CN114703313B - 一种菰黑粉菌分型鉴定方法及其应用 - Google Patents

一种菰黑粉菌分型鉴定方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种菰黑粉菌分型鉴定方法及其应用，属于分子生物技术领域。本发明提供了一种用于菰黑粉菌分型鉴定的靶标，所述靶标来源于T型菰黑粉菌，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的一种菰黑粉菌分型鉴定方法，可定量检测复杂样品中T型菰黑粉菌，检测限低至0.0088ng/μL(22.36copies/μL)，同时实现了对植物不同时期以及不同组织中T型菰黑粉菌的定量检测。

Description

一种菰黑粉菌分型鉴定方法及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及一种菰黑粉菌分型鉴定方法及其应用。
背景技术
菰黑粉菌(Ustilago esculenta)，属黑粉菌目(Ustilaginales)黑粉菌科(Ustilaginaceae)黑粉菌属(Ustilago(Pers.)Roussel)，与大麦坚黑穗病菌(UstilagoHordei)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)等具有较近的亲缘关系。菰黑粉菌是专性寄生于茭白植株的活体营养型真菌，其完整生活史包括单倍体融合、寄主侵染、菌丝增殖、冬孢子形成、冬孢子萌发、单倍体腐生等过程。此菌的菌丝体为多年生，存在于菰(Zizaniacaduciflora)的地下茎内，夏秋季形成茭白。除了作为蔬菜，茭白也可药用，具有利尿止渴、清热解毒之功效。
菰黑粉菌侵染是茭白植物膨大形成可食用肉质茎的关键，未受菰黑粉菌侵染的植株茎部不发生膨大。菰黑粉菌的侵染导致植株薄壁细胞分裂加快，同时维管束变得过度简化，生长锥膨大伸长，从而形成肥大的肉质茎。正常茭白与灰茭中的菰黑粉菌具有较大差异，正常茭白中菰黑粉菌主要以菌丝体的形态存在，被称作MT型菰黑粉菌；灰茭中菰黑粉菌主要以灰褐色冬孢子的形式存在，被称作T型菰黑粉菌(Investigation on thedifferentiation of two Ustilago esculenta strains-implications of arelationship with the host phenotypes appearing in the fields.BMC Microbiol,2017,17(1):228.)。T型菰黑粉菌侵染茭白植物后，在膨大茎部累积的大量灰褐色冬孢子严重影响茭白品质，进而影响销售，造成一定经济损失。
传统的菰黑粉菌分型鉴定主要根据植物的表型进行判断，然而出现可用于判别的植物表型的时间往往是栽培后期，此时已无法挽回经济损失。公开号为CN109680090A的专利申请公开了一种鉴定茭白表型特征的分子标记及其应用、获取方法，其通过高分辨熔解曲线的方法进行分析，可以在茭白苗期对茭白进行表型鉴定分析，但此方法仅适合菰黑粉菌定性分析，不适合定量分析。最新研究表明单个植物内可能同时含有T型与MT型菰黑粉菌，无论是基于植物表型还是高分辨溶解曲线的方法，都无法对两种菰黑粉菌进行定量分析。
现有技术中亟需一种简便，灵敏度高，特异性强，检测结果可靠的菰黑粉菌分型检测方法。探针法荧光定量PCR具有检测速度快、操作便捷、结果准确等优点，可以基于特征序列对T型和MT型菰黑粉菌进行鉴定及定量。
发明内容
为解决现有技术中的不足，本发明提供了一种菰黑粉菌分型鉴定方法及其应用。
本发明提供了一种用于菰黑粉菌分型鉴定的靶标，所述靶标来源于T型菰黑粉菌，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明有提供了所述靶标在菰黑粉菌分型鉴定中的应用。
本发明提供了一种用于菰黑粉菌分型鉴定的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。
本发明提供了一种用于菰黑粉菌分型鉴定的探针，所述探针的核苷酸序列如SEQID No.4所示。
本发明还提供了一种用于菰黑粉菌分型鉴定的试剂盒，包括所述的引物对和探针。
本发明还提供了一种菰黑粉菌分型鉴定方法，包括以下步骤：
(1)提取含有菰黑粉菌的待检测样品的DNA作为扩增模板；
(2)使用荧光定量PCR或数字PCR方法进行检测，检测使用的引物对包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示；检测使用的探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
(3)若能够扩增得到信号，说明待检测样品中含有T型菰黑粉菌。
具体的，荧光定量PCR反应体系为：II Probe qPCR SuperMix 10μL，正向引物、反向引物和探针各4pmol，模板1μL，用无菌无核酸酶水补足至20μL；扩增反应条件为95℃预变性2min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸30s，共40个循环。
具体的，数字PCR反应体系为：ddPCR Supermix for Probes 10μL，正向引物和反向引物各18pmol，探针5pmol，模板1μL，无菌无核酸酶水补至20μL；扩增反应条件为95℃预变性10min；94℃变性30s，60℃退火&延伸90s，共40个循环；60℃后延伸10min，反应结束后保持4℃。
本发明名基于基因组重测序数据，筛选T型菰黑粉菌的特异性靶标序列，建立荧光定量PCR和数字PCR检测方法，实现对T型菰黑粉菌的定量分析。这种方法可以对植物组织中微量的菰黑粉菌进行鉴定，不受其他真菌的干扰，有助于植物栽培早期的分析与鉴定。
本发明的有益效果为：
(1)本发明提供了用于菰黑粉菌分型鉴定的靶标，所述靶标来源于T型菰黑粉菌；
(2)本发明提供了一种菰黑粉菌分型鉴定方法，可定量检测复杂样品中T型菰黑粉菌，检测限低至0.0088ng/μL(22.36copies/μL)，同时实现了对植物不同时期以及不同组织中T型菰黑粉菌的定量检测。
附图说明
图1为45-65℃的温度梯度下对T型菰黑粉菌基因组DNA检测结果图。
图2为T型菰黑粉菌(A)和MT型菰黑粉菌(B)检测结果图。
图3为茭白常见病原菌及生长环境中真菌检测结果图。
图4为T型菰黑粉菌基因组DNA 4倍梯度稀释后检测结果图。
图5为ddPCR体系下不同延伸时间的扩增效果的影响图；其中，上图为延伸45s的扩增效果图；中图为延伸90s的扩增效果图；下图为延伸120s的扩增效果图。
图6为灰茭(A)及正常茭(B)中不同部位菰黑粉菌检测结果图。
图7为灰茭(A)及正常茭(B)中不同发育时期菰黑粉菌检测结果图。
图8为不同部位薹管萌发的植物嫩芽中T型菰黑粉菌检测结果图。
具体实施方式
实施例1
基因组重测序分析及T型菰黑粉菌荧光定量PCR。
(1)获取材料。
上下游引物和探针由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；无菌无核酸酶水，PerfectStart II Probe qPCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；植物基因组提取试剂盒购自天根生物科技有限公司；菰黑粉菌菌株样品由中国计量大学浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室分离、鉴定和保存。
(2)DNA提取、测序及序列分析
使用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen，DP305)，根据说明书指示步骤进行操作，最终将DNA溶解在50μL无菌水中。
在浙江、江苏等地共收集T型和MT型菰黑粉菌121个，通过高通量二代测序获得基因组重测序数据，然后将数据分别比对至T型和MT型菰黑粉菌基因组。使用CNVCaller和Breakdancer等软件进行基因拷贝数变异和基因结构变异分析。
(3)菰黑粉菌特异性序列鉴定及引物设计
基因组重测序结果表明，T型菰黑粉菌基因组T55contig45片段的363700-364900bp区域的核酸序列在MT型菰黑粉菌中不存在，是T型菰黑粉菌特有的，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。这段序列(命名为multi_copy_seq_1，mcs1)中没有发现已知功能的基因，且两侧为重复序列。引物和探针序列如表1所示，引物扩增出的片段长度为144bp。
表1
名称 编号 序列
正向引物 SEQ ID No.2 TCAGGGATGATCCAGCCTTC
反向引物 SEQ ID No.3 CAAGGGAGTAGGTGCTAGGG
探针 SEQ ID No.4 TGCCCAAGGAGCCTGCCTCA
将T型菰黑粉菌的重测序数据比对至MT型菰黑粉菌基因组，并分析基因缺失及结构变异。结果表明MT型菰黑粉菌不具有特异的核酸序列。
(4)退火温度对检测结果的影响。
取出荧光定量PCR所需的引物和探针等主要试剂，待恢复至室温(15-25℃)，涡旋混匀后短暂离心备用；按照表2配制荧光定量PCR体系，充分混匀；将反应管放入荧光定量扩增仪检测孔内：按加样顺序设置样品以及空白对照名称、位置；选择VIC通道检测荧光信号；设置反应程序如表3所示。
表2
试剂 使用量 终浓度
PerfectStart II Probe qPCR SuperMix 10μL 1x
正向引物(10μM) 4pmol 0.2μM
反向引物(10μM) 4pmol 0.2μM
TaqMan探针 4pmol 0.2μM
DNA模板 1μL
无酶水(Nuclease-Free Water) 至20μL
表3
在45-65℃的温度梯度下对相同浓度的T型菰黑粉菌基因组DNA进行检测(图1)。检测结果表明，不同退火温度对检测结果影响不大，考虑到提高退火温度可以减少非特异性扩增，因此后续荧光定量PCR使用65℃为退火温度。当与其他引物共同使用进行多重检测时，也可根据另一组引物确定退火温度。
(5)引物特异性检测。
分别使用T型菰黑粉菌、MT型菰黑粉菌、Nigrospora oryzae、Bipolaris oryzae、Xenopyricularia zizaniicola等病原菌及环境微生物的基因组DNA以及茭白植物基因组DNA为模板，反应体系和程序为步骤(4)优化后的条件。结果如图2和图3所示，仅在T型菰黑粉菌组中有明显信号，说明该引物及检测方法具有良好的特异性。检测结果Cq值如表4所示。
表4
品种 来源 Cq值
Ustilago esculenta T-1 浙茭2号灰茭 15.56
Ustilago esculenta T-2 浙茭3号灰茭 18.42
Ustilago esculenta T-3 浙茭6号灰茭 14.42
Ustilago esculenta T-4 浙茭7号灰茭 15.30
Ustilago esculenta T-5 浙茭911灰茭 15.70
Ustilago esculenta T-6 龙茭2号灰茭 19.60
Ustilago esculenta T-7 黄岩4号灰茭 14.87
Ustilago esculenta T-8 余茭4号灰茭 17.45
Ustilago esculenta MT-1 浙茭2号正常茭 N/A
Ustilago esculenta MT-2 浙茭3号正常茭 N/A
Ustilago esculenta MT-3 浙茭6号正常茭 N/A
Ustilago esculenta MT-4 浙茭7号正常茭 N/A
Ustilago esculenta MT-5 浙茭911正常茭 N/A
Ustilago esculenta MT-6 龙茭2号正常茭 N/A
Ustilago esculenta MT-7 黄岩4号正常茭 N/A
Ustilago esculenta MT-8 余茭4号正常茭 N/A
Nigrospora oryzae 浙茭10号 N/A
Bipolaris oryzae 浙茭10号 N/A
Xenopyricularia zizaniicola 浙茭10号 N/A
Nigrospora sphaerica 浙茭10号 N/A
Microdochium seminicola 浙茭10号 N/A
Fusanrium andiyazi 浙茭10号 N/A
Fusarium verticillioides 环境 N/A
Fusarium graminearum 环境 N/A
Trichoderma hamatum 环境 N/A
Fusarium oxysporum 环境 N/A
Fusarium solani 环境 N/A
Alternaria porri 环境 N/A
Rhizopus oryzae 环境 N/A
Delftia tsuruhatensis 环境 N/A
Chryseobacterium bernardetii 环境 N/A
Klebsiella oxytoca 环境 N/A
Rhizoctonia solani 环境 N/A
Fusarium sp. 环境 N/A
Fusarium kyushuense 环境 N/A
(6)扩增效率与检测限
将T型菰黑粉菌基因组DNA按照1:4比例梯度稀释后进行检测(图4)。将稀释后浓度取对数后与Cq值进行线性回归分析，回归曲线为y＝1.0141×log2X+22.325，R2＝0.999，式中y为检测的Cq值，x为稀释倍数。模板浓度的对数与Cq值具有良好线性关系，引物扩增效率为98.6％。空白对照的Ct值为38.45，标准偏差2.20，因此当Ct值小于33.61时判定阳性，据此计算该方法的检出限为0.0088ng/μL(22.36copies/μL)。
实施例2
数字PCR检测。
(1)获取材料。
上下游引物和探针由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；无菌无核酸酶水，ddPCRSupermix for Probes(无dUTP)购自伯乐生物工程有限公司；植物基因组提取试剂盒购自天根生物科技有限公司；菰黑粉菌菌株样品由中国计量大学浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室分离、鉴定和保存。
(2)数字PCR检测。
取出数字PCR所需的引物、探针等主要试剂，待恢复至室温(15-25℃)，轻柔混匀后短暂离心备用；根据检测样品量，按照表5配制相应用量的数字PCR混合液，充分混匀后短暂离心备用。
表5
试剂 使用量 终浓度
ddPCR Supermix for Probes(无dUTP) 10μL 1x
正向引物(10μM) 18pmol 0.9μM
反向引物(10μM) 18pmol 0.9μM
TaqMan探针 5pmol 0.25μM
DNA模板 1μL
无酶水(Nuclease-Free Water) 至20μL
根据检测样品量准备适当数量的微滴生成卡，向微滴生成卡的每个样品槽中加入20μL混合液；盖好管盖。将微滴生成卡放入QX200微滴生成仪中进行微滴生成。操作过程注意避免交叉污染；使用移液器将生成的微滴轻柔地转移至96孔PCR板中，在96孔PCR板表面贴上箔膜并热封。封膜完成后的96孔反应板转入PCR仪进行反应，反应体系如表6所示。最后利用QX200 Droplet Reader进行读数，检测通道为FAM和VIC。
表6
(3)不同延伸时间的扩增效果的影响。
ddPCR在体系中形成油包水的大量微滴，由于微滴的导热速度较慢，ddPCR的延伸时间通常大于普通PCR。考虑到本次设计扩增的区域AT含量较高，也可能影响扩增的速度。因此设置3个不同的延伸时间，分别为45s、90s和120s(图5)。结果表明，延伸时间为90s时，检测所得的阳性微滴与阴性微滴的信号响应强度具有较好的分离，易于检测结果判断；延伸时间为45s或120s时，阴性微滴与阳性微滴的分离不明显。因此最后选择延伸时间为90s。
(4)菰黑粉菌基因组中mcs1拷贝数分析。
g2146基因(GenBank号：JTLW0100012.1，493958bp-497504bp)是一个单拷贝基因，设计针对基因g2146的引物及探针如表7所示，引物扩增出的片段长度为146bp。然后使用数字PCR分别检测msc1和g2146序列的拷贝数，结果如表8所示。结果表明，msc1的基因拷贝数基本2倍于g2146的基因拷贝数，说明基因msc1在菰黑粉菌基因组中具有两个拷贝数。再根据菰黑粉菌基因组大小估算1份菰黑粉菌核基因组的含量约为0.0004ng，后续可根据此计算样品中菰黑粉菌基因组的含量。
表7
表8
msc1拷贝数 g2146拷贝数
2063 1182
2100 1307
1063 665
558 333
575 347
571 317
156 81.5
167 92
实施例3
实际样品检测。
(1)材料的获取。
上下游引物和探针由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；无菌无核酸酶水，PerfectStart II Probe qPCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；植物基因组提取试剂盒购自天根生物科技有限公司；植株样品由金华市农业科学研究院、杭州市农业技术推广中心等单位提供。
(2)DNA提取和荧光定量PCR检测。
使用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen，DP305)，根据说明书指示步骤进行操作，最终将DNA溶解在50uL无菌水中。
取出荧光定量PCR所需的引物和探针(序列如表1所示)等主要试剂，待恢复至室温(15-25℃)，涡旋混匀后短暂离心备用；按照表9配制荧光定量PCR体系，充分混匀。
表9
将反应管放入荧光定量扩增仪检测孔内。按加样顺序设置样品以及空白对照名称和位置；选择VIC通道检测荧光信号；设置反应程序如表10所示。
表10
(3)灰茭及正常茭中不同部位菰黑粉菌检测。
分别对浙茭7号正常茭与浙茭7号灰茭的根、茎和茎尖中的T型菰黑粉菌进行检测，首先对根、茎和茎尖进行DNA的提取，然后对获得的DNA进行qPCR检测。根据结果(图6，表11)，T型菰黑粉菌在浙茭7号灰茭中含量较高；在浙茭7号正常茭中含量较低，仅在根部发现有T型菰黑粉菌的存在。目前尚不能确定正常茭根部的T型菰黑粉菌是在植物组织内部还是在环境中存在。
表11
(4)灰茭及正常茭中不同发育时期菰黑粉菌检测结果。
分别在浙茭7号正常茭与余茭4号灰茭的三叶期与孕茭期，对其根，茎，茎尖的的菰黑粉菌含量进行检测，根据结果(图7，表12)，余茭4号灰茭在三叶期与孕茭期，三个部位中均有T型菰黑粉菌的分布。浙茭7号正常茭在三叶期与孕茭期，三个部位中几乎没有T型菰黑粉菌的分布。
表12
时期 茭白品种 茭白部位 Cq值
三叶期 余茭4号灰茭 根 25.61
三叶期 余茭4号灰茭 茎 19.09
三叶期 余茭4号灰茭 茎尖 18.39
孕茭期 余茭4号灰茭 根 22.06
孕茭期 余茭4号灰茭 茎 22.57
孕茭期 余茭4号灰茭 茎尖 20.14
三叶期 浙茭7号正常茭 根 33.59
三叶期 浙茭7号正常茭 茎 N/A
三叶期 浙茭7号正常茭 茎尖 N/A
孕茭期 浙茭7号正常茭 根 N/A
孕茭期 浙茭7号正常茭 茎 N/A
孕茭期 浙茭7号正常茭 茎尖 N/A
(4)不同部位薹管萌发的植物嫩芽中T型菰黑粉菌检测结果。
表13
分别选取浙茭7号正常茭与灰茭的薹管进行茭白的育种，并根据植物嫩芽萌发的薹管部位不同，将新萌发的新苗分为薹管上部新苗，薹管中部新苗，薹管下部新苗，并分别对其新发的芽头进行T型菌菰黑粉菌含量的检测。根据结果(图8，表13)，浙茭7号正常茭与灰茭不同部位薹管萌发的植物嫩苗芽头均有T型菰黑粉菌的分布，说明在正常茭白栽培的苗期T型菰黑粉菌也可以侵入植物顶端，后期植物生长过程中T型菰黑粉菌如何变化有待进一步观察。
序列表
<110> 中国计量大学
杭州市农业技术推广中心
<120> 一种菰黑粉菌分型鉴定方法及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1201
<212> DNA
<213> 菰黑粉菌(Ustilago esculenta)
<400> 1
ttgaaattcc cacactgaca tgtgaaaaat tgacaaagac aaaaattttc accagggggc 60
tccaaccaag agtatatata tggcacacca ccaagatgat ctcccccctc caaaccagga 120
atctgtctcc tagccttctg cacctccact ccaagctccc aacctcacca agctcccaac 180
ctcaccaagc tcccaacctc accaagctcc caacctcacc aacctcacta tcaacctcac 240
caacctcatc ttaccaacct caccatgtca acctgtcaac ctcagcctca gcctcaacct 300
caacctcaac ctcaacctgt ccctcccatg tcaacctcac caggtcccaa ccttatggag 360
cccactgtaa gtcaaacatc acccttgttt cctggacatg ctttgtggct gaccctctcc 420
aacctcccct caacctcatc aacctctgac ccaacctctc aacctcacca acccccccaa 480
cctctggttc aaccttcctc accaaactaa ccaacctcac caacctctgg tccaacctca 540
acctcaacct caacctcaca ggtgaacctc ccacccaagg atgttgatgc ctggaacttt 600
gtttgcactc ctgatgagct ggttcagagg tttggacccc ttgccatcat gcagctgctt 660
caccatgctc ccaacctcag ggatgatcca gccttcaaca agtggtgcta tgttgcccaa 720
ggagcctgcc tcatcaagat ccccttggag aagaaggaga ccctcatgaa cctcatgaac 780
ctcaccaact tcaccatctg ccctagcacc tactcccttg ccttctgtga ggctccccaa 840
cctatcaacc taggcaacct tgttgtcttg atggtggagg ccaacatcac cctggtgagg 900
gtgcaggcat gtggcatgaa gttgatcctg cctgacagtg tggtgcacct tggcaaccct 960
gaccttccca tggccaacct caacagctgg gacctaggtt gcaactgggt ctctgatgag 1020
atacccttgg tcaagttcaa gaaggctggt ggacctgcta gggaggtttg gcctatgatg 1080
ctgtaccttg gtgagggaca tggaagcatc agaacctcat tccagttcag aggtcactac 1140
tacaccctga agatctaccc tctgttggtt catgccatca agtcaacctc agggaagatg 1200
c 1201
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcagggatga tccagccttc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caagggagta ggtgctaggg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgcccaagga gcctgcctca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctccgaagac gaagcaacag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agatgtgcgg gtttaccaga 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgcagcctct gctgtgcgcg 20

Claims (4)

1.一种用于菰黑粉菌分型鉴定的试剂盒，其特征在于，包括用于菰黑粉菌分型鉴定的引物对和探针，
所述引物对包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，
所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
2.一种菰黑粉菌分型鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取含有菰黑粉菌的待检测样品的DNA作为扩增模板；
(2)使用荧光定量PCR或数字PCR方法进行检测，检测使用的引物对包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示；检测使用的探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
(3)若能够扩增得到信号，说明待检测样品中含有T型菰黑粉菌。
3.如权利要求2所述的菰黑粉菌分型鉴定方法，其特征在于，荧光定量PCR反应体系为：IIProbe qPCR SuperMix 10μL，正向引物、反向引物和探针各4pmol，模板1μL，用无菌无核酸酶水补足至20μL；扩增反应条件为95℃预变性2min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸30s，共40个循环。
4.如权利要求2所述的菰黑粉菌分型鉴定方法，其特征在于，数字PCR反应体系为：ddPCR Supermix for Probes 10μL，正向引物和反向引物各18pmol，探针5pmol，模板1μL，无菌无核酸酶水补至20μL；扩增反应条件为95℃预变性10min；94℃变性30s，60℃退火&延伸90s，共40个循环；60℃后延伸10min，反应结束后保持4℃。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109554498A (zh) * 2018-12-21 2019-04-02 中国计量大学 一种鉴定单季茭白早晚熟特性的分子标记及其应用、获取方法
CN109680090A (zh) * 2018-12-21 2019-04-26 中国计量大学 一种鉴定茭白表型特征的分子标记及其应用、获取方法
CN110331223A (zh) * 2019-07-08 2019-10-15 浙江大学 一种用于鉴别不同茭白类型的分子标记、引物对、试剂盒及方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109554498A (zh) * 2018-12-21 2019-04-02 中国计量大学 一种鉴定单季茭白早晚熟特性的分子标记及其应用、获取方法
CN109680090A (zh) * 2018-12-21 2019-04-26 中国计量大学 一种鉴定茭白表型特征的分子标记及其应用、获取方法
CN110331223A (zh) * 2019-07-08 2019-10-15 浙江大学 一种用于鉴别不同茭白类型的分子标记、引物对、试剂盒及方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Accession NO: XM_024513278.1，PREDICTED: Physcomitrella patens uncharacterized LOC112279135 (LOC112279135), transcript variant X2, mRNA.GenBank.2018,1. *

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