CN113322346B

CN113322346B - 适用于簸箕柳雌花荧光定量的内参基因及其引物和应用

Info

Publication number: CN113322346B
Application number: CN202110760927.5A
Authority: CN
Inventors: 周芳伟; 李淑娴; 尹佟明
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2021-07-06
Filing date: 2021-07-06
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2041-07-06
Also published as: CN113322346A

Abstract

本发明公开了一种簸箕柳雌花荧光定量的内参基因及其专用引物和应用。本发明选择簸箕柳雌花为实验材料，这些雌花涵盖4个不同发育阶段：雌蕊分化期、休眠期、初花期和盛花期，依次通过荧光定量PCR分析，扩增曲线和熔解曲线分析，LinRegPCR扩增效率分析，geNorm、NormFinder和BestKeeper基因表达稳定性分析，筛选出符合适用于簸箕柳雌花荧光定量PCR的2个内参基因(α‑TUB1和ACT)，其中，α‑TUB1基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示，ACT基因的基因序列如SEQ ID NO.2所示，并用这些基因为基础设计了实时荧光定量PCR引物，填补了不同发育时期的簸箕柳雌花没有内参基因的现状，为簸箕柳雌花发育相关功能基因的精确定量提供有力支持，可提高研究的稳定性和准确性。

Description

适用于簸箕柳雌花荧光定量的内参基因及其引物和应用

技术领域

本发明属于柳树荧光定量技术领域，具体适用于簸箕柳雌花荧光定量内参基因及其引物和应用。

背景技术

柳树(Salix)广泛分布于北半球，由于其生长速度快，环境适应性强，常被用做造林树种。簸箕柳(Salix suchowensis)属杨柳科柳属，是原产我国的一种扦插当年即可开花的小灌木，个体矮小，世代周期短，易于开展大规模田间试验。

簸箕柳的花为单性花，雌雄异株，葇荑花序，花先叶开放，雌花授粉后蒴果成熟开裂产生柳絮四处飞扬，污染环境同时也会让人呼吸不畅，因此雌花发育分子机理研究成为近年来研究热点。簸箕柳是柳属中最早解析全基因组序列的柳树，属于二倍体的小灌木，可以实现当年开花，可以作为林木功能基因挖掘的模式物种，但目前还没有用于柳树雌花发育相关研究的内参基因，常用的内参基因在不同的植物及实验条件下会表现不稳定的性状，从而影响目的基因检测的准确性，因此筛选在簸箕柳雌花发育不同时期稳定表达的内参基因是实时荧光定量结果准确的关键因素。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明目的在于提供适用于簸箕柳雌花荧光定量内参基因，该基因能够满足实时荧光定量检测簸箕柳雌花转录表达水平的要求，提高了簸箕柳雌花基因表达分析研究的稳定性和可靠性。本发明的另一目的是提供一种上述内参基因的专用引物。本发明还有一目的是提供一种上述内参基因或专用引物的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

适用于簸箕柳雌花荧光定量的内参基因，为α-TUB1和ACT基因，其中，α-TUB1基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示，ACT基因的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的适用于簸箕柳雌花荧光定量内参基因的专用引物，α-TUB1基因的引物序列如下：

α-TUB1正向引物5’-CTCTTGGAGCGTTTGTCAGT-3’(SEQ ID NO.3)

α-TUB1反向引物5’-TCGTAGATGGCTTCATTGTC-3’(SEQ ID NO.4)。

所述的适用于簸箕柳雌花荧光定量内参基因的专用引物，ACT基因的引物序列如下：

ACT正向引物5’-CCAAGGAGGCTGCTGGTAAT-3’(SEQ ID NO.5)

ACT反向引物5’-CCAAGGCCACCATGTCTGTC-3’(SEQ ID NO.6)。

所述的适用于簸箕柳雌花荧光定量内参基因的在簸箕柳雌花荧光定量中的应用。

所述的α-TUB1基因的引物序列的在簸箕柳雌花荧光定量中的应用。

所述的ACT基因的引物序列的在簸箕柳雌花荧光定量中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本申请通过GeNorm、NormFinder和BestKeeper这三个软件对9个内参进行基因稳定性评价，综合软件分析结果，筛选出在簸箕柳雌花不同发育时期稳定表达的内参基因。共获得两个稳定表达内参基因分别为α-TUB1和ACT基因，同时揭示了这两个内参基因序列，并依此为基础设计的实时荧光定量引物，不仅解决了现有簸箕柳雌花检测中没有内参基因的现状，而且所设计的实时荧光定量引物用于簸箕柳雌花发育过程中基因表达分析时引物特异性强，从而能够大大的提高采用实时荧光定量检测簸箕柳雌花中优良基因时的检测效率，并提高了检测结果的可信度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是簸箕柳雌花采集的样品图，图1A为雌花分化期、图1B为雌花休眠期、图1C为雌花初花期，图1D为雌花盛花期；

图2是琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量胶图，最左侧为Maker，A、D、C、D依次对应图1四个不同时期样品；

图3是9个候选内参基因的Ct值分布箱型图；

图4是geNorm确定用于准确定量分析最优的内参基因数目结果图；

图5是geNorm软件计算9个候选内参基因表达稳定性；

图6是应用SmCAT验证所筛选出的内参基因结果图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

以下实施例所使用的主要供试材料为：供试材料采用种植于南京林业大学白马基地的簸箕柳。随机选择生长良好，并且高度和长势一致的3棵植株做样品采集，在2020年9月份至2021年3月份选择雌花发育的四个阶段(雌蕊分化期、休眠期、初花期和盛花期)，每个时期每株树分别采集3朵雌花，采集后放入离心管，迅速用液氮速冻，-80℃保存，直至使用。

实施例1

1、植物组织总RNA提取及cDNA的合成

使用RNAprep Pure Polysaccharide Polyphenol Plant Total RNA ExtrACTionKit(TIANGEN,NanJing,China)在不同发育时期的雌花中分离总RNA，用分光光度计(METTLER TOLEDO，Switzeriand)检测RNA浓度和质量。通过1.0％琼脂凝胶电泳检测RNA。用于实时荧光相对定量PCR分析的cDNA逆转录反应体系的配制参照One-Step gDNA Removaland cDNA Synthesis SuperMix(Trans,NanJing,China))说明书，使用1μg总RNA建立20μLcDNA逆转录反应体系。反应完成后存于-20℃备用。

2、内参基因的选择及引物的设计

根据文献查询其他植物中主要的内参基因并最终设计出实验所需的9个内参基因，分别为α-TUB1(SEQ ID NO.1)、ACT(SEQ ID NO.2)、α-TUB2(SEQ ID NO.7)、H2A(SEQ IDNO.8)、DnaJ(SEQ ID NO.9)、CDC2(SEQ ID NO.10)、GAPDH(SEQ ID NO.11)、TIP41(SEQ IDNO.12)、β-TUB(SEQ ID NO.13)。首先在本申请人通过与簸箕柳基因组序列进行比对，确定各候选基因的全长序列和全长转录本序列，根据基因的转录全长序列用Primer Premier5.0设计引物，通过BLAST工具鉴定引物特异性。引物均在生工生物工程股份有限公司合成(表1)，通过普通PCR初步筛选引物，利用琼脂糖胶和凝胶成像系统观察PCR产物的条带，检测产物特异性。选择条带大小正确，条带特异性好，没有引物二聚体的引物，近一步通过qRT-PCR进一步检测引物特异性，选择峰图单一，没有杂峰，阴性对照无峰的引物作为最终的引物。

表1内参基因及其对应的引物

3、内参基因引物标准曲线的建立

对每一对内参基因的引物制作各自的标准曲线，计算对应引物的扩增效率。将反转录的cDNA以5为倍数稀释成5个梯度(1、1/5、1/25、1/125、1/625)，作为建立标准曲线的模板。同时，以dd H₂O作为阴性对照模板，来检测实验过程中的试剂或者人为污染。所有的样品均做3次重复，以确保实验数据的可信度。用Applied Biosystems StepOne(ThermoFisher Scientific，USA)进行qRT-PCR，利用得到的数据结果求得各候选基因的扩增效率及斜率，荧光定量PCR扩增效率要求所选引物的扩增效率在90％-110％之间。

4、荧光实时定量

使用Applied Biosystems StepOne(Thermo Fisher Scientific，USA)进行qRT-PCR，每个反应均包含正向和反向引物各4pM，稀释10倍的模板cDNA 2ul，10ulPowerUp^TMSYBR^TMGreen Master Mix(Thermo Fisher，USA)，加ddH₂O至20ul反应体系。每个反应体系进行三次重复。反应在7500Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems，USA)上进行。qRT-PCR反应条件为：95℃持续3分钟，随后进行95℃持续15秒，60℃持续15秒，72℃持续30秒的40个循环，在每个实验结束时，使用默认参数在55–95℃以0.3℃的增量持续60s的周期进行熔体曲线分析，所有分析均设置了三个重复。

5、数据处理

(1)geNorm软件采用成对比较法(Pairwise comparison approach)，计算出基因表达稳定性M值。判定标准是当M值低于1.5时，M值越低，稳定性越高，反之，则稳定性越差。该软件还可计算引入1个新的内参基因后标准化因子的平均配对变异V值，并根据Vn/Vn+1值来确定所需最适内参基因的数目。当配对变异值Vn/Vn+1<0.15时，内参基因组合的最适基因是高稳定性排名的前n个。而如果Vn/Vn+1>0.15，则最适内参基因组合数量是n+1个。

(2)NormFinder软件采用基于模型的方法，获得内参基因表达稳定值，再根据稳定值大小来筛选出最合适的内参基因，判定标准为表达稳定值最小的内参基因为最合适的内参基因。

(3)BestKeeper采用重复配对相关分析、相关分析和回归分析，计算Ct值的标准偏差(SD)和变异系数(CV)，再通过比较各个值的大小，最终确定稳定性较好的内参基因。

6、结果

(1)RNA提取质量及引物特异性检测

各样品的OD260/OD280、OD260/OD230均符合要求，琼脂糖凝胶电泳图检测显示28S及18S条带清晰，无降解现象，满足要求(图2)。9对引物在荧光实时定量中熔解曲线均只有明显的单一峰，且电泳检测也只有单一条带图，说明所用引物可特异扩增各内参基因的相应产物，无引物二聚体，且每个待测样品扩增曲线的重复性好，模板能特异性扩增，实时荧光定量结果准确可信。

(2)内参基因Ct值分析

Ct值与基因的表达量呈反比，Ct值越大，基因的表达量越低，反之，Ct值越小，代表基因的表达量越高。9个内参基因Ct值的均值在17.59-29.65之间，其中α-TUB1和GAPDH表达量较高，CDC2表达量较低(图3)。

(3)软件分析

geNorm软件分析：geNorm软件是根据平均变异度M值来衡量基因的稳定性，软件默认的取舍值为1.5，高于1.5的基因不适合作为内参使用，M值越低表示基因越稳定。此外geNorm软件还根据候选内参基因的配对差异值Vn/Vn+1来确定合适的内参基因个数，当Vn/Vn+1＜1.5时，采用n个内参基因个数。根据软件，计算出V2/V3＝0.143＜1.5，所以在雌花不同发育时期应该选用两个内参基因(图4)，为α-TUB1和ACT(图5)。

NormFinder软件分析：NormFinder软件是根据计算候选内参基因的稳定值进行评价，稳定值越高稳定性越差，具有最小稳定值的基因为最稳定的基因。α-TUB1的值为0.079，为最稳定的基因，β-TUB稳定值为1.203，为最不稳定的基因(表2)。

表2 NormFinder软件分析结果

BestKeeper软件分析：BesterKeeper软件是基于内参基因Ct值的标准差(SD)和变异系数(CV)来评判基因的表达稳定性，直接对基因表达Ct值进行分析。SD值越小，表达越稳定，程序默认临界值为1，当SD值大于1时，认为该基因表达不稳定。分析结果显示CDC2、TIP41和β-TUB，SD数值均大于1，其余基因SD数值均小于1，表达最稳定的是α-TUB1，最不稳定的为β-TUB(表3)。

表3BestKeeper软件分析结果

(4)内参基因稳定性验证

综合考虑BestKeeper、geNorm和Normfinder 3个软件的分析结果得出，α-TUB1和ACT是适合于簸箕柳雌花发育过程中适用的内参基因(表4)。

表4综合排名

选用SmCAT(SEQ ID NO.14)来验证所筛选的内参基因α-TUB1和A CT稳定性，并用表达不稳定的β-TUB基因来做比较，发现用所筛选出的内参基因来作为内参时SmCAT有着相似的变化趋势，但用β-TUB基因来做内参时，SmCAT基因表达情况不同，说明筛选出的内参基因是准确可靠的(图6)。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 适用于簸箕柳雌花荧光定量的内参基因及其引物和应用

<130> 2021

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1356

<212> DNA

<213> 簸箕柳(salix suchowensis)

<400> 1

atgagagagt gcatttcgat ccacattggt caggctggta ttcaggtcgg aaatgcctgc 60

tgggaactct actgcctcga gcacggtatt cagcctgatg gccagatgcc aagtgacaag 120

actgtcggtg gtggagatga tgccttcaac acctttttca gtgaaactgg tgccgggaag 180

cacgtcccac gtgccgtctt tgtagatctt gagcccactg tcattgatga agtcagaacc 240

gggacctacc gccagctttt ccaccctgaa cagctcatca gtggcaaaga agatgctgcc 300

aacaattttg cccgtggaca ctataccatt ggcaaggaaa ttgttgacct gtgcttagac 360

cgtatcagaa agcttgctga caactgcact ggactgcaag gtttccttgt attcaatgct 420

gttggcggtg gcactggatc tggtcttgga tcccttctct tggagcgttt gtcagttgac 480

tatggaaaga aatccaagtt gggattcact gtctatccat ctcctcaggt ctctacatct 540

gttgtcgagc cctacaacag tgtcctctca actcactccc tgttggaaca cactgatgtg 600

gctgtgcttc ttgacaatga agccatctac gatatctgca agcgctctct tgacattgag 660

cgacccacct ataccaacct caatagactt atctctcagg tcatttcctc cctgaccgct 720

tctctgaggt ttgatggtgc tttgaatgtg gatgtcactg aattccagac caacttggtc 780

ccctacccta gaatccactt catgctttcc tcctatgcac cagtcatctc tgctgagaaa 840

gcctaccatg aacaactctc tgttgctgag atcaccaaca gtgccttcga acctgcatct 900

atgatggcaa agtgtgatcc tcgccatggc aagtacatgg cctgctgcct gatgtaccgt 960

ggtgatgttg tgcctaagga cgtcaacgct gcagttgcca ccatcaagac caagcgtaca 1020

attcagtttg tcgactggtg ccccaccgga ttcaagtgtg gtatcaacta ccagccaccc 1080

acagttgttc ctggtggtga tcttgccaag gtccagaggg ctgtgtgcat gatctccaac 1140

tccaccagtg ttgctgaggt gttctctcgc attgaccaca aatttgacct catgtactcc 1200

aagcgcgctt tcgttcactg gtatgttggt gagggcatgg aggagggtga gttctccgag 1260

gcgcgtgagg atcttgctgc actcgagaag gattatgaag aggtaggcgc ggaatcagcc 1320

gagggtgagg atgaagacgg tgaggagtac atgtga 1356

<210> 2

<211> 1134

<212> DNA

<213> 簸箕柳(salix suchowensis)

<400> 2

atggccgatg ctgaggatat tcaacccctt gtctgtgaca atggaactgg aatggtgaag 60

gctgggtttg ctggtgatga tgcacctagg gcagtgtttc ccagtattgt gggtagacca 120

agacacaccg gtgtcatggt tggaatgggg caaaaggatg cctatgttgg tgatgaagca 180

caatctaaaa gaggtatctt gacattgaaa taccctattg agcacggtat tgtcagcaac 240

tgggatgata tggagaagat ttggcatcac actttctaca atgagcttcg tgttgctcct 300

gaggagcacc ctgtcctcct gactgaggcc cccctcaacc ctaaggctaa cagagagaag 360

atgacacaaa ttatgtttga gaccttcaat gttcctgcaa tgtatgttgc catccaggct 420

gtcctttccc tgtatgccag tggtcgtaca actggtatcg tgttggattc tggtgatggt 480

gtgagtcaca ctgtgccaat ctatgaaggt tatgctcttc cacacgccat ccttcgattg 540

gatcttgctg gtcgtgacct cactgatgct ttgatgaaaa ttctgactga gagaggttac 600

atgttcacca ccactgctga gcgggaaatt gtccgtgata tgaaggagaa gctagcgtat 660

gttgcccttg actacgagca ggagctcgag actgccaaga gcagctcctc tgttgagaag 720

aactacgagc ttcctgatgg tcaggtcatc accattggag ccgagaggtt ccgttgccca 780

gaagtcctct tccagccatc tctcatcgga atggaagctg ctggtatcca tgagactaca 840

tacaactcaa tcatgaagtg tgatgtggat atcagaaagg atctgtacgg taacattgtg 900

ctcagtggtg gttccactat gttccctggt attgctgacc gaatgagcaa ggagataacc 960

gcccttgccc caagcagcat gaagatcaag gtggttgcac caccagagag aaagtacagt 1020

gtctggattg gaggatctat ccttgcttcc ctcagcacct tccagcagat gtggatttcc 1080

aagggtgagt atgatgagtc tggcccatcc attgtccaca ggaagtgctt ctaa 1134

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

ctcttggagc gtttgtcagt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

tcgtagatgg cttcattgtc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

ccaaggaggc tgctggtaat 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

ccaaggccac catgtctgtc 20

<210> 7

<211> 1350

<212> DNA

<213> 簸箕柳(salix suchowensis)

<400> 7

atgagggaga taataagcat acatattgga caggcaggga ttcaggtcgg gaattcttgt 60

tgggaacttt actgtcttga acatggaatg cagcctgatg gaacaatgcc tagtgacacc 120

tcagtcggaa tggaacatga ttctttcaat accttcttca gcgaaactgg ttcaggcaag 180

catgtgccaa gagctatatt tgttgatctt gaaccctctg tcattgatga agtcagaact 240

gggacttaca ggcaactttt tcatcctgag caacttattt ctggcaagga agatgctgct 300

aataactttg ccaggggaca ttatacagtg ggaagggaaa ttgtcgagct atgccttgat 360

cgtgtgagga aattggcaga caattgcact ggtttgcaag gttttttggt gtttaatgct 420

gttggcggtg gcactggttc tggtctgggc tccctacttt tggaacgctt gtctgtggat 480

tatggaaaga agtcgaaact tggctttacc atttatcctt ctcctcaggt ttccacggct 540

gttgtggaac cttacaacag tgtgctctcc acccactctc tccttgaaca cacagatgtt 600

gctgtgcttt tggacaatga agctatctat gacatctgca ggagatcttt agacattgaa 660

agaccaacat actccaactt gaaccgtttg atatcccaga ttatctcatc tttgaccact 720

tccttgaggt ttgatggggc cattaatgtg gacatcacag agtttcaaac taatcttgtt 780

ccatatcccc gaatccattt catgctttca tcttatgccc cagtgatctc agccgcaaag 840

gcttaccacg agcagctctc agttcctgag atcacaagtg ctgtgtttga gccctcgagt 900

atgatggcca aatgtgatcc aaggcatgga aaatacatgg cttgctgtct catgtatcgt 960

ggagatgttg taccaaagga tgttaattct tctgttgcca ccattaagac aaagaggaca 1020

gttcaatttg tagactggtg cccaactggt ttcaagtgcg gtatcaacta ccagccacca 1080

acagtggtac ctggaggtga tcttgctaaa gtgcagcgtg cagtttgcat gataagcaac 1140

aacacagcag tagctgaggt cttctccaga attgatcaca agtttgatct catgtattcc 1200

aagcgagcat ttgtccactg gtatgtgggc gaaggcatgg aggaaggtga attctcagaa 1260

gctcgtgaag atcttgctgc tcttgagaaa gactacgagg aagtcggagc agaaggtggc 1320

gaggaggaag gcgaggagga agattactga 1350

<210> 8

<211> 402

<212> DNA

<213> 簸箕柳(salix suchowensis)

<400> 8

atggctggta gaggcaagac cctaggatct ggagcccaaa agaaggctac ttcaaggagt 60

agcaaggctg gtttgcaatt tcctgtgggt cgtatcgcta ggttcctgaa ggccggcaag 120

tatgctgagc gtgttggcgc cggcgctcct gtttaccttg ctgctgttct tgaatatctt 180

gctgccgagg ttctagaatt ggctggaaat gcagcaagag acaacaagaa gacccgtatc 240

gtgccacgcc acatccaact agcagttagg aatgatgagg agcttagcaa gcttcttggt 300

gatgttacaa ttgctaatgg aggtgtcatg cccaacattc acaaccttct ccttccaaag 360

aaggctggct cctctaaggc ccctgctgat gatgacagtt aa 402

<210> 9

<211> 1062

<212> DNA

<213> 簸箕柳(salix suchowensis)

<400> 9

atggatggaa acaaagacga tgcgttgaaa tgcttgaaaa tcggcaaaga agccctcgaa 60

tccggcgatc gaagccgtgc tttaaaattc ttcaccaaag ctcgtcgcct ggatcctgca 120

atcgccatcg acgatctctt atctgcggcg gaaaaggatg agcctaataa aacggcggat 180

gaaaacatta ataatgggtc cactacagcc acgtcctcca acgaatccaa agttcgccac 240

aggggttcat catcatcatc atatacagag gagcaaattt cgattgtgag agaaatcagg 300

aagaagaaga attactatga gattttggga ttggaaaagt ctagcactgt agaagatgtt 360

cgaaaagcat atcgaaaact atcactgaaa gtccatcctg ataagaacaa gtctcctgga 420

gctgaggatg catttaaagc tgtttcgaaa gcgtttcagt gccttagcaa tgaagagagc 480

aggagcaaat atgatgttag cggaactgaa gagcctctct acgagagacg cacttccagt 540

catcgtcgtc attataatta taacgatgat ttagatcctg acgagatatt caggcaattc 600

ttctttggag gtggaatgag gcctgccacc acccagtttc ggagctttaa ttttggagct 660

ggaatgggtg gccctagaat ggatcataat ggatctggct ttaatttccg tgcattgatt 720

caactgctcc cggttcttct tattttcctt ttcaacttcc taccgtcatc tgagcctatt 780

tatgcccttt ccaggtccta tccttatgaa tacaggttta ctacgcagag aggggttaat 840

ttttatgtga agagcaccaa atttgagcag gattatcgac cggataccca tgagagggct 900

gcgctggaag ccaaggtgga taaggactac gtctctgccc ttgtgcagaa ttgtaggttt 960

gagttgcaga ggaagcagtg gggttttgta agggagactc ctcactgtga aatgctgcag 1020

cagtttcaag atggggaatt ggtgcttgat ggaaactttt aa 1062

<210> 10

<211> 885

<212> DNA

<213> 簸箕柳(salix suchowensis)

<400> 10

atggatcagt atgagaaagt ggaaaaaatt ggtgaaggaa cctacggagt ggtctacaaa 60

gctcgtgatc gtgtcaccaa tgagaccatt gctttgaaga agatccgttt ggagcaggaa 120

gacgagggcg tacccagcac tgctatccga gaaatctctc tcttgaaaga gatgcagcat 180

ggtaacattg tcagactgca ggatgtggtg cacagtgaga agcgccttta cttggttttt 240

gagtatctag acttggattt gaagaagcac atggattctt cacctgaatt tgctaatgat 300

ccacgcctgg ttaaaacatt tctttatcaa attctccgtg gcattgcata ctgccattct 360

catagagttc tgcatcgaga tttgaaacct cagaatttgc tcattgatcg ccgtaccaac 420

gcgctgaagc ttgcagattt tggactggct agagcatttg gtatacctgt taggacattt 480

acacatgagg ttgttaccct gtggtataga gcccctgaaa ttctgcttgg atctcgccat 540

tactcgactc cagttgatgt atggtcagtg ggatgtatat ttgctgagat ggtgaaccag 600

aagccactgt tcccagggga ttccgagata gatgaactat tcaaaatttt cagaatcttg 660

ggtactccaa atgaggacac atggcccgga gttacttctt tgcctgactt caagagtgca 720

ttccctaagt ggccttctaa ggatttggca actgtagttc caactcttga taaagctggc 780

gtggatcttc tcgctaaaat gctttgcttg gatcccacta aaagaattac tgccaggagt 840

gctttggagc atgaatactt caaggatatt ggttttgtac cttaa 885

<210> 11

<211> 1362

<212> DNA

<213> 簸箕柳(salix suchowensis)

<400> 11

atggctaccc acgcagctct tgcctcttca agaatccctg ccaatacaag acttccctca 60

aagatcaacc actctttccc cactcaatgc tccttaaaga ggctagaagt ggctgagttt 120

tctgggcttc gagccagttc atgtgtaacc tatgccaaga acgctggtga gggatccttc 180

tttgatgtgg tggcttccca acttgctcca aaggttgcag tttcaactcc tgtcagggca 240

gaaactgtgg ccaaattaaa ggttgctatc aacggatttg gacgcattgg caggaacttc 300

ctgcgatgct ggcatggtcg caaagactct ccccttgatg taattgttgt caatgacagt 360

ggtggtgtca agaacgcttc ccacttgttg aaatatgatt caatgcttgg aactttcaaa 420

gcagaggtga aaattgtgga caacgagacc atcagtgttg atggcaagcc cattaaggtt 480

gtttccagca gagaccctct caagcttcct tgggctgagc tcggaataga cattgttatt 540

gagggaaccg gagtttttgt ggatggtcct ggtgctggga aacatattca agctggtgcc 600

aagaaagtta tcatcactgc tccagccaaa ggtgccgata ttccaaccta tgttgttggt 660

gttaacgaaa aggactacgg ccatgaggtt gccgacatta taagtaatgc ttcctgcacc 720

acaaattgtc tggctccctt tgtgaaaatc ctggatgaag aattcggcat tgtcaaggga 780

acaatgacaa caactcactc ctacactgga gatcagaggc tcttggatgc ttcacaccga 840

gacttgagga gagccagggc tgcagcattg aacatagtcc caacaagcac tggtgcagcc 900

aaggctgtat ctcttgtgct gccccagctc aagggcaagc tcaatggcat cgcactccgt 960

gtcccgacac ccaatgtttc agttgttgac cttgttgtga atgttgcgaa gaagggcatt 1020

acagcagaag atgtcaatgg agccttcaga aaggccgctg gggggccatt gaagggtgta 1080

ttggacgtgt gtgatgttcc tcttgtgtct gttgacttcc gatgctctga tgtttcctca 1140

accattgact cttcattgac catggtcatg ggagatgata tggtcaaggt tgtcgcctgg 1200

tatgacaatg aatggggata cagccaaagg gtcgtcgatt tagcacatct tgtagcggaa 1260

agtggccagg agtggctgca gcaggaagtg gagacccatt ggaggatttc tgcaagacaa 1320

acccagctga tgaggaatgc aaagtttatg aagcttagat ga 1362

<210> 12

<211> 870

<212> DNA

<213> 簸箕柳(salix suchowensis)

<400> 12

atggacgtgg aagtagatga caaagaccta aaagccgccg gcgccgaggt tttaaccgac 60

gaccgtcatg gactccgcat ccatggctgg gaaatcgtat cttgcaacgg ctccattctc 120

aactcctcct ctctgatcac atgggaagaa aagttaaaaa cttctcattt accagagatg 180

gtttttggag aaagttgttt agtacttaaa catgcgacca gtggtaccaa aattcatttc 240

aacgcgtttg atgccctaac tggctggaaa caagaggctt tacctccggt cgaagtccct 300

gctgctgcgc aatggaaatt tagaagcaaa ccattccagc aggtgatatt ggattatgat 360

tatacattca cgacgcctta ttgtggtagt gaaacaatgg aatttgacac agagaagaaa 420

aacagcgagg aatttctgga ggctagctgc agcccctgtt gggaagactg tgaagagcaa 480

attgatgtgg ttgcacttgc atcaaaagag cctattcttt tctatgatga ggtagtcttg 540

tatgaagatg aactggctga taatggggtg tcgcttttaa ctgttaaagt gagagtcatg 600

ccgagttgct ggtttcttct tttgcgattc tggcttagag ttgatggagt gctaatgaga 660

ttaagggaca ctcgtatgca ttgtattttt agtgacagcg caaatcctat tgttcttcga 720

gaaagctgct ggagagaagc cacctttgaa gctctggctg ctaaaggata tcctgctgac 780

tctgcttcat atagtgatcc aagcatcatc agccaaaggc ttcccatcat catgcacaag 840

actcaaaagc ttagggtcgg tccactgtaa 870

<210> 13

<211> 1341

<212> DNA

<213> 簸箕柳(salix suchowensis)

<400> 13

atgagagaaa tccttcacat ccaagcaggc caatgcggca accaaatagg agcaaagttt 60

tgggaagtag tatgtgcaga acacgggatt gactccaccg gtcggtacaa tggtgactcg 120

gctctccaac tcgagcgagt taatgtttac tataatgaag ccagctgtgg aagatttgtc 180

cctcgtgctg ttctagtgga tcttgaaccg ggtactatgg acagtcttag atccggcccg 240

tacgggcaga tttttagacc ggataatttt gtgtttggcc aatctggtgc tggtaataac 300

tgggctaaag gacattatac ggagggcgcg gagctgattg attctgttct tgatgttgtt 360

aggaaggagg ctgagaactg tgactgcctg caaggatttc aggtatgcca ctcactgggg 420

ggtggtacag ggtctggaat gggaacactt ttgatctcga aaataagaga ggaatacccg 480

gaccggatga tgctaacatt ctctgttttc ccatctccaa aggtctcaga cactgtggtc 540

gagccttaca atgcaactct ctctgttcac cagcttgttg aaaatgctga tgagtgtatg 600

gttcttgata atgaggctct ttatgatatc tgcttccgta ctctcaagct cgcaactccc 660

agctttgggg atctgaacca cctgatttca gccaccatga gtggtgttac atgctgcctt 720

cgtttccctg gtcagctcaa ttcagacctt cgcaaacttg ctgtgaacct catcccattc 780

ccccgtcttc actttttcat ggttggcttt gcacctctca cttcccgtgg ctcgcagcag 840

taccgttccc taactgtacc tgaactcacc caacaaatgt gggattccaa gaatatgatg 900

tgtgctgctg atccccgcca tggcagatat ctcacagcct ctgccatgtt tcgtgggaaa 960

atgagcacaa aggaagttga tgagcagatg atcaacgttc aaaacaagaa ctcatcctac 1020

tttgtcgaat ggatccccaa caatgtcaag tctactgtct gtgacattcc tcctacaggc 1080

ttgacaatgg cttccacttt cattggcaac tccacatcaa tccaagagat gttccgaaga 1140

gttagcgagc agttcactgc catgttccgc aggaaggctt tcttgcattg gtacacggga 1200

gagggaatgg atgagatgga atttacagag gctgagagca acatgaacga tttggtctca 1260

gagtaccaac aataccagga cgcaactgcc gacgaggaag gcgagtatga agatgaggaa 1320

gaataccagg atgaggccta a 1341

<210> 14

<211> 1479

<212> DNA

<213> 簸箕柳(salix suchowensis)

<400> 14

atggatccct acaagcaccg tccgtcaagc gctttcagca ctccatactg gactacaaat 60

tctggagctc cggtttggaa caacaactcg tctctgaccg ttggatctag aggtccaatc 120

ctcctcgagg attaccatct ggtggagaag attgccaatt ttgacaggga gaggattcca 180

gagcgtgtcg tccatgctag gggagccagt gcaaagggtt tctttgaggt tacccatgat 240

atctctggtc tcacatgtgc tgattttctc cgggcccctg gagttcagac acctgtcatt 300

gtccgcttct ccacagttat ccatgagcgt ggcagccctg aaaccctgag ggatccacgt 360

ggatttgcag tgaagtttta caccagagag ggtaactttg atcttgtggg aaacaatttc 420

cctgtcttct tcatccgtga tgggatgaaa ttcccagaca tggtgcatgc ccttaagccc 480

aaccccaagt ctcatattca ggagaactgg aggattcttg acttcttctc ccaccatcct 540

gaaagtttgc acatgttctc cttcctattt gatgatgtgg gtgtgccaca agattataga 600

catatggaag gctctggtgt taacacctac acgttgatca acaaggctgg aaaagcccat 660

tatgtgaaat ttcattggaa acctacttgt ggtgtgaaat gtttgttgga ggacgaggca 720

attaaagtag gaggcacaaa tcacagccat gctactcagg atctatacga ctccattgcg 780

gctggcaact atcctgagtg gaaacttttc attcagacaa ttgatcctga ccatgaagcc 840

aggtttgatt ttgacccact tgatgtaacg aagacctggc ctgaggatat cttgcccctg 900

cagccagttg gtcgcttggt cttgaataag aacatcgaca acttctttgc tgaaaatgag 960

cagcttgctt tctgccctgc tattgtggtt cctggtatct actattcaga tgacaagcta 1020

ctccagactc gaatcttctc ctattctgat acccagaggc accgtcttgg accaaactat 1080

ctgcagctcc ctgctaatgc tcccaagtgt gctcatcata acaatcacca tgaaggtttc 1140

atgaatttca tgcataggga cgaggaggtc aactatttcc catcaaggta cgatcctgtt 1200

cgccatgctg agagtttccc cattcctcct gctgtctgca gtggaaagcg tgagaagtgc 1260

atcattgaga aggagaacaa cttcaagcaa cctggagaga gataccgatc ctgggcacca 1320

gacaggcaag aacgatttat ttgccgatgg gttgatgcct tatctgaccc acgcgccaca 1380

tatgagattc gcagcatctg gatctcatac tggtctcagg ctgataaatc tttgggtcag 1440

aagctagcat ctcgtctcag cgtgagacca agcatttga 1479

Claims

1.α-TUB1基因和ACT基因组合在簸箕柳雌花分化期、休眠期、初花期及盛花期荧光定量中作为内参基因的应用，其特征在于，所述α-TUB1基因的序列如SEQ ID NO .1所示，所述ACT基因的序列如SEQ ID NO .2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述α-TUB1基因的引物序列如下：

α-TUB1正向引物5’-CTCTTGGAGCGTTTGTCAGT-3’

α-TUB1反向引物5’-TCGTAGATGGCTTCATTGTC-3’。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ACT基因的引物序列如下：

ACT正向引物5’-CCAAGGAGGCTGCTGGTAAT-3’

ACT反向引物5’-CCAAGGCCACCATGTCTGTC-3’。

4.检测α-TUB1基因和ACT基因的引物组合在簸箕柳雌花分化期、休眠期、初花期及盛花期荧光定量中的应用，其特征在于，所述引物组合由以下引物组成：

α-TUB1正向引物5’-CTCTTGGAGCGTTTGTCAGT-3’

α-TUB1反向引物5’-TCGTAGATGGCTTCATTGTC-3’

ACT正向引物5’-CCAAGGAGGCTGCTGGTAAT-3’

ACT反向引物5’-CCAAGGCCACCATGTCTGTC-3’。