KR100969177B1 - 양조 효모 유전자의 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 목적은, 원하는 양조 특성에 관여하는 유전자 선별 방법으로서, 이는 맥주와 같은 알콜성 음료에 사용되는 산업용 효모, 특히 양조 효모의 전체 게놈 서열 데이터를 집계한 데이터베이스를 제작하고; 양조 효모가 특이적으로 보유한 양조 특성에 관여하는 유전자를 상기 데이터베이스로부터 선별하고; 파괴 또는 과발현으로 상기 유전자의 기능 분석을 수행하는 방식으로 달성되는 방법을 제공하는 것, 및 산업용 효모, 특히 양조 효모의 전체 게놈 서열의 데이터를 집계한 데이터베이스를 기초로 한 (선별된 올리고뉴클레오티드(들)이 고체 지지체 상에 부착되어 있는) DNA 어레이를 제공하는 것이다. 또다른 목적은 상기 유전자가 관여하는 양조 특성을 나타내는 효모의 육종 방법 및 상기 효모를 이용하여 생산성 및 품질이 개선된 알콜 또는 알콜성 음료의 제조 방법을 제공하는 것이다. 또다른 목적은 상기 양조 효모에 특이적인 유전자 및 상기 유전자에 의해 암호화되는 펩티드를 제공하는 것이다. 상기 목적을 달성하는 수단은 알콜 또는 알콜성 음료의 제조에 있어서 생산성 증가 및/또는 풍미 개선에 관여하는 유전자의 스크리닝 방법으로서, 이는 (A) 산업용 효모의 전체 게놈 서열을 분석하고, (B) 상기 게놈 서열을 에스. 세레비지애의 전체 게놈 서열과 비교하고, (C) 에스. 세레비지애의 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 70 내지 97% 의 상동성을 가진 아미노산 서열을 암호화하는 상기 산업용 효모의 유전자를 선별하고, (D) 상기 유전자의 기능 분석을 수행함으로써, 상기 유전자에 의해 효모에 제공되는 특성을 동정하는 것을 특징으로 한다.

양조 효모, DNA 어레이, 에스. 세레비지애

Description

양조 효모 유전자의 스크리닝 방법 {SCREENING METHOD FOR GENES OF BREWING YEAST}

본 발명은 알콜성 음료, 예컨대 맥주 또는 정종, 연료 알콜 등의 생산에 사용되는 산업용 효모의 유전자, 특히 알콜성 음료의 제조에 사용되는 양조 효모의 유전자의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 알콜성 음료의 제조에서, 양조 효모의 DNA 서열 정보를 데이터베이스로 집계하여, 생산 증가 및/또는 풍미의 개선, 예컨대 향 안정화, 강화 등에 관여하는 유전자를 선별하도록 하는 방법; 유전자의 발현이 제어되는 양조에 적합한 효모, 예컨대 선별된 유전자가 파괴된 효모 또는 상기 유전자가 과발현된 효모의 육종법; 및 육종 효모를 이용한 알콜성 음료의 제조 방법에 관한 것이다.

연료 알콜, 알콜성 음료, 예컨대 맥주 또는 정종 등의 생산 기술 개발은 산업용 효모를 이용하여 수행된다. 특히 양조 효모를 이용한 알콜성 음료의 제조에서, 생산성 증가 및 알콜성 음료의 향 안정화 또는 증강과 같은 풍미 개선을 위한 기술에서의 활발한 개발이 있어 왔다.

전세계에서 가장 많이 소비되는 알콜성 음료는 맥주이며, 2001 년도에 전세계에서 생산된 맥주의 양은 약 140,000,000 kL 이다. 맥주의 유형은 효모의 유형 및 발효 방법에 따라 크게 3 가지로 분류된다. 상기 3 가지 유형은, 발효가 양조장에 있는 효모 및 미생물을 이용하여 수행되는 천연 발효 맥주; 발효가 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) (이후, 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae) 로 간단히 표기함) 에 속하는 상면 발효 효모를 이용하여 20 내지 25℃ 에서 수행되며, 이어지는 숙성 기간이 단축되는 에일형 (ale-type) 맥주; 및 발효가 사카로마이세스 파스토리아누스 (Saccharomyces pastorianus) 에 속하는 하면 발효 효모를 이용하여 6 내지 15℃ 에서 수행되며 이어서 저온 숙성에 적용되는 라거형 발효 맥주 (larger-type beer) 이다. 최근, 전세계에서 생산되는 맥주의 90% 이상이 라거형 발효 맥주이며, 따라서, 라거형 발효 맥주의 양조에 사용되는 하면 발효 효모가 맥주 양조에서 가장 널리 사용된다.

상기 언급된 양조 효모를 포함하는 미생물을 이용하여 생산이 수행되는 소위 발효 생산에서, 생산성을 증가시키고 제품의 품질을 개선하기 위해서는 발효 공정이 최적화되고 유용한 균주가 선별 및 육종되는 것이 중요하다.

맥주 양조의 최적화의 경우, 효모 대사물, 예컨대 알콜 (예를 들어, 에탄올), 에스테르, 유기산 등의 양이 모니터링되며, 온도, 기류의 품질, 원료의 함량 등이 제어되는 방법이 수행되어 왔다. 상기의 경우, 효모 세포에 의한 재료 흡수 및 방출 및 세포에서의 대사가 블랙 박스로서 취급되며 매우 표면적인 제어만이 수행된다. 또한, 예를 들어, 알콜성 음료에 대한 높은 수준의 풍미를 제공하려는 목적으로, 맥주 양조 동안 공급되는 산소의 양 등을 줄이기 위한 공정 제어 방법이 시도되었다. 그러나, 상기 방법에서 효모 자체의 성장 속도는 불충분한 산소로 인해 감소될 수 있고, 발효의 지연 및/또는 맥주 품질의 악화와 같은 부작용이 발생할 수 있다. 따라서, 발효 공정의 최적화를 수단으로 하는 맥주의 생산 및 품질에서의 개선에는 한계가 있다.

한편, 유용한 산업용 효모와 같은 유용한 산업용 효모 육종법과 관련하여, 바람직한 균주의 선별 기술이 실제 육종보다는 더욱 널리 사용된다. 파스퇴르에 의한 미생물의 발견 훨씬 전부터 맥주 양조는 그대로 수행되었고, 맥주 양조시 맥주 양조에 사용되는 다수의 효모 균주로부터 맥주 효모의 더욱 적합한 균주를 선별하는 방법이 전통적으로 수행되었으나, 우수한 형질을 가진 맥주 효모가 양성적으로 육종되는 경우가 드물었다.

양성 육종법의 예시로서, 화학물 또는 방사선에 의한 인공적인 돌연변이화가 이용되는 방법이 있다. 그러나, 양조 효모, 특히 맥주 양조에 널리 사용되는 하면 발효 효모는, 다수의 경우 배수체이다. 상기의 경우, 돌연변이화될 모든 대립 유전자에서 돌연변이가 발생하지 않으면 원하는 돌연변이체를 생산하는 것이 불가능하다. 따라서, 바람직한 돌연변이를 유도하는 것이 반수체인 실험실용 효모에서는 가능하다고 해도, 배수체인 맥주 효모의 경우에 있어서는 실질적으로 불가능하다.

근년에, 하면 발효 효모로부터 분리된 포자를 이용함으로써 돌연변이 또는 교배육종이 수행되는 육종법이 시도되었다 (참조, 예를 들어, 비-특허 문헌 1). 그러나, 하면 발효 효모는 배수체이며, 복잡한 염색체 구조를 가지며, 따라서, 증식 능력을 가진 포자의 분리는 어렵고, 더욱이 이들로부터 우수한 형질을 가진 균 주를 수득하는 것은 거의 불가능하다.

한편, 최근에 유전자 조작 기술을 이용하여 원하는 유전자를 양조 효모에 도입하고 발현시키는 것이 가능해짐으로써, 유전자의 기능 분석 결과 및 기능적으로 분석된 유전자를 이용함으로써 원하는 특징을 가진 효모를 육종하는 것이 가능해졌다. 그러나, 전체 게놈 서열이 이미 밝혀진 제빵 효모 (에스. 세레비지애 (S. cerevisiae); 참조, 예를 들어, 비-특허 문헌 2) 에 비하여, 하면 발효 효모의 전체 게놈 서열은 밝혀지지 않았고, 하면 발효 효모에 특이적인 양조 특징에 참여하는 유전자 및 맥주 양조에서의 상기 유전자의 기능에 대하여 단지 매우 적은 발견사실만이 있을 뿐이다.

근년에, DNA 분절 또는 뉴클레오티드 올리고머로서 이들 각각이 염색제의 구조적 유전자 또는 통합 영역의 부분적인 서열을 갖는 것을 고체 지지체 상에 고정한 DNA 마이크로어레이를 이용하여 전사물 분석 (transcriptome analysis) 이 수행되었다. 예를 들어, Olesen 등은 양조 동안 GeneFilters (Research Genetics Co. 제조) 을 이용하여 하면 발효 효모의 포괄적인 유전자 발현 분석을 수행했다 (참조, 예를 들어, 비-특허 문헌 3). 그러나, 하면 발효 효모의 전체 게놈 서열이 아직 밝혀지지 않아서, 발현에 대해 모니터링된 유전자가 정확히 어느 것인지 모호하다. 그 결과, 상기 정보는 하면 발효 효모의 대사 분석 및 유용한 효모의 육종 및 맥주 양조 과정의 제어에 매우 불충분하다.

최근에, 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae), 에셰리키아 콜라이 (Escherichia coli) (참고로, 예를 들어, 비-특허 문헌 4) 및 마이코박테리움 튜베 르굴로시스 (Mycobacterium tuberculosis) (참조, 예를 들어, 비-특허 문헌 5) 를 포함하는 100 종 이상의 미생물의 전체 게놈 서열이 결정되었다 (참고로, 예를 들어, 비-특허 문헌 6). 결정된 DNA 서열을 근거로 상기 미생물의 유전자가 동정되었으며, 유전학적, 생화학적 및 분자생물학적 실험없이도 엄청난 갯수의 유전자의 기능이 예측되었다. 그러나, 양조 효모와 같은 산업용 효모는 높은 배수성 및 복잡한 염색체 구조를 가져, 어셈블리 (DNA 서열을 연결하기 위한 조작) 가 어려울 것으로 추정된다. 따라서, 2 가지 상이한 유형의 게놈을 포함하는 하면 발효 효모 (참고로, 예를 들어, 비-특허 문헌 7) 의 전체 게놈 서열은 아직 보고되지 않았다.

특별한 알콜 또는 알콜성 음료의 제조에서, 풍미 제어를 위한 제품에서 아황산염의 농도를 증가시키는 기술이 있다. 아황산염은 항산화 활성을 가지며, 식품, 음료 및 제약 분야 및 알콜성 음료에서도 항산화제로서 널리 이용되어 왔다. 예를 들어, 긴 숙성 기간을 필요로 하는 와인의 경우, 아황산염은 그의 품질 보존에 중요한 역할을 한다. 맥주 양조에서는, 제품에 포함된 아황산염의 농도 증가에 비례하여 품질 보존 기간이 길어진다는 것이 공지되어 있다. 이에 따라, 제품 내의 아황산염의 양이 증가하면, 탁월한 풍미 안정성 및 긴 품질 보존 기간을 가진 제품을 제조하는 것이 가능하다.

제품에 아황산염의 양을 증가시키는 가장 단순한 방법은 아황산염의 첨가이다. 일본에서는 와인에 대하여 보건, 노동 및 복지부에서 잔류 아황산염 농도에 있어서 350 ppm 이하의 아황산염 첨가를 허용한다. 그러나, 상기의 경우, 아황산염이 식품 첨가물로서 분류되므로, 식품 첨가물에 대한 소비자의 부정적인 인상을 고려한다면 아황산염을 맥주에 첨가하는 것은 적당하지 않다.

그러나, 양조에 사용되는 효모는, 황 함유 아미노산과 같은 황 함유 대사물을 합성하기 위해 매질 중의 황산염을 환원시켜 황화수소를 생성한다. 아황산염은 상기 경로의 중간 대사물이다. 발효 기간 동안 아황산염이 세포외로 효율적으로 방출된다면, 맥아즙 및 제품 모두에서 아황산염의 양이 증가될 수 있다.

발효 동안 맥아즙 내의 아황산염 농도 증가를 위한 두 가지 방법이 있다. 한 가지는 발효 공정의 제어이며, 다른 한 가지는 양조 효모의 육종이다. 발효 공정의 제어에 있어서, 발효 동안 생산되는 아황산염의 양은 용존 산소의 농도에 반비례하므로, 용존 산소의 농도를 감소시켜 아황산염의 양을 증가시키고 동시에 아황산염의 산화를 억제하는 방법이 시도되었다. 그러나, 상기 방법에서는, 산소 결핍으로 인해 효모의 성장 속도가 둔화되며, 이는 발효의 지연 및 품질 악화와 같은 부정적인 영향을 미친다. 따라서, 상기 방법은 실용적이지 않다.

한편, 상기 언급된 바와 같이, 유전자 조작 기술이 양조 효모 육종을 위해 개발되었다. 예를 들어, 효모의 황 대사에 초점을 맞춘 소정의 보고가 있다. 아황산염 (SO₂) 은 황 함유 아미노산 및 비타민 합성의 중간 산물이며, 황산염 이온 (S0₄ ^2-) → APS (아데닐 황산염) →PAPS (포스포아데닐릴황산염) → 아황산염 이온 (SO₃ ^2-) (여기서, 황산염 이온은 세포의 외부에서 혼입된다) 의 경로를 통해 생산된 다. 황산염 이온 (SO₄ ^2-) → APS (아데닐릴 황산염) 의 반응에 참여하는 MET 3 유전자 및 APS (아데닐릴황산염) → PAPS (포스포아데닐릴 황산염) 의 반응에 참여하는 MET 14 유전자의 복제수를 증가시켜 아황산염의 생산에 대한 효모의 능력을 개선하려는 시도가 있었다 (참조, 예를 들어, 비-특허 문헌 8). 아황산염 이온 (SO₃ ^2-) 의 환원을 MET 10 유전자의 파괴로 저해함으로써, 효모에 의해 생산된 아황산염의 양을 증가시키려는 또다른 시도의 예시가 있다 (참조, 예를 들어, 비-특허 문헌 9). 상기 시도에 따르면, MET 10 유전자 파괴에 의한 아황산염의 양이 모체 균주의 10 배 이상으로 증가되나, 한편으로는 발효에서의 소정의 지연 및 맥주에서의 아세트알데히드 및 1-프로판올의 양 증가가 알려져, 실제적인 용도로는 문제가 된다.

따라서, 유전자 조작을 이용한 양조 효모와 같은 산업용 효모에 대한 육종 방법의 개발이 진행 중이지만, 양조 효모의 불충분한 게놈 정보로 인해, 양조 효모의 양조 특성에 관여되는 유전자의 선별, 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 기능 분석 및 육종에 대한 상기 관찰사항의 이용은 충분히 수행되지 않았다.

이에 따라, 발효 속도 및 제품 품질의 악화없이 원하는 특성을 나타내는 효모 육종 방법이 아직 확립되지 않았고, 양조 산업에서 뿐만 아니라 효모가 이용되는 산업들에서도 상기 방법의 개발이 크게 요구되고 있다.

(비-특허 문헌 1) C. Gjermansen :"Construction of a hybrid brew strain of Saccharomyces carlsbergensis by mating of meiotic segregants", Carlsberg Res. Commun., volume 46, 1 내지 11 페이지 (1981).

(비-특허 문헌 2) A.Goffeau, 등 :"The Yeast Genome Directory", Nature, volume 387, 5 내지 105 페이지 (1997).

(비-특허 문헌 3) K. Olesen, 등:"The dynamics of the Saccharomyces carlsbergensis brewing yeast transcriptome during a production-scale lager beer fermentation", FEMS Yeast Research, volume 2, 563 내지 573 페이지(2000).

(비-특허 문헌 4) F. R. Blattner, 등 :"The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12", Science, volume 277, 1453-1462 페이지 (1997).

(비-특허 문헌 5) S. T. Cole, 등 ;"Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence". Nature, volume 393, pages 537-544 (1998).

(비-특허 문헌 6) The National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/micr.html.

(비-특허 문헌 7) Y. Tamai 등: "Co-esistence of two types of chromosome in the fermenting yeast, Sacchaomyces cerevisiae", Yeast, volume 10, 923-933 페이지 (1998).

(비-특허 문헌 8) C. Korch, 등 : Proc. Eur. Brew. Conv. Congress, Lisbon, 201-208 페이지 (1991).

(비-특허 문헌 9) J. Hansen, 등 : "Inactivation of MET 10 in brewer's yeast specifically increases S0₂ formation during beer production", Nature Biotech. , volume 14, 1587-1591 페이지 (1996).

(비-특허 문헌 10) T. Sijen, 등: "Transcriptional and posttranscriptional gene silencing are mechanistically related", Curr. Biol., volume 11, 436-440 페이지 (2001).

(비-특허 문헌 11) N. Goto, 등: "SSU1-R, a sulphite resistance gene of wine yeast, is an allele of SSU 1 with a different upstream sequence", J. Ferment. Bioeng., volume 86, 427-433 페이지 (1998).

(비-특허 문헌 12) D. Avram, 등: "SSU1 encodes a plasma membrane protein with a central role in a network of proteins conferring sulfite tolerance in Saccharomyces cerevisiae", J. Bacteriol., volume 179, 5971-5974 페이지 (1997).

(비-특허 문헌 13) H. Park, 등; "SSU1 mediates sulphite efflux in Saccharomyces cerevisiae", Yeast, volume 16, 881-888 페이지 (2000).

발명의 개시

본 발명의 목적은 원하는 양조 특성에 관여하는 유전자 선별 방법을 제공하는 것으로, 이는 맥주와 같은 알콜성 음료에 사용되는 산업용 효모, 특히 양조 효모의 전체 게놈 서열을 집계한 데이터베이스 (이후, 게놈 DB 로 간단히 표기될 수 있다) 를 제작하고; 양조 효모가 보유한 유전자를 상기 데이터베이스로부터 선별하고; 파괴 또는 과발현으로 상기 유전자의 기능 분석을 수행하는 방식으로 달성된다. 또다른 목적은 상기 유전자가 관여하는 양조 특성을 나타내는 효모의 육종 방법 및 상기 효모를 이용하여 생산성 및 품질이 개선된 알콜 또는 알콜성 음료의 제조 방법을 제공하는 것이다. 또다른 목적은 상기 언급된 유전자 및 상기 유전자에 의해 암호화되는 펩티드를 제공하는 것이다.

공업적 목적으로 널리 이용되는 양조 효모는 배수체이며 특히 하면 발효 효모는 2 가지 이상의 게놈을 포함하여 이루어진 이질 배수체 (allopolyploid) 인 것으로 공지되어 있다. 상기 게놈 중 하나는 전체 게놈 서열이 밝혀진 에스. 세레비지애로부터 유도된 게놈인 것으로 여겨지며, 또다른 게놈(들)의 근원은 아직 밝혀지지 않았다.

본 발명의 발명자들은 탁월한 양조에 대한 핵심적인 기능을 나타내는 비동정 유전자를 찾기 위해 하면 발효 효모의 전체 게놈 서열을 결정했다. 이어서, 하면 발효 효모의 아미노산 서열은 에스. 세레비지애에 대한 게놈 DB 로 등록된 것과 비교했고, 상기 양조 효모의 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 기능을 추측했다. 그 결과, 하면 발효 효모의 유전자는 크게 에스. 세레비지애와 거의 100% 의 아미노산 상동성을 나타내는 Sc 유형 유전자 및 약 70 내지 97% 상동성을 나타내는 비-Sc 유형 유전자로 분류된다는 것이 밝혀졌다. 더욱이, 하면 발효 효모는 Sc-유형 염색체, 비-Sc-유형 염색체 및 Sc/비-Sc-유형 키메라 염색체로 이루어진 복잡한 염색체 구조를 갖는다는 것을 밝혀냈다. 하면 발효 효모의 전체 염색체의 구조는 도 1 에 나타냈다. 본 발명에 의해 밝혀진 게놈 정보를 근거로, 본 발명의 발명자들은 그러한 예측못한 복잡한 염색체의 구조를 발견했으며, 하면 발효 효모의 유전자 스크리닝 방법을 개발했다. 더 구체적으로, 양조 효모에 대한 양조 특성에 관여하는 유전자의 스크리닝 방법을 달성했는데, 이는 (A) 산업용 효모, 특히 양조 효모의 일종인 하면 발효 효모의 전체 게놈 서열을 분석하고, (B) 상기 게놈 서열을 에스. 세레비지애의 전체 게놈 서열과 비교하고, (C) 에스. 세레비지애의 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 70 내지 97% 의 상동성을 가진 아미노산 서열을 암호화하는 상기 하면 발효 효모의 유전자를 선별하고, (D) 선별된 유전자의 기능 분석을 수행함으로써, 상기 유전자에 의해 효모에 주어진 양조 특성을 동정하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 발명자들은 상기 발견사실을 근거로 집중적인 연구를 반복 수행했으며, 본 발명을 완성했다.

이에 따라, 본 발명은 하기에 관한 것이다:

(1) 알콜 또는 알콜성 음료의 제조에서 생산성 증가 및/또는 풍미의 개선에 관여하는 유전자의 스크리닝 방법으로서, (a) 산업용 효모의 전체 게놈 서열을 분석하고, (b) 상기 서열을 에스. 세레비지애의 것과 비교하고, (c) 에스. 세레비지애의 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 70 내지 97% 의 상동성을 가진 아미노산 서열을 암호화하는 상기 산업용 효모의 유전자를 선별하고, (d) 선별된 유전자의 기능 분석을 수행함으로써, 상기 유전자에 의해 효모에 주어진 특성을 동정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법;

(2) (1) 에 있어서, DNA 어레이가 상기 (1) 의 (d) 에서의 기능 분석에 이용되는 스크리닝 방법;

(3) (2) 에 있어서, 하기 DNA 서열 또는 그의 상보적인 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드가 고체 지지체에 부착되어 있는 DNA 어레이가 이용되는 방법:

(1) 산업용 효모의 전체 게놈 서열의 오픈 리딩 프레임에 존재하는 10 내지 30 개의 뉴클레오티드를 가지며, (2) 전체 게놈 서열에서 상기 10 내지 30 개의 뉴클레오티드 서열의 영역 이외의 영역에는 존재하지 않는 DNA 서열;

(4) (2) 에 있어서, 엄격한 조건에서 상기 (3) 에서 정의된 올리고뉴클레오티드에 혼성화(hybridization)하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드(들)이 고체 지지체에 부착되어 있는 DNA 어레이가 이용되는 방법;

(5) (2) 에 있어서, 하기 DNA 서열 또는 그의 상보적인 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드가 고체 지지체에 부착되어 있는 DNA 어레이가 이용되는 방법:

(1) 산업용 효모의 전체 게놈 서열의 비-암호화 영역에 존재하는 10 내지 30 개의 뉴클레오티드를 가지며, (2) 전체 게놈 서열에서 상기 10 내지 30 개의 뉴클레오티드 서열의 영역 이외의 영역에는 존재하지 않는 DNA 서열;

(6) (2) 에 있어서, 엄격한 조건에서 상기 (5) 에서 정의된 올리고뉴클레오티드에 혼성화하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드가 고체 지지체에 결합된 DNA 어레이가 이용되는 방법;

(7) (2) 에 있어서, 상기 (3) 에서 정의된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드, 상기 (4) 에서 정의된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드, 상기 (5) 에서 정의된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 상기 (6) 에서 정의된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 4 개 군의 2 개 이상의 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드가 고체 지지체에 부착되어 있는 DNA 어레이가 이용되는 방법;

(8) (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 있어서, 산업용 효모가 양조 효모인 스크리닝 방법;

(9) (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 양조 효모가 맥주 효모인 스크리닝 방법;

(10) 상기 (1) 에 따른 스크리닝 방법으로 수득되는 유전자;

(11) (10) 에 있어서, 상기 (10) 에서 언급된 유전자가 효모에서 발현되며, 효모의 배양 배지 중의 아황산염의 농도가 증가하는 것을 특징으로 하는 유전자;

(12) 서열 번호 1 또는 2 로 나타내는 DNA 서열 및 엄격한 조건 하에 상기 DNA 에 혼성화하는 DNA 를 포함하는 DNA;

(13) 서열 번호 3 또는 4 로 나타내는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 암호화하는 DNA, 및 서열 번호 3 또는 4 로 나타내는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기(들)이 결손 및/또는 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA;

(14) (9) 내지 (12) 중 어느 하나에 언급된 유전자 또는 DNA 를 포함하는 재조합 벡터;

(15) (9) 에 있어서, 프로모터 및/또는 종결자가 상기 (10) 내지 (13) 중 어느 하나에 언급된 유전자 또는 DNA 에 근접하게 위치하는 재조합 벡터;

(16) (15) 에 있어서, 프로모터가 본질적인 발현을 나타내는 프로모터인 재조합 벡터;

(17) (15) 또는 (16) 에 있어서, 프로모터가 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 유전자의 프로모터인 재조합 벡터;

(18) (10) 내지 (17) 중 어느 하나에 언급된 유전자 또는 DNA 또는 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체;

(19) (18) 에 있어서, 형질전환체가 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속의 효모에 속하는 형질전환체;

(20) (10) 내지 (13) 중 어느 하나에 언급된 유전자 또는 DNA 에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드 내의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 잔기(들)이 결손 및/또는 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;

(21) 서열 번호 3 또는 4 로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 서열 번호 3 또는 4 로 나타내는 아미노산 서열에 한 이상의 아미노산 잔기가 결손 및/또는 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;

(22) (18) 또는 (19) 에서 언급된 형질전환체가 사용되는 것을 특징으로 하는 알콜 또는 알콜성 음료의 제조 방법;

(23) (10) 또는 (11) 에서 언급된 유전자 또는 (12) 또는 (13) 에서 언급된 DNA 상의 유전자의 발현이 제어되는 것을 특징으로 하는 알콜 또는 알콜성 음료 제조에 적합한 효모의 육종법;

(24) (23) 에 있어서, 효모가 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속에 속하는 육종법;

(25) (23) 또는 (24) 에 따른 육종법에 의해 수득되는 효모;

(26) (25) 에서 언급된 효모를 이용하는 알콜 또는 알콜성 음료의 제조 방법;

(27) (26) 에 따른 알콜 또는 알콜성 음료의 제조 방법을 이용하여 제조되는 알콜 또는 알콜성 음료;

(28) 하기 DNA 서열 또는 그의 상보적인 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드가 고체 지지체에 부착되어 있는 DNA 어레이:

(1) 산업용 효모의 전체 게놈 서열의 오픈 리딩 프레임 내에 존재하는 10 내지 30 개 뉴클레오티드를 가지며,

(2) 상기 전체 게놈 서열 내에서 상기 10 내지 30 개 뉴클레오티드 서열의 영역 외의 다른 영역에는 존재하지 않는, DNA 서열.;

(29) 엄격한 조건에서 상기 (28)에서 정의한 올리고뉴클레오티드에 혼성화하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드가 고체 지지체에 부착되어 있는 DNA 어레이;

(30) 하기 DNA 서열 또는 이의 상보적 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드가 고체 지지체에 부착되어 있는 DNA 어레이: (1) 산업용 효모의 전체 게놈 서열의 비-암호화 영역에 존재하는 10 내지 30 개 뉴클레오티드를 가지며,

(2) 상기 전체 게놈 서열 내에서 상기 10 내지 30 개 뉴클레오티드 서열의 영역 외의 다른 영역에는 존재하지 않는, DNA 서열;

(31) 엄격한 조건에서 상기 (30)에서 정의한 올리고뉴클레오티드에 혼성화하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드가 고체 지지체에 부착되어 있는 DNA 어레이; 및

(32) 상기 (28)에 정의된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드, 상기 (29)에 정의된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드, 상기 (30)에 정의된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드, 및 상기 (31)에 정의된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 4 개군의 2 개 이상의 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드가 고체 지지체에 부착되어 있는 DNA 어레이.

[도면의 간단한 설명]

도 1 은 하면 발효(bottom fermenting) 효모의 총 염색체 구조를 나타낸다.

백색 막대는 Sc 유형 염색체를 나타내는 반면, 흑색 막대는 비-Sc 유형 염색체를 나타낸다. 타원은 중심체를 나타낸다. 로마 숫자는 대응하는 에스. 세레비지애에 대한 염색체 수를 나타낸다. 비-Sc 염색체를 보이는 도면에서, 상기 흑색으로 표시된 부분은 연결반응이 상기 부위에서 일어나는 것을 나타낸다. 예를 들어, 비ScII-비ScIV에서, 비ScII 및 비ScIV은 흑색으로 표시된 부분에서 연결되는 것을 나타낸다(300kb).

도 2 는 에스. 세레비지애의 게놈 서열을 갖는 균주 34/70 의 게놈 DNA로부터 제조된 3648 코스미드의 양쪽 말단에 DNA 서열의 상동성의 분포를 나타낸다. X-축은 에스. 세레비지애와 상동성, 예를 들어, X-축상에 84% 는 82% 초과, 84% 이하의 상동성을 나타낸다. Y-축은 상기 상동성을 보이는 코스미드 말단 서열의 수를 나타낸다.

도 3 은 에스. 세레비지애의 게놈 서열에 코스미드 및 샷건 클론의 맵핑 예를 나타낸다. ① 및 ② 는 에스. 세레비지애의 염색체 XVI상에 각각, 왓슨 가닥 및 크릭 가닥에 존재하는 유전자를 나타낸다. ③ 및 ④ 는 각각, 코스미드 클론에 삽입된 Sc 유형 및 비-Sc 유형 DNA 절편을 나타낸다. ⑤ 및 ⑥ 는 각각, 샷건 클론에서 삽입된 Sc 유형 및 비-Sc 유형 DNA 절편을 나타낸다.

도 4 는 에스. 세레비지애의 게놈 서열에 콘티그(Contig)의 맵핑 예를 나타낸다. (A)는 에스. 세레비지애의 염색체 XVI의 개략적인 묘사이다. (B) 는 에스. 세레비지애의 염색체 XVI의 857 내지 886 kb의 부분이 상세히 설명된 도이다. Y-축은 에스. 세레비지애 게놈 서열에 대한 콘티그의 상동성 %을 나타낸다. X-축은 에스. 세레비지애 게놈 서열에 대한 콘티그의 위치를 나타낸다. 콘티그(실선)는 각각 상기 샷건 및 코스미드 리드로부터 정방향-역방향 연결(점선)과 연결되어있다.

도 5 는 DNA 마이크로어레이-근거하여 비교 게놈 혼성화의 결과를 나타낸다. 균주 34/70의 게놈 DNA는 DNA 마이크로어레이(Affymetrix Gene Chip Yeast Genome S98 Array)에 혼성화되고 상기 각 ORF(오픈 리딩 프레임)의 시그널을 단배체(haploid) 균주 S288C의 것에 표준화하고 신호 로그 비 (Signal Log Ratio) (2ⁿ)로서 나타낸다. 신호 로그 비는 하기 염색체 XVI내에 하기 유전자 순서로 나열되어 있다. 비-Sc 유형 유전자는 상기 Sc 유형 배열에 혼성화하지 않으므로, 신호 로그 비가 강한 변화를 보이는 지점(화살표로 나타내는)이 전좌(translocation) 부위로 여겨진다.

도 6 은 DNA 마이크로어레이 및 PCR 분석으로 추론되는 균주 34/70의 염색체 XVI의 구조를 나타낸다.

도 7 은 SSU1 파괴체(disruptant) 및 모체(parental) 균주 (BH96)의 발효 프로필을 나타낸다. a)는 효모 증식을 나타내고(OD 600), b)는 외견상의 추출액(w/w %)의 변화를 나타내고 c)는 아황산 농도를 나타낸다(ppm).

도 8 은 SSU1 과발현 균주 및 모체 균주 (BH225)의 발효 프로필을 나타낸다. a)는 효모 증식을 나타내고(OD 600), b)는 외견상의 추출액(w/w %)의 변화를 나타내고 c)는 아황산 농도를 나타낸다(ppm).

도 9 는 MET14 과발현 균주 및 모체 균주(KN009F 및 FOY227)을 이용한 발효 동안 아황산 농도의 변화를 나타낸다.

도 10 은 ScSSU1 및 비-ScSSU1의 DNA 서열을 나타낸다.

도 11 은 ScMET14 및 비-ScMET14의 DNA 서열을 나타낸다.

도 12 는 균주 34/70의 발효 프로필을 나타낸다. a) 는 효모 증식을 나타내고(OD 600), b)는 외견상의 추출액(w/w %)의 변화를 나타낸다.

[본 발명을 수행하기 위한 최적 모드]

본 발명에 따른 산업용 효모에 관련하여, 맥주, 와인, 정종, 등을 위한 양조 효모 및 연료 알코올의 제조용으로 사용되는 효모가 예시되었다. 더욱 구체적으로, 사카로마이세스 속의 효모 등이 나열될 수 있고, 본 발명에서 맥주 효모, 예컨대, 사카로마이세스 파스토리아누스 바이헨슈테판(Weihenstephan) 34/70, BH 84, NBRC 1951, NBRC 1952, NBRC 1953, NBRC 1954, 등이 사용될 수 있다. 위스키 효모 예컨대, 에스. 세레비지애 NCYC 90, 등, 와인 효모 예컨대, 쿄카이 와인(Kyokai wine) 효모 No.1, No. 3, No. 4, 등, 정종 효모 예컨대, 쿄카이 정종(Kyokai sake) 효모 No. 7, No. 9, 등 등을 사용하는 것 또한 가능하다.

본 발명에 따른 유전자 스크리닝 방법은 (A)산업용 효모의 전체 게놈 서열, 특히 양조 효모의 일종인 하면 발효 효모를 분석하고, (B)상기 게놈 DNA 서열은 에스. 세레비지애의 전체 게놈 서열과 비교하고, (C) 에스. 세레비지애의 상기 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 70 내지 97 % 상동성을 가진 아미노산 서열을 암호화하는 하면 발효 효모의 유전자를 선별하고 추가로 (D) 상기 선별된 유전자의 기능 분석은 수행되어, 상기 유전자에 의해 효모에 주어진 양조 특성을 동정하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 수득된 상기 유전자가 상기 유전자가 효모내에서 과발현되고/되거나 유전자가 파괴되는 방법으로 발현 조절을 수행하기 위해 사용될 때, 우수한 양조 특성을 갖는 효모를 육종하는 것 또한 가능하다. 따라서, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 수득된 유전자, 상기 유전자에 의해 암호화된 펩티드, 상기 유전자를 이용한 산업용 효모의 양조 방법, 상기 양조 방법에 의해 수득된 효모, 및 효모를 이용한 알코올 또는 알코올성 음료의 제조 방법 또한 본 발명의 범위에 있다.

(A) 산업용 효모의 전체 게놈 서열의 결정

산업용 효모의 전체 게놈 서열의 결정은 (a) 게놈 DNA가 효모로부터 제조되고,(b) 샷건 라이브러리 및 (c) 코스미드 라이브러리가 상기 게놈 DNA로부터 제조되고, (d) DNA 서열의 측정용으로 사용된 DNA 절편이 상기 라이브러리 클론으로부터 제조되고, (e) 라이브러리 DNA 절편의 DNA 서열이 서열분석 반응에 의해 결정되고 및 (f) 상기 DNA 절편의 서열이 전체 게놈 DNA 서열을 재구성하기 위해 조합되는 단계를 포함한다.

(a) 내지 (f)에 사용된 방법은 특히 제한적이지 않고 상기 방법은 공지된 방법에 따라 수행될 수 있고, 반면 각각에 대한 바람직한 방법은 하기에 언급된다.

(a)게놈 DNA의 제조, 예컨대, 추출, 정제, 등은 공지된 방법, 예를 들어, "Yeast, a practical approach(IRL Press, 6.2.1, 쪽 228)" 및 "Seibutukagakujikkennhou, No 39, Experiments in Yeast Molecular Genetics (Yasuharu Oshima 편집, Gakkai Shuppan Center, 84 내지 85 페이지, 1996)"에 따라 바람직하게 수행된다. DNA 제조용 바람직한 방법의 특정예는 하기에 언급된다.

게놈 DNA의 제조용 효모 세포는 일반적인 방법으로 배양된다. 배지에 관련해서, 배지가 상기 효모가 대사시킬수 있는 탄소원, 질소원, 무기염 등을 함유하는 한, 임의의 천연 및 합성 배지가 사용되어, 미생물의 배양이 효율적으로 수행될 수 있다. 예를 들어, YPD 배지 (2% (w/w) 글루코스, 1% (w/w) 효모 추출물 및 2% (w/w) 폴리펩톤)가 사용될 수 있다. 배양 방법에 관련해서, 밤새 약 25 내지 35℃에서 진탕 배양이 요구된다.

배양 후에, 세포는 원심분리에 의해 배지로부터 회수된다. 상기 생성 세포 펠렛은 세척액으로 세척시킨다. 상기 세척액의 예는 완충액 A (50 mM 인산 나트륨, 25 mM EDTA 및 1%(v/v) (β-메르캅토에탄올; pH 7.5), 등이다. 세척된 세포의 게놈 DNA의 제조는 자이몰리아제 및 SDS를 이용함으로써 세포벽을 분해하는 방법; 페놀 및 페놀/클로로포름 용액을 이용한 단백질등 제거 방법; 및 에탄올 등을 이용하여 게놈 DNA 침전하는 방법의 게놈 DNA의 일반적인 제조 방법에 따라 수행될 수 있다. 더욱 구체적으로, 하기 방법이 예시될 수 있다.

배양된 세포는 세척되고 완충액 A에 재현탁된 다음, 약 5 내지 10 mg 의 자이몰라아제 100T(Seikagaku Kogyo)를 첨가시키고 상기 혼합물을 약 25 내지 40 ℃에서 약 30분 내지 2시간 동안 부드럽게 진탕시킨다. 진탕 후에, SDS를 함유하는 완충액, 예컨대, 완충액 B(0.2M Tris-HCl, 80 mM EDTA 및 1% SDS; pH 9.5)를 이에 첨가시키고 혼합물을 세포를 분해하기 위해 약 60 내지 70℃에서 약 30분 동안 유지시킨다. 그런 후에, 상기 세포 라이세이트을 얼음상에서 냉각시키고, 5M 아세트산칼륨과 혼합하고, 추가로 약 60분 동안 얼음상에 유지시켰다. 생성 용액을 원심분리하여(예를 들어, 15℃에서 10분동안 5,000 g로) 상층액을 취한다. 동일한 부피의 에탄올을 상층액에 첨가시켜 DNA를 침전하고 혼합물을 즉시 원심분리하여(예를 들어, 15℃에서 10분동안 5,000 g로) DNA를 수득한다. 상기 생성 침전물을 70% (v/v) 에탄올로 세척하고, 자연 건조시키고, TE 완충액(10 mM Tris-HCl 및 1 mM EDTA; pH 8.0)과 같은 용액에 용해시켜 조(crude) 게놈 DNA 용액을 제조한다. 세슘 클로라이드 및 비스벤즈이미드를 첨가하고 상기 조 게놈 DNA 용액에 용해하고, 혼합된 용액을 초원심분리시키고(예를 들어, 25℃에서 17시간동안 100,000 g로) UV 선으로 방사선조사를 수행하여 DNA 밴드를 나타내고 낮은 밴드는 회수한다. 세슘 클로라이드 용액으로 포화시킨 이소프로판올로 상기 회수된 DNA 용액을 추출함으로써 비스벤즈이미드를 제거하고, 0.3 M 아세트산 나트륨 4배(v)를 회수된 수성 층에 첨가한 다음 혼합하고 DNA를 에탄올로 침전하고 원심분리하여 회수한다. 회수된 DNA를 RNase처리하고 페놀/클로로포름으로 추출하고 DNA를 에탄올로 재침전함으로써 회수된 수성층으로부터 정제한다. 원심분리에 의해 회수된 침전물을 70% (v/v) 에탄올로 세척하고 자연 건조시키고 TE 완충액에 용해하여 게놈 DNA 용액을 제조한다.

(b) 샷건 라이브러리의 제조

상기 (a)에 제조된 효모의 게놈 DNA를 이용한 게놈 DNA 라이브러리의 제조 방법에 대해, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3판 (2001)" (이하, "Molecular Cloning, 3판"로 약칭)에 언급된 방법이 사용될 수 있고, 전체 게놈 서열의 결정에 특히 적합한 샷건 라이브러리의 제조 방법에 관련하여, 하기 방법이 예시될 수 있다. TE 완충액을 (a)에 제조된 게놈 DNA에 첨가하고 게놈 DNA를 Hydroshear (GeneMachines 제조) 등을 이용하여 단편화한다. 게놈 단편의 말단은 DNA Blunting Kit (Takara Shuzo사 제조) 등을 이용하여 블런트화하고, 아가로즈 겔 전기영동의 방법으로 분별한다. 그런 다음, 약 1.5 내지 2.5 kb의 게놈 단편을 겔로부터 제거하고 DNA의 용출용 완충액, 예컨대, MG-용출 완충액(0.5 mol/L 암모늄 아세테이트, 10 mmol/L 마그네슘 아세테이트, 1 mmol/L EDTA 및 0.1% SDS)등을 겔에 첨가한 다음 약 25 내지 40℃에서 진탕하고 밤새 DNA를 용출한다. DNA 용출물을 페놀/클로로포름으로 처리하고 에탄올로 침전시켜 게놈 라이브러리 삽입물을 제조한다. 상기 언급된 삽입물을 모두 및 적당한 벡터, 예컨대, pUC 18 SmaI/BAP (Amersham Biosciences사 제조)를 약 10 내지 20℃에서 약 20 내지 50 시간동안 T4 리가아제(Takara Shuzo사 제조)를 이용하여 연결시킨다. 연결 반응 생성물은 에탄올로 침전하고 생성 재조합 벡터 DNA는 적당한 양의 TE 완충액에 용해한다. 전기 천공 등의 방법으로, 재조합 벡터 DNA를 에셰리키아 콜라이, 예컨대, Electro Cell DH5α 균주 (Takara Shuzo사 제조)로 형질전환한다. 전기 천공은 첨부된 실험 메뉴얼에 언급된 조건하에서 수행되는 것이 요구된다.

게놈 DNA 절편을 함유하는 재조합 벡터가 삽입되는 형질전환체는 적합한 선택적 배지에서 선별된다. 예를 들어, pUC 18 SmaI/BAP가 벡터로 사용될 때, 형질전환체는 약 0.01 내지 0.1 mg/mL의 앰피실린, 약 0.1 mg/mL 의 X-gal 및 약 1 mmol/L 의 이소프로필-β-D-티오갈라토피라노시드(IPTG)를 함유하는 LB 평판배지(1.6%의 아가(agar)를 함유하는 LB 배지 (10g/L의 박토트립톤, 5 g/L의 효모 추출물 및 10 g/L의 염화나트륨; pH 7.0)상에서 약 30 내지 37℃에서 밤새 배양시에 백색 콜로니를 형성하므로, 선별이 용이하다. 형질전환체는 약 0.1 mg/mL의 앰피실린을 함유하는 LB 평판배지에서 384-웰 타이터 플레이트를 이용하여 약 30 내지 37℃에서 밤새 배양되고, LB와 동일한 부피의 50% 글리세롤 수성 용액을 첨가하고 혼합물을 교반하여 글리세롤 보존액을 제조한다. 일반적으로, 글리세롤 보존액은 약 -80 ℃에서 보존된다.

(c) 코스미드 라이브러리의 제조

(a)에서 제조된 게놈 DNA는 적합한 제한 효소, 예컨대, Sau3AI(Takara Shuzo사 제조)를 이용하여 부분 분해시킨다. 코스미드 벡터, 예컨대, Super CosI 벡터 (Stratagene사 제조)의 BamHI 부위로 Sau3AI에 의해 분해된 DNA 절편을 삽입하는 것이 가능하다. 제한 효소의 처리 및 연결은 여기에 첨부된 프로토콜에 의해 수행될 수 있다. 상기 방법에 의해 수득된 연결된 생성물은 예를 들어, Gigapack III Gold (Stratagene사 제조)를 이용하여 패키징 시키고, 여기에 첨부된 실험 방법에 따라, 에셰리키아 콜라이, 예컨대, XL1-Blue MR 균주(Stratagene사 제조)에 도입한다. 이를 앰피실린을 함유한 LB 평판 배지에 분무하고 약 30 내지 37℃에서 밤새 배양하여 형질전환체를 얻는다. 형질전환체는 약 0.1 mg/mL의 앰피실린을 함유하는 LB 평판배지에서 96-웰 타이터 플레이트를 이용하여 약 30 내지 37℃에서 밤새 배양되고, LB와 동일한 부피의 50% 글리세롤 수성 용액을 첨가하고 혼합물을 교반하여 글리세롤 보존액을 제조한다. 일반적으로 글리세롤 보존액은 약 -80 ℃에서 보존된다.

(d) DNA 서열의 결정을 위한 DNA 절편의 제조

양조 효모의 전체 게놈 서열은 주로 전체 게놈 샷건 방법을 이용하여 결정될 수 있다. DNA 서열이 결정되는 DNA 절편은 상기 (b)에 제조된 샷건 라이브러리를 이용하여 PCR에 의해 제조될 수 있다. 구체적으로, 게놈 샷건 라이브러리의 클론은 복제기(Gene Solution사 제조)를 이용하여 384-웰 타이터 플레이트에 접종하여 앰피실린 함유 LB 배지의 각 50 ㎕를 각 웰에 놓고 밤새 진탕없이 약 30 내지 37℃에서 배양한다. 상기 배양은 복제기(Gene Solution사 제조) 등을 이용하여 384-웰 반응 플레이트(AB Gene 사 제조)에 이동시키고 여기에, 각각 PCR용 반응 용액을 약 10 ㎕을 놓고, PCR을 GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems사 제조) 등을 이용하여 Makino 등(DNA Research, 5권, 쪽 1~9 (1998))등에 의한 프로토콜에 따라 수행하여, 삽입된 단편의 증폭이 수행된다.

과잉의 프라이머 및 뉴클레오티드는 PCR 생성물의 정제용 키트(Amersham Bioscience사 제조)등을 사용하여 제거하고 시컨스 반응은 주형으로써 상기 샘플을 이용하여 수행한다.

(c)의 코스미드 라이브러리의 코스미드 DNA는 하기 방법에 의해 제조될 수 있다. 즉, 코스미드 라이브러리로부터 유도된 클론은 앰피실린-함유의 적당한 배지, 예컨대, 2 × YT 배지 (1.6% 박토트립톤, 1% 효모 추출물 및 0.5 % 염화 나트륨; pH 7.0)의 각 1.0 mL이 놓인 96 웰 플레이트의 각 웰에 접종하고 약 30 내지 37℃에서 밤새 진탕 배양한다. 상기 배양으로부터 코스미드 DNA는 KURABO 등의 메뉴얼에 따라 KURABO PI-1100 AUTOMATIC DNA ISOLATION SYSTEM(KURABO 사 제조)를 이용하여 제조할 수 있고 이는 서열결정 반응용 주형으로써 사용될 수 있다.

(e) 서열결정 반응(Sequencing reaction)

서열결정 반응은 상용 서열 키트 등을 이용하여 수행할 수 있다. 본 발명의 바람직한 예들은 하기에 나타낸다.

시컨스 반응 혼합물은 하기와 같이 제조될 수 있다. 상기 (d)에 제조된 코스미드 DNA 또는 PCR 생성물은 약 2 ㎕의 DYEnamic ET Terminator Sequencing Kit(Amersham Bioscience사 제조) 및 적합한 프라이머와 혼합하여 8 ㎕의 반응 혼합물을 제조한다. M13 정방향 (M13-21) 프라이머 및 M13 역방향 (M13RV) 프라이머 (Takara Bio사 제조),등은 샷건 DNA로부터 유도된 PCR 생성물의 시컨스 반응용으로 사용되는 반면, 정방향 프라이머, 예컨대, SS-cos F.1(서열 번호 7) 및 역방향 프라이머, 예컨대, SS-cos R.1(서열 번호 8),등은 코스미드 DNA용으로 사용된다. 프라이머 및 DNA 절편의 양은 각각 약 1 내지 4 pmloe 및 약 50 내지 200 ng이다.

약 50 내지 70 사이클의 다이 터미네이터 시컨스 반응(dye terminator sequence reaction)은 반응 용액 및 GeneSmp PCR System 9700 (Applied Biosciences사 제조)를 이용하여 수행될 수 있다. 상용 키트 예컨대, DYEnamic ET 터미네이터 시컨싱 키트가 사용될 때, 사이클 파라미터는 이에 첨부된 메뉴얼에 따른다. 샘플의 정제는 MultiScreen HV 플레이트(Millipore사 제조), 등을 이용하여 Millipore의 메뉴얼에 따라 수행된다. 정제된 반응 생성물은 에탄올로 침전하고 생성 침전물은 건조하고 약 4℃의 암실에서 저장한다. 건조된 생성물은 상용 서열기 및 분석기, 예컨대 MegaBACE 1000 Sequencing System (Amersham Bioscience사 제조) 및 ABI PRISM 3700 DNA 분석기 ( Applied Biosystems사 제조),등을 사용하여, 이에 첨부된 메뉴얼에 따라 분석한다.

(f) 조합(assembly)으로 게놈 서열의 재구성(다수의 시컨스된 DNA 절편의 순서를 결정하는 공정)

게놈 DNA의 재구성은 상기 (4)에서 수득된 DNA 절편의 서열 정보로부터 수행될 수 있다. 게놈 DNA 서열의 재구성의 모든 작동은 UNIX^® platform 상에서 수행될 수 있다. 베이스 콜(Base call)은 소프트웨어 예컨대, phred (The University of Washington) 등에 의해 수행될 수 있고, 벡터 서열의 차단은 소프트웨어, 예컨대 Cross Match (The University of Washington) 등에 의해 수행될 수 있고 조합은 소프트웨어, 예컨대 Phrap (The University of Washington) 등에 의해 수행될 수 있다. 조합의 결과로 수득된 콘티그는 그래픽 에디터 예컨대, 콘시드, 그래픽 에디터(The University of Washington) 등에 의해 분석된다. 베이스 콜로부터 조합하기 위한 일련의 작동은 총괄적으로 상기 콘시드에 첨부된 스크립트, phredPhrap를 사용하여 수행될 수 있다.

(B) 양조 효모와 에스. 세레비지애의 전체 게놈 서열의 비교

에스. 세레비지애와 (A)에서 수득된 전체 게놈 서열의 비교는 (g) 코스미드 및 샷건 클론의 양쪽 말단의 각 DNA 서열 및 에스. 세레비지애 게놈 서열를 갖는 콘티그의 비교 데이타를 집계하여 비교 데이타베이스를 구축 및 에스. 세레비지애 게놈 서열상의 이의 맵핑을 포함한다.

(g) 코스미드 및 샷건 클론의 양쪽 말단의 각 DNA 서열 및 에스. 세레비지애 게놈 서열를 갖는 콘티그의 비교 데이타를 집계하여 비교 데이타베이스를 구축 및 에스. 세레비지애 게놈 서열상의 이의 맵핑.

널리 사용되는 산업용 효모 예를 들어, 하면 발효 효모 (에스. 파스토리아누스)는 에스. 세레비지애 및 이의 유사 관련 종(예컨대, 에스. 바야누스(bayanus)) "Int. J. Syst. Bacteriol. 35권, 쪽 508-511(1985)"의 본래의 하이브리드로 여겨지고 있다. 상기 관점에서, (e)에서 제조된 코스미드 클론의 양쪽 말단의 DNA서열은 상동성 검색 알고리즘에 의해 에스. 세레비지애 게놈 서열에 대한 상동성 검색을 하여, 상동 부위 및 에스. 세레비지애 게놈 서열에 대한 각 DNA 서열의 상동성을 결정하였고, 그리하여 데이타베이스를 구축할 수 있다. 에스. 세레비지애 게놈 DNA 서열에 대응하는 코스미드 DNA 서열의 상동성 % 분포 그래프는 도 2 에 나타낸다. 코스미드의 DNA 서열은 크게 에스. 세레비지애 게놈 서열에 94% 초과의 상동성을 보이는 DNA 서열 군 및 이에 약 84% 상동성을 보이는 군으로 분류한다. 따라서, 94% 상동성 초과를 보이는 DNA 서열은 에스. 세레비지애로 유래된 Sc-유형 DNA 서열로 명칭하는 반면, 약 84% 상동성을 보이는 DNA 서열은 에스. 세레비지애의 유사 관련 종으로 유래된 비-Sc-유형 DNA 서열로 명칭하고 Sc 유형 DNA 서열 또는 비-Sc 유형 DNA 서열을 갖는 유전자는 각각 Sc 유형 유전자 또는 비-Sc 유형 유전자로 명명한다.

유사하게 에스. 세레비지애의 게놈 DNA 서열와 (e)에서 제조된 샷건 클론의 양쪽 말단의 DNA 서열의 비교 데이타베이스를 구축하였다. 구축된 비교 데이타베이스로부터 수득한 정보를 근거로, 에스. 세레비지애 게놈 서열상에 코스미드 클론 및 샷건 클론의 맵핑은 수행되었다(예를 들어 도 3에 언급). 에스. 세레비지애 게놈 서열과 (f)에서 제조된 콘티그의 DNA 서열의 비교 데이타베이스 또한 구축되고 맵핑은 수행된다. 비록 맵핑 기술이 상기 언급한 것과 거의 유사하지만, 콘티그가 동일한 코스미드 및 샷건 클론으로부터 짝지어진 정방향-역방향 DNA 서열에 의해 연결될 때, 상기 콘티그는 연결된다(예를 들어, 도 4 참조).

(C) 에스. 세레비지애의 유전자로 암호화된 아미노산 서열에 70 내지 97% 상동성을 갖는 아마노산 서열을 암호화하는 하면 발효 효모의 유전자 선별

에스. 세레비지애의 유전자로 암호화된 아미노산 서열과 70 내지 97 % 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 하면 발효 효모의 유전자를 선별하는 단계는 (h)ORF (오픈 리딩 플레임)의 동정 단계 및 기능 지정 단계를 포함한다.

(h) ORF의 동정 및 이의 기능의 지정

(f)에서 조합된 DNA 서열내에 ORF의 동정은 수행된다. 바람직한 예들은 구체적으로 하기에 언급된다. 개시 코든 및 종결 코든이 포함된 임의 길이 DNA 서열(예컨대 150 염기 이상)에 관련하여, 프로그램 예컨대, ORF 파인더 (http://www.ncbi.nih.gov/gorf/gorf.html) 등을 이용하여 상보적 서열을 포함하는 리딩 프레임의 6 종류에 대한 ORF의 동정을 위하여 (f)에서 조합된 DNA 서열내에 존재하는 ORF의 동정을 수행할 수 있다.

동정된 ORF에 의해 암호화된 단백질의 기능의 지정은 Saccharomyces Genome Database (SGD: http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/)에 등록되고 공개된 에스. 세레비지애의 ORF의 아미노산 서열에 대해 상동성 검색, 예컨대, BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 등을 이용하여 수행될 수 있다.

한편, DNA 마이크로어레이-근거한 비교 게놈 혼성화 및 PCR에 의해 양조 효모의 염색체 구조를 분석하는 것이 가능하다.

효모 게놈 DNA를 Quiagen Genomic Tip 100/G (#10243) 및 Quiagen Genomic DNA Buffer Set (#19060)를 키트에 첨부된 설명서에 따라 사용하여 제조했다. DNA (10 μg)를 Winzeler, 등. (Science, 제 281 권, 1194-1197 페이지 (1998))의 방법에 따라 DNaseI(Invitrogen사에 의해 제조됨)으로 절단하고, 말단 전이효소 (Roche사에 의해 제조됨)를 사용하여 비오티닐화하고, DNA 마이크로어레이(microarray) (Affymetrix Gene Chip Yeast Genome S98 Array)에 혼성화한다. 마이크로어레이의 신호 강도의 혼성화 및 검출을 Affymetrix사에 의해 제조된 Gene Chip Analysis Basic System 및 분석 소프트웨어 (Microarray Suite 5.0)를 사용하여 수행한다.

양조 효모의 DNA와 혼성화된 각 프로브의 신호는 분석 소프트웨어 (Microarray Suite 5.0)를 사용해서 반수체의 실험실 효모 균주 S288C의 것에 표준화시키고, 신호 로그비 (2ⁿ)로 나타낸다. 신호 로그비를 스프레드시트 프로그램 (Microsoft Excel 2000)을 사용하여 각 염색체에서 하기 유전자 순서로 나누고, 신호 로그비를 막대 그래프 (예를 들면, 도. 5에 언급됨)에서 나타낸다. 비-Sc 유형 유전자는 에스. 세레비지애 어레이와 혼성화되지 않으므로, Sc 유형 유전자 용량이 신호 로그비에 영향을 끼치고, 신호 로그비가 강한 변화를 보이는 지점이 Sc 유형 및 비-Sc 유형 염색체 사이의 전위 위치라고 간주한다.

키메라 염색체 구조는, 양조 효모로부터 유도된 게놈 DNA가 주형으로 사용되고, Sc 유형 및 비-Sc 유형 샷건(shotgun) 서열이 프라이머로 사용되는 PCR에 의해 확인할 수 있다.

PCR을 Takara LA Taq™ 및 첨부된 완충액을 사용하여, 첨부된 설명서에 따라 Takara PCR Thermal Cycler SP을 사용하여 수행한다.

PCR의 결과로, 양조 효모로부터 증폭된 특정 길이의 DNA 절편을 0.8% 아가로스 전기영동에 의해 확인한다. 실험실 균주인 에스. 세레비지애의 게놈 DNA가 PCR에 대한 주형으로 사용될 때, DNA 절편의 증폭이 검출되지 않는다. 양조 효모로부터 증폭된 DNA 절편의 양 말단의 DNA 서열을 더욱 확인한다면, 샷건법에 의해 결정된 게놈 서열과 동일하고, 상기 구역내에, Sc 유형 및 비-Sc 유형 염색체 사이의 전위가 일어나고, 그 결과 키메라 염색체가 형성되는 것을 확인할 수 있다.

(D) 하면 발효 효모로부터 유도되는 유전자의 기능 분석

유전자의 기능 분석의 단계는 (i) 유전자의 선별, (i') 유전자의 클로닝, (j) 파괴에 의한 유전자의 기능 분석 및 (k) 과발현에 의한 유전자의 기능 분석을 포함한다.

(i) 유전자의 선별

유전자 기능 분석을 위한 유전자 선별에 사용되는 방법에 대해 특별히 제한은 없지만, 바람직한 방법은, 예를 들면, 상기 (h)에서 수득된 기능의 지정을 사용하는 방법 및 하기에 기술된 바와 같이 DNA 마이크로어레이를 사용하는 방법이다. DNA 마이크로어레이를 사용하는 방법은, 예를 들면, 일부 조건하에서 특징적인 발현 프로필을 나타내는 유전자를 동정하기 위한 유전자 발현 분석, 또는 프로브의 신호 강도의 차이(difference)를 측정함으로서 상이한 복제수 또는 상이한 DNA 서열을 가진 유전자를 동정하기 위한 비교 게놈 혼성화이다.

(i') 유전자의 클로닝

상기 (i)에서 선택된 유전자를 예를 들면, [Molecular Cloning, Third Edition]에서 언급된 통상적인 방법에 따라, 하면 발효 효모로부터 수득할 수 있다. 즉, 유전자에 근접한 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 통상적인 PCR 클로닝 방법을 하면 발효 효모로부터 제조된 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 수행하여, 그 결과 선택된 유전자를 단리하고, 수득할 수 있다. 수득된 DNA 서열에 대해서 상기와 같이, 예를 들면, 서열번호: 1 또는 번호: 2에 의해 열거할 수 있다.

유전자가 명명될 때, 예를 들면, 유전자^①, 유전자^① 을 PCR 방법에 의해 증폭하기 위한 유전자^① 또는 프라이머를 또한 상기 언급된 서열 정보에 기초해서 폴리뉴클레오티드 합성기를 사용하여 합성할 수 있다. 게다가, 유전자^① 은 유전자^① 로서 동일한 DNA 서열을 가진 DNA 절편 뿐 아니라, 엄격한 조건하에서 상기 유전자에 혼성화하는 DNA 절편 또한 의미한다. 엄격한 조건하에서 혼성화하는 DNA 절편은, 프로브로 상기에서 동정되는 유전자^① 의 서열을 함유하는 DNA 절편을 사용해서 콜로니 혼성화 방법, 플라크 혼성화 방법, 서던 블롯 혼성화 방법 등에 의해서 수득되는 DNA 절편을 의미한다. 확실히 말하면, 유전자^① 의 DNA 서열과 60% 이상 동일성, 바람직하게는 그것에 80% 이상 동일성, 더욱 바람직하게는 그것에 95% 이상 동일성을 나타내는 DNA 절편을 열거할 수 있다. 혼성화는 "Molecular Cloning, Third Edition", "Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (이하, Current Protocols in Molecular Biology로 약칭됨), "DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995) " 등에서 언급되는 방법에 따라 수행할 수 있다.

더욱 확실히 말하면, 총길이의 상기 언급된 유전자^① 를 함유하는 샷건 클론은 (g) 및, 상동 및 위치상 정보 등의 기초에서 수득되는 비교 데이타베이스를 사용해서 검색할 수 있다. 샷건 라이브러리내에 총길이의 유전자를 함유하는 클론이 없을 때, 총길이의 유전자를 암호화하는 DNA 절편은 PCR 방법에 의해 제조된다. 예를 들면, 상기 언급된 유전자를 함유하는 DNA 절편은 서열번호: 13 및 서열번호: 14 등에 의해서 나타내지는 합성 DNA 프라이머 쌍을 사용해서 수득된다. 유사하게, PCR은 SGD의 공개된 정보에 기초하여 설계된 프라이머 쌍을 사용하고, 에스. 세레비지애 또는 하면 발효 효모의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 수행하고, 그 결과, 비-Sc 유형 유전자에 상응하는 총길이의 Sc 유형 유전자를 제조한다. 예를 들면, 서열번호: 15 및 번호: 16의 합성 올리고뉴클레오티드를 프라이머 쌍으로 사용하여, Sc 유형 유전자를 함유하는 DNA 절편을 수득할 수 있다.

상기 언급된 바와 같이 제조된 Sc 또는 비-Sc 유형 DNA 절편을, 예를 들면, TA 클로닝 키트 등을 사용하는 TA 클로닝 키트 (Invitrogen)에 첨부된 pCR 2.1-TOPO 벡터내에 삽입하여, 그 결과 각각 Sc 및 비-Sc 유형 유전자를 갖는 DNA 절편을 함유하는 재조합 벡터 TOPO/Sc 유전자 및 TOPO/비-Sc 유전자를 제조할 수 있다. Sc 및 비-Sc 유형 DNA 절편의 DNA 서열은 생어법(Sanger's method) "F. Sanger, Science, 제 214 권, 1215 페이지, 1981"에 의해 확인할 수 있다.

(j) 파괴에 의한 유전자의 기능 분석

문헌 "Goldstein, 등., Yeast, 제 15 권, 1541 페이지, (1999)"의 방법에 따라, 약제 내성 유전자 (예컨대, pFA 6a (G418^r), pAG 25 (nat1))를 함유하는 플라스미드가 주형으로 사용된 PCR에 의해 유전자 파괴에 대한 DNA 절편을 제조하는 것이 가능하다. PCR에 대한 프라이머 쌍으로서, 비-ScSSU1_for (서열번호: 17)/비-ScSSU1_rv (서열번호: 18) 등이 비-ScSSU1 파괴에 대해 사용되는 동안, Sc SSU1 파괴에 대해, ScSSU1_for (서열번호: 19) /ScSSU1_rv (서열번호: 20) 등이 사용된다. 비-Sc 유형 유전자 파괴에 대해, 플라스미드 예컨대, pPGAPAUR (AUR1-C) 및 프라이머 쌍 예컨대, 비-ScSSU1_for + pGAPAUR (서열번호: 21)/비-ScSSU1_rv + AURI-C (서열번호: 22)을 사용하는 것이 또한 가능하다.

하면 발효 효모를 상기 언급된 방법에 의해 제조되는 유전자 파괴에 대한 DNA 절편으로 형질전환시킨다. 형질전환은 Japanese Patent Laid-Open Gazette No. 07/303,475에서 언급된 방법을 따를 수 있다. 게다가, 형질전환체의 선별을 위한 약물의 농도는 숙주로서 사용된 효모의 민감도에 의해 대략 측정될 수 있다.

여기 제조된 형질전환체에 대해, 각 약제 내성 유전자를 도입하고, 상기 유전자를 서던 분석을 사용해서 올바르게 파괴시키는 것을 확인한다. 확실히 말하면, 모균주 및 형질전환체로부터 추출된 게놈 DNA를 Sc 및 비-Sc 유형 유전자를 구별하기 위해 먼저 적절한 제한 효소로 절단하고 (예를 들면 37℃에서 18시간 동안), 1.5% 아가로스 젤 전기영동으로 분리하고, 막에 이전시킨다. 그 후에, Alkphos Direct Labelling Reagents (Amersham)의 프로토콜에 따라 예를 들면, 55℃에서 18시간 동안, 이들을 Sc-유형 또는 비-Sc 유형 유전자에 특이적인 프로브에 혼성화시키고, 신호를 CDP-Star에 의해 검출한다.

(i')에서 수득된 유전자의 기능은 모균주 및 상기 (j)에서 제조된 SSU1 파괴체를 사용하는 발효 시험 및 그들의 발효 특성의 비교에 의해 확인할 수 있다. 발효 시험은, 예를 들면, 하기 조건하에서 맥아즙을 사용해서 수행할 수 있다.

원 추출물: 약 10 내지 15%

발효 규모: 1 내지 3 리터

용존 산소 농도: 약 8 내지 10 ppm

발효 온도: 약 15℃

피칭 비율: 약 4 내지 6 g 의 습윤 효모 세포/L

맥아즙을 주기적으로 채취하여, 세포 증식 (OD 600), 명백한 추출물을 모니터링하고, (i') 등에서 수득되는 유전자의 기능에 관여하는 물질의 농도를 분석한다. 예를 들면, (i')에서 수득되는 유전자의 기능이 아황산염의 배출에 관여할 때, 발효동안 맥아즙 내의 아황산염 농도를 분석한다. 아황산염의 정량 분석을 산성 조건하에서 증류에 의해 아황산염이 과산화수소 용액에 포획되는 상기 방법으로 수행하고, 알칼리로 적정한다 (Revised Method for BCOJ Beer Analysis by the Brewing Society of Japan).

(k) 과발현에 의한 유전자의 기능 분석

총길이의 비-Sc 유형 유전자를 함유하는 DNA 절편을 (i')에서 제조된 플라스미드 TOPO/비-Sc 유전자로부터 적절한 제한 효소에 의해 절단한다. 이를 유전자 발현을 위한 벡터의 클로닝 사이트, 예컨대 비-Sc 유형 유전자의 과발현을 위한 벡터 (pYI-비-Sc 유형 유전자)를 제작하기 위한 pNI-NUT 내에 삽입한다. 벡터 pNI-NUT는 상동 재조합 사이트로서 URA3 및 선별 마커로서 노우르세오트리신-저항 유전자 (nat1) 및 암피실린-저항 유전자 (Amp^r)를 함유한다. 반면, Sc 유형 유전자 (pNI-Sc 유형 유전자)의 과발현을 위한 벡터는 상기 언급된 pYI-비-Sc 유형 유전자가 상응하는 Sc 유형 유전자에 의해 치환되는 구조를 가진다. 여기 소개된 Sc 또는 비-Sc 유형 유전자의 과발현을 위해, 항상 발현하는 유전자, 예를 들면, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 유전자 (TDH3)의 촉진자 및 종결자에 의해 작동되는 것이 바람직하다.

하면 발효 효모는 상기 언급된 방법에 의해 제조되는 과발현 벡터를 사용해서 형질전환된다. 형질전환을 the Japanese Patent Laid-Open Gazette No. 07/303, 475에서 언급되는 방법에 의해서 수행하고, 형질전환체를 적절한 선별 배지상에서 선별한다. 과발현의 확인은 RT-PCR 방법 등에 의해서 수행할 수 있다. 총 RNA의 추출은 RNeasy Mini Kit (Qiagen) 등을, 키트에 첨부된 "효모로부터 총 RNA 단리"의 설명서에 따라 사용해서 수행할 수 있다. 예를 들면, ScSSU1_for331 (서열번호: 23)/ScSSU1_982rv (서열번호: 24) 및 비Sc-SSU1_for329 (서열번호: 25)/nonSc-SSU1_981rv (서열번호: 26)을, 각각 Sc 및 비-ScSSU1 유전자의 증폭에 대한 특정 프라이머 쌍으로 사용하는 것이 가능하다. 항상 발현하는 유전자를 증폭시키기 위해서, 예를 들면 PDA1, 내부 기준으로, PDA1_for1 (서열번호: 27)/PDA1_730rv (서열번호: 28) 등을 특정 프라이머 쌍으로 사용할 수 있다. PCR 생성물을 1.2% 아가로스 젤 전기영동으로 분리하고, 에티디움 브로마이드 염색으로 검출한다. 형질전환체내의 상기 유전자의 과발현을 PCR 생성물의 양을 비교하여 확인한다.

(i')에서 수득된 유전자의 기능 분석은 모균주 및 상기 (k)에서 제조된 과발현된 균주를 사용하는 발효 시험에 의해 수행할 수 있다. 발효 시험은 (j)에서 언급된 조건하에서 수행할 수 있다.

(j)에서 언급된 동일한 방법에 따라, 맥아즙을 주기적으로 채취하여, 세포 증식 (OD600), 명백한 추출물 및 (i')에서 수득되는 유전자의 기능에 관여하는 물질의 농도를 모니터링한다.

본 발명의 스크리닝 방법에 의해 수득되는 DNA에 대해, 상기에서 수득되는 비-Sc 유형 유전자의 DNA 서열을 함유하는 DNA 및 엄격한 조건하에서 상기 DNA에 혼성화하는 DNA가 열거될 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에 의해 수득되는 DNA는 비-한정적이라 하더라도 단일-가닥 및 이중-가닥 DNA를 포함한다. 상기 엄격한 조건하에서 수득되는 비-Sc 유형 유전자의 DNA 서열을 함유하는 DNA에 혼성화하는 DNA는 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 코돈의 축퇴 변이체를 포함한다. 축퇴 변이체는 코돈의 축퇴에 의한 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미하고, DNA 서열의 관점에도 불구하고, 본 발명에 의해 선별되는 비-Sc 유형의 DNA 서열과 다르다.

이의 특정 예시는 서열번호: 1 또는 2에 의해 제시되는 서열을 가진 DNA, 엄격한 조건하에서 상기 DNA에 혼성화하는 DNA 등이다. 엄격한 조건하에서 혼성화하는 DNA는 상기 확인된 비-Sc 유형의 서열을 가진 DNA 절편을 프로프로 사용하여 콜로니 혼성화 방법, 플라크 혼성화 방법, 서던 블롯 혼성화 방법에 의해서 제조된 DNA를 의미한다.

혼성화는 "Molecular Cloning, Third Edition", "Current Protocols in Molecular Biology", "DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)" 등에 언급되는 방법에 따라 수행할 수 있다. 혼성화 할 수 있는 DNA의 특정 예시는, 서열번호: 1 또는 2에서 제시되는 DNA 서열에, 상동 검색에 대한 소프트웨어 예컨대, FASTA, BLAST, Smith-Waterman "Meth. Enzym., 제 164 권, 765 페이지 (1988)" 등에 의해 디폴트 세팅(초기 세팅)의 척도를 사용하여 계산을 수행할 때, 60% 이상 동일성을 보이는 DNA, 바람직하게는 80% 이상 동일성을 보이는 DNA, 더욱 바람직하게는 95% 이상 동일성을 보이는 DNA이다.

본 발명의 스크리닝 방법에 의해 수득된 DNA의 예시는 서열번호: 3 또는 4에 의해서 제시되는 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 또는 엄격한 조건하에서 상기 DNA에 혼성화되는 DNA이다.

본 발명의 스크리닝 방법에 의해 수득된 DNA에 의해서 암호화되는 폴리펩티드의 예시는, 상기에서 수득되는 ORF의 DNA 서열을 함유하는 DNA에 의해 암호화되는 폴리펩티드 및 엄격한 조건하에서 상기 DNA에 혼성화되는 DNA에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 서열번호: 3 또는 4에 의해 제시되는 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드이다.

게다가, 1개 이상 아미노산 잔기가 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열에 결손 및/또는 치환 및/또는 첨가되고, 상기 폴리펩티드의 활성과 실질적으로 동일한 활성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 또한 본 발명에 포함된다. 표현 "상기 폴리펩티드의 활성과 실질적으로 동일한 활성"은 결손, 치환 또는 첨가전에 폴리펩티드에 고유한 효소 활성 또는 기능에 의해 나타내지는 활성에 동일한 활성을 의미한다. 상기 폴리펩티드는 "Molecular Cloning, Third Edition", "Current Protocols in Molecular Biology", "Nuc. Acids. Res., 제 10 권, 6487 페이지 (1982)", "Proc. Natl. Acad. Sic. USA, 제 79 권, 6409 페이지 (1982)", "Gene, 제 34 권, 315 페이지 (1985)", "Nuc. Acids. Res., 제 13 권, 4431 페이지 (1985)", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제 82 권, 488 페이지 (1985)" 등에 언급된 특이-자리 변이 도입에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 서열번호: 3 또는 4에서 보여지는 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA내에 특이-자리 변이를 도입함으로써 제조될 수 있다. 결손 및/또는 치환 및/또는 첨가될 수 있는 아미노산 잔기의 수에 대한 특별한 제한이 없음에도 불구하고, 수는 공지된 방법, 예컨대 상기 언급된 특이-자리 변이 방법에 의해 결손 및/또는 치환 및/또는 첨가될 수 있는 상기 범위내에 있고, 1 내지 수십, 바람직하게는 1 내지 20 더욱 바람직하게는 1 내지 10, 더욱 더 바람직하게는, 1 내지 5이다.

본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 결손 및/또는 치환 및/또는 첨가되는 1개 이상 아미노산 잔기의 DNA는, 동일한 서열에서 아미노산 서열의 임의의 1개 이상의 위치에 1개 이상의 아미노산 잔기의 1개 이상의 결손 및/또는 치환 및/또는 첨가가 있는 것을 의미한다. 상기 결손(들) 및/또는 치환(들) 및/또는 첨가(들)는 동시에 일어날 수 있고 치환된 또는 첨가된 아미노산 잔기는 자연적으로 발생하는 유형 또는 비-자연적으로 발생하는 유형일 수 있다. 자연적 유형의 아미노산 잔기의 예는 L-알라닌, L-아스파라진, L-아스파르트산, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린 및 L-시스테인 등이다.

서로 치환될 수 있는 아미노산 잔기의 예는 하기에 제시될 것이다. 동일 군에서 아미노산 잔기가 서로 치환될 수 있다.

군 A: 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부타노산, 메티오닌, O-메틸세린, tert-부틸글리신, tert-부틸알라닌 및 시클로헥실알라닌.

군 B: 아스파르트산, 글루탐산, 이소아스파르트산, 이소글루탐산, 2-아미노아디프산 및 2-아미노수베르산.

군 C : 아스파라진 및 글루타민.

군 D: 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부타노산 및 2,3-디아미노프로피온산.

군 E : 프롤린, 3-히드록시프롤린 및 4-히드록시프롤린.

군 F : 세린, 트레오닌 및 호모세린.

군 G : 페닐 알라닌 및 티로신.

수득된 변이된 폴리펩티드가 변이 전에 폴리펩티드의 활성과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 목적을 위해, 분석 예컨대, BLAST 및 FASTA 용 소프트웨어에 의해서 디폴트 세팅(초기 세팅)의 척도를 사용하여 계산을 수행할 때, 변이 전에 폴리펩티드의 아미노산 서열에 60% 이상, 주로 80% 이상 또는, 특히 95% 이상의 동일성을 보이는 변이되 것을 갖는 것이 바람직하다.

화학적 합성 방법 예컨대, Fmoc 방법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐 방법), tBoc 방법 (tert-부틸옥시카르보닐 방법) 등에 의해서 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 것이 또한 가능하다. 게다가 [Advanced ChemTech, Perkin-Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimadzu 등]에 의해서 제조된 펩티드 합성기를 사용함으로서 화학적으로 합성하는 것이 가능하다.

본 발명의 방법이 사용될 때, 산업적 효모의 총 게놈 서열을 결정하는 것, 산업적 효모의 유용한 유전자를 동정하는 것 및 상기 유전자의 기능을 지정하는 것이 가능하다. 산업적 효모내의 유전자가 산업적으로 유용한 많은 경우가 있고, 유전자가 지정된 기능에 기초해서 분류될 때, 효모의 특성이 명백해지고, 산업적 효모의 증식에 대한 귀중한 정보를 수득할 수 있다. 예를 들면, 산업적 효모가 양조 효모일 때, 알코올 음료의 생산에서, 생산성의 증가 및 맛의 향상에 관여하는 유전자를 확인하고, 유전자가 생산성의 증가 또는 맛의 향상에 불리한 경우에는, 유전자 발현을 유전자 파괴, 안티센스 방법 또는 RNAi 방법 (참조, 예를 들면, 비-특허 문헌 10)에 의해 억제하여, 그 결과 뛰어난 양조 특성을 나타내는 효모를 육종할 수 있다. 유전자가 생산성의 증가, 맛의 향상 등에 유리한 경우에는, 예를 들면 유전자는 효모에서 과발현되고, 그 결과 산업적으로 유용한 뛰어난 양조 특성을 나타내는 양조 효모를 육종할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에 의해 수득되는 유전자가 유용한 효모를 증식하기 위해 사용되는 예는 하기에 제시된다.

이미 상기 언급된 바와 같이, 제품에서 아황산염 농도가 증가하면, 뛰어난 맛 안정성을 가진 제품을 만드는 것이 가능하다. 그러므로, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 수득되는 유전자가 아황산염의 제조 및 유출에 기여한다면, 이제 형질전환체가 배양되고, 상기 유전자를 발현하여, 제품내의 아황산염의 농도가 증가하여 그 결과 뛰어난 맛 안정성을 가진 제품을 만드는 것이 가능하다.

하면 발효 효모는 세포의 외부로부터 섭취한 황산 이온 (SO₄ ^2-)을 아황산염 이온 (SO₃ ^2-)으로 환원시키는 것으로 알려져 있다. 그러나, 아황산염은 글리세로알데히드-3-포스페이트 탈수소효소를 억제하고, 세포내 ATP의 농도를 감소시켜, 효모는 아황산염 배출 작용을 가지므로, 과도한 아황산염은 세포내에 축적될 수 없다. SSU1는 단리되고, 아황산염-민감성 변이 (참조, 예를 들면, 비특허 문헌 11) 보완을 제시하는 유전자이다. SSU1 유전자는 485 아미노산 잔기를 함유하고, 구조 분석은 이것이 9 내지 10 막-통과 도메인을 가진 운송체라는 것을 제시한다 (참조, 예를 들면, 비특허 문헌 12). 게다가, SSU1 과발현된 균주를 사용한 실험의 결과로, SSU1 유전자 제품이 아황산염의 배출에 관여한다는 것이 이미 증명되었다 (참조, 예를 들면, 비특허 문헌 13).

상면 발효 효모가 아황산염을 거의 생산하지 않는데 비해, 하면 발효 효모는 주로 높은 아황산염의 생산 능력을 가진다. 본 발명의 스크리닝 방법을 사용함으로써, 상면 및 하면 발효 효모 모두에 존재하는 ScSSU1 유전자에 더해서 하면 발효 효모에 특이적인 비-ScSSU1 유전자를 선별하는 것이 가능하다. 유사하게, 아황산염의 생산에 관여하는 단백질을 암호화하는 MET14 유전자의 경우, 하면 발효 효모에 특이적인 비-ScMET14를 선별하는 것이 또한 가능하다. 예를 들면, 비-ScSSU1 및 비-ScMET14의 기능은 하면 발효 효모에 특이적인 아황산염의 높은 생산 능력에 크게 관여하고, 아황산염의 높은 생산 능력을 보이는 효모를 육종하기 위해서 상기 비-ScSSU1 유전자, 비-ScMET14 등을 강화하는 것이 효과적이다.

상기 비-ScSSU1 유전자 및 비-ScMET14가 강화된 효모의 육종 방법은 특히 실시예에서 언급된다.

본 발명의 스크리닝 방법에 의해 선별되는 유전자의 도입에 숙주로서 사용되는 효모에 대해, 양조용으로 사용가능한 효묘에 한해서 특별한 제한이 없으며, 현재 양조 효모로서 널리 사용되는 임의의 효모 예컨대, BH 84, NBRC 1951, NBRC 1952, NBRC 1953 및 NBRC 1954를 포함하는 맥주 효모가 사용될 수 있다.

게다가, 위스키 효모 (예컨대, 에스. 세레비지애 NCYC 90), 와인 효모 (예컨대, 와인 효모 Kyokai No.1, No.3, No.4 등) 및 사케 효모 (예컨대, 사케 효모 Kyokai No.7, No.9 등)이 또한 사용될 수 있다.

상기 언급된 숙주내에 유전자의 도입에 사용되는 벡터에 대해서, 효모에서 유전자를 발현할 수 있는 벡터에 한해서 특별한 제한이 없고, 임의의 다수복제본의 플라스미드 (YEp 유형), 단일-복제본 플라스미드 (YCp 유형) 및 염색체 DNA-통합 플라스미드 (YIp 유형)을 사용할 수 있다. YEp 벡터의 예는 YEp 51 (J. R. Broach, 등., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983) 등. YCp 벡터의 예는 YCp 50 (M. D. Rose, etal., Gene, 제 60 권, 237 페이지, 1987) 등.; 및 YIp 벡터의 예는 YIp 5(K. Struhl, 등., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제 76 권, 1035 페이지, 1979) 등이다. 상기 플라스미드는 시판되고 쉽게 구할 수 있다.

상기 언급된 벡터는 효모에서 유전자의 발현을 조절하는 다른 서열 예컨대, 촉진자, 작동자, 증강인자, 침묵자, 리보솜 결합 서열, 종결자 등을 가질 수 있다. 유전자의 항상 발현을 위한 촉진자 및 종결자에 대해, 특별한 제한이 없으나, 그것이 양조 효모에서 기능하고, 제품에서 아황산염 농도와 독립적인 것에 한에서 임의 조합이 사용될 수 있다. 촉진자에 대한 예를 들면, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (TDH3) 유전자에 대한 촉진자, 포스포글리세레이트 키나아제 (PGK1) 유전자에 대한 촉진자 등을 사용하는 것이 가능하다. 상기 촉진자는 공지되고, PGK1 유전자는, 예를 들면, 공개적으로 알려진 문헌 예컨대 M. F. Tuite, 등., EMBO J., 제 1 권, 603 페이지 (1982)에서 상세하게 언급되고, 쉽게 이용할 수 있다.

상기 도입된 유전자의 발현을 조절하는 상기 언급된 기타의 서열들은, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 수득된 DNA 에 포함되어 있는 한 특별히 벡터로부터 제공될 필요는 없다. 이러한 기타 서열들이 상기 DNA 에 포함되어 있지 않은 경우, 기타 서열들을 개별적으로 제조하여 상기 DNA 에 연결(ligation)하는 것이 바람직하다. 대안적으로, 보다 고도의 발현 수준 또는 특이적인 발현 조절이 요구되는 경우, 이러한 목적에 적절한 기타 서열을 상기 DNA 에 연결한다.

상기 벡터의 숙주로의 형질전환 방법은 공지의 절차들을 따를 수 있다. 예를 들어, 하기 방법들을 사용할 수 있다; 전기천공 방법 "Meth. Enzym., volume 194, page 182 (1990)", 스페로플라스트 (spheroplast) 방법 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, volume 75, page 1929 (1978)", 리튬 아세테이트 방법 "J. Bacteriology, volume 153, page 163 (1983)", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, volume 75, page 1929 (1978)" 에 언급된 방법, 등.

좀 더 구체적으로, 숙주를 표준 효모 영양 배지 (예컨대 YEPD 배지 "Genetic Engineering, vol. 1, Plenum Press, 뉴욕, 117 (1979)" 등) 에서 배양하여 600 ㎚ 에서의 흡광도가 1 내지 6 이 되도록 한다. 원심분리로 세포를 수집하고, 세척한 후, 알칼리 금속 이온 또는, 바람직하게는, 리튬 이온을 약 1 M 내지 2 M 의 농도로 예비-처리한다. 상기 세포들을 약 30 ℃ 에서 약 60 분간 인큐베이션한 후, 이들을 도입될 DNA (약 1 내지 20 ㎍) 와 함께 약 30 ℃ 에서 약 60 분간 인큐베이션한다. 최종 농도가 약 20% 내지 50% 일 때, 폴리에틸렌글리콜 또는, 바람직하게는, 약 4,000 달톤의 폴리에틸렌글리콜을 첨가한다. 인큐베이션을 약 30 ℃ 에서 약 30 분간 수행한 후, 세포들을 약 42 ℃ 에서 약 5 분간 열처리한다. 바람직하게는, 세포 현탁액을 표준 효모 영양 배지로 세척하고, 미리 정해진 양의 신선한 표준 효모 영양 배지 중에 넣은 후, 약 30 ℃ 에서 약 1 시간동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 이를 적절한 선택배지 플레이트 상에 스프레딩한다.

상기 외에, 일반적인 클로닝 방법으로서, "Molecular Cloning, Third Edition", "Methods in 효모 Genetics, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)" 등을 참조하였다.

상기 형질전환에 사용되는 선별 마커 (selective marker) 에 관해서, 양조 효모 (양조 효모) 의 경우 영양요구성 (auxotrophic) 표지자를 이용하는 것이 가능하지 않기 때문에, G 418-내성 유전자 (G 418^r), 구리-내성 유전자 (CUP 1) "M. Marin, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, volume 81, page 337, 1984", 세룰레닌(serulenin)-내성 유전자 (fas2m, PDR 4) ("Atsushi Inogoshi, 등, Seikagaku, volume 64, page 660, 1992", "M. Hussain, 등, Gene, volume 101, page 149, 1991") 등이 응용가능하다.

본 발명에 따라 육종된 양조 효모는 효모의 성장 및 발효 능력의 점에서 모 균주와 다르지 않다. 따라서, 재료, 생산 설비, 생산 관리 등은 종래의 방법들에서와 완전히 동일한 것일 수 있으며, 이것은 본 발명의 중요한 양상이다. 그러나, 원할 경우, 발효 기간 등의 조건을 각 경우별로 달리할 수 있음은 물론이다. 예를 들어, 아황산염 방출 능력이 증대된 양조 효모를 사용하고, 이러한 효모를 사용하여 알콜성 음료를 생산하는 경우, 생산물 중에서 아황산염의 함유량만이 변화할 뿐, 효모의 성장 및 발효 능력의 점에서는, 모 균주를 사용하는 경우와 차이가 없다. 따라서, 재료, 생산 설비, 생산 관리 등이 종래의 방법들에서와 완전히 동일할 수 있으며, 비용 증가 없이, 아황산염 함유량이 증가되고 풍미가 개선된 알콜성 음료가 생산된다.

(E) 본 발명의 DNA 어레이 (array) 의 제조

상기 (f) 에서 수득된 ORF 들의 DNA 서열 정보에 기초하여 본 발명의 DNA 어레이를 제조할 수 있다. 예로서, 고체 지지체를 포함하고, 상기 지지체에 상기 항목 (f) 에서 수득한 DNA 서열을 포함하고 있는 폴리뉴클레오티드, 엄격한 조건하에서 상기 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드의 DNA 서열 중의 10 내지 200 개의 연속 뉴클레오티드들을 포함하고 있는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상이 부착되어 있는 DNA 어레이; 및, 고체 지지체를 포함하고, 상기 지지체에 상기 (h) 로서 수득된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 엄격한 조건하에서 상기 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드의 DNA 서열 중의 10 내지 200 개의 연속 염기들을 포함하고 있는 폴리뉴클레오티드, 상기 (h) 로부터 유추된 두 ORF 사이의 유전자간 (intergenic) DNA 서열을 포함하고 있는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상이 부착되어 있는 DNA 어레이를 들 수 있다.

본 발명의 DNA 어레이로는, 당업계에 공지된 기질들, 예컨대 DNA 칩, 폴리뉴클레오티드 어레이 및 DNA 마이크로어레이 및 DNA 매크로어레이 등이 있으며, 고체 지지체와 상기 고체 지지체의 표면에 부착되어 있는 복수 개의 이들의 절편들의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 고체 지지체에 부착된 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드로서, 상기 항목 (f) 및 (h) 에서 수득되는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 고체 지지체에 상기 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 고밀도로 부착시킴으로써 하기 기술한 분석을 효율적으로 수행할 수 있으나, 고도의 고정 밀도 (fixation density) 가 항상 필요한 것은 아니다. 고밀도를 수행하는 장치, 예컨대 어레이어 로봇 (arrayer robot) 등은 Takara Shuzo (GMS417 Arrayer) 로부터 시중에서 구매가능하고, 시판되는 제품도 사용가능하다. 또한, 포토리소그라피 (photolithograpy) 방법 등에 의해 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체 상에서 직접 합성할 수 있다 (Nat. Genet. 21, 20-24 (1999)). 이 방법에서, 광 조사로 제거될 수 있는 보호기를 가진 연결자를 먼저 고체 지지체, 예컨대 슬라이드 글라스 등에 부착시킨다. 그런 다음, 상기 부착 부분의 한정된 부분에서만 광을 배타적으로 투과시키는 마스크 (포토리소그라프 마스크) 에 광을 조사한다. 그 후, 광 조사로 제거될 수 있는 보호기를 가진 올리고뉴클레오티드를 상기 부분에 부가한다. 이렇게 하여, 상기 뉴클레오티드와의 연결 반응이 상기 조사된 부분에서 배타적으로 일어난다. 이 과정을 반복함으로써, 각 부분에서 각각 원하는 서열을 가진 서로 다른 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 통상, 합성되는 올리고뉴클레오티드는 길이가 10 내지 30 개 뉴클레오티드이다. DNA 어레이의 제조에 사용되는 방법에는 특별한 제한이 없으며, 공지된 방법들에 따라 수행할 수 있으나, 이들 각각에 대한 바람직한 방법을 하기에 언급한다.

(l) DNA 어레이 제조

(l)-1 고체 지지체

폴리뉴클레오티드 또는 절편들이 그 표면에 부착될 수 있는 임의의 물질이 본 발명의 DNA 어레이에 대한 고체 지지체로 사용가능하다. 상기 고체 지지체에 사용되는 물질 및 모양에는 특별한 제한이 없으나, 물질로서는 일부 레지노이드(resinoid)류, 예컨대 폴리카르보네이트, 플라스틱 등이, 그리고 고체로서 플레이트 모양 및 필름 모양이 바람직하다.

(l)-2 올리고뉴클레오티드의 선택

본 발명의 DNA 어레이의 플레이트 상에 고정시킬 올리고뉴클레오티드의 예는 하기와 같다. 특정 프로브 제조 방법, 예컨대 GeneChip

(Affymetri=) 기술 등을 이용하여, 상기 (h) 에서 수득된 ORF 의 DNA 서열 및/또는 상기 (h) 에서 유래된 유전자간 DNA 서열에 기초하여, 양조 효모의 전체 게놈 서열에 대한 유일하고도 상보적인 프로브 (probe) (PM 프로브; Perfect Match 프로브) 를 설계할 수 있다. 이들 프로브들에 대한 예는, (i) 산업용 효모의 전체 게놈 서열의 오픈 리딩 프레임 (open reading frame) 에 존재하고 상기 전체 게놈 서열 내의 상기 10 내지 30 개의 뉴클레오티드 영역 외의 다른 영역에는 존재하지 않는, 뉴클레오티드 수가 10 내지 30 인 올리고뉴클레오티드, (ii) (i) 에 기재된 올리고뉴클레오티드의 DNA 서열에 상보적인 DNA 서열을 가진 올리고뉴클레오티드, (iii) 엄격한 조건중에서 (i) 및 (ii) 에 기재된 올리고뉴클레오티드들에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드이다. 이들 프로브들의 다른 예는, (iv) 산업용 효모의 전체 게놈 서열의 비-암호화 영역에 존재하고 상기 전체 게놈 서열 내의 상기 10 내지 30 개 뉴클레오티드 영역 외의 다른 영역에는 존재하지 않는, 뉴클레오티드 수가 10 내지 30 인 올리고뉴클레오티드, (v) (iv) 에 기재된 올리고뉴클레오티드의 DNA 서열에 상보적인 DNA 서열을 가진 올리고뉴클레오티드, (vi) 엄격한 조건중에서 (iv) 및 (v) 에 기재된 올리고뉴클레오티드에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드이다. 이들 올리고뉴클레오티드들의 뉴클레오티드 수는 제한이 없으나, 10 내지 30 개 뉴클레오티드가 바람직하다. 각 좌위에 3' 측에 초점을 두면서 11 내지 50 개의 프로브를 설계할 수 있는데, 각 좌위에 대한 프로브 집합들을 사용할 경우 데이터 검출 및 분석이 풍부해질 수 있고, 혼동시킬 가능성이 있는 우발적인 이종 결합 (cross-hybridization) 의 효과가 완화될 수 있으며, 양적인 정보를 위하여 모든 프로프가 이상적으로 혼성화할 필요가 없게 될 수 있다. 검출의 감도 및 특이성을 더욱 증가시키기 위하여, 부정합(mismatch)된 염기, 즉 염기 13 을 제외하고는 PM 프로브와 동일한 밀접하게 관련된 부정합 프로브 (MM 프로브) 를 이용하여 각 PM 프로브를 설계할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 길이에는 특별한 제한이 없으나, 본 발명에 사용되는 올리고뉴클레오티드의 바람직한 길이는 26 개 염기이다.

(l)-3 고체 지지체로의 올리고뉴클레오티드 부착

올리고뉴클레오티드를 고체 지지체에 부착하는데 사용되는 방법에는 특별한 제한이 없으며, 공지의 수단들에 따라 수행할 수 있으나, 하기 언급되는 방법이 바람직하다. 예를 들어, 특정 방법, 예컨대 GeneChip

기술 등을 사용하여, 상기 ((l)-2) 와 같이 설계된 PM 및 MM 프로브들 모두를 고체 지지체의 표면에 부착시켜 DNA 어레이를 제조할 수 있다.

DNA 마이크로어레이를 사용하는 분석에 사용되는 방법에는 특별한 제한이 없으나, 이들 각각에 대한 바람직한 방법은 하기에 언급되는데, 즉, 일정 조건하에서 특징적인 발현 프로필을 나타내는 유전자들을 동정하는 유전자 발현 분석의 예, 산업용 효모의 분류법, 뉴클레오티드 다형성 (polymorphism) 검출법 및 기능 분석용 유전자 선별법이 하기에 언급된다.

(m) 유전자 발현 분석

(l) 에 기재된 방법에 따라 제조된 본 발명의 DNA 어레이를 사용하여 양조 효모의 유전자 발현 분석을 수행할 수 있다. 상기 DNA 어레이를 사용하여 배지 뿐 아니라 주위환경의 변화에 따른 고도 유도성 (inducible) 또는 환원성 (reducible) 유전자(들)을 동정하는 것이 가능하다. 또한, 상기 DNA 어레이를 사용하여, 양조에 있어서 라거 (lager) 양조 효모에 대한 특이적 유전자(들)을 동정할 수 있다. 그러나, 이들 예들에 제한되지는 않는다.

유전자 발현 분석은 산업용 효모 배양, mRNA 제조, 표지된 cRNA (또는 cDNA) 합성, 혼성화 및 데이터 분석을 포함한다. 유전자 발현 분석의 방법에는 특별한 제한이 없으나, 하기 언급되는 것이 이들 각각에 대한 바람직한 방법이다.

(m)-1 다양한 조건에서의 산업용 효모 배양

임의의 목적을 위하여 다양한 조건하에서 산업용 효모를 배양할 수 있다. 예를 들어, 이하 언급되는 바와 같이 배양 배지의 조성의 변화에 반응하는 유전자의 동정을 위한 배양을 수행할 수 있다. 산업용 효모를 30 ℃ 의 아연 풍부 (replete) 배지, 예컨대 LZMM 배지 + 40 M 황산아연 중에서 진탕하면서 하룻밤동안 증식시킬 수 있다. LZMM 배지는 0.17% 효모 질소 염기 w/o 아미노산 (DIFCO 사 제조), 0.5% 황산암모늄, 20 mM 시트르산나트륨 (pH 4.2), 125 μM MnCl₂, 10 μM FeCl₂, 2% 말토오스, 10 mM EDTA (pH 8.0) 등을 함유한다. 세포들을 거두어들이고 멸균 증류수로 3회 세척한다. 흡광도 (OD600) 가 0.25 등이 되도록 적량의 세포를, 1) 아연 결핍 배지 (LZMM 배지) 등, 2) 아연 풍부 배지 (LZMM+ 40 μM 황산아연) 등, 3) 산화적 스트레스 (oxidative stress) 배지 (LZMM + 40 μM 황산아연 + 2mM H₂O₂) 등, 4) 탄소 기아 (starvation) 배지 (상기 LZMM+ 40 μM 황산아연에서 말토오스 제거) 등에 접종한다. 세포를 30 ℃ 에서 6 시간 정도 증식시키고, RNA 조제를 위해 거두어 들인다. 맥주 발효 조건하의 발효 튜브로부터 회수한 세포를 하기 실험에 사용할 수 있다.

(m)-2 mRNA 조제

RNeasy

미니 키트 (QIAGEN 사 제조) 등을 사용설명서에 따라 사용하여 전체 RNA 를 조제할 수 있다. Oligotex Direct mRNA 키트 (QIAGEN 사 제조) 등을 사용설명서에 따라 사용하여 전체 RNA 로부터 폴리(A) + mRNA 를 조제한다. mRNA 의 조제에 사용되는 방법에는 특별한 제한이 없으며 공지의 수단들에 따라 수행할 수 있다.

(m)-3 표지된 cRNA 합성

BioArray HighYield RNA Transcript Labeling Kit (Affymetrix 사 제조) 등을 사용설명서에 따라 사용하여 표지된 cRNA 를 합성할 수 있다. 표지를 위해 비오틴을 사용할 수 있다. 표지된 cRNA 합성에 사용되는 방법에는 특별한 제한이 없으며 공지의 수단들에 따라 수행할 수 있다.

(m)-4 혼성화

5 ㎍ 의 비오틴-표지된 cRNA, 1.7 ㎕ 의 3 nM 의 대조군 (Control) 올리고뉴클레오티드 B2 (Affymetrix 사 제조), 5 ㎕ 의 20X 진핵세포 혼성화 대조군 (Affymetrix 사 제조), 1 ㎕ 의 10 ㎎/㎖ 청어 (Herring) 정액 DNA (Affymetrix 사 제조), 1 ㎕ 의 50 ㎎/㎖ 아세틸화 BSA (Affymetrix 사 제조), 50 ㎕ 의 2X 혼성화 완충액 (Affymetrix 사 제조), 및 최종 부피가 100 ㎕ 이 되게 하는 물 (Affymetrix 사 제조) 을 혼합하고 Affymetrix 사의 기술 설명서에 따라 상기 DNA 어레이에 혼성화한다. 혼성화 16 시간 후, 혼성화 혼합물 (cocktail) 을 제거하고, DNA 어레이를 GeneChip

Fludics Station (Affymetrix 사 제조) 등을 사용하여 세척한 후, Affymetrix 사의 기술 설명서에 따라 스트렙타비딘 피코에리트린 (Streptavidin Phycoerythrin, 300 ㎕ 의 2X MES 염색 완충액 (Affymetrix 사 제조), 24 ㎕ 의 50 ㎎/㎖ 아세틸화 BSA (Affymetrix 사 제조), 6 ㎕ 의 1 ㎎/㎖ 스트렙타비딘-피코에리트린 (Affymetrix 사 제조), 270 ㎕ 의 물 (Affymetrix 사 제조)) 으로 염색한다. 혼성화에 사용되는 방법에는 특별한 제한이 없으며 공지의 수단들에 따라 수행할 수 있다.

(m)-5 데이터 분석

시판되는 소프트웨어 (예를 들어, GCOS (GeneChip Operating Software), Affymetrix 사 제조; GeneSpring, Silicon Genetics 사 제조; ImaGene, Takara Shuzo 사 제조; Array Gauge, Fuji Photo Film 사 제조; ImageQuant, Amersham Pharmacia Biotech 사 제조, 등) 를 사용하여 기술 설명서에 따라 상기 DNA 어레이에 대한 데이터 분석을 수행할 수 있다. 특징적인 발현 프로필을 보이는 유전자를 동정 및 선별하여 기능 분석할 수 있다.

나아가, 동정된 유전자를 유전자 표지자로 사용하여 발효 동안 효모 세포의 상태를 추정할 수 있다.

데이터 분석에 사용되는 방법에는 특별한 제한이 없으며 공지의 수단들에 따라 수행할 수 있다.

(n) 산업용 효모 분류

상기 언급한 DNA 어레이를 사용하여 산업용 효모를 분류할 수 있다. 효모의 게놈 DNA 조제 및 DNA 어레이로의 혼성화는 앞서 기재한 바와 같이 수행할 수 있다. Affymetrix 사 제조의 Gene Chip Analysis Basic System 및 분석 소프트웨어 (GCOS; GeneChip Operating Software 1.0) 를 사용하여 어레이의 신호 강도를 검출할 수 있다. 양조 효모의 DNA 가 혼성화하는 프로브의 백분율을 계산하고, 균주 34/70 및 시험 균주 간의 동일성을 평가한다. 산업용 효모 균주를 상기 동일성을 기초로 분류할 수 있다.

(o) 뉴클레오티드 다형성 검출

상기 언급한 DNA 어레이를 이용한 비교 게놈 혼성화에 의해 산업용 효모의 뉴클레오티드 다형성을 검출할 수 있다. 각 프로브에 대한 올리고뉴클레오티드 집합은 균주 34/70 의 서열과 동일한 완전 매치 올리고뉴클레오티드 (PM) 및 예를 들어, 상기 올리고뉴클레오티드의 중앙 위치의 단 하나의 염기가 부정합인 부정합 올리고뉴클레오티드(MM) 로 이루어져 있다. MM 내의 신호 강도가 PM 에서의 강도보다 (예를 들어, 5-배 초과) 더 높은 유전자로부터 뉴클레오티드 다형성을 검출할 수 있다.

(p) 기능 분석을 위한 유전자 선별

상기 비교 게놈 혼성화 분석의 결과로부터, 낮은 신호 강도를 보이는 프로브 집합들을 가진 유전자는 유실된 것이거나 또는 균주 34/70 의 서열과는 상이한 서열을 가진 것일 수 있다. 반대로, 높은 신호 강도를 보이는 프로브 집합들을 가진 유전자는 복제 수가 높은 것일 수 있다. 이러한 유전자들은, 그 좌위가 균주 34/70 와 시험 균주 간의 발효 특성의 차이에 기여할 수 있기 때문에 기능 분석을 위해 선별될 수 있다. 상기 언급한 방법으로 검출된 뉴클레오티드 다형성을 가진 유전자들 또한 기능 분석을 위해 선별될 수 있다.

실시예

본 발명의 상세한 것은 하기 실시예를 이용하여 언급되나, 본 발명이 하기 실시예들에 제한되는 것은 아니다.

(실시예 1) 사카로마이세스 파스토리아누스 바이헨슈테판 (Saccharomyces pastorianus Weihenstephan) 34/70 (이하, 균주 34/70 로 약칭함) 의 염색체 DNA 조제

문헌 [Yeast, a practical approach (IRL Press) 6.2.1 (228-229 페이지)] 에 언급된 방법으로 염색체 DNA 를 조제하였는데, 상기 방법은 부분적으로 변형되었다. 세포를 30 ℃ 에서 200 ㎖ 의 YPD 배지 (2% 글루코오스, 1% 효모 추출물 및 2% 폴리펩톤 (polypeptone)) 에 접종하고 배양액의 660 ㎚ 에서의 흡광도가 4 가 될 때까지 배양하였다. 세포를 원심분리로 수집하고, 완충액 A (50 mM 인산나트륨, 25 mM EDTA 및 1% (v/v) β-메르캅토에탄올; pH 7.5) 으로 세척한 후, 25 ㎖ 의 완충액 A 에 재현탁하고, 거기에 7 ㎎ 의 Zymolyase 100T (Seikagaku Kogyo 사) 을 첨가하고, 혼합물을 37 ℃ 에서 60 분간 온건하게 진탕하였다. 여기에, 25 ㎖ 의 완충액 B (0.2 M Tris-HCl, 80 mM EDTA 및 1 % SDS; pH 9.5) 를 첨가하고, 혼합물을 65 ℃ 에서 30 분간 방치한 후, 얼음 상에서 냉각시키고, 12 ㎖ 의 5M 아세트산 칼륨과 혼합하여 추가로 60 분간 얼음 상에 방치하였다. 생성된 용액을 15 ℃ 에서 5,000 g 로 10 분간 원심분리하였다. 회수된 상청액에, 동일 부피의 에탄올을 첨가하여 DNA 를 침전시키고, 혼합물을 즉시 15 ℃ 에서 5,000 g 로 10 분간 원심분리하여 침전물을 수집하였다. 생성된 침전물을 70% (v/v) 에탄올로 세척하고, 자연 건조시킨 후, 5 ㎖ 의 TE 완충액 (10 mM Tris-HCl 및 1 mM 의 EDTA; pH 8.0) 에 용해시켜 조 DNA 용액을 수득하였다. 염화세슘 (4.06 g) 및 840 ㎍ 의 비스벤즈이미드 (Hoechst 33258) 을 첨가하고, 3.5 ㎖ 의 상기 조 DNA 용액에 용해시킨 후, 혼합물을 25 ℃ 에서 100,000 g 로 17 시간동안 원심분리하고, UV 광에 노출시켜 DNA 띠 (band) 들을 가시화한 후, 보다 하층의 띠를 회수하였다. 회수된 DNA 용액을 염화세슘 용액으로 포화된 이소프로판올로 추출하 여 비스벤즈이미드 (Hoechst 33258) 을 제거하였다. 회수된 수성층에 4 배 부피의 0.3M 아세트산 나트륨을 첨가한 후, 혼합하고, 거기에 3 배 부피의 에탄올을 첨가하여 DNA 를 침전시키고, 원심분리로 이를 회수하였다. 회수된 DNA 를, 75 ㎍/㎖ 의 RNA 분해효소 (RNase) 를 함유한 TE 완충액에 용해시키고, 37 ℃ 에서 5 분간 방치한 후, 페놀/클로로포름으로 3 회 추출하고, 수성층을 추가로 에탄올 침전시켰다. 원심분리로 회수된 침전물을 70 % (v/v) 에탄올로 세척하고, 자연 건조한 후, TE 완충액에 용해시켜 염색체 DNA 용액을 제조하였다.

(실시예 2) 샷건 (shotgun) 라이브러리 (library) 제조

실시예 1 에서 제조된 균주 34/70 의 게놈 용액의 농도를 TE 완충액을 사용하여 1 ㎎/㎖ 로 조절하고, 이의 0.1 ㎖ 를 Hydroshear (GeneMachines 사 제조; 속도: 6; 순환: 20) 로 처리하여 상기 게놈 DNA 를 단편화하였다. DNA Blunting Kit (Takara Shuzo 사 제조) 를 사용하여 게놈 절편의 말단들을 평활화(blunting)하고, 0.8% 아가로오스 전기영동으로 분별한 후, 상기 겔로부터 1.5 내지 2.5 kb 의 게놈 절편을 절개한 후, DNA 를 용출하였다. DNA 용출액을 페놀/클로로포름으로 처리하고, 에탄올로 침전시켜 게놈 라이브러리 삽입물을 수득하였다. 상기 삽입물 모두와 0.5 ㎍ 의 pUC 18 SmaI/BAP (Amersham Biosciences 사 제조) 를, T4 리가아제 (Takara Shuzo 사 제조) 를 사용하여 15 ℃ 에서 15 시간동안 연결반응시켰다.

연결 반응 생성물을 에탄올로 침전시킨 후, 10 ㎕ 의 TE 완충액에 용해시켰다. 상기 연결 용액 (1 ㎕) 을, 첨부된 실험 설명서에 언급된 조건하에서의 전기천공법으로 40 ㎕ 의 에셰리키아 콜라이 (Escherichia coli) Electro 세포 DH5α (Takara Shuzo 사 제조) 에 삽입하였다. 결과적인 생성물을, 0.1 ㎎/㎖ 의 암피실린, 0.1 ㎎/㎖ 의 X-gal 및 1 mmol/ℓ 의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 를 함유한 1.6% 의 한천을 함유한 LB 플레이트 배지 (LB 배지 (1% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물 및 1% 염화나트륨; pH 7.0)) 에 스프레딩하고, 37 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이션 하였다.

상기 플레이트 배지 상에 생성된 집락들로부터 수득한 형질전환체들을, 0.1 ㎎/㎖ 의 암피실린을 함유한 50 ㎕ 의 LB 배지가 첨가된 384-웰 타이터 (titer) 플레이트에서 37 ℃ 에서 하룻밤동안 진탕없이 배양하고, 여기에 50 ㎕ 의 50% 글리세롤 수용액을 첨가한 후, 교반하고, 혼합물을 글리세롤 보존액 (stock) 으로 사용하였다.

(실시예 3) 코스미드 (cosmid) 라이브러리의 제조

실시예 1 에서 수득한 약 0.1 ㎎ 의 게놈 DNA 를 Sau3AI (Takara Shuzo 사 제조) 로 부분적으로 절단하였다. 설명서에 따라 상기 절편을 Super Cos I 벡터 (Stratagene 사 제조) 의 BamHI 부위로 삽입하였다. 이 방법으로 제조된 연결된 생성물을 Gigapack III Gold (Stratagene 사 제조) 를 사용하여 포장한 후, 설명서에 따라 에스케리키아 콜리 XL1-Blue MR 균주 (Stratagene 사 제조) 내로 도입하였다. 이를 0.1 ㎎/㎖ 의 암피실린을 함유한 LB 플레이트 배지 상에 스프레딩하고, 37 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 생성된 형질전환체들을, 96-웰 타이터 플레이트를 사용하여 0.1 ㎎/㎖ 의 암피실린을 함유한 LB 배지 (각 웰: 50 ㎕) 중에서 37 ℃ 에서 하룻밤 배양한 후, 여기에 5 ㎕ 의 50% 글리세롤 용액을 첨가하고 교반한 후, 혼합물을 글리세롤 보존액으로 사용하였다.

(실시예 4) DNA 서열 결정

(4-1) DNA 절편 제조

전체 게놈 샷건법을 주로 사용하여 균주 34/70 의 전체 게놈 서열을 결정하였다. PCR 방법에 의하여 상기 실시예 2 에서 제조된 샷건라이브러리로부터 상기 샷건법으로 결정될 DNA 서열의 DNA 절편을 제조하였다. 구체적으로, 복제기 (replicator, Gene Solution 사 제조) 를 사용하여 상기 전체 게놈 샷건 라이브러리에서 유래한 클론들을, 각 웰에 0.1 ㎎/㎖ 의 암피실린을 함유한 LB 배지가 50 ㎕ 씩 들어 있는 384-웰 타이터 플레이트에 접종하고, 37 ℃ 에서 진탕없이 하룻밤 배양하였다. 상기 배양액을 복제기 (Gene Solution 사 제조) 를 사용하여 10 ㎕ 의 PCR 용 반응 혼합물 (Takara Shuzo 사 제조의 TaKaRa Ex Taq) 을 함유한 384-웰 반응 플레이트 (AB Gene 사 제조) 로 옮기고, GeneAmp PCR 시스템 9700 (Applied Biosystems 사 제조) 를 사용하여 문헌 [Makino, 등, DNA Research, volume 5, 1 내지 9 페이지 (1998)] 에 의한 절차에 따라 PCR 을 수행하여, 삽입된 절편을 증폭시켰다. 그 후, PCR 생성물 정제 키트 (Amersham Bioscience 사 제조) 로 과량의 프라이머 및 뉴클레오티드를 제거하고, 상기 정제된 PCR 표본을 주형으로 사용하여 서열 반응을 수행하였다.

하기 방법에 따라 상기 실시예 3 의 코스미드 라이브러리로부터의 DNA 절편을 제조하였다. 즉, 전체 코스미드 라이브러리에서 유래한 클론들을, 각각 50 ㎍/㎖ 의 암피실린이 함유된 2 x YT 배지 (1.6% bactotrypsin, 0.1% 효모 추출물 및 0.5% 염화나트륨; pH 7.0) 1.0 ㎖ 씩이 들어 있는 96-웰 플레이트의 각 웰에 접종하고, 30 ℃ 에서 하룻밤 진탕 배양하였다. 상기 배양물로부터, KURABO PI-1100 AUTOMATIC DNA ISOLATION SYSTEM (KURABO 사 제조) 을 사용하고 KURABO 의 설명서에 따라 코스미드 DNA 를 제조하고, 서열 반응의 주형으로 사용하였다.

(4-2) 서열 반응

서열 반응 혼합물을 하기와 같이 제조하였다. 상기 (4-1) 에서 제조된 PCR 생성물 또는 코스미드 DNA 를 약 2 ㎕ 의 DYEnamic ET 종결자 Sequencing Kit (Amersham Bioscience 사 제조) 및 적절한 프라이머를 이용하여 혼합하여 약 8 ㎕ 의 반응 혼합물을 수득하였다. 샷건 DNA 유래의 PCR 생성물의 서열 반응을 위해서는 M13 정방향 (M13-21) 프라이머 및 M13 역방향 (M13RV) 프라이머 (Takara Bio 사 제조) 를 사용한 한편, 코스미드 DNA 용으로는, 정방향 프라이머 SS-cos F.1 (서열번호: 7) 와 역방향 프라이머 SS-cos R.1 (서열번호: 8) 을 사용하였다. 상기 프라이머와 DNA 절편의 양은, 각각 3.2 pmol 및 50 내지 200 ng 이었다. 상기 반응 용액을, GeneAmp PCR 시스템 9700 을 사용하여 60 회 순환의 염료 종결자 서열 반응시켰다. 순환 파라미터 (cycle parameter) 는 DYEnamic ET 종결자 Sequencing Kit 에 첨부된 설명서에 따랐다. 멀티 스크린 HV 플레이트 (Millipore 사 제조) 를 사용하고 Millipore 사의 설명서에 따라 상기 표본을 정제하였다. 정제된 반응물을 4 ℃ 의 어두운 곳에 저장하였다. 상기 정제 반응물을 Mega BACE 1000 Sequencing System (Amersham Bioscience 사 제조) 및 ABI PRISM 3700 DNA 분석기 (Applied Biosystems 사 제조) 를 사용하여 이들에 첨부된 설명서들에 따라 분석하였다. Mega BACE 1000 Sequencing System 으로 수득된 332,592 개 서열들 및 3700 DNA 분석기로 수득된 13,461 개 서열들에 대한 데이터를 서버인 Enterprise 6500 (Sun Microsystems 사 제조) 으로 옮기고 저장하였다. 346,053 개 서열들에 대한 데이터는 상기 전체 게놈 크기의 약 7 배에 해당하였다.

본 실시예에서 사용된 PCR 용 프라이머들의 목록은 표 3 에 나와 있다.

(실시예 5) 조립 (다중 서열분석된 DNA 절편들의 순서를 결정하는 과정)

상기 실시예 4 에서 수득한 346,053 개 서열들의 DNA 절편용 서열 정보로부터 게놈 DNA 서열의 재구축을 위한 모든 작업을 UNIX

플랫폼 상에서 수행하였다. 프레드 (phred) (워싱턴 대학교) 로 베이스 콜 (base call) 을 수행하고, Cross_Match (워싱턴 대학교) 를 이용하여 벡터 서열의 차폐 (masking) 를 수행하고, 프랩 (Phrap) (워싱턴 대학교) 을 이용하여 조립을 수행하였다. 상기 조립의 결과로 수득된 콘티그 (contig) 들을 그래픽 편집기인 콘시드 (Consed) (워싱턴 대학교) 를 이용하여 분석하였다. 콘시드에 부착된 스크립트 프레드프랩 (script phredPhrap) 을 모두 함께 이용하여 베이스 콜에서부터 조립까지의 일련의 작업들을 수행하였다.

(실시예 6) 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae) 의 전체 게놈 서열과의 비교 데이터베이스 제조

에스. 파스토리아누스는 에스. 세레비지애와 이의 밀접히 관련된 종과의 천연 교잡종 (hybrid) 인 것으로 여겨진다(Int. J. Syst. Bacteriol., volume 35, 508 내지 511 페이지 (1985)). 따라서, (4-2) 에서 수득한 코스미드 DNA 클론의 양 말단의 DNA 서열 (10,044 개 염기들 포함) 을, 에스. 세레비지애의 게놈 서열에 대한 상동성 검색 알고리즘을 이용하여 상동성 검색을 수행하였는데, 이때 각 DNA 에 대하여 에스. 세레비지애의 게놈 서열 상의 상동 영역의 서열 정렬과 이의 상동성을 결정하여 데이터베이스를 작성하였다. 코스미드 DNA 서열의 에스. 세레비지애의 대응 게놈 DNA 서열과의 상동성 분포 도표가 도 2 에 나와 있다. 코스미드들의 DNA 서열을 개략적으로, 에스. 세레비지애의 게놈 DNA 서열에 대하여 94% 이상의 상동성을 보이는 DNA 서열 군과 그에 대하여 대략 84% 의 상동성을 보이는 DNA 서열 군으로 분류하였다. 94% 이상의 상동성을 보이는 DNA 서열 군은 에스. 세레비지애 유래의 Sc 형의 DNA 서열로 명명되었고, 대략 84% 의 상동성을 보이는 DNA 서열 군은 밀접하게 관련된 종의 게놈에서 유래한 비-Sc 형의 DNA 서열로 명명되었다. 유사하게, (4-1) 에서 수득한 샷건 클론의 양 말단의 DNA 서열과 에스. 세레비지애의 게놈 DNA 서열과의 비교 데이터베이스 (표 1) 를 작성하였다. 표 1 은 3,648-코스미드 클론의 양 말단의 DNA 서열과 에스. 세레비지애의 게놈 DNA 서열과의 비교 데이터베이스의 일례를 보여준다. 표 1 은 에스. 세레비지애의 각 게놈 DNA 서열에 대한, DNA 서열 결정된 코스미드의 정방향 서열 및 역방향 서열의 상동 영역 및 상동성을 보여 준다.

상기 작성된 비교 데이터베이스로 수득된 정보에 기초하여, 에스. 세레비지애 게놈 서열 상의 코스미드 클론 및 샷건 클론의 맵핑 (mapping) 을 수행하였다(도 3). 또한, 실시예 5 에서 수득한 콘티그 DNA 서열과 에스. 세레비지애 게놈 서열과의 비교 데이터베이스 (표 1) 를 작성한 후, 맵핑을 수행하였다. 맵핑 방법은 상기 언급된 방법과 거의 동일하나, 코스미드 및 샷건 클론들의 정방향 및 역방향 서열이 상이한 콘티그 내에 존재할 경우, 이들 콘티그들을 정방향-역방향 링크 (link) 로 연결하였다(도 4).

(실시예 7) ORF 의 동정 및 기능 지정

실시예 5 에서 조립된 DNA 서열 내에서 ORF (open reading frame, 오픈 리딩 프레임) 를 동정하였다. 그 예들이 하기에 구체적으로 나와 있다. 실시예 5 에서 조립된 DNA 서열 내에 존재하는, 개시 코돈에서 종결 코돈까지의 길이가 이의 상보 서열을 포함하여 150 개 염기 이상인 6 종류의 해독 프레임에 대하여, ORF 의 동정을 위한 ORF 탐색자 (finder) (http://www.ncbi.nih.gov/gorf/gorf.html) 를 사용하는 이용가능한 프로그램을 사용하여 ORF 의 동정을 수행하였다. SGD 에 등록되어 있는 공개된 에스. 세레비지애의 ORF 들의 아미노산 서열에 대한 상동성 검색으로, 상기 추출한 ORF 의 기능 지정을 수행하였다. 표 2 는, 상기 비-Sc 게놈에 존재하는 ORF 의 기능 지정의 결과에 해당하는 에스. 세레비지애의 ORF 명칭의 예들을 보여준다. 상기 표의 좌측으로부터, 상기 양조 효모 상에 존재하는 ORF 의 명칭, 폴리뉴클레오티드의 ORF 길이, 폴리펩티드의 ORF 길이, 상동성 검색으로 결정된 에스. 세레비지애의 ORF 의 명칭, 상동성, 일치하는 부분의 길이 및 상기 유전자의 기능들이 나타난다.

(실시예 8) DNA 마이크로어레이에 기초한 비교 게놈 혼성화 및 PCR 에 의한 염색체 구조 분석

Qiagen Genomic Tip 100/G (#10243: Qiagen 사 제조) 및 Qiagen 게놈 DNA 완충제 세트 (#19060: Qiagen 사 제조) 를 사용하여 상기 키트들에 첨부된 설명서에 따라 효모의 게놈 DNA 를 제조하였다. 상기 DNA (10 ㎍) 을 문헌 [Winzeler, 등, Science, volume 281, 1194 내지 1197 페이지 (1998)] 의 방법에 따라 DNase I (Invitrogen 사 제조) 으로 절단하고, 말단 전이효소 (Roche 사 제조) 로 비오티닐화한 후, DNA 마이크로어레이 (Affymetrix 유전자 칩 효모 게놈 S98 어레이: Affymetrix 사 제조) 에 혼성화반응시켰다. 혼성화 반응 및 어레이의 신호 강도 검출은 Affymetrix 사 제조의 유전자 칩 분석 베이직 시스템을 이용하여 수행하였다.

균주 34/70 의 DNA 와 혼성화된 각 프로브의 신호를 분석 소프트웨어 (Microarray Suite 5.0: Affymetrix 사 제조) 를 사용하여 반수체 (haploid) 실험용 효모 균주 S288C 의 신호에 대하여 표준화(normalization)하고, 신호 로그 비 (2ⁿ) 로 나타내었다. 스프레드시트 (spreadsheet) 프로그램 (마이크로소프트 엑셀 2000) 을 사용하여 각 염색체 내의 유전자 순서에 따라 신호 로그 비를 정렬하고, 상기 신호 로그 비를 도 5 에 나타낸 바와 같이 막대 그래프로 나타낸다. 비-Sc 형 유전자들은 에스. 세레비지애 어레이와 혼성화하지 않으며, 따라서, Sc 형 유전자 투여량은 신호 로그 비에 영향을 미치며, 신호 로그 비가 격렬한 변화를 보이는 지점들은 Sc 형 염색체와 비-Sc 형 염색체 사이의 전좌 (translocation) 부위인 것으로 고려된다.

샷건법으로 결정된 균주 34/70 의 게놈 서열을 기초로, 한쪽은 Sc 형이고 다른 쪽은 비-Sc 형인 DNA 서열들을 가진 두 쌍의 프라이머 (XVI-1(L)cer-95894 (서열번호: 9)/XVI-1(R)비Sc-106302rv (서열번호: 10) 및 XVI-2(L)cer-859737 (서열번호: 11)/XVI-2(R)비Sc-864595rv (서열번호: 12)) 를 설계하고 균주 34/70 에서 유래한 게놈 DNA 를 주형으로 사용한 PCR 로 상기 키메라 염색체 구조를 확인하였다. 염색체 XVI 의 전좌의 두가지 예가 하기에 나와 있다.

Takara PCR Thermal Cycler SP 사의 Takara LA Taq^TM 및 그에 부속된 완충액을 사용하여 첨부된 설명서에 따라 PCR 을 수행하였다.

상기 PCR 의 결과로서, 0.8% 아가로오스 전기영동에 의하여, 균주 34/70 로부터 예상된 길이의 DNA 절편이 증폭된 것이 확인된 반면, 실험용 균주 에스. 세레비지애 X2180-1A 의 게놈 DNA 를 상기 PCR 의 주형으로 사용한 경우, 상기 DNA 절편의 증폭이 검출되지 않았다. 더욱이, 균주 34/70 로부터 증폭된 DNA 절편의 양 말단의 DNA 서열을 확인하였을 때, 이는 샷건법으로 결정된 게놈 서열과 일치하였고, 이러한 영역내에서 Sc 형 염색체와 비-Sc 형 염색체 간의 전좌가 일어난다는 것이 확인되었다.

상기 결과로부터, 도 6 에서 보여지는 바와 같이, 염색체 XVI 내에 2 종류 이상의 염색체가 존재한 것으로 추정된다. 동일한 방법에 따라, Sc 염색체와 비-Sc 염색체 (또는 그 반대) 간의 연결 또는, 다시 말해, 키메라 염색체 구조의 존재가 암시되는 영역이 확인되었다. 이러한 Sc 염색체 및 비-Sc 염색체의 키메라 염색체 구조는 균주 34/70 의 전체 염색체들내에서 13 개 이상의 곳에서 확인되었다(도 1).

게놈 분석의 결과로서, 하면 발효 (bottom fermenting) 의 염색체 구조가 매우 복잡하며, 균주 34/70 내에는 37 종 이상의 염색체가 존재하는 것으로 나타났다.

(실시예 9) 균주 34/70 의 SSU1 유전자들의 클로닝

실시예 6 에서 수득한 비교 데이터베이스를 이용하여 비-ScSSU1 유전자를 포함하고 있는 샷건 클론을 검색하였다. 비-ScSSU1 ORF 의 전장 (full-length) 을 포함하고 있는 약 2.4kb 의 절편이 포함된 SSS103_G08 이 있는데, 에스. 세레비지애에 대한 샷건 클론의 정방향 및 역방향 서열의 상동성은 각각 62.9% 및 82.9% 였다.

SSS103-G08 을 게놈 DNA 의 라이브러리로부터 선별한 후, PCR 로 비-ScSSU1 의 전장을 제조하였다. SacI-비-Sc-SSU1_for1 (서열번호: 13) 및 Bg1II-비-Sc-SSU1_rv1460 (서열번호: 14) 의 합성 DNA 들을 프라이머로 사용하였다. 이러한 조합의 결과로서, 염기 수가 1 내지 1460 인 비ScSSU1 이 증폭되어 약 1.5 kb 의 SacI-Bg1II 절편이 수득되었다.

ScSSU1 유전자에 대해서는, 상기 균주 34/70 의 게놈 DNA 를 주형으로 사용하고 SGD 의 정보를 기초로 설계된 프라이머 쌍을 사용한 PCR 에 의해 전장 유전자를 수득하였다. SacI-ScSSU1_for1 (서열번호: 15) 및 Bg1II-ScSSU1_rv1406 (서열번호: 16) 의 합성 DNA 들을 프라이머로 사용하였다. 이러한 조합의 결과로서, 염기 수가 1 내지 1406 인 ScSSU1 유전자가 증폭되어 약 1.4 kb 의 SacI-Bg1II 절편이 수득되었다.

상기와 같이 수득된 ScSSU1 및 비-ScSSU1 유전자들을 TA 클로닝 키트 (Invitrogen) 를 사용하여 상기 키트에 첨부된 pCR 2.1-TOPO 벡터에 삽입하고, 이들을 각각 TOPO/ScSSU1 및 TOPO/비-ScSSU1 으로 명명하였다. 상기 생성된 ScSSU1 및 비-ScSSU1 유전자들의 서열을, 문헌 [F. Sanger, Science, volume 214, 페이지 1215, 1981] 의 Sanger 방법으로 확인하였다(도 10).

(실시예 10) 각 SSU1 유전자의 파괴

문헌 [Goldstein, 등, Yeast, volume 15, 1541 페이지 (1999)] 에 언급된 방법에 따라, 약제 내성 표지자를 포함하고 있는 플라스미드 (pFA6a (G418^r), pAG 25 (nat1)) 를 주형으로 사용한 PCR 로 유전자 파괴용 DNA 절편들을 제조하였다. 상기 PCR 에서 프라이머로서, 비-ScSSU1 유전자 파괴를 위해서는 비-Sc-SSU1_for (서열번호: 17)/비-Sc-SSU1_rv (서열번호: 18) 을 사용하고, ScSSU1 유전자 파괴를 위해서는, ScSSU1_for (서열번호: 19)/ScSSU1_rv (서열번호: 20) 을 사용하였다. 비-ScSSU1 유전자의 파괴에 있어서, 플라스미드 pPGAPAUR (AUR1-C) 와 프라이머 비-Sc-SSU1_for + pGAPAUR (서열번호: 21)/비-Sc-SSU1_rv + AURI-C (서열번호: 22) 를 추가로 사용하였다. 이와 같이, ScSSU1 및 비-ScSSU1 유전자 파괴용으로서 각각 2 종류 및 3 종류의 DNA 절편들을 제조하였다.

상기 방법으로 제조한 유전자 파괴용 DNA 절편을 사용하여 상기 하면 발효 효모 BH 96 을 형질전환시켰다. 상기 형질전환은, 일본 특허 공개 공보 제 07/303,475 호 에 언급된 방법으로 실시하였고, 약제의 농도는 제네티신 (geneticin) 에 대하여는 300 ㎎/ℓ, 노우어세오트리신 (nourseothricin) 에 대하여는 50 ㎎/ℓ 및 아우레오바시딘 A (aureobasidin A) 에 대하여는 1 ㎎/ℓ 이었다.

상기 제조된 형질전환체에 대해서, 써던 (Southern) 분석으로 유전자 파괴를 확인하였다. 먼저, 모 균주로부터 게놈 DNA 를 추출하고, ScSSU1 유전자 파괴에 대한 확인을 위하여는 NcoI 를 사용하고 비-ScSSU1 유전자 파괴의 확인을 위하여는 HindIII 를 사용하여 파괴체를 제한효소 처리하고 (37 ℃ 에서 18 시간), 그 후, 1.5% 아가로오스 겔 전기영동으로 분별하여 멤브레인 (membrane) 으로 이동시켰다. 그 후, Alkphos Direct Labelling Reagents (Amersham) 의 프로토콜을 따라 ScSSU1 또는 비-ScSSU1 에 특이적인 프로브를 가지고 혼성화반응을 수행하고(55 ℃ 에서 18 시간동안), CDP-Star 로 신호들을 검출하였다.

유전자 파괴가 확인된 균주들 각각을 하기와 같이 명명하였다.

Sc-1 (ScSSU1/Scssu1::G418^r)

Sc-2 (Scssu1::G418^r/Scssu1::nat1)

비-Sc-1 (비-ScSSU1/비-ScSSU1/비-Scssu1::G418^r)

비-Sc-2 (비-ScSSU1/비-Scssu1::G418^r/비-Scssu1::nat1)

비-Sc-3 (비-Scssu1::G418^r/비-Scssu1::nat1/비-Scssu1::AUR1-C)

(실시예 11) 발효 테스트에서 아황산염 생성물의 정량 분석

하기 조건하에서 모 균주 및 실시예 10 에서 제조된 파괴체 Sc-1 내지 비-Sc-3 를 사용한 발효 테스트를 실시하였다.

최초 추출물: 12.75%

발효 규모: 2 리터

용존 산소 농도 : 약 9 ppm

발효 온도: 15 ℃

피칭률 (pitching rate): 맥아즙 (wort) 2ℓ 당 습윤 효모 세포 10 g

맥아즙을 주기적으로 표본 채취하여, 세포 증식 (OD600) (도 7-(a)), 외견상의 추출물 (도 7-(b)) 및 아황산염 농도 (도 7-(c)) 를 모니터링하였다. 아황산염을 산성 조건에서의 증류에 의해 과산화수소 용액 중에 포획되도록 하고 알칼리로 적정시키는 방법으로 맥아즙 중의 아황산염의 정량 분석을 수행하였다(일본양조협회의 수정된 BCOJ 맥주 분석 방법).

그 결과, ScSSU1 파괴체에 의한 맥아즙 중의 아황산염 생성은 모 균주에 의해 생산된 것과 거의 동일한 반면, 비-ScSSU1 파괴체에 의하여는 상당히 감소하였다. 이는, 하면 발효 효모에 특이적인 비-ScSSU1 유전자가 맥아즙 중의 아황산염 생성에 크게 기여함을 시사한다.

동시에, 비-ScSSU1 파괴체에서는 증식률 및 추출물-소비율도 상당히 감소하였는데, 이는 세포 중의 과량의 아황산염이 세포 증식을 저해한다는 것을 뒷받침하였다.

(실시예 12) 각 SSU1 유전자의 과발현

실시예 9 에서 언급된 플라스미드 TOPO/비-ScSSU1 로부터, 비-ScSSU1 ORF 의 전장을 포함하고 있는 약 1.5 kb 의 절편을 제한효소 (SacI-Bg1II) 로 처리하여 절단하였다. 그런 다음, 상기 절편을 플라스미드 pNI-NUT 에 삽입하고, 이를 마찬가지로 제한효소 (SacI-Bg1II) 로 처리하여 비-ScSSU1 과발현 벡터 pYI-비-ScSSU1 을 구축하였다. 상기 벡터 pNI-NUT 는 상동 재조합 부위로서의 URA3 및 선별 마커로서의 노우어세오트리신-내성 유전자 (nat1) 및 암피실린-내성 유전자 (Amp^r) 을 포함하고 있다. 한편, 상기 ScSSU1 과발현 벡터 pNI-ScSSU1 은 상기 언급한 pYI-비-ScSSU1 의 비-ScSSU1 유전자가 에스. 세레비지애에서 유래한 약 2 kb 의 SSU1-R 로 치환된 구조를 갖고 있다(J. Ferment. Bioeng., volume 86, 427 페이지 (1998)). 각 SSU1 유전자의 과발현을 위하여, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 유전자 (TDH3) 의 프로모터 및 종결자를 사용하였다.

하면 발효 효모 BH225 를 상기 언급한 방법에 따라 제조된 과발현 벡터로 형질전환시켰다. 일본 특허 공개 공보 제 07/303,475 호에 언급된 방법으로 형질전환을 수행하였고, 50 ㎎/ℓ 의 노우어세오트리신을 함유한 YPD 플레이트 배지 상에서 선별하였다.

상기 과발현의 확인은 RT-PCR 로 하였다. RNeasy

미니 키트 (Qiagen) 를 사용하고 상기 키트에 첨부된 "효모로부터의 전체 RNA 분리"의 설명서에 따라 전체 RNA 를 추출하였다. ScSSU1-특이적 프라이머로는 ScSSU1_for331 (서열번호: 23)/ScSSUI_982rv (서열번호: 24) 를 사용하고; 비-ScSSU1-특이적 프라이머로는 비-ScSSU1_for329 (서열번호: 25)/비-ScSSU1_981rv (서열번호: 26) 를 사용하고; 내부 표준으로 사용되는 항시 발현되는 유전자 PDA1 에 대하여 특이적인 프라이머로는 PDA1_for1 (서열번호: 27)/PDA1_730rv (서열번호: 28) 을 사용하였다. 1.2% 아가로오스 전기영동으로 PCR 생성물을 분별하고, 에티디움 브로마이드 (ethidium bromide) 용액으로 염색한 후, 형질전환체의 각 SSU1 유전자의 신호 값을 PDA 1 의 신호 값을 이용하여 표준화하고, 모 균주의 값과 비교하였다. 상기와 같이 확인된 과발현 균주들을 ScSSU1 과발현 균주 및 비-ScSSU1 과발현 균주로 명명하였다.

(실시예 13) 발효 테스트에서 아황산염 생산의 정량 분석

하기 조건하에서 모 균주 및 실시예 12 에서 수득한 SSU1 과발현 균주를 사용하여 발효 테스트를 실시하였다.

최초 추출물 : 12.83%

발효 규모: 2 리터

용존 산소 농도: 약 9 ppm

발효 온도: 12 ℃

피칭률: 맥아즙 2ℓ 당 습윤 효모 세포 10 g

실시예 11 에서와 같이, 맥아즙을 주기적으로 표본 채취하여, 세포 증식 (OD600) (도 8-(a)), 외견상의 추출물 (도 8-(b)) 및 아황산염 농도 (도 8-(c)) 를 모니터링하였다. 아황산염 생성에 있어서, 이는, 모 균주 (발효 종료지점에서 12 ppm) 와 비교할 때 Sc SSU1 과발현 균주 (동일 단계에서 19 ppm) 에서는 단지 약간 더 높은 반면, 비-Sc SSU1 과발현 균주는 상당한 증가를 나타내었다(동일 단계에서 45 ppm). 그렇지만, 모 균주와 과발현 균주들 간에 증식률 및 추출물-소비율에서는 차이가 없었다.

상기 결과로부터, 본 발명에 나타난 하면 발효 효모에 특이적인 아황산염-배출 펌프를 암호화하는 유전자의 과발현에 의하여 발효 공정 및 발효 기간을 변화시키지 않고 맥주 중의 아황산염 농도를 증가시키는 것이 가능하다. 그 결과, 이제 향 안정성이 뛰어나고 품질 보전 기간이 늘어난 알콜성 음료의 제조가 가능하다.

(실시예 14) 균주 34/70 의 MET14 유전자의 클로닝

실시예 6 에서 수득한 비교 데이터베이스로부터 비-Sc MET14 유전자의 DNA 서열을 검색하였다. 약 1.9 kb (전장) 의 비-Sc MET14 유전자를 포함한 샷건 클론 SSS 134_021 을 수득하였는데; 에스. 세레비지애에 대한 이의 정방향 및 역방향 DNA 서열 상동성은 각각 79.0% 및 56.0% 이었다.

샷건 라이브러리로부터 샷건 클론 134_021 을 선별하고, PCR 로 상기 전장 비-Sc MET14 유전자를 수득하였다. 프라이머 쌍으로서, SacI-비Sc-MET14_for-21 (서열번호: 29) 및 BamHI-비Sc-MET14_rv618 (서열번호: 30) 의 합성 DNA 를 사용하였다(표 3). 이러한 조합의 결과로, SacI 및 BamHI 제한효소 절단부위들로 둘러싸인 비-Sc MET14 유전자 (약 0.6 kb) 를 수득하였다.

Sc MET14 유전자에 대해서, 상기 구조 유전자의 전장은 SGD 의 정보를 기초로 설계된 프라이머 쌍을 사용하고 주형으로 균주 34/70 의 게놈 DNA 를 사용하는 PCR 로 수득하였다. SacI-ScMET14_for (서열번호: 31) 및 BamHI-ScMET14_rv (서열번호: 32) 의 합성 DNA 들을 프라이머로 사용하였다. 이러한 조합의 결과로서, SacI 및 BamHI 제한효소 절단부위들로 둘러싸인 Sc MET14 유전자 (약 0.6 kb) 를 수득하였다.

상기와 같이 수득된 Sc MET14 및 비-Sc MET14 유전자들을 TA 클로닝 키트 (Invitrogen 사 제조) 를 사용하여 상기 키트에 부속된 pCR 2.1-TOPO 벡터 내로 삽입하고, 이들을 각각 TOPO/ScMET14 및 TOPO/비Sc-MET14 로 명명하였다.

결과적으로 생성된 Sc MET14 및 비-Sc MET14 유전자들의 DNA 서열들을 문헌 [Sanger, Science, volume 214, 1215 페이지 (1981)] 의 방법으로 검사하였다(도 11).

(실시예 15) Sc SSU1 과발현 균주 내의 각 MET14 유전자의 과발현

실시예 14 에 언급된 Sc MET14 또는 비-Sc MET14 를 포함한 약 0.6 kb 의 절편을 발현 벡터인 pUP3GLP (일본 특허 공개 공보 제 2000/316,559 호) 의 다중-클로닝 부위내로 삽입하여, 각 MET14 유전자가 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소프로모터 및 종결자의 제어하에 발현되는 과발현 벡터들인 pUP3Sc MET14 및 pUP3비Sc-MET14 를 구축하였다. 상면 발효 효모인 균주 KN009F 를 실시예 12 에 언급된 Sc SSU1 과발현 벡터 pNI-SSU1 로 형질전환시켜 Sc SSU1 과발현 균주인 균주 FOY227 을 제조하였다. 균주 FOY227 을 상기한 pUP3ScMET14 및 pUP3비Sc-MET14 로 형질전환시켜, Sc SSU1 와 함께 Sc MET14 및 비-Sc MET14 가 각각 과발현되는 균주 FOY306 및 균주 FOY 307 를 제조하였다.

(실시예 16) 발효 테스트에서 아황산염 생성의 정량 분석

하기 조건 하에서 실시예 15 에서 제조된 다음 균주들을 사용하여 발효 테스트를 수행하였다; Sc SSU1 과발현 균주인 균주 FOY227, 균주 FOY227 내의 Sc MET14 과발현 균주인 균주 FOY306, 균주 FOY227 내의 비-ScMET14 과발현 균주인 균주 FOY307 및 모 균주 KN009 F.

최초 추출물 :12.84 %

발효 규모 : 1.5 리터

용존 산소 농도: 약 9 ppm

발효 온도: 항상 25 ℃

피칭률: 맥아즙 1.5ℓ 당 습윤 효모 세포 7.5 g

실시예 11 에서와 같이, 맥아즙을 주기적으로 표본 채취하여, 세포 증식 (OD600), 외견상의 추출물 및 아황산염 농도를 모니터링하였다. 효모 증식 및 추출물 소비량에 있어서, 상기 균주들 간에 차이가 없었다. 그러나, 아황산염 생성에 있어서는, 모 균주 KN009F (발효 종료 시점에서 0.32 ppm) 와 비교할 때, Sc SSU1 과발현 균주 FOY227 (동일 단계에서 3.4 ppm), 및 Sc MET14 및 Sc SSU1 과발현 균주 FOY306 (동일 단계에서 6.4 ppm) 에서 단지 약간 더 높은 반면, 비-Sc MET14 및 Sc SSU1 과발현 균주 FOY307 는 도 9 에 나타난 바와 같이 상당한 증가 (동일 단계에서 16.6 ppm) 를 보였다.

상기 결과들로부터, 본 발명에 나타난 하면 발효 효모에 특이적인 아데닐릴 술페이트 키나아제를 암호화하는 유전자의 과발현이, 발효 공정 및 발효 시간을 변화시키지 않고 맥주 중의 아황산염 농도를 증가시키는데 효과적인 것으로 나타났다. 그 결과, 이제 향 안정성이 뛰어나고 품질 보전 기간이 늘어난 알콜성 음료의 제조가 가능하다.

(실시예 17) 하면 발효 효모 DNA 마이크로어레이의 제조

상기 (h) 에서 수득된 ORF 들의 DNA 서열 정보와 균주 34/70 의 전체 게놈 서열에서 유추된 ORF 들 사이에 위치한 유전자간 DNA 서열들을 기초로, 하면 발효 효모의 DNA 마이크로어레이를 제조하였다.

DNA 마이크로어레이 제조

하기 4 개 군:

(1) 34/70 균주의 전체 게놈 서열 정보로부터의 22483 개 영역들, (2) 34/70 균주 내의 Sc 형 ORF 들로 밝혀지지 않은 SGD 로부터의 403 개 에스. 세레비지애 ORF 들, (3) Genbank 에 제출된 에스. 파스토리아누스 유전자들로부터의 27 개 영역들, (4) 내부 표준으로 사용된 유전자들의 64 개 DNA 서열들

의 DNA 서열 정보를 기초로, GeneChip

(Affymetrix) 기술을 이용하여, 하면 발효 효모의 전체 게놈 서열에 대하여 유일한 PM 프로브 (Perfect Match 프로브; 25 개 염기 길이) 를 설계하였다. 정량적이고 재현성있는 정보를 수득하기 위하여, (1), (2), (3) 및 (4) 의 각 좌위 또는 영역에 대하여 11 개 프로브 및 20 개 프로브를 각각 설계하였다. 상기 검출의 감도 및 특이성을 더욱 증가시키기 위하여, 중심 위치에서의 1 개의 부정합 염기 (즉, 염기 13) 를 제외하고는 상기 PM 프로브와 동일한 서열을 가진 부정합 프로브 (MM 프로브) 를 또한 설계하였다.

설계된 PM 및 MM 프로브들을 모두 합성하고, 슬라이드 글래스 (Affymetrix 사 제조) 에 채워 GeneChip

기술을 사용하여 마이크로어레이를 제조하였다.

(1) 은 하기에 포함되어 있었다:

A) 비-Sc 형 ORF 들의 6307 개 DNA 서열들, B) Sc 형 ORF 들의 7640 개 DNA 서열들, C) 34/70 균주의 미토콘드리아 ORF 들의 28 개 DNA 서열들, D) 상기 ORF 들로는 확인되지 않았으나 NCBI-BlastX 상동성 검색을 사용할 때 에스. 세레비지애의 단백질들과 일부 유사성을 가진 553 개 DNA 서열들, E) 상기 A) 또는 B) 사이의 7955 개 유전자간 DNA 서열들.

(2) 는 하기에 포함되어 있었다:

(3) 은 하기에 포함되어 있었다:

(4) 는 하기에 포함되어 있었다:

(실시예 18) 아연 결핍 조건에서 고도로 유도성인 분자 표지자 동정.

1. mRNA 제조

균주 34/70 을 30 ℃ 의 LZMM 배지 + 40 μM 황산아연 중에서 진탕하면서 하룻밤 배양하였다. LZMM 배지는 0.17% 효모 질소 염기 w/o 아미노산 (DIFCO 사 제조), 0.5% 황산암모늄, 20 mM 시트르산나트륨 (pH 4.2), 125 μM MnCl₂, 10 μM FeCl₂, 2% 말토오스, 10 mM EDTA (pH 8.0) 을 함유한다. 세포들을 거두어 들여 멸균 증류수로 3회 세척한 후, 500 ㎖ 의 1) 아연 결핍 배지 (LZMM 배지), 2) 아연 풍부 배지 (LZMM + 40 μM 황산아연), 3) 산화적 스트레스 배지 (LZMM + 40 μM 황산아연 + 2 mM H₂0₂), 4) 탄소 기아 배지 (상기 LZMM+ 40 μM 황산아연에서 말토오스 제거) 중에 흡광도 (OD600) 가 0.25 가 되도록 접종하였다. 세포들을 30 ℃ 에서 6 시간동안 배양한 후, RNA 제조를 위해 거두어들였다.

전체 RNA 제조는 RNeasy

미니 키트 (QIAGEN 사 제조) 를 사용하여 첨부된 설명서에 따라 수행하였다. 전체 RNA 로부터 폴리 (A) + mRNA 제조는 Oligotex Direct mRNA 키트 (QIAGEN 사 제조) 를 사용하여 첨부된 설명서에 따라 수행하였다.

2. 비오틴-표지된 cRNA 의 합성

BioArray HighYield RNA Transcript Labeling Kit (Affymetrix 사 제조) 를 사용하여 첨부된 설명서에 따라 비오틴-표지된 cRNA 의 합성을 수행하였다.

3. 혼성화반응

5 ㎍ 의 비오틴-표지된 cRNA, 1.7 ㎕ 의 3 nM 의 대조군 올리고뉴클레오티드 B2 (Affymetrix 사 제조), 5 ㎕ 의 20X 진핵세포 혼성화 대조군 (Affymetrix 사 제조), 1 ㎕ 의 10 ㎎/㎖ 청어 정액 DNA (Affymetrix 사 제조), 1 ㎕ 의 50 ㎎/㎖ 아세틸화 BSA (Affymetrix 사 제조), 50 ㎕ 의 2X 혼성화 완충액 (Affymetrix 사 제조), 및 최종 부피가 100 ㎕ 이 되게 하는 물 (Affymetrix 사 제조) 을 혼합하고 Affymetrix 사의 기술 설명서에 따라 상기 DNA 마이크로어레이에 혼성화하였다. 혼성화 16 시간 후, 혼성화 혼합물을 제거하고, DNA 마이크로어레이를 GeneChip

Fludics Station (Affymetrix 사 제조) 등을 사용하여 세척한 후, Affymetrix 사의 기술 설명서에 따라 스트렙타비딘 피코에리트린 (300 ㎕ 의 2X MES 염색 완충액 (Affymetrix 사 제조), 24 ㎕ 의 50 ㎎/㎖ 아세틸화 BSA (Affymetrix 사 제조), 6 ㎕ 의 1 ㎎/㎖ 스트렙타비딘-피코에리트린 (Affymetrix 사 제조), 270 ㎕ 의 물 (Affymetrix 사 제조)) 으로 염색하였다.

4. 데이터 분석

유전자 칩 분석 베이직 시스템 및 분석 소프트웨어 (GCOS; GeneChip Operating Software 1.0) 를 사용하여 Affymetrix 사의 기술 설명서에 따라 상기 마이크로어레이의 신호 강도에 대한 검출을 수행하였다. GCOS 내의 All Probe Sets 를 이용하여 표준화를 수행하여 비교 분석에서의 신호를 조절하였다. GCOS 를 이용하여, (1) 아연 결핍 조건 대 아연 풍부 조건,(2) 산화적 스트레스 조건 대 아연 풍부 조건 및 (3) 탄소 기아 조건 대 아연 풍부 조건이 비교된 유전자 발현의 비교 파일들을 각각 생성하였다. 발현이 상기 비교 (1) 에서만 신호 로그 비에서 0.3 초과 증가한 유전자들을 표 4 에 나타내었다.

Sc-1159-1_at, Sc-1161-1_at, Sc-5030-1_at, Sc-2123-1_at 은 각각 Sc YGL258W, Sc YGL256W, Sc YOL154W, Sc YKL175W 에 해당한다. 그리고, 이들 유전자들이 아연 결핍 상태에서 전사적으로 유도된다는 것이 공지되어 있다 (Higgins, V.J. 등, Appl. Environ. Microbiol., 69:7535-7540 (2003)). 비-Sc YKL175W 에 대응시키기 위해 Lg-4216-1_s_at 을 설계하였는데, 이의 기능은 아연 이온 수송인자 활성으로 지정되었다. 아연 이온 수송인자는 아연 결핍 조건에서 전사적으로 유도되는 것으로 알려져 있다.

결론적으로, 하면 발효 효모 DNA 마이크로어레이를 사용하여 아연 결핍 조건에서 고도로 유도되는 분자 표지자들을 동정할 수 있는 것으로 나타난다.

신호 로그 비 (2ⁿ) 는, 두 어레이들을 비교할 때 전사산물의 크기 및 방향을 나타낸다. 검출은, GCOS 에서 기본 매개변수를 가진 검출 알고리즘으로 계산된 검출 p-값에 기초하여 전사산물이 신뢰할 만하게 검출되는지 (P; 존재) 또는 검출되지 않는지 (A; 부재) 를 가리킨다. 변화는, GCOS 에서 기본 매개변수를 가진 변화 알고리즘으로 계산된 변화 p-값에 기초하여 전사산물이 신뢰할 만하게 증가하였는지 (I; 증가) 또는 감소하였는지 (D; 감소) 를 나타낸다. 유전자 명은 대응하는 프로브 세트가 어디에서 설계되었는지를 나타낸다. 종류는, 유전자가 Sc ORF (Sc) 인지 비-Sc ORF (비-Sc) 인지를 나타낸다.

(실시예 19) 맥주 발효 조건하에서의 양조 효모의 유전자 발현 분석

하기 조건하에서, 균주 34/70 을 사용한 발효 테스트를 수행하였다.

최초 추출물: 12.84%

발효 규모: 2 리터

용존 산소 농도: 약 9 ppm

발효 온도: 15 ℃

피칭률: 맥아즙 2ℓ 당 습윤 효모 세포 10 g

맥아즙을 주기적으로 표본 채취하여, 세포 증식 (OD600) (도 12-(a)) 및 외견상의 추출물 (도 12-(b)) 를 모니터링하였다. 실시예 18 에 기재된 바와 같이, 접종 후 42 시간된 발효 튜브에서 회수된 세포들에서 mRNA 를 추출하고, 비오틴-표지한 후, 상기 하면 발효 효모 DNA 마이크로어레이에 혼성화반응시켰다. Affymetrix 사 제조의 유전자 칩 분석 베이직 시스템 및 분석 소프트웨어 (GCOS; GeneChip Operating Software 1.0) 를 사용하여 신호 강도 검출을 수행하였다.

Sc 형 프로브 세트 및 비-Sc 형 프로브 세트들이 완전히 상이한 신호 강도를 나타낸 유전자들이 수 개 이상 있었다. 맥주 발효 동안의 아황산염 생성에 관련된 SSU1 유전자 및 MET14 유전자의 예들이 표 5 에 나와 있다. 균주34/70 의 SSU1 유전자 및 MET14 유전자의 경우, 비-Sc 형의 발현이 Sc 형의 발현보다 각각 3.4 배 및 7 배 더 높았다.

이 차이가 각 프로프 세트의 혼성화 효율의 차이 또는 Sc 형 및 비-Sc 형 프로브 세트들 간의 이종 결합에 기인한 것이 아님을 확인하기 위하여, 균주 34/70, 실험용 균주 (에스. 세레비지애) S288C 및 에스. 카를스베르겐시스 균주 IFO11023 을 사용하여 하면 발효 효모 DNA 마이크로어레이와의 비교 게놈 혼성화를 수행하였다. 앞서 기술된 방법을 이용하여 게놈 DNA 의 제조, DNA 마이크로어레이로의 혼성화반응 및 신호 강도의 검출을 수행하였다. 표 6 에 나타난 바와 같이, 균주 34/70 에서 Sc 형의 신호 강도에 대한 비-Sc 형의 신호 강도의 비는 SSU1 유전자들에 대하여는 1.0 이었고, MET14 유전자에 대하여는 1.3 이었다. 이 결과는, Sc 및 비-Sc 프로브 세트들의 혼성화 효율이 거의 동일하였다는 것을 보여준다.

나아가, 비-Sc 형 유전자를 가지지 않은 균주 S288C 는 비-Sc 형 프로브 세트들에 대하여 매우 낮은 신호 강도들을 나타내었고, Sc 형 SSU1 유전자 및 Sc 형 MET14 를 가지지 않은 균주 IFO11023 은 Sc 형 SSU1 및 Sc 형 MET14 프로브 세트들에 대하여 매우 낮은 신호 강도들을 나타내었다. 이들 결과는, Sc 및 비-Sc 형 프로브 세트들 사이에 이종 결합이 일어나지 않았음을 명백히 보여준다.

상기 결과들로부터, 균주 34/70 에서, 비-Sc SSU1 및 비-Sc MET14 의 발현이 각각 Sc SSU1 및 Sc MET14 의 발현보다 상당히 더 높았다. 이들 유전자들은 하면 발효 효모의 높은 아황산염 생성 능력에 기여하는 후보들인 것으로 여겨진다.

결론적으로, 하면 발효 효모 DNA 마이크로어레이를 사용한 양조 효모 균주들의 유전자 발현 분석이 기능 분석을 위한 유전자(들) 선별에 유용하다는 것이 증명되었다.

유전자	Sc SSU1	비 Sc SSU1	Sc MET14	비 Sc MET14
프로브 세트	Sc-3594-1_at	Lg-3333-1_at	Sc-2246-1_at	Lg-1564-1_at
신호 강도	145.2	490.4	177.3	1245.8

(실시예 20) 하면 발효 효모 DNA 마이크로어레이와의 비교 게놈 혼성화에 의한 양조 균주들의 분류.

(실시예 8) 에 기술된 바와 같이 효모 게놈 DNA 제조 및 DNA 마이크로어레이에의 혼성화를 수행하였다. Affymetrix 사 제조의 유전자 칩 분석 베이직 시스템 및 분석 소프트웨어 (GCOS; GeneChip Operating Software 1.0) 를 사용하여 마이크로어레이의 신호 강도 검출을 수행하였다. 표 7 에 나타난 바와 같이 양조 효모의 DNA 가 혼성화한 프로브들의 백분율을 계산하고, 균주 34/70 과 시험 균주 간의 상동성을 평가하였다. 균주들인 BH225, BH232 및 BH235 는 상기 하면 발효 효모 DNA 마이크로어레이의 Sc 형 및 비-Sc 형 프로브 둘 모두의 99% 초과에 혼성화하였다. 이는, 이들 균주들이 균주 34/70 과 매우 유사하며, 상기 마이크로어레이가 이들 균주들의 유전자 발현 분석에 유용함을 시사한다. 한편, 균주 BH212 는 비교적 낮은 (Sc 형 및 비-Sc 형 프로브에 대하여 각각 97.8 및 97.7%) 혼성화 백분율을 보였는데, 이는 상기 균주가 균주 34/70 과 조금 상이하다는 것을 의미한다. 상기 결과들로부터 라거 양조 균주들 간의 관계를 평가할 수 있고, 라거 양조 균주들의 분류를 수행할 수 있다.

균주 BH212 의 분석 결과로부터, 매우 낮은 신호 강도를 나타내는 일부 좌위들이 발견되었다. 이들이 균주 BH212 에서 소실되었을 수 있고, 또는 이들의 서열이 균주 34/70 의 서열들과는 상이한 것일 수 있다. 반대로, 높은 신호 강도를 보이는 일부 좌위들도 발견되었다. 이들은 균주 BH212 에서 복제수가 높은 것일 수 있다. 이러한 좌위들을 기능 분석을 위해 선별할 수 있는데, 이는 이들이 균주 BH212 와 균주 34/70 간의 발효 특성의 차이에 기여하는 것일 수 있기 때문이다.

혼성화된 프로브들의 백분율
균주 번호	34/70	BH225	BH232	BH235	BH212
Sc 형	99.6	99.8	99.8	99.8	97.8
비-Sc 형	99.5	99.9	99.9	99.6	97.7

(실시예 21) 뉴클레오티드 다형성 검출

또한, 비교 게놈 혼성화반응을 분석하여 (단일) 뉴클레오티드 다형성을 검출할 수 있다. 각 프로브에 대한 올리고뉴클레오티드들의 세트들은 균주 34/70 의 서열과 동일한 완전 매치 올리고뉴클레오티드 (PM) 와, 상기 올리고뉴클레오티드의 중심 위치 내에 단일한 염기 부정합을 포함하고 있는 부정합 올리고뉴클레오티드(MM) 로 이루어져 있다. 실험용 균주 S288C 의 게놈 DNA 를 상기 하면 발효 효모 DNA 마이크로어레이에 혼성화시켰다. 표 8 에 나타난 바와 같이, PM 에서보다 MM 에서 더 높은 (5 배 초과) 신호를 나타내는 프로브들은 단일 뉴클레오티드 다형성을 가졌다.

산업용 효모 또는, 특히, 맥주 등의 알콜성 음료의 제조에 사용되는 양조 효모의 전체 게놈 서열의 데이터를 수집한 데이터베이스를 작성한다. 이러한 데이터베이스를 사용하여, 양조 효모의 유전자들을 선별하고, 효모 세포 내에서의 파괴 또는 과발현으로 유전자들의 기능을 분석하고, 원하는 양조 특성에 관여하는 유전자들을 찾는다. 나아가, 상기 유전자들의 발현을 조절하여 효모 균주를 육종하고, 및 생산성 및 품질이 향상된 알콜 또는 알콜성 음료, 예컨대 상기 제품에서 항산화 활성을 나타내는 아황산염의 농도가 높고 향 안정성이 우수하며 품질 보전 기간이 늘어난 알콜성 음료를 제조하는 것이 가능하다.

산업용 효모 또는, 특히, 양조 효모의 전체 게놈 서열들의 데이터를 수집한 데이터베이스를 기초로, DNA 어레이를 제조한다. 상기 DNA 어레이를 사용하여, 유전자들의 기능을 분석하고, 산업용 효모들을 분류하고, 뉴클레오티드 다형성 등을 검출하는 것이 가능하다.

<110> Suntory Limited <120> Screening method for genes of brewing yeast <130> S07F1263 <160> 32 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1377 <212> DNA <213> Saccharomyces sp. <400> 1 atggtcgcta gttggatgct cactgccaca agggatttca accctttcat gtttgtcatg 60 gttatggggg tcggtatttc atcgaatatt ctgtacagct tcccgtatcc ggcgaggtgg 120 ctgaggatat gctcgtacat catgtttgcc attacatgtt tgattttcat ctctgtacag 180 gcgctgcagc ttttgcacat ggtcatctat atcaaagaaa aaagctttag agattacttc 240 aatgaatatt tcagaagtct gaagtacaat ttattttggg gtacttatcc catgggatta 300 gtaacaatca taaatttttt gggggcgctg tcacaaaaat ttaccacgac aagccctgcg 360 aatgccaagc acttgatcat ttttgtttac gtcctgtggt ggtatgacct cgcggtttgt 420 ttagtaaccg cttgggggat ttcattcctc atctggcaaa agtactactt cgtggacggg 480 gttggaaatc actcttcata cagttcacga atggcttccg accacatgaa aagcgtactg 540 ttgctagata tcattccgct ggtcgttgtc gcttcgagcg gtgggacatt tacaatgtca 600 aaaatattcg gtaccacttt tgataggaat attcaattgc taacactggt catctgtgcc 660 ctggtttggc tacacgctct tatatttgtc tttattctga ttacaatata cttctggaat 720 ctttacatca ataagatacc accaatgacg caggtattta cgttgttctt ggtattgggg 780 ccattgggcc aaggaagttt tggtattttg ttgcttactg acaatataag aaagtatgta 840 gaaaaatact acccaaggga aaacatcacc atggaacaag aaatactaac cattatggtt 900 ccgtggtgtt tcaaggttct gggcatgaca tttgctttgg cattaatcgc tatgggttac 960 ttctttacgg taatttccct tatttcgatt ttatcatact acaatgaaag agttgttgac 1020 aatgaaacag gcaaagtgaa aaggatctac actttccata aaggtttctg ggggatgact 1080 ttcccgatgg gtaccatgtc tttgggaaac gaggagctgt atctgcaata caaccagtat 1140 gttcccttat atgcattcag agtcatagct accatatatg gtggtatttg tgtttgctgg 1200 tcaatcttat gcctctcgtg cacgttgtat ggttacctga aaacgattct ccatgctgcc 1260 cgtaaacctt cgtttttatc agaggaaggg acggagaaga ctgtcaattc tcctttcaac 1320 agcatcgaaa gtgtggagga atcaaactcg gctatcgata gtacatattt aacataa 1377 <210> 2 <211> 609 <212> DNA <213> Saccharomyces sp. <400> 2 atggctacta atatcacttg gcatccaaat cttacctacg acgaacgtaa ggaattaaga 60 aagcaagacg gctgtaccgt ttggttgacc ggtctaagtg cgtcaggaaa aagtacaata 120 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80 Asn Glu Tyr Phe Arg Ser Leu Lys Tyr Asn Leu Phe Trp Gly Thr Tyr 85 90 95 Pro Met Gly Leu Val Thr Ile Ile Asn Phe Leu Gly Ala Leu Ser Gln 100 105 110 Lys Phe Thr Thr Thr Ser Pro Ala Asn Ala Lys His Leu Ile Ile Phe 115 120 125 Val Tyr Val Leu Trp Trp Tyr Asp Leu Ala Val Cys Leu Val Thr Ala 130 135 140 Trp Gly Ile Ser Phe Leu Ile Trp Gln Lys Tyr Tyr Phe Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Gly Asn His Ser Ser Tyr Ser Ser Arg Met Ala Ser Asp His Met 165 170 175 Lys Ser Val Leu Leu Leu Asp Ile Ile Pro Leu Val Val Val Ala Ser 180 185 190 Ser Gly Gly Thr Phe Thr Met Ser Lys Ile Phe Gly Thr Thr Phe Asp 195 200 205 Arg Asn Ile Gln Leu Leu Thr Leu Val Ile Cys Ala Leu Val Trp Leu 210 215 220 His Ala Leu Ile Phe Val Phe Ile Leu Ile Thr Ile Tyr Phe Trp Asn 225 230 235 240 Leu Tyr Ile Asn Lys Ile Pro Pro Met Thr Gln Val Phe Thr Leu Phe 245 250 255 Leu Val Leu Gly Pro Leu Gly Gln Gly Ser Phe Gly Ile Leu Leu Leu 260 265 270 Thr Asp Asn Ile Arg Lys Tyr Val Glu Lys Tyr Tyr Pro Arg Glu Asn 275 280 285 Ile Thr Met Glu Gln Glu Ile Leu Thr Ile Met Val Pro Trp Cys Phe 290 295 300 Lys Val Leu Gly Met Thr Phe Ala Leu Ala Leu Ile Ala Met Gly Tyr 305 310 315 320 Phe Phe Thr Val Ile Ser Leu Ile Ser Ile Leu Ser Tyr Tyr Asn Glu 325 330 335 Arg Val Val Asp Asn Glu Thr Gly Lys Val Lys Arg Ile Tyr Thr Phe 340 345 350 His Lys Gly Phe Trp Gly Met Thr Phe Pro Met Gly Thr Met Ser Leu 355 360 365 Gly Asn Glu Glu Leu Tyr Leu Gln Tyr Asn Gln Tyr Val Pro Leu Tyr 370 375 380 Ala Phe Arg Val Ile Ala Thr Ile Tyr Gly Gly Ile Cys Val Cys Trp 385 390 395 400 Ser Ile Leu Cys Leu Ser Cys Thr Leu Tyr Gly Tyr Leu Lys Thr Ile 405 410 415 Leu His Ala Ala Arg Lys Pro Ser Phe Leu Ser Glu Glu Gly Thr Glu 420 425 430 Lys Thr Val Asn Ser Pro Phe Asn Ser Ile Glu Ser Val Glu Glu Ser 435 440 445 Asn Ser Ala Ile Asp Ser Thr Tyr Leu Thr 450 455 <210> 4 <211> 202 <212> PRT <213> Saccharomyces sp. <400> 4 Met Ala Thr Asn Ile Thr Trp His Pro Asn Leu Thr Tyr Asp Glu Arg 1 5 10 15 Lys Glu Leu Arg Lys Gln Asp Gly Cys Thr Val Trp Leu Thr Gly Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Gly Lys Ser Thr Ile Ala Cys Ala Leu Glu Gln Leu Leu 35 40 45 Leu Gln Lys Asn Leu Ser Ala Tyr Arg Leu Asp Gly Asp Asn Ile Arg 50 55 60 Phe Gly Leu Asn Lys Asp Leu Gly Phe Ser Glu Lys Asp Arg Asn Glu 65 70 75 80 Asn Ile Arg Arg Ile Ser Glu Val Ser Lys Leu Phe Ala Asp Ser Cys 85 90 95 Ala Val Ser Ile Thr Ser Phe Ile Ser Pro Tyr Arg Val Asp Arg Asp 100 105 110 Arg Ala Arg Asp Leu His Lys Glu Ala Gly Leu Lys Phe Ile Glu Ile 115 120 125 Phe Val Asp Val Pro Leu Glu Val Ala Glu Gln Arg Asp Pro Lys Gly 130 135 140 Leu Tyr Lys Lys Ala Arg Glu Gly Val Ile Lys Glu Phe Thr Gly Ile 145 150 155 160 Ser Ala Pro Tyr Glu Ala Pro Lys Ala Pro Glu Leu His Leu Arg Thr 165 170 175 Asp Gln Lys Thr Val Glu Glu Cys Ala Ala Ile Ile Tyr Glu Tyr Leu 180 185 190 Val Asn Glu Lys Ile Ile Arg Lys His Leu 195 200 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13_for <400> 5 agtcacgacg ttgta 15 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13_rv <400> 6 caggaaacag ctatgac 17 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SS-cosF.1 <400> 7 aggcgtatca cgaggccctt tc 22 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SS-cosR.1 <400> 8 cttatcgatg ataagcggtc aaacatgag 29 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XVI-1(L)cer-95894 <400> 9 cgcaagctcc gtacgttcaa cattcttatg aacggc 36 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XVI-1(R)nonSc-106302rv <400> 10 gcatcatcgt cgtgatcctt ctttggcaaa tgcagg 36 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XVI-2(L)cer-859737 <400> 11 gcgggtattt tgatggtaaa tctacaagcc ctcggc 36 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XVI-2(R)nonSc-864595rv <400> 12 cccagacaca gtttccagta tcatcctcgc agaac 35 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SacI-nonScSSU1_for1 <400> 13 gagctcatgg tcgctagttg gatgct 26 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BglII-nonScSSU1_rv1460 <400> 14 agatctcagc ttcagcccaa tccatt 26 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SacI-ScSSU1_for1 <400> 15 gagctcatgg ttgccaattg ggtact 26 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BglII-ScSSU1_rv1406 <400> 16 agatctctcc tacatgaaat gcttgc 26 <210> 17 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nonScSSU1_for <400> 17 atggtcgcta gttggatgct cactgccaca agggatttca accctttcat atcgaatatt 60 ctgtacagct gtttgtcatg gttatggggg tcggtatttc ccttgacagt cttgacgtgc 120 120 <210> 18 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nonScSSU1_rv <400> 18 tgttaaatat gtactatcga tagccgagtt tgattcctcc acactttcga acagtcttct 60 ccgtcccttc ctctgataaa tgctgttgaa aggagaattg cgcacttaac ttcgcatctg 120 120 <210> 19 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ScSSU1_for <400> 19 atggttgcca attgggtact tgctcttacg aggcagtttg accccttcat gtttatgatg 60 gtcatgggtg tcggcatttc atcgaatatt ctatatagct ccttgacagt cttgacgtgc 120 120 <210> 20 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ScSSU1_rv <400> 20 ttatgctaaa cgcgtaaaat ctagagccga gtttgattct tccacgcttt caatgctgtt 60 atacggagaa actgtcgtct tttccgtacc tgactctgaa cgcacttaac ttcgcatctg 120 120 <210> 21 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nonScSSU1_for+pGAPAUR <400> 21 atggtcgcta gttggatgct cactgccaca agggatttca accctttcat gtttgtcatg 60 gttatggggg tcggtatttc atcgaatatt ctgtacagct ccggagctta ccagttctca 120 120 <210> 22 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nonScSSU1_rv+AUR1-C <400> 22 tgttaaatat gtactatcga tagccgagtt tgattcctcc acactttcga tgctgttgaa 60 aggagaattg acagtcttct ccgtcccttc ctctgataaa tcgactctag aggatccaga 120 120 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ScSSU1_for331 <400> 23 tcgaaagcga acacgacgaa 20 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ScSSU1_982rv <400> 24 cgacagaaat cacggtgaaa a 21 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nonScSSU1_329 <400> 25 tgtcacaaaa atttaccacg ac 22 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nonScSSU1_981rv <400> 26 aagggaaatt accgtaaaga ag 22 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDA1_for1 <400> 27 atgtttgtcg cacctgtatc t 21 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDA1_730rv <400> 28 gattagaggc accatcac 18 <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SacI-nonSc-MET14_for-21 <400> 29 ctcgagctct cgtgaaattc attgaaacaa atg 33 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BamHI-nonSc-MET14_rv618 <400> 30 ggatccttat aagatttata gatgcttccg 30 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SacI-ScMET14_for <400> 31 ctcgagctca gaaaagttgg aattatttct cca 33 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BamHI-ScMET14_rv <400> 32 ggatccaatg tacagtaatc ggtcaaatta 30

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13. 서열번호: 3 의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 DNA.
14. 제 13 항에 따른 DNA 를 포함하는 재조합 벡터.
15. 제 14 항에 있어서, 프로모터, 종결자, 또는 프로모터 및 종결자가 상기 DNA 에 인접하여 위치해 있는 재조합 벡터.
16. 제 15 항에 있어서, 프로모터가 항상 발현(Constitutive expression)을 나타내는 프로모터인 재조합 벡터.
17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 프로모터가 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 유전자의 프로모터인 재조합 벡터.
18. 제 13 항에 따른 DNA 또는 제 14 항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체.
19. 제 18 항에 있어서, 형질전환체가 사카로마이세스 속 (genus) 효모에 속하는 형질전환체.
20. 제 13 항에 따른 DNA 로 암호화된 폴리펩티드.
21. 서열번호: 3 의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드.
22. 제 18 항에 따른 형질전환체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 알콜 또는 알콜성 음료의 제조 방법.
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