CN112877465B

CN112877465B - 柳杉不同组织的荧光定量内参基因及其专用引物和应用

Info

Publication number: CN112877465B
Application number: CN202110284668.3A
Authority: CN
Inventors: 徐进; 胡海亮; 崔洁冰
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2021-03-16
Filing date: 2021-03-16
Publication date: 2023-10-10
Anticipated expiration: 2041-03-16
Also published as: CN112877465A

Abstract

本发明公开了柳杉不同组织的荧光定量内参基因及其专用引物和应用，属于植物分子生物学技术领域。该荧光定量内参基因为UBI、CYP和SDH1基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。本发明通过柳杉转录组数据筛选了12个候选内参基因基因序列，利用三款内参基因稳定性评测软件对候选内参基因的稳定性进行评估，获得了柳杉不同组织的实时荧光定量PCR的最适基因UBI、CYP和SDH1。并设计了内参基因的实时荧光定量PCR引物，该引物特异性强，扩增效率高，能够大大的提高采用实时荧光定量检测柳杉基因时的检测效率，并提高了检测结果的可信度。

Description

柳杉不同组织的荧光定量内参基因及其专用引物和应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学技术领域，具体涉及柳杉不同组织的荧光定量内参基因及其专用引物和应用。

背景技术

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)由于其灵敏度高、重复性强、特异性强、快速和高效的特点，成为研究基因表达的主要方法。但qRT-PCR会受到RNA纯度、数量和反转录效率的影响，因此需要引入内参基因作为标准以准确量化基因表达。

内参基因是指在理想情况下，其在植物不同组织、不同生长阶段和不同条件处理下都能够稳定表达，且不受外界环境影响的基因。目前已有大量报道鉴定出了多种植物的合适内参基因。

柳杉(Cryptomeria fortunei Hooibrenk)，又名长叶孔雀松，杉科柳杉属，是我国重要的工业用材和园林绿化树种。在对柳杉的分子生物学研究过程中，难免会涉及到柳杉基因表达的研究，但关于使用qRT-PCR分析和验证柳杉基因表达水平所使用的内参基因的报道基本没有，而稳定的内参基因是保证qRT-PCR结果准确的关键因素，因此有必要鉴定出适合柳杉不同组织荧光定量的内参基因用于柳杉的基因表达研究。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的第一技术问题是提供柳杉不同组织的荧光定量内参基因，能够应用在柳杉不同组织的实时荧光定量中；本发明所要解决的第二技术问题是提供柳杉不同组织的荧光定量内参基因的专用引物；本发明所要解决的第三技术问题是提供上述内参基因或专用引物在柳杉荧光定量中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

柳杉不同组织的荧光定量内参基因，为UBI、CYP和SDH1基因，UBI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；CYP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；SDH1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的柳杉不同组织的荧光定量内参基因的专用引物，

UBI基因的引物序列如下：

UBI正向引物：5’-CGTTAAAGCCAAGATCCAGGACAA-3’；

UBI反向引物：5’-TCCATCCTCAAGCTGTTTCCC-3’；

CYP基因的引物序列如下：

CYP正向引物：5’-GCCATTTCCACAGGGTTATCAAG-3’；

CYP反向引物：5’-GCCATAGAAAGGAGACCAGGAC-3’；

SDH1基因的引物序列如下：

SDH1正向引物：5’-GCCAATACCTGTCTTGCCAAC-3’；

SDH1反向引物：5’-CTCTCCAGCAGCCATTAGTCC-3’。

所述的柳杉不同组织的荧光定量内参基因在柳杉荧光定量中的应用。

所述的柳杉不同组织的荧光定量内参基因的专用引物在柳杉荧光定量中的应用。

有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：

本发明通过柳杉转录组数据筛选了12个候选内参基因基因序列，利用三款内参基因稳定性评测软件(geNorm、NormFinder和BestKeeper)对候选内参基因的稳定性进行评估，获得了柳杉不同组织的实时荧光定量PCR的最适基因UBI、CYP和SDH1。并设计了内参基因的实时荧光定量PCR引物，该引物特异性强，扩增效率高，能够大大的提高采用实时荧光定量检测柳杉基因时的检测效率，并提高了检测结果的可信度。

附图说明

图1是12个内参基因在柳杉不同组织中的Ct值；

图2是geNorm软件分析内参基因表达稳定性；

图3是geNorm软件分析的最佳内参基因的数目；

图4是稳定性较好的3个基因UBI、CYP和SDH1以及不稳定基因18S rRNA作为内参基因，分析柳杉不同组织中CESA基因的表达量；

图5是稳定性较好的3个基因UBI、CYP和SDH1以及不稳定基因18S rRNA作为内参基因，分析柳杉不同组织中CHS基因的表达量；

图6是为稳定性较好的3个基因UBI、CYP和SDH1以及不稳定基因18S rRNA作为内参基因，分析柳杉不同组织中PYL基因的表达量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实施例中如无特殊说明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

柳杉不同组织中表达最稳定的内参基因的筛选包括如下步骤：

1、供试材料取样：采集南京林业大学白马基地生长良好的柳杉，并在2020年7月采集柳杉根、茎、叶和果，用干冰保存后带回实验室，放置-80℃冰箱保存。

2、不同组织总RNA的提取：采用百泰克生物技术公司的通用型总RNA提取试剂盒按照说明书提取柳杉不同组织的总RNA。

3、cDNA第一链的合成：

采用诺唯赞生物科技有限公司的cDNA反转录试剂盒(III RT SuperMixfor qPCR(+gDNA wiper)R323-01)将总RNA反转eDNA，作为荧光定量PCR的模板。

1)在RNase-free离心管中配置如下混合液：4x gDNA wiper Mix 4μL，模板RNA1pg-1ug，加RNase-free ddH₂O至16μL；

2)用移液器轻轻吹打均匀，反应混合物在42℃水浴2min；

3)然后加入5x HiScript III qRT SuperMix 4μL；

4)用移液枪轻轻吹打均匀；

5)在PCR仪按照下列条件进行反转录反应：37℃，15min；85℃，15sec；

6)将上述溶液-20℃保存。

4、通过查阅文献资料暂定候选内参基因，并根据柳杉转录组数据的注释信息筛选表达量较高的候选内参基因。将已筛选的候选内参基因在NCBI网站上进行比对，选择同源性最高的基因。最终筛选出12个内参基因，分别为泛素基因(UBI)、肌动蛋白基因(ACT)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、转录延伸因子的编码蛋白(EF1α)、18S核糖体RNA(18SrRNA)、F-box家族蛋白(FBOX)、β-肌动蛋白(β-actin)、α-tubulin(TUBA)、亲环蛋白(CYP)、琥珀酸脱氢酶(SDH1)、β-tubulin(TUBB)和泛素结合酶基因(UBC)。

5、根据获得的候选基因序列设计该基因相应的特异性引物。引物通过Primer 5.0设计，参数设计如下：扩增长度100-250bp，溶解温度在50-62℃，GC含量在40％-60％之间，并委托擎科生物技术公司合成引物。内参基因及引物序列如下表1所示。

表1 12个内参基因名和引物序列

5、荧光定量PCR反应：以反转的cDNA为模板，用内参基因相应的特异性引物在Applied Biosystems(ABI)7500 Fast Real-Time PCR系统(Applied Biosystems)中进行扩增。获得各个基因的Ct值。

qRT-PCR使用Applied Biosystems 7500系统进行扩增，程序如下：在95℃下30s，之后进行40次循环，参数为95℃下10s，在60℃下30s，之后在60℃～95℃生成熔解曲线。qPCR的20μL体系为：10μL的2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Low Rox Premixed)；1μL稀释10倍的cDNA和0.4μL的正反向引物，最后ddH₂O定容至20μL。3个生物学重复。

完成上述步骤后，将点好样的96孔板放在Applied Biosystems 7500型荧光定量仪中进行反应。

通过观察荧光定量PCR仪在PCR后生成的溶解曲线为单一峰判定所用的引物无特异性扩增；得到的定量Ct值(图1)用于后期内参基因稳定性分析。

分布图每个盒代表一个内参基因的一组处理，盒中的横线代表中位数，盒的上下分别代表上/下四分位，两端的盒须代表95％置信区间。

6、根据所得Ct值采用GeNorm、NormFinder和BestKepper对12个候选内参基因在柳杉不同组织中的表达稳定性进行分析。根据统计结果筛选出本实验中最合适的内参基因。

1)GeNorm分析

GeNorm算法是根据所有候选内参基因的成对变异值来计算各基因的表达稳定值M，M值越大表明基因稳定性越差，只有M值小于1.5时，该候选内参基因才能作为内参基因使用。

GeNorm计算结果表明，12个内参基因的M值均小于1.5，表现出较高的稳定性，按照M值由高到低排序依次为：18S rRNA＞ACT＞GAPDH＞TUBA＞β-actin＞TUBB＞FBOX＞EF1α＞UBC＞SDH1＞UBI＝CYP(图2)，表明UBI和CYP稳定性最好，其次是SDH1和UBC。

GeNorm能够通过计算配对差异值来确定最适内参数目，当V_n/n+1＞1.5时，则最适内参基因数量为n+1个，当V_n/n+1＜1.5时，则最适内参基因数量为n个。GeNorm分析表明V_3/4＜1.5(图3)，因此柳杉不同组织中最适内参基因数量为3个。

2)NormFinder分析

NormFinder算法是基于方差分析对候选内参基因稳定性进行排序，并引入不同样品间的表达差异。与geNorm类似，候选内参基因的表达稳定值M越小，表达越稳定。结果如表2所示，12个候选内参基因按照M值由高到低排序依次为：GAPDH＞18S rRNA＞ACT＞TUBB＞FBOX＞β-actin＞TUBA＞UBC＞EF1α＞CYP＞UBI＞SDH1，表明SDH1最稳定，其次是UBI和CYP。

表2 NormFinder分析12个内参基因表达稳定性

3)BestKeeper分析

BestKeeper软件是根据导入Cp值计算获得候选内参基因在所有样品中Cp值得标准差(SD)、变异系数(CV)和基因间相关系数(r)等值，来评估候选内参基因的稳定性。SD值越小，表达越稳定。程序默认SD的临界值为1，当SD＞1时，表明该基因不适合作为内参基因使用。分析结果显示TUBA、EFIα、β-action和TUBB的SD均大于1，表示这4个基因不适合作为内参基因使用，根据r值排列发现，CYP的r值最小，其次是UBI和SDH1。

综上述3种软件分析结果，最适合作为内参基因的选择是UBI、CYP和SDH1。

实施例2

采用综合排名稳定的3个内参基因UBI、CYP和SDH1和不稳定的内参基因18S rRNA进行验证。

为了验证筛选得到的内参基因的稳定性，分析CESA、CHS和PYL在柳杉不同组织的表达模式。

CESA基因的特异性引物为：

CESA-F：5’-CCAACGGTCAAGTGGTGTCT-3’；

CESA-R：5’-GGTTAGGGTCAGCATAGGGA-3’。

CHS基因的特异性引物为：

CHS-F：5’-ATGCCAAATGTCGCCAAAGT-3’；

CHS-R：5’-GTCGTTCTCAAGAGCGTGCC-3’。

PYL基因的特异性引物为：

PYL-F：5’-CACAGGCTACGGGATTACCA-3’：

PYL-R：5’-GCAAATTACACCGCACAACG-3’。

在CESA、CHS和PYL的表达量中(图4、图5和图6)，以不稳定内参基因18S rRNA作为内参基因时，在茎和叶中都出现了高表达。当使用SDH1作为内参基因时则出现在茎中低表达的现象。因此选择合适的内参基因对实时荧光定量PCR结果的准确性至关重要。

综上，本发明的柳杉不同组织荧光定量最适内参基因为UBI、CYP和SDH1，这三个内参基因表达稳定性优于其他10个候选内参基因，作为荧光定量内参基因能为柳杉不同组织中功能基因表达的准确定量提供有力支持。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 柳杉不同组织的荧光定量内参基因及其专用引物和应用

<130> 1

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 407

<212> DNA

<213> UBI

<400> 1

aaaatccagg acaaggaagg cattcctccc gaccagcaga ggctgatctt tgcaggaaaa 60

caacttgaag atggtcgtac tctggcggat tataatattc agaaagagtc aaccctacat 120

ctggttcttc gtcttcgtgg tggattttag attgtgtcat ggtctcgttg tgtagtggct 180

gatgcgaact ctctgtgttt cctttttttg gctttaaagt tgtgtcatgg tctcatatat 240

ttcctttctt atttctagtt gagtctgtag aagttagaac tggcgtccca gctcgcaaga 300

ctagtctaag ctctgaaaca tttattctgt agtaaaacat atggttaaat aacgactttt 360

atatggaatc cataagtgtg ttttattttt aatgtctatc tttaaaa 407

<210> 2

<211> 976

<212> DNA

<213> CYP

<400> 2

gagaaacaaa agaatcaagc cctccagaac gctcgtcagc cacagttacc tgcaaatcga 60

aactactaac tgtaagctcg atcgtctata cgtcattaac aatttctttc accatatata 120

cagcagcagg aaggggaaaa atttaggcat ggctagcggg ggagcagggg tgatagaatg 180

gcatcaaaag ccttcaaacc ccaagaatcc cattgtcttc ttcgatgtca caattggcac 240

aatcccagct ggacgaatta agatggagct ttttgccgat attgtcccca agacagctga 300

aaactttagg cagttctgta caggcgagta caggaaggca ggcattcctg ttggctataa 360

aggctgccat ttccacaggg ttatcaagga cttcatgatt caagctggtg attttgtgaa 420

gggagatggc agtggatgtg ttagcatcta tggtagcaag tttgaagatg aaaactttgt 480

agctaagcat acaggtcctg gtctcctttc tatggcaaat agtgggccta atacaaatgg 540

atgccagttc tttttaactt gtgcaaaatg tgattggctg gacaataagc atgtcgtttt 600

tgggagggtg ctaggagaag ggctcttggt actgaggaaa attgaaaatg tacaaactgg 660

acccaataat cgacccaagc taccttgtat tattgcagaa tgtggtgaaa tgtaataatc 720

aaatgttcta tgacaggatg tgttatttca tagctccaaa ttttcctgct gtttttgtat 780

aatgctaatt tgggtaaaat gtgaatggac tgttgtttat catcggtgga tctagtgcta 840

aaggataagt tcatgcattt tgatttgatc atttatgcca ttgtgggctt gttgagacta 900

gtgattggtc attgttaatt tgtaaatcag tttaataagg aatttttgat atgaagaaca 960

atgaattttc tggctt 976

<210> 3

<211> 2567

<212> DNA

<213> SDH1

<400> 3

atttaacttc aatagctttc gaacatctaa tttattatca ggaaatctca cttctgaaat 60

aaaaagcacg ggcgtcttcg tttacatttt tgcatcgcat gatcattatt ttattgccta 120

attgtacata taggcattgc agtagtacta cacaatcttt ttcctgccac aacaattttt 180

tcctctcaaa gcaagggttt tgagagttca ctggttcgaa tcccgcaagg atgtggcgaa 240

gggttgcgca gaaattttct tcttcttacc cagtttcaag caaacgattg tatcaaaatg 300

gattgatttt ttctagatcg gtttcttcag agacctcgtc ggtaggaggg cgttcttctt 360

acaccatcgt tgatcatacg tacgatgcag tggttgtcgg agcaggaggg gctggtttaa 420

gagctgctat agggctttcc gagcatggat ttaacacggc ttgtattacc aaacttttcc 480

ccactcgatc gcacaccgtt gcagcgcagg gtggaatgaa tgcagctttg ggaaatatga 540

ctgaagatga ttggaggtgg catatgtatg atacggttaa gggcagtgat tggcttggcg 600

atcaagatgc tattcaatat atgtgcaggg aggctccaaa ggctgttatt gagctggaaa 660

attatggact accattttca agaactgaag atggaaagat ctaccagcgt gcatttggtg 720

gtcaaagtct agattttgga aaaggtggac aagcatatcg ctgtgcttgt gctgcggacc 780

gaactggcca tgctctactg cacacacttt atgggcaggc aatgaagcat aacactcagt 840

tctttgtgga atactttgca ctggatctta tcatggatga tgatggttcc tgtcgagggg 900

tgcttgcttt aaacatggaa gatggcacaa tacatcgttt tcgtgcccat tccacaattt 960

tagccacagg cggttatggc cgaacttatt tctctgcaac gtcagctcat acttgtactg 1020

gagatggaaa cggtatggtt gcacgtgctg ggctgccttt acaggatctt gaatttgtcc 1080

agttccatcc tacgggcata tatggtgcag gttgtcttat caccgaaggg tcacgtggtg 1140

aaggagggat tttacgtaat agtgaaggtg agaggtttat ggagagatat gctccaactg 1200

ccaaggatct ggcttctaga gatgttgtgt ccaggtccat gacgatggaa attcgtgaag 1260

gccgtggtgt tggacccttg aaagaccaca tatatctcca tttaaatcac ctacctccag 1320

aggtcttgaa agagaggctt cctggcatct cagaaactgc agcaatcttt gcaggggttg 1380

atgttacaaa ggagccaata cctgtcttgc caactgtgca ctataatatg ggtggcattc 1440

caacaaatca ccttggtgag gtatcgcata tcaaaggaga taacccagat tctgtggtac 1500

ctggactaat ggctgctgga gaggcagcat gtgcatcagt ccatggtgct aatcgacttg 1560

gtgcaaactc ccttctcgac attgttgtct ttggtcgagc ttgtgccaac acagttgctg 1620

atctatataa accaggtcaa agtcagaaac ctttgccaaa aaatgctgga gaaaagacaa 1680

tttcttggct ggataaatta aggaattcaa atggtagctt acctacttcc aagattcgct 1740

tgaacatgca gagagtgatg cagaacaatg cagcagtttt ccgcactcag gatactttgg 1800

aggaagggtg caagttaatt aacgaaacat ggaagagctt tgaagatgtc aagataaaag 1860

acaggagtct gatatggaat tcagatttga tagaaacaat tgaactagaa aaccttctaa 1920

tcaatgcctg catcaccatg cactcagcag aggctagaaa ggaaagcaga ggagcacatg 1980

ctcgtgaaga ctttacaaaa agagaagacg gggaatggat gaaacacaca cttgggtatt 2040

gggaaaatgg gaaggttcgt ttggcctata ggcctgtcca tctgaacact ttggatgatg 2100

aggtggaaac atttcctcca aaagctcgag tatactgacc actcagatta ctggcaccaa 2160

ggagttccaa aatccttatt tgcagatttt gtaacacatt taaaactgct attgtttaat 2220

gaataaatgt aagtacattt atttaaatta tttgcgttca ccttgcaagg aggcttttcg 2280

gtatttttca taggttgcaa gtgatacaga agaatgaaaa tgggctgcag ctatgattcg 2340

ccaagtgtac atgggaatca atgtattgat atcattcaaa attgatattt tgttaataga 2400

gctgcatggt tactgagaaa tttagaacag agatttcagt atcaactttg caaagtcgaa 2460

accttaatat tatactgttc aataattgaa ttttatgcat gcaccaaaga acagaacaaa 2520

tgtcatctca agcacagtta ataaaattac atttagtatc attgttg 2567

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> UBI正向引物(artificial)

<400> 4

cgttaaagcc aagatccagg acaa 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> UBI反向引物(artificial)

<400> 5

tccatcctca agctgtttcc c 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> CYP正向引物(artificial)

<400> 6

gccatttcca cagggttatc aag 23

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> CYP反向引物(artificial)

<400> 7

gccatagaaa ggagaccagg ac 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> SDH1正向引物(artificial)

<400> 8

gccaatacct gtcttgccaa c 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> SDH1反向引物(artificial)

<400> 9

ctctccagca gccattagtc c 21

Claims

1.柳杉不同组织的荧光定量内参基因，其特征在于，为UBI、CYP和SDH1基因，UBI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；CYP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；SDH1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述的柳杉不同组织为根、茎、叶、果实。

2.权利要求1所述的柳杉不同组织的荧光定量内参基因的专用引物，其特征在于，UBI基因的引物序列如下：

UBI正向引物：5’-CGTTAAAGCCAAGATCCAGGACAA-3’；

UBI反向引物：5’-TCCATCCTCAAGCTGTTTCCC-3’；

CYP基因的引物序列如下：

CYP正向引物：5’-GCCATTTCCACAGGGTTATCAAG-3’；

CYP反向引物：5’-GCCATAGAAAGGAGACCAGGAC-3’；

SDH1基因的引物序列如下：

SDH1正向引物：5’-GCCAATACCTGTCTTGCCAAC-3’；

SDH1反向引物：5’-CTCTCCAGCAGCCATTAGTCC-3’；

所述的柳杉不同组织为根、茎、叶、果实。

3.权利要求1所述的柳杉不同组织的荧光定量内参基因在柳杉荧光定量中的应用；所述的柳杉不同组织为根、茎、叶、果实。

4.权利要求2所述的柳杉不同组织的荧光定量内参基因的专用引物在柳杉荧光定量中的应用；所述的柳杉不同组织为根、茎、叶、果实。