CN116497020A - 华仁杏微卫星分子标记引物组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开华仁杏微卫星分子标记引物组合及其应用，其中，华仁杏微卫星分子标记引物组合由20对微卫星分子标记引物组成，20对微卫星分子标记引物对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑40所示。本发明华仁杏微卫星分子标记引物能够用于华仁杏遗传资源评价、种质鉴定或分子标记辅助育种，解决了目前华仁杏现有遗传标记数量少，鉴定精度不足、稳定性差等问题。
Description
技术领域
本发明涉及华仁杏微卫星分子标记技术领域。具体地说是华仁杏微卫星分子标记引物组合及其应用。
背景技术
华仁杏(Armeniaca cathayana D.L.Fu et al.)作为2010年发现的杏属新种，能在含水量较低的土壤中正常生长，具有巨大的经济利用潜力。目前，人们对华仁杏的遗传信息还知之甚少，现有的遗传标记也大多是从其近缘物种中筛选得到，具有开发精度受限、针对性或重复性差等缺点，不能满足资源评价和育种工作的需要。
微卫星(SSR)是由1至6个核苷酸为基本单位组成的串联重复序列，根据其来源不同可分为基因组微卫星(Genomic-SSR)和表达序列标签微卫星(EST-SSR)两种，是目前应用较为广泛的遗传标记之一。因此，研究开发华仁杏微卫星分子标记引物对华仁杏资源评价和育种工作具有重要意义。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种华仁杏微卫星分子标记引物组合及其应用，以解决华仁杏现有遗传标记数量少，鉴定精度不足、稳定性差的问题。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
华仁杏微卫星分子标记引物组合，由20对微卫星分子标记引物组成，20对微卫星分子标记引物对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-40所示。
华仁杏微卫星分子标记引物组合的应用，将上述华仁杏微卫星分子标记引物用于华仁杏遗传资源评价、种质鉴定或分子标记辅助育种。
上述华仁杏微卫星分子标记引物组合的应用，用于华仁杏种质鉴定的操作方法包括如下步骤：
(1)提取华仁杏样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取得到的基因组DNA为模板，利用微卫星分子标记引物组合进行PCR扩增，获得PCR产物；
(3)对PCR扩增产物进行多态性检测，根据扩增产物的分子量大小对不同华仁杏种质进行区别、评价和遗传参数估算，进而完成华仁杏种质鉴定。
本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：
本发明华仁杏微卫星分子标记引物组合能够解决目前华仁杏现有遗传标记开发精度受限、传标记数量少，鉴定精度不足，针对性或重复性差的问题，可用于华仁杏遗传资源评价、种质鉴定及分子标记辅助育种。
附图说明
图1本发明实施例中引物HS1-HS96在华仁杏品种‘优一’中的琼脂糖扩增片段示意图；
图2本发明实施例中引物HS97-HS192在华仁杏品种‘优一’中的琼脂糖扩增片段示意图；
图3本发明实施例中引物H3856在华仁杏品种12054中的毛细管电泳扩增片段长度图谱；
图4本发明实施例中引物H3856在华仁杏品种龙王帽中的毛细管电泳扩增片段长度图谱；
图5本发明实施例中引物H4628在华仁杏品种12054中的毛细管电泳扩增片段长度图谱；
图6本发明实施例中引物H4628在华仁杏品种龙王帽中的毛细管电泳扩增片段长度图谱；
图7本发明实施例中引物H381在华仁杏品种11-6中的毛细管电泳扩增片段长度图谱；
图8本发明实施例中引物H381在华仁杏品种80D05中的毛细管电泳扩增片段长度图谱；
图9本发明实施例中引物H381在华仁杏品种11Y09中的毛细管电泳扩增片段长度图谱；
图10本发明实施例中引物H1572在华仁杏品种11-6中的毛细管电泳扩增片段长度图谱；
图11本发明实施例中引物H1572在华仁杏品种80D05中的毛细管电泳扩增片段长度图谱；
图12本发明实施例中引物H1572在华仁杏品种11Y09中的毛细管电泳扩增片段长度图谱；
图13本发明实施例中引物HS18在华仁杏品种龙王帽中的毛细管电泳扩增片段长度图谱；
图14本发明实施例中引物HS7在华仁杏品种YB5中的毛细管电泳扩增片段长度图谱；
图15本发明实施例中引物HS40在华仁杏品种G2中的毛细管电泳扩增片段长度图谱；
图16本发明实施例中引物HS113在华仁杏品种YB5中的毛细管电泳扩增片段长度图谱。
具体实施方式
1材料与方法
1.1试验材料
转录组测序样本来源于华仁杏品种“中仁1号”幼果。测序时每株树采4个幼果，3次重复，RNA-Seq转录组测序试验委托联川生物技术有限公司进行。测序结果组装采用DeNovo的方法(参见Grabherr M G，Haas B J，Yassour M，et al.Full-lengthtranscriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome)，组装后共得到25692条Unigene，作为微卫星标记开发的基础数据。SSR分子标记扩增试验及位点检测分析所用的样本来自华仁杏的主栽品种及优良无性系。
1.2试验方法
1.2.1样本DNA提取
每个品种或无性系取1至两片嫩叶，采用试剂盒对叶片进行DNA提取，采用琼脂糖凝胶电泳和nondrop检测提取的DNA浓度和质量，DNA提取后-20℃保存备用。
1.2.2转录组微卫星位点的鉴别和引物设计
以转录组测序数据为基础，采用MISA软件进行微卫星位点查找，查找标准为2、3、4、5、6核苷酸的最小重复次数分别为6次、5次、5次、5次、5次。用Primer3软件进行引物批量设计。设计标准为：微卫星位点侧翼序列长度≥50bp；PCR产物大小在100～350bp；引物长度在18～26bp；引物解链温度Tm在55～70℃之间；上下游引物的解链温度Tm≦2℃；GC含量在40％～60％之间。引物设计过程中尽量避免错配和引物二聚体的出现，引物设计完成后在数据库中对引物进行Blast验证。
1.2.3引物筛选与PCR扩增
经过评估和筛选，最终合成的引物用于PCR扩增，微卫星位点主要分布在2-5个核苷酸重复单元。PCR反应体系为20μL，其中2×Taq Master Mix10μL；10μmol·L-1的正反向引物各0.5μL；dd H2O 8μL；50ng·μL-1的DNA模板1μL。扩增程序为95℃预变性5min；然后进行33个循环，每个循环包括95℃变性30s，55℃退火30s(退火温度因不同引物而异)，72℃延伸30s；最后72℃延伸5min。PCR产物首先用2％琼脂糖凝胶电泳进行初步检测，舍去没有条带的或扩增效果不好的引物，然后将引物进行荧光标记后用毛细管电泳进行多态性筛选，并进行多态性分析。
1.2.4数据分析
每对引物作为1对等位基因位点，统计等位基因数量并利用Power Marker V3.25软件计算引物多态性信息量(PIC)。
2结果与分析
2.1微卫星引物的筛选与验证
通过对具有较高微卫星重复次数的引物进行进一步的试验验证，结果表明，参试的引物中有20对引物可检测出多态性位点(表1)。
表1
2.2微卫星多态性检验
毛细管电泳结果显示，样本DNA在20个微卫星位点共检测到102个等位基因，平均每对引物检测到5.1个等位基因，引物的多态性信息含量(PIC)介于0.21-0.78之间；开发出的20个标记中，有9个标记为高度多态性位点(PIC≧0.5)，占多态性引物比例的45％，10个标记为中度多态性位点(0.5>PIC>0.25)。
可见，本实施例中华仁杏微卫星分子标记引物组合质量较好，可用于华仁杏遗传资源评价、种质鉴定及分子标记辅助育种。通过不同引物组合以待测品种的DNA为模板进行PCR扩增，将扩增获得的PCR产物进行毛细管电泳，获得扩增片段长度，通过不同的扩增片段大小对不同品种进行鉴定和区分。
Claims (3)
1.华仁杏微卫星分子标记引物组合，其特征在于，由20对微卫星分子标记引物组成，20对微卫星分子标记引物对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-40所示。
2.华仁杏微卫星分子标记引物组合的应用，其特征在于，将如权利要求1所述的华仁杏微卫星分子标记引物用于华仁杏遗传资源评价、种质鉴定或分子标记辅助育种。
3.根据权利要求2所述的华仁杏微卫星分子标记引物组合的应用，其特征在于，用于华仁杏种质鉴定的操作方法包括如下步骤：
(1)提取华仁杏样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取得到的基因组DNA为模板，利用微卫星分子标记引物组合进行PCR扩增，获得PCR产物；
(3)对PCR扩增产物进行多态性检测，根据扩增产物的分子量大小对不同华仁杏种质进行区别、评价和遗传参数估算，进而完成华仁杏种质鉴定。
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