CN116411118B - 与南瓜蔗糖含量主效qtl连锁的kasp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与南瓜蔗糖含量主效QTL连锁的KASP分子标记及其应用，属于分子生物学检测技术及南瓜遗传育种技术领域。所述分子标记为分子标记347798和分子标记347840中的一种或多种；分子标记347798的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，分子标记347840的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；分子标记347798和分子标记347840定位于南瓜15号染色体上，且位于8201165‑8236299bp区段内。本发明的分子标记与南瓜果肉蔗糖含量呈现紧密连锁标记特征，通过KASP技术获得SNP分型，可以灵敏、高效、低成本的预测果实蔗糖含量，推动南瓜分子育种进程。

Description

与南瓜蔗糖含量主效QTL连锁的KASP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术及南瓜遗传育种技术领域，特别是涉及与南瓜蔗糖含量主效QTL连锁的KASP分子标记及其应用。

背景技术

南瓜是葫芦科南瓜属一年生草本植物，其耐储藏便运输，营养丰富，加工价值高，是具有重要经济价值的蔬菜。中国南瓜是南瓜属的三个栽培品种之一，其在中国的种植面积位于三个南瓜栽培种之首。碳水化合物是人类饮食中最重要的能量来源，是植物生长和发育的基础。可溶性糖是重要的碳水化合物，参与生物体的重要生理和功能代谢途径，并确保植物的生长和发育。糖类化合物也是果蔬其他质量特征和风味物质合成的前体和基础物质，如有机酸、花青素、香气、淀粉、纤维素和类胡萝卜素。此外，果实甜味也是重要的品质性状。在中国南瓜中可溶性糖，主要包括蔗糖、葡萄糖和果糖，随着果实的成熟，葡萄糖和果糖呈先增加后降低的趋势，而蔗糖的含量一直升高。在中国南瓜果实发育的后期，蔗糖是主要的可溶性糖，是果实中糖分的主要存储形式，也是果实甜味的最大贡献者。因此，通过研究蔗糖含量的遗传与分子标记，对筛选满足市场需求的不同甜度的南瓜品种具有重要的意义。

QTL定位是通过DNA分子标记和性状表型数据关联分析，将已知的分子标记定位未知的QTL(数量性状基因座)，通过分子间标记与QTL的连锁关系，从而估算某一数量性状连锁的标记和基因。单核苷酸多态性位点(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性，如基因组上单个碱基的转换、颠换、插入和缺失。竞争性等位基因特异性PCR(KompetitiveAllele Specific PCR，KASP)可在广泛的基因组DNA样品中(甚至是一些复杂基因组的DNA样品)，对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断。KASP位点特异性扩增强，标记转化率高，可以快速、准确、灵敏的特定的突变位点，可大大缩短育种的周期提高育种效率。

发明内容

本发明的目的是提供与南瓜蔗糖含量主效QTL连锁的KASP分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明的分子标记与南瓜果肉蔗糖含量呈现紧密连锁标记特征，通过KASP技术获得SNP分型，可以准确、高效、低成本的鉴定南瓜果实蔗糖含量性状，为南瓜品种的选育提供有力的技术支持，从而推动南瓜品质育种改良的进程。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种与南瓜蔗糖含量主效QTL连锁的分子标记，所述分子标记为分子标记347798和分子标记347840中的一种或多种；所述分子标记347798的核苷酸序列如SEQID NO：1所示，所述分子标记347840的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述分子标记347798和分子标记347840定位于南瓜15号染色体上，且均位于8201165-8236299bp区段内。

进一步地，所述分子标记347798和分子标记347840的第151bp处均有一个T/C碱基突变。

本发明还提供一种检测所述分子标记的KASP引物组，检测分子标记347798的KASP引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的第一下游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的第二下游引物；

检测分子标记347840的KASP引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的第一下游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的第二下游引物。

本发明还提供一种所述分子标记的检测试剂或检测试剂盒，包含所述的KASP引物组。

本发明还提供一种所述的分子标记、所述的KASP引物组或所述的检测试剂或检测试剂盒的应用，用于如下任一项应用中：

(1)鉴定南瓜蔗糖含量；

(2)筛选高低蔗糖含量的南瓜品种或品系；

(3)南瓜分子标记辅助育种；

(4)改良南瓜种质资源。

本发明还提供一种鉴定南瓜蔗糖含量高低的方法，包括如下步骤：

以待测南瓜样品的基因组DNA作为模板，利用所述的KASP引物组或所述的检测试剂或检测试剂盒对模板进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果判断南瓜蔗糖含量高低。

进一步地，若扩增结果显示所述分子标记347798的碱基突变为C或分子标记347840的碱基突变为T时，则判断待测南瓜样品蔗糖含量高。

进一步地，所述荧光定量PCR扩增的程序为：94℃预变性15min，94℃变性20s，65-75℃梯度复性/延伸1min，10个循环；94℃变性20s，57℃复性/延伸1min，30个循环。

进一步地，所述荧光定量PCR扩增的体系为：2×PARMS master mix 5μL，上游引物0.15μL，第一下游引物0.15μL，第二下游引物0.15μL和DNA模板10-100ng，总体积为10μL。

本发明公开了以下技术效果：

本发明以中国南瓜高代自交系COM-E(低蔗糖亲本P1)和COM-X(高蔗糖亲本P2)为亲本构建含有122个株系的重组自交群体，利用重测序技术和HighMap软件对上述中国南瓜RIL遗传分离群体(包括2个亲本和122个子代)开发高密度SNP，并进行遗传图谱的构建。利用MapQTL5软件采用复合区间作图法(MQM)对上述收集得到的群体表型数据和遗传图谱信息进行分析和计算，将蔗糖含量相关基因定位在15号染色体8201165-8236299bp区间，该区间LOD＝3.25，Exp％＝8.23。针对此区间设计两个SNP标记分别为347798和347840，该SNP标记可将高低蔗糖含量的南瓜材料进行区分。Marker 347798对应高蔗糖含量的基因型为HEX，低蔗糖含量的基因型为FAM；Marker 347840对应高蔗糖含量的基因型为FAM，低蔗糖含量的基因型为HEX。

HPLC-RI可以灵敏检测南瓜果实中蔗糖含量，但是该方法具有仪器依赖性，在无色谱平台的实验室无法开展相关检测。无论是HPLC-RI检测还是常规生理生化检测，都是基于对南瓜果实的有损检测。本发明的分子标记可以通过对南瓜种子或者幼苗进行基于SNP的KASP分型鉴定，可以灵敏、高效、低成本的预测果实蔗糖含量，推动南瓜分子育种进程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为RIL群体的部分南瓜外观照片；

图2为南瓜蔗糖基因在高密度遗传连锁图谱的初步定位结果图：横坐标表示连锁群的位置，纵坐标表示LOD值；灰色横线标记的阈值是代表p<0.05的关联阈值，表示关联性显著；

图3为分子标记347798在蔗糖含量极端差异77份材料里的荧光信号基因分型结果，绿色为基因型HEX，蓝色为基因型FAM；

图4为分子标记347840在蔗糖含量极端差异77份材料里的荧光型号基因分型结果，绿色为基因型HEX，蓝色为基因型FAM。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1遗传群体的构建及遗传分析

(1)供试植物材料的选择：

在下述实施例中，供试植物材料以中国南瓜高代自交系COM-E(低蔗糖亲本P₁)和COM-X(高蔗糖亲本P₂)亲本构建含有122个株系的重组自交群体(RIL群体)(亲本材料由广东省农业科学院蔬菜研究所钟玉娟研究员提供)，于2019年上半年种植于广东省农业科学院蔬菜研究所白云基地试验田内。图1为RIL群体的部分南瓜外观照片。

(2)南瓜果实蔗糖含量的测定：

收取上述122株RIL群体中单株南瓜果实，进行切片冻干，研磨成粉，以色谱级乙腈：水(5：5，V：V)作为提取液，4℃、12000r/min离心15min取上清，利用HPLC-RI系统定量检测可溶性糖组成及其含量(部分RIL群体蔗糖含量检测结果见表1)。

实施例2南瓜遗传图谱构建和蔗糖含量的初步定位

(1)南瓜基因组DNA的提取：

后续文库构建需要的DNA使用本领域常规的CTAB法提取。分别提取南瓜亲本(COM-E和COM-X)及122株RIL群体的基因组DNA。

(2)遗传图谱的构建：

利用重测序技术和HighMap软件对上述中国南瓜RIL遗传分离群体(包括2个亲本和122个子代)开发高密度SNP，并进行遗传图谱的构建。

(3)蔗糖含量基因的QTL定位：

利用MapQTL5软件采用复合区间作图法(MQM)对上述收集得到的群体表型数据和遗传图谱信息进行分析和计算，以获得性状相关的QTL。通过置换检测(Permutation test，PT)检验1000次，以进行阈值设定。其中，QTL判断标准为：p值小于0.05时对应的LOD值作为筛选的阈值。

如图2所示，图中灰色的部分为筛选的阈值范围。而超过阈值表示为一个基因的连锁定位区间，从图2可以看出，糖含量基因在15号染色体有定位，定位在15号染色体的两个SNP标记347798和347840之间，区间从8201165bp到8236299bp。

其中，经过测序可得SNP标记347798的序列为：

其中，下划线阴影标记的T具有T→C的变化(即自SEQ ID NO：1所示序列的5’端起第151位碱基是SNP位点，其碱基为T或C)。

SNP标记347840的序列为：

其中，下划线标记的T具有T→C的变化(即自SEQ ID NO：2所示序列的5’端起第151位碱基是SNP位点，其碱基为T或C)。

实施例3KASP分子标记的开发和验证

根据上述实施例中获得的分子标记347798和分子标记347840的SNPs标记信息，设计KASP引物。

在本发明实施例中，其设计得到的KASP引物由3条序列组成：上游引物F、下游引物R1和下游引物R2引物。

其中，下游R1和R2引物分别带有FAM(蓝色)和HEX(绿色)荧光接头。上游引物F与普通PCR引物结构一样。

下游引物(下游引物R1和下游引物R2)则由依次由3个部分组成：通用接头序列、普通扩增引物序列和分型位点序列。

其中，用于扩增分子标记347798的具体KASP引物序列如下所示：

上游引物F：

5’-CTTTTCCACTAACTTTCCTAATCATCT-3’(SEQ ID NO：3)；

下游引物R1：

下游引物R2：

其中，下游引物中的斜体为通用接头序列，正体部分为普通扩增引物序列，3’末尾的加粗的一个碱基T(针对SEQ ID NO：4)和C(针对SEQ ID NO：5)为分型位点(序列)。

如图3所示。在利用分子标记347798基因分型检测糖含量分布时，当分子标记347798所在的等位基因中均为T时，检测样品会与特定的FAM检测引物结合并释放出蓝色荧光基团，随着PCR反应循环数的增加，蓝色荧光信号增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实中蔗糖含量低的基因型(KASP标记的分型结果定义为：FAM)。当该位点的等位基因碱基均为C时，检测样品与特定的HEX检测引物结合并释放出绿色荧光基团，随着PCR反应循环数的增加，绿色荧光信号被增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实中蔗糖含量高的基因型(KASP标记的分型结果定义为：HEX)。

用于扩增分子标记347840的具体KASP引物序列如下所示：

上游引物F：

5’-CGTGATTTAGAAACCCATGAGACTAC-3’(SEQ ID NO：6)；

下游引物R1：

下游引物R2:

其中，上游引物中的斜体部分为通用接头序列，正体部分为普通扩增引物序列，3’末尾的加粗的一个碱基T(针对SEQ ID NO：7)和C(针对SEQ ID NO：8)为分型位点(序列)。

如图4所示。在利用分子标记347840基因分型检测蔗糖含量分布时，当分子标记347840所在的等位基因中均为T时，检测样品与特定的FAM检测引物结合并释放出蓝色荧光基团，随着PCR反应循环数的增加，蓝色荧光信号增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实中蔗糖含量高的基因型(KASP标记的分型结果定义为：FAM)。当分子标记347840所在的等位基因中均为C时，检测样品与特定的HEX检测引物结合并释放出绿色荧光基团，随着PCR反应循环数的增加，绿色荧光信号增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实中蔗糖含量低的基因型(KASP标记的分型结果定义为：HEX)。

其中，上述分子标记347798和347840基因分型检测，所涉及的PCR反应体系及PCR反应条件如下：

PCR检测体系为：2×PARMS master mix(5μL)，上游引物F(10μM，0.15μL)，下游分型引物R1(10μM，0.15μL)，下游分型引物R2(10μM，0.15μL)，DNA模板(10-100ng)，总体积为10μL；

PCR检测条件为：94℃预变性15min；94℃变性20s，65-75℃梯度复性/延伸1min(每个循环降温0.8℃)，10个循环；94℃变性20s，57度复性/延伸1min，30个循环。

PCR完成后，使用TECAN infinite M1000酶标仪读取荧光信号，然后利用在线软件snpdecoder(http://www.snpway.com/snpdecoder/)解析转换荧光信号，得到清晰直观的分型图，并根据颜色不同，输出基因型结果(图3和图4)。

在122份RIL群体材料中，选取蔗糖含量极端差异的77份材料，蔗糖含量如表1所示：其中高蔗糖含量的材料45份，低蔗糖含量的材料32份，采用本文所用的两个分子标记347798和分子标记347840的荧光信号进行KASP分型分析，分型结果如图3和图4所示。其中分子标记347798，将高蔗糖含量的材料归于HEX中，低蔗糖含量的材料归于FAM中；分子标记347840，将高蔗糖含量的材料归于FAM中，低蔗糖的材料归于HEX中。以上实验结果表明这两个Marker对应的SNP标记与性状紧密连锁。

表177份RIL群体的蔗糖含量

若使用其他公知的方法对分子标记347798和分子标记347840进行检测，确定其SNP情况，也可以达到相同的目的。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种与南瓜蔗糖含量主效QTL连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为分子标记347798和分子标记347840中的一种或多种；所述分子标记347798的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，所述分子标记347840的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述分子标记347798和分子标记347840定位于南瓜15号染色体上，且均位于8201165-8236299bp区段内；

所述分子标记347798和分子标记347840的第151bp处均有一个T/C碱基突变。

2.一种检测权利要求1所述分子标记的KASP引物组，其特征在于，检测分子标记347798的KASP引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的第一下游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的第二下游引物；

检测分子标记347840的KASP引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的第一下游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的第二下游引物。

3.一种权利要求1所述分子标记的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的KASP引物组。

4.一种权利要求1所述的分子标记、权利要求2所述的KASP引物组或权利要求3所述的检测试剂或检测试剂盒的应用，其特征在于，用于如下任一项应用中：

(1)鉴定南瓜蔗糖含量；

(2)筛选高低蔗糖含量的南瓜品种或品系。

5.一种鉴定南瓜蔗糖含量高低的方法，其特征在于，包括如下步骤：

以待测南瓜样品的基因组DNA作为模板，利用权利要求2所述的KASP引物组或权利要求3所述的检测试剂或检测试剂盒对模板进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果判断南瓜蔗糖含量高低。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，若扩增结果显示权利要求1中所述分子标记347798的碱基突变为C或分子标记347840的碱基突变为T时，则判断待测南瓜样品蔗糖含量高。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的程序为：94℃预变性15min，94℃变性20s，65-75℃梯度复性/延伸1min，10个循环；94℃变性20s，57℃复性/延伸1min，30个循环。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的体系为：2×PARMSmaster mix 5μL，上游引物0.15μL，第一下游引物0.15μL，第二下游引物0.15μL和DNA模板10-100ng，总体积为10μL。