CN116144819B - 与南瓜果肉类胡萝卜素主效qtl紧密连锁的snp分子标记及其应用 - Google Patents

与南瓜果肉类胡萝卜素主效qtl紧密连锁的snp分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了与南瓜果肉类胡萝卜素主效QTL紧密连锁的SNP分子标记及其应用，属于植物分子遗传育种领域。该SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，在第79bp处有一个C/A碱基突变。该分子标记与南瓜果肉类胡萝卜素呈现紧密连锁标记特征，采用本发明的方法，利用南瓜种子或长出真叶的早期幼苗即可鉴定南瓜果肉类胡萝卜素性状，试验准确度高，成本低、耗时短，本发明可用于南瓜分子标记辅助选择育种，加速南瓜营养品质育种的进程。

Description

与南瓜果肉类胡萝卜素主效QTL紧密连锁的SNP分子标记及其 应用
技术领域
本发明涉及植物分子遗传育种领域，特别是涉及与南瓜果肉类胡萝卜素主效QTL紧密连锁的SNP分子标记及其应用。
背景技术
类胡萝卜素是叶绿体、有色体等质体中合成的色素类物质，作为果实内含物既可以保护果实抵御紫外胁迫发挥抗氧化功能，也可以作为人体的营养元素发挥功效。在自然界中种类多样，如：胡萝卜素类(番茄红素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素)；叶黄素类(玉米黄质、叶黄素、紫黄质、新黄质)；脱辅基类胡萝卜素(β-紫罗酮、β-橙色素、独角金内酯SLs、脱落酸ABA)。
南瓜是富含类胡萝卜素的菜粮兼用作物，其丰富的类胡萝卜素组成及含量可与胡萝卜相当。南瓜作为类胡萝卜素的富集物种，多食不仅可以过滤蓝光，改善现今由于电子产品屏幕使用时间过高导致的视力异常，防止视网膜损伤，而且还对维持年长者的认知能力、语言能力有利。加之现今人们对于植物源功能性营养成分的高品质追求，因此研究南瓜果肉类胡萝卜素的遗传及分子标记，选育符合市场需求的高类胡萝卜素南瓜新品种具有重要意义。
全基因组关联分析(GWAS，Genome-wide Association Study)利用群体在自然选择和人工选择中发生的重组和遗传多样性，并通过基因芯片、重测序等对自然群体进行测序，基于生物信息学技术对基因型和表型进行分析，从而检测QTL、鉴定目标性状的功能位点。与传统的连锁作图相比，GWAS选用自然群体，无需构建专门的作图群体；而且GWAS信息更全面，其利用的是全基因组的序列信息，全方位体现了个体或群体的遗传背景及关系，真实反映了品种间的亲缘关系。GWAS能在全基因组水平挖掘多个有利等位基因，能检测到基因组上所有主效QTL及大量微效QTL，某一座位上多个等位基因型及多个性状的关键基因结构变异能被同时检测到，提高了功能基因在育种中的价值；并且GWAS解析精度高，能精确到单个SNP位点，可直接找到致因突变，进行未知基因的挖掘。因此，GWAS方法目前已广泛应用于不同作物的重要农艺性状的关键基因挖掘，可大大地缩短基因定位的时间，降低劳动强度，为南瓜重要农艺性状的遗传分子机制研究提供了新思路，推动南瓜传统育种向高效、精准的分子育种转变。
单核苷酸多态性(SNPs)，是继限制性酶切片断长度多态性、可变数量重复序列和微卫星多态性之后的新一代多态性遗传标记，KASP技术(竞争性等位基因特异性PCR)是国际上SNP分型的主流方法之一，可以对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断。这项技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels(插入和缺失)。KASP技术用于大规模检测SNP标记基因分型，缩短标记验证时间，减少标记检测成本，是当前应用于植物分子标记定位和大群体扫描的重要方式。KASP分型技术基于自己独特的PCR原理，可以让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，这大大降低了KASP的试剂成本，既有金标准的准确，又降低了使用成本，所以在医学、农学检测方面KASP都具有非常好的应用前景。
然而，截至目前有关南瓜果肉类胡萝卜素的基因及其分子标记开发的研究较少。基于此，本发明拟研究获得有关南瓜果肉类胡萝卜素的调控基因，开发辅助选择育种分子标记，开展生物学功能研究，为深入了解南瓜果肉类胡萝卜素形成机制及分子育种奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供与南瓜果肉类胡萝卜素主效QTL紧密连锁的SNP分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该分子标记与南瓜果肉类胡萝卜素呈现紧密连锁标记特征，利用KASP技术获得SNP分型，能够准确高效地鉴定南瓜果肉类胡萝卜素性状，可用于南瓜分子标记辅助选择育种，加速南瓜营养品质育种的进程。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供与南瓜果肉类胡萝卜素主效QTL紧密连锁的SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，在第79bp处有一个C/A碱基突变。
本发明还提供一种检测上述SNP分子标记的引物组，所述引物组包括两条正向引物和一条反向引物，两条所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供一种鉴定南瓜果肉类胡萝卜素含量的试剂盒，所述试剂盒包含上述的引物组。
本发明还提供一种鉴定南瓜果肉类胡萝卜素含量的方法，包括以下步骤：
以待测南瓜的基因组DNA为模板，利用上述的引物组或上述的试剂盒对模板进行KASP PCR扩增，利用扩增结果进行基因分型。
进一步地，若基因分型结果为CC，则待测南瓜为低类胡萝卜素品种；若基因分型结果为AA，则待测南瓜为高类胡萝卜素品种。
进一步地，所述KASP PCR扩增的反应体系为：DNA 10-100ng、2×PARMS Mastermix 5μL、混合引物0.7μL，H2O补足至10μL；其中，所述混合引物包括两条所述正向引物各0.15μL和所述反向引物0.4μL。
进一步地，所述KASP PCR扩增的反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，65-57℃复性/延伸60s，每个循环降0.8℃，10个循环；94℃变性20s，57℃复性/延伸60s，32个循环。
进一步地，所述待测南瓜包括南瓜种子、幼苗或果肉。
本发明还提供一种上述的SNP分子标记或上述的引物组或上述的试剂盒的应用，所述应用用于如下任一项应用中：
(1)鉴定南瓜果肉类胡萝卜素；
(2)筛选具有高类胡萝卜素的南瓜品种或品系；
(3)调控南瓜果肉类胡萝卜素性状；
(4)改良南瓜种质资源；
(5)南瓜分子育种。
本发明公开了以下技术效果：
本发明以实验室收集的268份中国南瓜核心种质资源为自然群体材料，通过全基因组重测序技术获得基因型，并调查自然群体表型数据，将基因型数据与表型数据结合进行全基因组关联分析，超过-log10P阈值6，类胡萝卜素中的叶黄素和紫黄质都显著关联到2号染色体的一个区段，其中位于2号染色体的FCa_SNP1位点与各类胡萝卜素关联最显著，此位点在叶黄素中的-log10(P)＝15.96，紫黄质中的-log10(P)＝11.16。该SNP分子标记位于南瓜2号染色体9542057bp的位置处，其多态性为C/A，低类胡萝卜素为C，高类胡萝卜素为A。
现有技术鉴定南瓜果肉类胡萝卜素性状是在果实商品成熟期基于有损检测，即生化HPLC-PDA检测才可明确的品质性状，成本高、工序复杂，在无色谱平台的实验室较难开展。本发明的分子标记可利用南瓜种子或长出真叶的早期幼苗即可鉴定，而且可以对商品期的果实无需切开检测即可知表型，另外本发明利用KASP技术，基于引物末端碱基的特异匹配进行SNP分型及检测，试验准确度高，成本低、耗时短，可用于南瓜分子标记辅助选择育种，加速南瓜营养品质育种的进程。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为部分GWAS南瓜群体外观图和纵切图；
图2为南瓜类胡萝卜素性状全基组关联分析图；A为紫黄质的曼哈顿图，为遗传标记效应值即经F检验的全基因组P值按染色体上物理位置排序图，横坐标为基因组坐标，纵坐标-log10P，P值越小关联性越强，表现为纵坐标越大；B为紫黄质的关联分析Quantile-Quantile图；C为叶黄素的曼哈顿图；D为叶黄素的关联分析Quantile-Quantile图；
图3是FCa_SNP1位点在类胡萝卜素极端差异的77份遗传背景较远的自然群体中的KASP标记基因分型图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
与南瓜果肉类胡萝卜素主效QTL紧密连锁的SNP分子标记的获得
1GWAS种质资源信息
1.1材料与试剂
本研究所用的268份南瓜自然群体材料是课题组多年收集纯化的资源，包括高代自交材料、表型纯合的农家种和少量的F1代现代商业品种，这些资源来源于12个国家，分别是中国、泰国、印度、巴基斯坦、柬埔寨、菲律宾、马来西亚、日本、美国、西班牙、澳大利亚、俄罗斯，其中，来自于中国有214份，来自于国外有54份。国内资源收集地主要包括广东、广西、浙江、云南、新疆、香港、台湾、内蒙古、上海、陕西、陕西、山东、河南、河北、北京、重庆、甘肃、福建、安徽、黑龙江，其中广东省收集资源最多，达到83份。
引物由上海生工生物合成，均为PAGE级纯化。
1.2类胡萝卜素在GWAS群体里的变异范围分析
南瓜样本均采样切片后迅速放置于液氮冷冻，后置于冷冻干燥机冻干，研磨成粉末，利用HPLC-PDA系统分析其类胡萝卜素组成和含量，检测波长450nm，色谱柱是WatersODS2(4.6×250mm，5μm)，柱温是25℃，提取液是丙酮，流动相梯度洗脱，测定类胡萝卜素含量，各标准品均为色谱级。
对从国内外收集的268份类胡萝卜素性状多态性极其丰富的中国南瓜资源群体进行检测，结果发现类胡萝卜素在群体中差幅度极大，紫黄质含量从1.01μg/g DW到213.32μg/g DW，变异系数112.5％，叶黄素的从0.08μg/g DW到1292.97μg/g DW，变异系数159.4％。图1是部分GWAS南瓜群体外观图和纵切图。
2南瓜类胡萝卜素性状全基组关联分析
2.1基因DNA的提取
采用改良十六烷基三甲基溴化铵法(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB法)提取中国南瓜268份自然群体的基因组的DNA。2％琼脂糖凝胶电泳检测南瓜DNA的质量与浓度，将其稀释至50～100ng/μL待用。
2.2重测序数据的分析
委托诺禾致源公司完成268份南瓜建库和重测序。基于二代重测序平台IlluminaHi-Seq，经过DNA质检，建库，上机测序并过滤，最终得到clean reads data共1452.15Gb，平均每个样品5.37GB，对基因组的平均测序深度达到:16.58×，测序最大深度为：30.6，最低深度为：9.28。比对到中国南瓜参考基因组，得到.bam格式的结果文件，统计各个样品的比对率，所有样品比对的平均覆盖度为：96.38％，最低覆盖度为：68.78％，最高覆盖度为：99.37％。经过滤得到了1,157,313个高质量SNP位点。并且染色体上的SNP的平均密度为0.2Kb/SNP。重测序数据表明，数据的深度以及质量可以满足在后续的研究中使用。
2.3类胡萝卜素全基因组关联分析
全基因组关联分析是一种对全基因组范围内的常见遗传变异(单核苷酸多态性和拷贝数)基因总体关联分析的方法，本发明利用GEMMA分析软件，采用混合线性模型(MixedLinear Model,MLM)对相关性状进行关联分析，通过关联的显著度(P-value)，筛选出潜在的候选SNPs。
运行分析得出与类胡萝卜素关联的SNP的P值，manhattan plot图中设定-log10(P)≥6值为紧密关联SNP，类胡萝卜素中的叶黄素和紫黄质都显著关联到2号染色体的一个区段，其中位于2号染色体的一个SNP位点与各类胡萝卜素关联最显著，命名为FCa_SNP1，此位点在叶黄素中的-log10(P)＝15.96，紫黄质中的-log10(P)＝11.16(见图2中A-D)。该SNP分子标记位于南瓜2号染色体9542057bp的位置处，其多态性为C/A，低类胡萝卜素为C，高类胡萝卜素为A。
实施例2
KASP技术用于检测南瓜果肉类胡萝卜素的基因分型
本发明设计了扩增FCa_SNP1位点的特异性引物对，包括两条末端碱基不同的等位基因正向引物与一条反向引物，两条正向引物5’端分别连有不同的检测接头序列；该组特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示：
正向引物F1(下划线部分为FAM标签序列)：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCTTCAGGTCATCGAACTCGTG-3’(SEQ ID NO.1)；
正向引物F2(下划线部分为HEX标签序列)：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCTTCAGGTCATCGAACTCGTT-3’(SEQ ID NO.2)；
反向引物R：5’-CATCACGACTCTGCCACTGCT-3’(SEQ ID NO.3)。
两条正向引物的末端碱基不同，差异碱基为SNP位点。
KASP反应体系具体为：DNA(10-100ng)，2×PARMS Master mix(5μL)，primer mix(0.7μL)[F1(0.15μL)，F2(0.15μL)，R(0.4μL)]，H2O(N/A)，Total reaction volume(10μL)。
KASP反应程序：94℃预变性15min；94℃变性20s，65-57℃复性/延伸60s，每个循环降0.8℃，10个循环；94℃变性20s，57℃复性/延伸60s，32个循环。
PCR反应I：变性模板与Primer Mix中相匹配的引物结合并退火，延伸后序列被加上了检测接头序列；
PCR反应II：等位基因特异性的末端序列的互补链合成；
PCR反应III：信号产生---特异序列对应的检测序列随PCR反应进行指数性增长，相应信号被检测。
PCR完成后，使用TECAN infinite M1000酶标仪读取荧光信号，然后利用在线软件snpdecoder(http://www.snpway.com/snpdecoder/)解析转换荧光信号，得到清晰直观的分型图，并根据颜色不同，输出基因型结果。图表分为X，Y轴，每一个数据点代表一个独立的DNA样品，相同基因型的样品会聚堆在一起呈现相同的颜色。靠近X，Y轴的是纯合基因型(蓝点FAM，绿点HEX)。低类胡萝卜素的基因型为C，在靠近X轴的位置(蓝点FAM)，高类胡萝卜素的基因型为A，在靠近Y轴的位置(绿点HEX)。
其中PCR产物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
PCR产物序列(SEQ ID NO：4)：
CATCACGACTCTGCCACTGCTGCCGCCGCCACCACCGCCACTTCCCACCACCTAGCCTTCCCAAACGGATTTTCTCAGMACGAGTTCGATGACCTGAAGC。
注：该序列第79位碱基位置为SNP位点，该位置的多态性为C/A。
选取在268份自然群体中类胡萝卜素极端差异的77份材料，含量如表1所示：其中低类胡萝卜素39份，高类胡萝卜素38份，为证实本发明筛选的分子标记的检测准确性，采用此KASP标记对此群体进行分型，分型结果如表1和图3所示：极端低类胡萝卜素的个体聚团在靠近X轴的位置(纯合CC，蓝点)，极端高类胡萝卜素的个体聚团在靠近Y轴的位置(纯合AA，绿点)。证明该SNP标记与性状紧密连锁。
表1南瓜77份自然群体的类胡萝卜素含量及FCa_SNP1标记的检测结果
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.与南瓜果肉类胡萝卜素含量相关的SNP分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.4所示，在第79 bp处有一个C/A碱基突变。
2.一种检测权利要求1所述SNP分子标记的引物组，其特征在于，所述引物组包括两条正向引物和一条反向引物，两条所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种鉴定南瓜果肉类胡萝卜素含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2所述的引物组。
4.一种鉴定南瓜果肉类胡萝卜素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以待测南瓜的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的引物组或权利要求3所述的试剂盒对模板进行KASP PCR扩增，利用扩增结果进行基因分型。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，若基因分型结果为CC，则待测南瓜为低类胡萝卜素品种；若基因分型结果为AA，则待测南瓜为高类胡萝卜素品种。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述KASP PCR扩增的反应体系为：DNA 10-100 ng、2×PARMS Master mix 5 μL、混合引物0.7 μL，H2O补足至10 μL；其中，所述混合引物包括两条所述正向引物各0.15 μL和所述反向引物0.4 μL。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述KASP PCR扩增的反应程序为：94℃预变性15 min；94℃变性20 s，65-57℃复性/延伸60 s，每个循环降0.8℃，10个循环；94℃变性20 s，57℃复性/延伸60 s，32个循环。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待测南瓜包括南瓜种子、幼苗或果肉。
9.一种权利要求1所述的SNP分子标记或权利要求2所述的引物组或权利要求3所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述应用用于如下任一项应用中：
（1）鉴定南瓜果肉类胡萝卜素含量；
（2）筛选具有高类胡萝卜素的南瓜品种或品系。
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CN107142315A (zh) * 2017-05-31 2017-09-08 广东省农业科学院蔬菜研究所 与南瓜叶黄素含量主效qtl紧密连锁的snp分子标记及其应用
CN111621586A (zh) * 2020-05-11 2020-09-04 广东省农业科学院蔬菜研究所 一种南瓜黄茎性状紧密连锁的snp分子标记及其应用

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中国南瓜育种研究进展;李俊星等;《广东农业科学》;第48卷(第9期);第12-21页 *

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