CN112080577B - 荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段的内参基因及其引物和应用 - Google Patents

荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段的内参基因及其引物和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112080577B
CN112080577B CN202010968521.1A CN202010968521A CN112080577B CN 112080577 B CN112080577 B CN 112080577B CN 202010968521 A CN202010968521 A CN 202010968521A CN 112080577 B CN112080577 B CN 112080577B
Authority
CN
China
Prior art keywords
litchi
genes
development
reference gene
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010968521.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112080577A (zh
Inventor
孔广辉
冯迪南
李雯
黄佳敏
连帅利
习平根
李敏慧
姜子德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Agricultural University
Original Assignee
South China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Agricultural University filed Critical South China Agricultural University
Priority to CN202010968521.1A priority Critical patent/CN112080577B/zh
Publication of CN112080577A publication Critical patent/CN112080577A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112080577B publication Critical patent/CN112080577B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段的内参基因及其引物和应用。本发明选取4个荔枝霜疫霉基因PlACTIN、PLGAPDH、PlrpS5和Pl006400，通过实时荧光定量PCR的方法测定了这些基因在荔枝霜疫霉菌丝、孢子囊、游动孢子、休止孢、休止孢萌发和侵染个阶段的表达量变化，比较所选基因表达量稳定性，发现了Pl006400和PlACTIN表达量稳定可作为内参基因。本发明的内参基因Pl006400和PlACTIN的特异性引物引物可广泛应用于荔枝霜疫霉发育及其侵染荔枝各阶段的基因表达研究，填补了荔枝霜疫霉缺少可靠内参基因的空白，具有重要的应用价值。

Description

荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段的内参基因及其引物和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段的内参基因及其引物和应用。
背景技术
荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)所引起的荔枝霜疫病是荔枝上最严重的病害，在我国广东和广西等主要产区均有发生，每年的发病率大约在30％-90％之间，除了在荔枝生长期使其果实发病腐烂，造成落果，也会影响荔枝采摘后的保存，让荔枝在运输过程中大量发病，严重制约我国荔枝产业的发展。
实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性高和精确性高的优点，已被应用于分子生物学、医学、食品检测和环境监测等多个研究与应用领域。内参基因作为在荧光定量PCR分析中检测基因表达水平变化的参照物，其稳定性可决定实时荧光定量的分析结果的可靠性。因此，选取稳定、合适的内参基因对分析荔枝霜疫霉基因荧光定量PCR结果有较大意义。
目前，荔枝霜疫霉内参基因的开发筛选的工作一片空白，严重阻碍了荔枝霜疫病的分子生物学研究，若要对荔枝霜疫霉进行生长发育和致病机制研究，可靠内参基因鉴定的是至关重要的。
发明内容
本发明针对现有技术中缺乏稳定、合适的荔枝霜疫霉内参基因及其引物的不足，提供荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段的内参基因及其引物和应用。
本发明比较了4个荔枝霜疫霉潜在的内参基因，通过荧光定量PCR发现了其中2个内参基因表达量较为稳定，可作为荔枝霜疫霉荧光定量PCR分析中的内参依据，分别是Pl006400和PlACTIN。所述的内参基因可用于荔枝霜疫霉基因表达研究。
本发明的第一个目的是提供荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段的内参基因，为内参基因Pl006400或PlACTIN，所述的内参基因Pl006400，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述的内参基因PlACTIN，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供所述的荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段的内参基因的特异性引物，所述的内参基因Pl006400的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.7和SEQID NO.8所示，所述的内参基因PlACTIN的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示。
本发明还提供所述的内参基因Pl006400或PlACTIN作为定量检测荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段基因表达的内参基因的应用。
本发明还提供所述的特异性引物作为定量检测荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段基因表达的内参基因特异性引物的应用。
本发明还提供所述的内参基因或所述的特异性引物在制备荧光定量试剂盒中的应用。
优选，所述的试剂盒还包括常规PCR试剂。
本发明具有以下优点：
本发明的荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段的内参基因Pl006400或PlACTIN及其特异性引物，可广泛应用于荔枝霜疫霉发育及其侵染荔枝各阶段的基因表达研究，填补了荔枝霜疫霉缺少可靠内参基因的空白，具有重要的应用价值。
附图说明
图1是Genorm对候选内参基因稳定性分析；
图2是Normfinder对候选内参基因稳定性分析；
图3是BestKeeper对候选内参基因稳定性分析；
图4是Delta CT对候选内参基因稳定性分析；
图5是候选内参基因稳定性排序；
图6是Pl006400溶解曲线；
图7是PlACTIN、PLGAPDH、PlrpS5和Pl006400的相对(其中以MY表达量定义为1)表达量；图中：MY：菌丝；SP：孢子囊；ZO：游动孢子；CY孢子囊；GC：孢子囊萌发阶段；1.5-24hpi：侵染1.5-24小时；
图8是PlACTIN、PLGAPDH、PlrpS5和Pl006400在荔枝霜疫霉各发育阶段荧光定量PCR中平均CT值；
图9是以Pl006400为内参基因，荔枝霜疫霉PlrpL13的转录分析；图中：MY：菌丝；SP：孢子囊；ZO：游动孢子；CY孢子囊；GC：孢子囊萌发阶段；1.5-24hpi：侵染1.5-24小时。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
首先通过对荔枝霜疫霉转录组分析，我们获得了荔枝霜疫霉转录组数据中表达较为稳定的基因942个，进一步我们在这942个基因中筛选了表达量较高的4个荔枝霜疫霉基因(PlACTIN、PLGAPDH、PlrpS5和Pl006400，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示)做进一步验证，通过实时荧光定量PCR的方法测定了这些基因在荔枝霜疫霉菌丝、孢子囊、游动孢子、休止孢、休止孢萌发和侵染个阶段的表达量变化，比较所选基因表达量稳定性。具体如下：
1.荔枝霜疫霉培养。将荔枝霜疫霉接种于胡萝卜固体培养基上，28℃培养一周，至长满培养皿。
2.收集荔枝霜疫霉菌丝、孢子囊、游动孢子、休止孢、休止孢萌发和侵染阶段的样品。1)荔枝霜疫霉在胡萝卜液体培养基中培养3天可获得荔枝霜疫霉菌丝样品；2)18℃无菌水冲洗培养了荔枝霜疫霉的固体培养皿，并用毛笔刷将菌丝刷下、过滤收集于50ml离心管中，获得荔枝霜疫霉孢子囊；3)将收集好的孢子囊放进18℃培养箱内2小时，期间轻轻晃动离心管，促进游动孢子释放。将离心管内的孢子囊过滤，滤液放于新的50ml离心管中，6000r/min离心10min，倒掉上清，加1ml无菌水溶解沉淀获得游动孢子样品；4)将游动孢子剧烈震荡，并通过显微观察检测获得荔枝霜疫霉的休止孢；5)荔枝霜疫霉休止孢在25℃的无菌水中培养2小时后，铜鼓显微观察确认可获得荔枝霜疫霉休止孢萌发阶段的样品；6)将荔枝霜疫霉游动孢子接种于叶片上在侵染1.5、3、6、12、24小时后可获得荔枝霜霜疫霉侵染阶段样品。将上述获得的不同阶段的样品加1ml无菌水溶解后的液体转移至1.5ml离心管，离心，倒掉上清，将离心管立刻放入液氮中，后将其放入-80℃保存，待提取RNA。
3.荔枝霜疫霉菌丝、孢子囊、游动孢子、休止孢、休止孢萌发和侵染阶段样品RNA提取及cDNA模板准备。
RNA提取：根据OMEGA试剂盒提取样本RNA。
cDNA模板准备：反转录体系：5*Fastking-RT Super Mix 4μl(TAKARA，RR036A，Japan)；Total RNA,50ng-2μg；RNase-Free ddH2O。反转程序为：42℃15min，95℃3min。
4.合成候选内参基因引物。根据荔枝霜疫霉基因序列，设计合成候选内参基因(PlACTIN、PLGAPDH、PlrpS5和Pl006400)的荧光定量PCR扩增引物(序列信息如表1所示)。
表1荧光定量PCR引物信息
Figure BDA0002683222430000031
Figure BDA0002683222430000041
5.荧光定量PCR溶解曲线。以菌丝、孢子囊、游动孢子、休止孢、休止孢萌发和侵染阶段样品cDNA为模板，分别加入4个候选基因的荧光定量PCR引物，进行荧光定量PCR分析。荧光定量PCR结束后，获得4个候选内参基因引物扩增的Ct值。荧光定量PCR测定上述的各样品中PlACTIN、PLGAPDH、PlrpS5和Pl006400的相对表达量如图7所示，其中以菌丝(MY)表达量定义为1，其他的是相对于菌丝(MY)中的表达量。图8为PlACTIN、PLGAPDH、PlrpS5和Pl006400在荔枝霜疫霉各发育阶段荧光定量PCR中平均CT值。
荧光定量PCR体系和扩增程序如下：
(1)反应体系：cDNA 2μL(50ng/ul)，10μmol/L上、下游引物各0.8μL，10μL Mix(TAKARA,RR820,Japan)，水6.4μL。
(2)扩增程序：95℃预变性30s；95℃变性30s，60℃退火和延伸30s，40个循环。循环结束后绘制溶解曲线：60℃-95℃，每1℃收集荧光信号。其中，Pl006400溶解曲线如图6所示。
筛选稳定的内参基因。根据荧光定量PCR所得Ct值，采用geNorm、Normfinder、Bestkeeper和RefFinder分析上述候选基因的稳定性(http://www.ciidirsinaloa.com.mx/RefFinder-master/type＝reference)，确定表达最稳定的候选内参基因；将所述候选基因的稳定性由强至弱排序，获得综合评价排名最前的候选基因作为荔枝霜疫霉的内参基因。
geNorm软件对候选内参基因的分析见表2和图1。在图中，纵坐标为M值，横坐标为内参基因，内参基因从左往右M值逐渐增大，其基因表达的稳定度逐渐降低。M值小于1.5时表示内参基因稳定，内参M值较小的两个基因分别为Pl006400和PlACTIN，他们的M值均为0.669。
NormFinder软件对候选内参基因的分析参见表2和图2，Pl00600的稳定值达0.334，分析结果与geNorm软件得出结果一致。
BestKeeper软件对候选内参基因的分析见表2和图3，Pl006400和PlACTIN的标准差(std dev[+/-CP])小于1，表明这两个内参基因表达相对稳定，其中Pl006400的标准差为所有内参基因中最小的。与geNorm和Normfinder分析基因表达稳定性一致。
表2内参基因表达稳定性分析
Figure BDA0002683222430000051
SD:Standard deviation；CV:Coefficient of variation
Delta CT软件对候选内参基因的分析参见表3和图4，Pl006400标准偏差是1.54，是所有候选内参基因中最小的，表明其稳定性高，其分析结果与geNorm、NormFinder和BestKeeper软件中得出结果一致。
表3 Delta CT软件对候选内参基因的分析
Figure BDA0002683222430000052
经过对各软件的排名进行综合分析排序得出结果参见表4和图5，其中稳定性较高的是Pl006400和PlACTIN。所以Pl006400和PlACTIN可以作为内参基因应用于荔枝霜疫霉相关基因表达研究。
表4不同软件对基因表达稳定性分析排名
Figure BDA0002683222430000053
Figure BDA0002683222430000061
以上结果说明，Pl006400和PlACTIN表达稳定可作为荔枝霜疫霉的内参基因，其中Pl006400作为荔枝霜疫霉发育和侵染各阶段的引物最佳、PlACTIN其次。Pl006400和PlACTIN引物可广泛应用于荔枝霜疫霉发育及其侵染荔枝各阶段的基因表达研究。
实施例2
按照本发明实施例1的方法以Pl006400为内参基因，对荔枝霜疫霉PlrpL13进行了转录水平分析，结果如图9所示，PlrpL13基因在荔枝霜疫霉菌丝、孢子囊、游动孢子、休止孢和休止孢萌发阶段表达量相对较高，在侵染阶段不表达。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段的内参基因及其引物和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1083
<212> DNA
<213> 荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)
<400> 1
atgtgcaagg ccggtttcgc cggtgatgac gctccgcgtg ccgtgttccc gtcgatcgtg 60
ggtcgcccca agcacctggg aatcatggtg ggcatggacc agaaggacgc ttacgtcggt 120
gacgaggccc agtccaagcg tggtgtgctg accctgaagt accccattga gcacggtatt 180
gtgaccaact gggacgacat ggagaagatc tggcaccaca cgttctacaa cgagctgcgt 240
gtggctcccg aggagcaccc ggtgctgctg acggaggctc cccttaaccc gaaggctaac 300
cgtgagcgca tgacgcagat catgttcgaa acgttcaacg tgcccgccat gtacgtgaac 360
atccaggccg tgctgtcgtt gtacgcttcc ggccgtacca cgggttgtgt gctcgactct 420
ggtgatggtg tgtcccacac cgtgcctatc tacgagggtt acgctcttcc tcacgctatt 480
gtgcgtctgg atctggctgg ccgcgatctg acggactaca tgatgaagat cctgacggag 540
cgtggttact cgttcaccac cacggccgag cgagaaattg tgcgtgacat caaggagaag 600
ctgacttaca ttgccctgga cttcgaccag gagatgaaga ctgctgctga gtcatcgggc 660
cttgagaaga gttacgagct gcccgatggc aacgttattg tcattggtaa cgagcgtttc 720
cgtacccccg aggtgctgtt ccagccctcg ctcatcggta aggaagcttc gggtatccac 780
gactgcacgt tccagaccat catgaagtgt gatgtcgata tccgtaagga cctgtactgc 840
aacattgtgc tgtcgggtgg taccaccatg tacccgggta ttggtgagcg tatgaccaag 900
gagcttacgg ctcttgctcc gtccaccatg aagatcaagg tggttgcccc gcctgagcgt 960
aagtactcgg tgtggatcgg tggatccatt ctgtcgtcgc tgtcgacgtt ccagcagatg 1020
tggatctcga aggccgagta cgacgagtct ggaccctcga tcgtgcaccg caagtgcttc 1080
taa 1083
<210> 2
<211> 1023
<212> DNA
<213> 荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)
<400> 2
atgtctgagc aagtcgccat cggtatcaac ggcttcggcc gcatcggtcg cctcgtggcc 60
cgcgctgcca tcgagaaccc caagaccaag gtggtggcca tcaacgaccc gttcatggac 120
ctggagtaca tggcgtacct gttcaagtac gactcgacgc acggcaagtt cgacggctcg 180
gtggagacca aggacggcaa cctggtggtg aacggcgagg tgatccacgt gttcgcggct 240
cgcaaccccg ccgagatccc atggggtcag gccggtgcca cgtacgtgtg cgagtctacg 300
ggagtgttca cgacgacgga gaaggccaag gcccacattg acggtggatg caagaaggtg 360
gtgatctctg ctcctcccaa ggactcgacc ccgatgtacg tgatgggcgt gaaccacaag 420
gagtacgacg gttctgcgcc ggtggtgtcg aacgcgtcgt gcacgacgaa ctgccttgcg 480
ccgctggcca aggtgatcaa cgacaagttc ggcatcgtgg agggtctgat gacgacggtg 540
cacgcgacga cggcgactca gcttccggtt gacggtccgg cgaagggtgg caaggactgg 600
cgtggcggcc gtggctgcgg ccagaacatc attccgtcgt cgacgggtgc tgcgaaggct 660
gtgggtaagg tgttgcctgt gttgaacggc aagctgacgg gtatggcgtt ccgtgtgccg 720
acgccggatg tgtctgtggt ggacctgacg tgccgtctgg agaagggtgc gtcgatggag 780
gagatcaagg ctgccgtgaa ggctgctgct gcgggtgagt tgtctggcat cctcggttac 840
acggaggacc aggtggtgtc gaacgacttc ctgcacgaca agcactcgag cacgttcgac 900
gcggatgcgt gcattgctct gaacgacaac ttcgtgaaac ttgtggcgtg gtacgacaac 960
gagtggggtt actcgaaccg tttggtggac ttggtgctgc acatggctac catcgacaac 1020
taa 1023
<210> 3
<211> 927
<212> DNA
<213> 荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)
<400> 3
atgttgcagc gcttcgccgc tcgatcgggc gtggcctcag tcgctcgccg caatgtcgtc 60
aagctgcagg tggcgacctt cgcatctgag gacgactggc gcatctcaga tgaggatttc 120
gatgaaggtg cggacaagat catcgacaag gaccgtcgtg actccacgcc gcgtcgtcag 180
atcatgcctg aagctgccaa gaagagccgc tttatggtcg tgtcgcctga caaccgtggt 240
aaggtgcgtc gccgtctctt ggacgagttc aagaaggatg gcatcacgct cgcggacccg 300
gaccagcctg gacagtacct tacgcctgac gctggcatct tgcgcgacat gcgcgccatg 360
aacaaggaag gtgacgagat ggaattcgct gaggatgaag atgaaggtga actcaacctt 420
ggtcggatgg gtctgctgcg tcagattgtg cacgtggacc aagtgcagaa ggtcacgacg 480
caggaacgga tcgtcaactt ccgcgcgctc gttgttgtgg gcaacatgcg cggtgttgct 540
ggttacgctg tgggcaaggg atcgtcaccg cccattgcta tccagcgtgg caccaagctc 600
gccatgaagc gtttcactta tattgatcgc tttgatgacc gcacactgta ccatgaagtg 660
cgcggcaagt ggaacagttg tacgttgttc ctgcgcccgg cgcccaagga caagggactc 720
accgtgagcg acactgtggc ttgtgtgctt gactgttttg gcatcacgga cattgtgtcc 780
aagacccacg gccagcgcaa ccctttcact gtcgttaagg ctacgtttga cgcactctcc 840
aagcacgaga cggcggagga gattgctctc cgaactggcc actcgcttgt ggagctcagc 900
actctggcac gtacgcgtaa cctgtag 927
<210> 4
<211> 480
<212> DNA
<213> 荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)
<400> 4
atgatcgctc gctcggctct caagcgttct cttggcgcgt tctcggcctc ccgctcggct 60
gtcagcgtgg cccctgcctt cggccaggtg cgcatgtacc acgagaacgt cattgaccac 120
tacgagaacc cgcgcaacgt gggtgcgatg gacaagaacg ccaaggacgt gggcacgggt 180
ctcgtgggcg cccccgcttg cggtgacgtg atgaagctgc agatccaggt ggacgagaac 240
ggtacgatcg tggactccaa gttcaagacg tttggctgcg gctcagccat tgcgtcctcg 300
tcggtcgcta cggagtggtt gaagggcaag agcgtggaag agtgtctgaa gatcaagaac 360
actgacatcg cttcgcatct gaagctcccg cctgtcaagc tgcactgcag catgttggcg 420
gaagacgcta tcaaggccgc catctcggac tacaagaaga agcaggccgc gtcgggctaa 480
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcacgctatt gttcgtctgg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcatctcctg gtcgaagtcc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agttcaagac gtttggctgc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cggcctgctt cttcttgtag 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtgagttgtc tggcatcctc gg 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gttgtcgatg gtagccatgt g 21
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gttgtctggc atcctcggtt ac 22
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gttgtcgatg gtagccatgt g 21

Claims (3)

1.内参基因Pl006400的特异性引物作为定量检测荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段基因表达的内参基因特异性引物的应用；所述的内参基因Pl006400的特异性引物的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括使用荧光定量试剂盒的步骤，所述的荧光定量试剂盒包含权利要求1所述的内参基因Pl006400的特异性引物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的荧光定量试剂盒还包括常规PCR试剂。
CN202010968521.1A 2020-09-15 2020-09-15 荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段的内参基因及其引物和应用 Active CN112080577B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010968521.1A CN112080577B (zh) 2020-09-15 2020-09-15 荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段的内参基因及其引物和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010968521.1A CN112080577B (zh) 2020-09-15 2020-09-15 荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段的内参基因及其引物和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112080577A CN112080577A (zh) 2020-12-15
CN112080577B true CN112080577B (zh) 2022-03-15

Family

ID=73737161

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010968521.1A Active CN112080577B (zh) 2020-09-15 2020-09-15 荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段的内参基因及其引物和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112080577B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113087780B (zh) * 2021-04-08 2022-08-12 华南农业大学 一种荔枝抗病基因LcLTP及编码蛋白和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104946756A (zh) * 2015-06-09 2015-09-30 江苏省农业科学院 UBC和Actin1作为水稻黑条矮缩病毒侵染植株中基因功能分析的双内参基因及其应用
CN107227340A (zh) * 2017-04-26 2017-10-03 武汉市农业科学技术研究院作物科学研究所 用于甜瓜果实基因pcr表达分析的内参基因及该内参基因的稳定性验证方法
CN107937586A (zh) * 2017-11-14 2018-04-20 河南省农业科学院植物保护研究所 检测小麦全蚀病菌根部侵染的内参基因及其引物和应用
CN108611434A (zh) * 2018-05-18 2018-10-02 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所 剑麻内参基因act/gapdh及其应用
CN110016518A (zh) * 2019-04-28 2019-07-16 福建省农业科学院作物研究所 一种黄秋葵内参基因EF-1α及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104789557B (zh) * 2015-02-11 2017-09-26 福建省农业科学院作物研究所 一种中国南瓜内参基因及其应用
CN111455077A (zh) * 2020-04-23 2020-07-28 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所 芒果细菌性角斑病菌内参基因、引物、筛选方法及应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104946756A (zh) * 2015-06-09 2015-09-30 江苏省农业科学院 UBC和Actin1作为水稻黑条矮缩病毒侵染植株中基因功能分析的双内参基因及其应用
CN107227340A (zh) * 2017-04-26 2017-10-03 武汉市农业科学技术研究院作物科学研究所 用于甜瓜果实基因pcr表达分析的内参基因及该内参基因的稳定性验证方法
CN107937586A (zh) * 2017-11-14 2018-04-20 河南省农业科学院植物保护研究所 检测小麦全蚀病菌根部侵染的内参基因及其引物和应用
CN108611434A (zh) * 2018-05-18 2018-10-02 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所 剑麻内参基因act/gapdh及其应用
CN110016518A (zh) * 2019-04-28 2019-07-16 福建省农业科学院作物研究所 一种黄秋葵内参基因EF-1α及其应用

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Puf RNA-binding protein encoding gene PlM90 regulates the sexual and asexual life stages of the litchi downy blight pathogen Peronophythora litchii;Liqun Jiang等;《Fungal Genet Biol》;20161107;第39-45页 *
Phytophthora litchii isolate SHS3 actin mRNA, partial cds;Kong,G等;《GenBank，登录号：MT396988.1》;20200427;第1页 *
Phytophthora litchii strain SHS3 PHYL000199, whole genome shotgun sequence;Ye,W.等;《GenBank，登录号：PCFV01000199.1》;20171003;第1-10页 *
PlMAPK10, a Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) in Peronophythora litchii, Is Required for Mycelial Growth, Sporulation, Laccase Activity, and Plant Infection;Liqun Jiang等;《Front Microbiol》;20180308;第1-12页 *
Selection of internal control genes for real-time quantitative RT-PCR assays in the oomycete plant pathogen Phytophthora parasitica;Hao-Zhi Yan，Ruey-Fen Liou;《Fungal Genet Biol》;20060313;第43卷(第6期);第430-438页 *
Sequencing of the Litchi Downy Blight Pathogen Reveals It Is a Phytophthora Species With Downy Mildew-Like Characteristics;Wenwu Ye等;《Mol Plant Microbe Interact》;20160620;第29卷(第7期);第573-583页 *
The Basic Leucine Zipper Transcription Factor PlBZP32 Associated with the Oxidative Stress Response Is Critical for Pathogenicity of the Lychee Downy Blight Oomycete Peronophythora litchii;Guanghui Kong等;《mSphere》;20200603;第5卷(第3期);图2-3、第9页材料和方法 *
Transcriptome analysis of Phytophthora litchii reveals pathogenicity arsenals and confirms taxonomic status;Jinhua Sun等;《PLoS One》;20170601;第12卷(第6期);第e0178245页 *
基于转录组测序的马尔尼菲青霉菌实时荧光定量PCR内参基因筛选与鉴定;陶玉婷等;《基因组学与应用生物学》;20160525;第35卷(第5期);第1042-1048页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112080577A (zh) 2020-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Pryce et al. Rapid identification of fungi by sequencing the ITS1 and ITS2 regions using an automated capillary electrophoresis system
CN112575010B (zh) 山药不同组织荧光定量的内参基因及其引物与应用
CN107868834B (zh) 一种达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量pcr检测引物组及方法
CN113881789B (zh) 用于检测隐球菌的探针及引物对组合物及检测方法和应用
CN107190062A (zh) 梨果实不同发育时期荧光定量内参基因的筛选及应用
CN112877465B (zh) 柳杉不同组织的荧光定量内参基因及其专用引物和应用
CN112980997A (zh) 侵袭性毛霉病病原菌的引物和探针及其实现方法、检测系统
CN111073891A (zh) 一种检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适配体及其构建方法和应用
CN112080577B (zh) 荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段的内参基因及其引物和应用
CN112011650B (zh) 中华蜜蜂囊状幼虫病毒rt-rpa检测引物和探针及试剂盒
CN113699220A (zh) 一种以地域植物源鉴别蜂蜜及蜂蜜产地溯源的方法
CN110184376B (zh) 高卢蜜环菌的pcr-rflp鉴别方法
CN114231603B (zh) 一种鉴别勃氏牡丹的引物、试剂、鉴别方法及试剂盒
CN111996274B (zh) 一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法
KR102147340B1 (ko) Ganoderma 속 미생물 검출 및 뿌리 썩음병 진단을 위한 조성물 및 이를 이용한 방법
CN111118014B (zh) 一种抗虹彩病毒的核酸适配体及其构建方法和应用
CN109112194B (zh) 半滑舌鳎性别标签piR-mmu-72274的应用
CN112695105A (zh) 栉孔扇贝的实时荧光pcr鉴定方法
CN106676193B (zh) 一种青霉菌鉴别用分子标记及引物和探针
CN114703313B (zh) 一种菰黑粉菌分型鉴定方法及其应用
KR102147327B1 (ko) Ganoderma 속 미생물 검출 및 뿌리 썩음병 진단을 위한 조성물 및 이를 이용한 방법
KR102492587B1 (ko) Ganoderma 속 미생물 검출 및 뿌리 썩음병 진단을 위한 조성물 및 이를 이용한 방법
CN104846111B (zh) 用于筛选枯草芽孢杆菌荧光定量pcr内参基因引物
KR102147412B1 (ko) Ganoderma 속 미생물 검출 및 뿌리 썩음병 진단을 위한 조성물 및 이를 이용한 방법
CN112342279B (zh) 一种同时检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的试剂盒及其方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant