多重SSR标记技术开发柚类新品种或优良、特色品种的特征SSR指纹(基因型组合)，揭示特早熟玉环柚与其他柚类品种间的基因型差异，对于‘早玉文旦’优良品种的鉴别与知识产权保护具有重要意义。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种快速鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’优良品种的分子特征性多重荧光SSR标记引物及方法。
本发明采用的技术方案是：
用于鉴别特早熟玉环柚的2对分子特征性多重荧光SSR标记引物，其核苷酸序列如下：
引物Cg_U213
上游引物Cg_U213F：5′-FAM-AAGAGAAAGGGAGACCGAGC-3′
下游引物Cg_U213R：5′-CTCTCCCTCTCACGTTCCAG-3′；
引物CT02
上游引物CT02F：5′-HEX-ACGGTGCGTTTTGAGGTAAG-3′
下游引物CT02R：5′-TGACTGTTGGATTTGGGATG-3′。
该引物对组合是基于荧光SSR标记技术，经过对大量自主开发的SSR 引物在待测5个柚类品种间进行多态性筛选试验后获得的。利用该多重荧光SSR引物对对5个柚类品种进行检测，‘早玉文旦’可稳定获得1种 SSR特征指纹(基因型)，而其他4个柚类品种均不具备该特征，因此该引物组合可用于快速鉴别‘早玉文旦’。需要说明的是，本发明分子特征性多重荧光SSR引物仅限于柚类品种的鉴别(鉴别其是否为‘早玉文旦’)，即待测样品仅限于柚类品种。
本发明还涉及一种鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’的方法，该方法是通过对多重荧光SSR引物的扩增体系优化后获得的，包括Cg_U213和 CT02标记的2对引物序列的设计、最适退火温度的优化、DNA模板和引物浓度的配比，以及体系的稳定性测试等。
所述方法包括：
提取待测柚类品种幼嫩叶片的基因组DNA作为模板，以分子特征性多重荧光SSR引物作为扩增引物，进行多重PCR扩增，对扩增产物进行毛细管电泳检测，若荧光毛细管电泳峰图上出现的基因型为256/256和 136/140，则待测柚类品种为特早熟玉环柚‘早玉文旦’；若出现的基因型为250/250和136/140、256/262和136/140、250/262和136/140以及 256/256和136/136，则待测柚类品种分别为葡萄柚、红心柚、早香柚和玉环文旦，而非‘早玉文旦’。
所述分子特征性多重荧光SSR引物核苷酸序列如下：
引物Cg_U213
上游引物Cg_U213F：5′-FAM-AAGAGAAAGGGAGACCGAGC-3′
下游引物Cg_U213R：5′-CTCTCCCTCTCACGTTCCAG-3′；
引物CT02
上游引物CT02F：5′-HEX-ACGGTGCGTTTTGAGGTAAG-3′
下游引物CT02R：5′-TGACTGTTGGATTTGGGATG-3′。
优选的，所述多重PCR扩增反应条件如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，57.6℃退火15s，72℃延伸15s，共35个循环；最后于72℃补平2min，终止温度为4℃。
优选的，所述荧光毛细管电泳检测方法如下：将PCR扩增产物稀释后于96℃变性5min，将变性后的稀释产物在-20℃下迅速冷冻2min后置入ABI 3730XL Genetic Analyzer(ABI,CA,USA)，与内标GeneScanTM-500 LIZ Size Standard(ABI)同步进行毛细管电泳检测，用Data Collection 3.0 软件(ABI)收集数据。
具体的，所述方法如下：
(1)取待测柚类品种幼嫩针叶，加液氮磨碎，提取柚类的基因组 DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特征性SSR 引物作为扩增引物，进行多重PCR扩增：
每25μLPCR反应体系组成如下：
| 反应组分 | 体积(μL) |
| 2×T5 Super PCR Mix(PAGE) | 12.5 |
| Cg_U213F(10μM) | 0.6 |
| Cg_U213R(10μM) | 0.45 |
| CT02F(10μM) | 0.55 |
| CT02R(10μM) | 0.4 |
| 30ng/μL模板DNA | 3.0 |
| ddH2O | 7.5 |
多重PCR反应条件如下：
98℃预变性2min；98℃变性10s，57.6℃退火15s，72℃延伸15s，共35个循环；最后于72℃补平2min，终止温度为4℃；
(3)内标配制：取10ml Hi-Di和80μLGeneScanTM-500LIZ Size Standard混匀，离心，以每孔10μL分装于96孔内标板，离心；将PCR扩增产物稀释，离心；取稀释产物按0.5μL/孔加入到分配好的96孔内标板中，混匀，离心，置入PCR仪，于96℃变性5min，之后在-20℃下迅速冷冻2min，离心，得到变性后的 PCR产物将变性后的PCR产物与内标同步置入ABI3730XL Genetic Analyzer进行毛细管电泳检测，用Data Collection 3.0软件收集数据；
(4)数据分析：用GeneMapper 4.1软件(ABI)对Data Collection 3.0 软件收集的原始数据进行分析，软件系统将根据目标峰的位置与同一泳道中的内标GeneScanTM-500LIZSize Standard进行比较，直接读出目标SSR片段的准确峰值(bp数)，等位变异数据记录为X/X；
(5)结果判断：若荧光毛细管电泳峰图上出现的基因型为256/256和 136/140，则待测柚类品种为特早熟玉环柚‘早玉文旦’，反之则否。
本发明的有益效果主要体现在：本发明所述的分子特征性多重荧光 SSR引物可利用幼叶DNA即同时对柚类优良品种特早熟玉环柚‘早玉文旦’进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是传统方法即根据果实形态学特征鉴别柚类品种所不能替代的分子手段。
(四)附图说明
图1为对代表5个柚类品种的DNA进行PCR扩增后的荧光毛细管电泳检测结果；A为葡萄柚(来自衢州和丽水)，B为红心柚(来自福建和台州)，C为早香柚(来自温州)，D为玉环文旦(来自玉环)，E为‘早玉文旦’(来自玉环)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
(1)柚类品种基因组DNA的提取：
取待测5个柚类品种硅胶保存的幼嫩叶片0.03g，加液氮彻底磨碎，基因组DNA的提取利用新型快速植物基因组DNA提取盒(DP3111，北京百泰克)，以提取获得柚类品种的基因组DNA粗提物。
DNA粗提物通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳和DNA/RNA紫外分光光度计(NanodropTechnologies,USA)来检测完整性、纯度及浓度。OD260/OD280>1.8的DNA样品用于后续PCR扩增。DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。
(2)分子特征性SSR引物，引物对的序列如下：
由杭州有康生物科技有限公司合成。
(3)多重PCR扩增，25μL PCR反应体系组成如下：
| 反应组分 | 体积(μL) |
| 2×T5 Super PCR Mix(PAGE) | 12.5 |
| Cg_U213F(10μM) | 0.6 |
| Cg_U213R(10μM) | 0.45 |
| CT02F(10μM) | 0.55 |
| CT02R(10μM) | 0.4 |
| 30ng/μL模板DNA | 3.0 |
| ddH2O | 7.5 |
扩增反应在Life ECO型扩增仪(Bioer，杭州博日科技)上进行。扩增条件：98℃预变性2min；98℃变性10s，57.6℃退火15s，72℃延伸15s，共35个循环；最后于72℃补平2min，终止温度为4℃。
(4)内标配制：取10ml Hi-Di和80μL GeneScanTM-500LIZ Size Standard混匀，离心，以每孔10μL分装于96孔内标板，离心。
(5)荧光毛细管电泳检测：取步骤(3)的PCR扩增产物5μL，稀释100倍后取0.5μL/孔加入到分配好的96孔内标板中，混匀，离心，放入PCR仪，于96℃变性5min，之后在-20℃下迅速冷冻2min，离心。将变性后的PCR产物与内标GeneScanTM-500LIZ Size Standard同步置入ABI 3730XL Genetic Analyzer进行毛细管电泳检测，用Data Collection 3.0 软件收集数据。
(6)基因型分析与品种鉴别：用GeneMapper 4.1软件对Data Collection 3.0软件收集的原始数据进行分析。软件系统将根据目标峰的位置与同一泳道中的内标GeneScanTM-500LIZ Size Standard进行比较，直接读出目标SSR片段的准确峰值(bp)，等位变异数据记录为X/X。根据等位变异数据的差异性比较可以鉴别不同的柚类品种。上述5个柚类品种的基因型数据见表1。
表1：五个柚类品种的基因型
表1显示来自不同产地的每个品种(葡萄柚、红心柚、早香柚、玉环文旦、‘早玉文旦’)具有相同的基因型。‘早玉文旦’的基因型为256/256 和136/140，显然不同于另外4个品种的基因型，即葡萄柚的250/250和 136/140、红心柚的256/262和136/140、早香柚的250/262和136/140、以及玉环文旦的256/256和136/136，且这4个品种间的基因型也彼此不同。这表明Cg_U213和CT02是在柚类品种间具高度多态性的SSR标记， Cg_U213和CT02不仅可以作为分子特征性SSR引物来鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’优良品种，还可以同时鉴别葡萄柚、红心柚、早香柚和玉环文旦。该分子特征性荧光SSR标记引物及方法是柚类品种鉴别与知识产权保护的有力工具。
序列表
<110> 浙江省林业科学研究院
玉环市自然资源和规划局
<120> 鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’的多重SSR标记引物及方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
aagagaaagg gagaccgagc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
ctctccctct cacgttccag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
acggtgcgtt ttgaggtaag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
tgactgttgg atttgggatg 20
Claims (4)
1.一种快速鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’品种的方法，所述方法包括：提取待测柚类品种幼嫩叶片的基因组DNA作为模板，以分子特征性多重荧光SSR引物作为扩增引物，进行多重PCR扩增，对扩增产物进行毛细管电泳检测，若荧光毛细管电泳峰图上出现的基因型为256/256和136/140，则待测柚类品种为特早熟玉环柚‘早玉文旦’；若出现的基因型为250/250和136/140、256/262和136/140、250/262和136/140以及256/256和136/136，则待测柚类品种分别为葡萄柚、红心柚、早香柚和玉环文旦；
所述分子特征性多重荧光SSR引物如下：
引物Cg_U213：
上游引物Cg_U213F：5′-FAM-AAGAGAAAGGGAGACCGAGC-3′
下游引物Cg_U213R：5′-CTCTCCCTCTCACGTTCCAG-3′；
引物CT02：
上游引物CT02F：5′-HEX-ACGGTGCGTTTTGAGGTAAG-3′
下游引物CT02R：5′-TGACTGTTGGATTTGGGATG-3′。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述PCR扩增反应条件如下：98℃预变性2min；98℃变性10 s，57.6℃退火15 s，72℃延伸15 s，共35个循环；最后于72℃补平2 min，终止温度为4℃。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述荧光毛细管电泳检测方法如下：将PCR扩增产物稀释后于96℃变性5 min，将变性后的稀释产物在-20℃下迅速冷冻2 min后置入ABI3730 XL Genetic Analyzer分析仪，与内标GeneScanTM-500 LIZ Size Standard同步进行毛细管电泳检测，用Data Collection 3.0软件收集数据。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：
（1）取待测柚类品种幼嫩针叶，加液氮磨碎，提取柚类的基因组DNA；
（2）以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，以所述分子特征性多重荧光SSR引物为扩增引物，进行多重PCR扩增：
PCR反应体系每25μL组成如下：
2×T5 Super PCR Mix 12.5μL
10 μM Cg_U213F 0.6μL
10 μM Cg_U213R 0.45μL
10 μM CT02F 0.55μL
10 μM CT02R 0.4μL
30 ng/μL模板DNA 3.0μL
ddH2O 7.5μL
多重PCR反应条件如下：
98℃预变性2 min；98℃变性10 s，57.6℃退火15 s，72℃延伸15 s，共35个循环；最后于72℃补平2 min，终止温度为4℃；
（3）内标配制：取10 ml Hi-Di 和80 μLGeneScanTM-500 LIZ Size Standard混匀，离心，以每孔10 μL分装于96孔内标板，离心；将PCR扩增产物稀释，离心；取稀释产物按0.5 μL/孔加入到分配好的96孔内标板中，混匀，离心，置入PCR仪，于96℃变性5 min，之后在-20℃下迅速冷冻2 min，离心，得到变性后的PCR产物将变性后的PCR产物与内标同步置入ABI3730 XL Genetic Analyzer进行毛细管电泳检测，用Data Collection 3.0软件收集数据；
（4）数据分析：用GeneMapper 4.1软件对Data Collection 3.0软件收集的原始数据进行分析，软件系统将根据目标峰的位置与同一泳道中的内标GeneScanTM-500 LIZ SizeStandard进行比较，直接读出目标SSR片段的准确峰值，等位变异数据记录为X/X；
（5）结果判断：若荧光毛细管电泳峰图上出现的基因型为256/256和136/140，则待测柚类品种为特早熟玉环柚‘早玉文旦’；若出现的基因型为250/250和136/140、256/262和136/140、250/262和136/140以及256/256和136/136，则待测柚类品种分别为葡萄柚、红心柚、早香柚和玉环文旦。
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