KR20080021593A

KR20080021593A - 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20080021593A
Application number: KR1020077026195A
Authority: KR
Inventors: 요시히로 나카오; 유키코 고다마; 도모코 시모나가
Original assignee: 산또리 가부시키가이샤
Priority date: 2006-03-01
Filing date: 2007-02-21
Publication date: 2008-03-07
Also published as: JP4478718B2; CN101255430A; EP1879915B1; CA2606130A1; US20090029002A1; DK1879915T3; JP2008530976A; CN101255430B; CN102643834A; CN102643834B; EP1879915A1; AU2007223596B2; AU2007223596A1; WO2007102351A1

Abstract

본 발명은 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자 및 그의 용도, 특히, 우수한 내건조성 및/또는 내 저온 저장성을 가진 실용적 용도를 위한 효모, 상기 효모를 사용해 제조된 알콜 음료, 및 상기 음료의 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은, 양조 효모 내 글리코겐 합성 개시제인 Glg1p 또는 Glg2p 를 암호화하는 GLG1 또는 GLG2 유전자, 특히 라거 양조 효모에 특이적인 비-ScGLG1 유전자 또는 비-ScGLG2 유전자의 발현 수준을 증폭시킴으로써 내건조성 및/또는 내 저온 저장성이 향상된 효모, 및 상기 효모를 사용한 알콜 음료 제조 방법 등에 관한 것이다.

글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자

Description

글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자 및 그의 용도 {GENE ENCODING GLYCOGEN SYNTHESIS INITIATOR AND USE THEREOF}

본 발명은 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자 및 그의 용도, 특히 우수한 내건조성 및/또는 내 저온 저장성을 가진 실용적인 효모, 상기 효모를 사용해 제조한 알콜 음료, 및 상기 음료의 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 양조 효모 내 글리코겐 합성 개시제인 Glg1p 또는 Glg2p 를 암호화하는 GLG1 또는 GLG2 유전자, 특히 라거 양조 효모에 특이적인 비-ScGLG1 유전자 또는 비-ScGLG2 유전자의 발현 수준을 증폭시킴으로써 내건조성 및/또는 내 저온 저장성이 향상되는 효모, 및 상기 효모를 사용해 알콜 음료를 제조하는 방법 등에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 효모는 제빵 효모로서, 또는 뿐만 아니라 산업적 효모로서 유용하다.

맥주 양조는 발효 후에 효모를 회수하고, 회수된 효모를 "렌조 (Renjo)" 라고 하는 후속 발효에서 사용하는 방법을 특징으로 한다. 상기 효모는 온도가 대략 0 내지 3℃ 인 탱크에서 에탄올의 존재 하에 저장된다. 저장 동안에 효모가 죽는 경우, 다음 단계의 발효 과정이 방해받을 뿐만 아니라, 세포 파쇄에 의해 방출된 효모 세포의 구성분이 제품에 바람직하지 못한 맛을 부여할 수 있다. 따라서, 제조 과정을 디자인하는데 일부 변형을 할 수 있고, 우수한 내 저온 저장성을 가진 효모를 사용해 품질 제품을 안정하게 제조하는 것이 매우 중요하다.

"렌조" 는 특정 횟수의 발효가 수행될 때 종료될 수 있다. "렌조" 의 횟수는 과정에 사용되는 효모의 특성 또는 발효 조건에 따라 다양할 수 있다. 발효용 효모를 신선하게 발달시키는 방법을 증식 (propagation) 이라고 한다. 증식 과정 동안에 연속해서 배양물 규모를 늘리기 위해 효모를 여러 번 계대배양한다. 증식 과정에는 수 일 내지 수 주가 필요하기 때문에, 상기 과정의 기간을 단축시키기거나 또는 대규모 예비-배양한 효모 세포를 저온에서 또는 건조한 조건 하에 연장된 시간 동안 안정하게 저장할 수 있다면, 증식은 제조 효율에 있어서 큰 이점을 가져온다.

높은 생존 세포비를 유지하는 건조 효모를 제조하는 방법에 관해서, 건조 장비의 개선, 또는 온도와 같은 제조 조건의 향상 또는 에멀젼화제의 첨가 등이 이루어졌다. 예를 들어, L-건조 방법은 산업적 제조 규모에 사용되기에는 실용적이지 못한데, 그 이유는 L-건조 방법이 극히 높은 생존 세포비를 유지할 수 있더라도, 동시에 많은 시간 및 비용이 들기 때문이다.

효모의 내 저온성에 관해서, 주로 제빵 효모의 내-냉장성을 향상시키도록 디자인된 일부 실험이 보고되었다. 이는, 제빵 효모인 사카로미세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae) 가 저온에서 발효할 수 있는 맥주 또는 쉐이크용 양조 효모와 비교해 불량한 저온 저장성을 갖고 있기 때문이다. 예를 들어, 내-냉장성 및 내건조성을 가진 제빵 효모는 주로, 일본 특허 출원 공개 공보 제 H11- 155559 호 및 일본 특허 출원 공개 공보 제 2003-304864 호의 스크리닝 방법에 의해 발견되었다. 추가로, 유전자 조작 기술을 활용한 예에 관해서는, 트레할라제 유전자인 NTH1 의 방해에 의한 트레할로스 고도 축적 계통이 일본 특허 출원 공개 공보 제 H10-117771 호에 보고되어 있고, 아기나제 (arginase) 유전자인 CAR1 의 방해에 의해 아르기닌과 같은 특정 아미노산을 고도로 축적하는 계통이 일본 특허 출원 공개 공보 제 2001-238665 호에 보고되어 있다.

발명의 개시

상기 상황 하에, 양조 효모의 내 건조성 및/또는 내 저온 저장성을 초래하는 단백질을 암호화하는 유전자 및 상기 단백질을 사용하여 가능한 한 알콜 음료 또는 유용한 물질을 고-효율로 제조할 필요가 있다.

본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위해 심도 있는 연구를 하였으며, 그 결과, 맥주 효모로부터 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자를 동정 및 단리하는데 성공하였다. 더욱이, 본 발명자들은 실제로 내건조성 및/또는 내 저온 저장성이 향상될 수 있는지 증명하기 위해 수득된 유전자가 발현된 형질전환된 효모를 제조하여, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 양조 효모의 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자, 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질, 상기 유전자의 발현이 조절된 형질전환된 효모, 상기 유전자의 발현이 조절된 효모를 사용하여 효모의 내건조성 및/또는 내 저온 저장성을 향상시키는 방법 등에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 하기 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터가 도입된 형질전환된 효모, 상기 형질전환된 효모를 사용하여 알콜 음료를 제조하는 방법 등을 제공한다.

(1) 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 :

(a) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ;

(b) SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ;

(c) 하나 이상의 아미노산이 소실, 치환, 삽입 및/또는 첨가되는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열로 이루어지고, 글리코겐 합성 개시 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ;

(d) SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열과 60% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열을 가지고, 글리코겐 합성 개시 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ;

(e) 엄격한 조건 하에, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고, 글리코겐 합성 개시 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ; 및

(f) 엄격한 조건 하에, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고, 글리코겐 합성 개시 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.

(2) 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 (1) 에 따른 폴리뉴클레오티드 :

(g) SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하거나, 또는 1 내지 10 개의 아미노산이 소실, 치환, 삽입 및/또는 첨가되는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, 상기 단백질은 글리코겐 합성 개시 활성을 가짐 ;

(h) SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 가지고 글리코겐 합성 개시 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ; 및

(i) 높은 엄격한 조건 하에, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하거나, 또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고, 글리코겐 합성 개시 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.

(3) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 (1) 에 따른 폴리뉴클레오티드.

(4) SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 (1) 에 따른 폴리뉴클레오티드.

(5) 폴리뉴클레오티드가 DNA 인, 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드.

(6) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 단백질.

(7) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터.

(7a) 하기 성분을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 상기 (7) 의 벡터 :

(x) 효모 세포에서 전사될 수 있는 프로모터 ;

(y) 센스 또는 안티센스 방향으로 프로모터에 연결된 상기 (1) 내지 (5) 에서 기술된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 폴리뉴클레오티드 ; 및

(z) 전사 종료 및 RNA 분자의 폴리아데닐화에 대해 효모에서 작용할 수 있는 신호.

(7b) 하기 성분을 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 상기 (7) 의 벡터 :

(x) 효모 세포 내에서 전사될 수 있는 프로모터 ;

(y) 프로모터에 센스 방향으로 연결되는 상기 (1) 내지 (5) 에서 기술된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 폴리뉴클레오티드 ; 및

(8) 상기 (7) 내지 (7b) 중 어느 하나에 따른 벡터가 도입된 효모.

(9) 내건조성이 증가된 상기 (8) 에 따른 효모 (실용적 용도를 위한 효모). "실용적 용도를 위한 효모" 는 양조 (양조의) 효모, 제빵 효모 또는 산업용 효모 등과 같이 실용적 가치를 가진 효모를 의미함.

(10) 내 저온 저장성이 증가된 상기 (8) 에 따른 효모.

(11) 상기 (6) 의 단백질의 발현 수준을 증가시킴으로써 내건조성이 증가된 상기 (9) 에 따른 효모.

(12) 상기 (6) 의 단백질의 발현 수준을 증가시킴으로써 내 저온 저장성이 증가된 상기 (10) 에 따른 효모.

(12a) 효모가 양조 효모인 상기 (9) 내지 (12) 중 어느 하나에 따른 효모.

(13) 상기 (8) 내지 (12a) 중 어느 하나에 따른 효모를 사용하여 알콜 음료를 제조하는 방법.

(14) 양조된 알콜 음료가 맥아 음료인 상기 (13) 에 따른 방법.

(15) 양조된 알콜 음료가 와인인 상기 (13) 에 따른 방법.

(16) 상기 (13) 내지 (15) 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 제조되는 알콜 음료.

(17) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가지고 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 바탕으로 디자인된 프라이머 또는 프로브를 사용하는 것을 포함하는, 내건조성 및/또는 내 저온 저장성에 대해 테스트 효모를 평가하는 방법.

(17a) 상기 (17) 에서 기술된 방법을 사용하여, 증가된 내건조성 및/또는 내 저온 저장성을 가진 효모를 선별하는 방법.

(17b) 상기 (17a) 에서 기술된 방법으로 선별된 효모를 사용하여 알콜 음료 (예를 들어, 맥주 또는 산업용 알콜 등) 를 제조하는 방법.

(17c) 상기 (17a) 에서 기술된 방법으로 선별된 효모를 사용하여 유용한 물질 (예를 들어, 단백질) 을 제조하는 방법.

(18) 하기를 포함하는, 내건조성 및/또는 내 저온 저장성에 대해 테스트 효모를 평가하는 방법 :

테스트 효모를 배양함 ; 및

SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가지고 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정함.

(18a) 상기 (18) 에서 기술된 방법에 의해 테스트 효모를 평가하고, 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자의 높은 발현 수준을 갖는 효모를 선별하는 것을 포함하는, 높은 내건조성 및/또는 내 저온 저장성을 가진 효모를 선별하는 방법.

(18b) 상기 (18a) 에서 기술된 방법으로 선별된 효모를 사용하여 알콜 음료 (예를 들어, 맥주) 를 제조하는 방법.

(18c) 상기 (18a) 에서 기술된 방법으로 선별된 효모를 사용하여 유용한 물질 (예를 들어, 단백질) 을 제조하는 방법.

(19) 하기를 포함하는, 효모 선별 방법 :

테스트 효모를 배양함 ;

상기 (6) 의 단백질을 정량화하거나, 또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가지고 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정함 ; 및

바람직한 내건조성 및/또는 내 저온 저장성에 따른 유전자 발현 수준 또는 단백질 양을 갖는 테스트 효모를 선별함.

(20) 하기를 포함하는, 상기 (19) 에 따른 효모 선별 방법 :

대조군 효모 및 테스트 효모를 배양함 ;

각각의 효모에 대해, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가지고 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정함 ; 및

대조군 효모보다 더 높은 유전자 발현 수준을 가진 효모를 선별함.

(21) 하기를 포함하는, 상기 (19) 에 따른 효모 선별 방법 :

대조군 효모 및 테스트 효모를 배양함 ;

각각의 효모 내 상기 (6) 에 따른 단백질을 정량화함 ; 및

대조군 효모보다 더 많은 양의 단백질을 가진 테스트 효모를 선별함.

(22) 상기 (8) 내지 (12a) 중 어느 하나에 따른 효모 또는 상기 (19) 내지 (21) 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 선별되는 효모를 사용하여 발효를 수행하는 것을 포함하는 알콜 음료 제조 방법.

본 발명의 형질전환된 효모는 건조 저장 또는 저온 저장 동안에 높은 생존 세포비를 유지할 수 있다. 따라서, 양조 등에 사용되는 경우, 효모를 보존시키는 고생이 없어질 수 있다. 추가로, 상기 효모는 품질 안정성에 기여할 것으로 예상된다. 더욱이, 건조 효모는 장기간-저장에 적합하고, 그의 감소된 중량으로 인해 분배 또는 수송에 매우 유리하다. 상기 효모는 산업용 알콜 제조 또는 유용한 단백질의 제조와 같은 산업적 적용을 위한 미생물로서도 유용하다. 본 발명의 효모는 또한, 제빵 효모 또는 산업용 효모로서 유용하다.

도 1 은 맥주 발효 테스트 시 시간에 따른 세포 성장을 보여준다. 수평축은 발효 시간을 나타내고, 한편, 수직축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.

도 2 는 맥주 발효 테스트 시 시간에 따른 추출물 (당) 소비를 나타낸다. 수평축은 발효 시간을 나타내고, 한편, 수직축은 명백한 추출물 농도 (중량/중량%) 를 나타낸다.

도 3 은 맥주 발효 테스트 시 효모 내 비-ScGLG1 유전자의 발현 프로파일을 보여준다. 수평축은 발효 시간을 나타내고, 한편, 수직축은 검출된 신호의 세기를 나타낸다.

도 4 는 모 계통 및 비-ScGLG1 고도 발현 계통의 내 건조성 테스트 결과를 보여준다.

도 5 는 모 계통 및 비-ScGLG1 고도 발현 계통의 내 저온 저장성 테스트 결과를 보여준다.

도 6 은 맥주 발효 테스트 시 시간에 따른 세포 성장을 보여준다. 수평 축은 발효 시간을 나타내고, 한편, 수직축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.

도 7 은 맥주 발효 테스트 시 시간에 따른 추출물 (당) 소비를 나타낸다. 수평축은 발효 시간을 나타내고, 한편, 수직축은 명백한 추출물 농도 (중량/중량%) 를 나타낸다.

도 8 은 맥주 발효 테스트 시 효모 내 비-ScGLG2 유전자의 발현 프로파일을 보여준다. 수평축은 발효 시간을 나타내고, 한편, 수직축은 검출된 신호의 세기를 나타낸다.

도 9 는 모 계통 및 비-ScGLG2 고도 발현 계통의 내 건조성 테스트 결과를 보여준다.

도 10 은 모 계통 및 비-ScGLG2 고도 발현 계통의 내 저온 저장성 테스트 결과를 보여준다.

발명을 수행하기 위한 최상의 형태

본 발명자들은 일본 특허 출원 공개 공보 제 2004-283169 호에서 개시된 방법에 따라 지도화된 라거 양조 효모 게놈 정보를 바탕으로 양조 효모의 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 비-ScGLG1 및 비-ScGLG2 유전자를 단리하고 동정하였다. 유전자의 뉴클레오티드 서열을 각각 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 3 으로 나타낸다. 또한, 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 아미노산 서열을 각각 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 4 로 나타낸다.

1. 본 발명의 폴리뉴클레오티드

우선, 본 발명자들은 (a) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ; 및 (b) SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 일 수 있다.

본 발명의 표적 폴리뉴클레오티드는 상기 기술된 글리코겐 합성 개시 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 제한되지 않고, 상기 단백질에 상응하는 기능을 가진 단백질을 암호화하는 다른 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상응하는 기능을 가진 단백질은 예를 들어, (c) 하나 이상의 아미노산 서열이 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가되고, 글리코겐 합성 개시 활성을 가진 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열의 단백질을 포함한다.

그러한 단백질은 예를 들어, 1 내지 100, 1 내지 90, 1 내지 80, 1 내지 70, 1 내지 60, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 39, 1 내지 38, 1 내지 37, 1 내지 36, 1 내지 35, 1 내지 34, 1 내지 33, 1 내지 32, 1 내지 31, 1 내지 30, 1 내지 29, 1 내지 28, 1 내지 27, 1 내지 26, 1 내지 25, 1 내지 24, 1 내지 23, 1 내지 22, 1 내지 21, 1 내지 20, 1 내지 19, 1 내지 18, 1 내지 17, 1 내지 16, 1 내지 15, 1 내지 14, 1 내지 13, 1 내지 12, 1 내지 11, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6 (1 내기 여러 개의 아미노산), 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1 개의 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가된 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열로 이루어지고, 글리코겐 합성 개시 활 성을 가진 단백질을 포함한다. 일반적으로, 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가의 수는 바람직하게는 더 적다. 또한, 상기 단백질은 (d) SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고, 글리코겐 합성 개시 활성을 가진 단백질을 포함한다. 일반적으로, 동일성 % 는 바람직하게는 더 높다.

글리코겐 합성 개시 활성은 [Cheng 등, Mol. Cell. Biol., 15(12), 6632-6640 (1995)] 에서 기술된 방법에 의해 효모 세포 내 글리코겐 함량을 측정함으로써 평가될 수 있다.

더욱이, 본 발명은 또한, (e) 엄격한 조건 하에, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고, 글리코겐 합성 개시 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ; 및 (f) 엄격한 조건 하에, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO: 4 의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고, 글리코겐 합성 개시 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본원에서, "엄격한 조건 하에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드" 는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드, 또는 프로브로서 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 전부 또는 일부를 사용하여 콜로니 혼성화 기술, 플라크 혼성화 기술, 서던 혼성화 기술 등에 의해 수득된, DNA 와 같은 뉴클레오티드 서열을 말한다. 혼성화 방법은 예를 들어, [MOLECULAR CLONING 3rd Ed., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons 1987-1997] 등에 기술된 방법일 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "엄격한 조건" 은 낮은 엄격한 조건, 중간 엄격한 조건, 또는 높은 엄격한 조건 중 임의일 수 있다. "낮은 엄격한 조건" 은, 예를 들어, 32℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "중간 엄격한 조건" 은 예를 들어, 42℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "높은 엄격한 조건" 은 예를 들어, 50℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. 상기 조건 하에, 더 높은 상동성을 가진 DNA 와 같은 폴리뉴클레오티드가 더 높은 온도에서 효율적으로 수득될 것으로 예상되며, 그럼에도 불구하고, 다수의 요소가 온도, 프로브 농도, 프로브 길이, 이온 세기, 시간, 염 농도 및 기타를 포함하여 혼성화 엄격성에 관여하고, 당업자는 이러한 요소를 적절하게 선택하여, 유사한 엄격성을 실현시킬 수 있다.

시판의 키트가 혼성화에 사용되는 경우, 예를 들어, Alkphos Direct Labeling Reagents (Amersham Pharmacia) 가 사용될 수 있다. 이 경우, 첨부된 프로토콜에 따르면, 표지된 프로브로 밤새 인큐베이션시킨 후, 55℃ 에서 0.1% (w/v) SDS 를 함유하는 1 차 세정 완충액으로 막을 세정하여, DNA 와 같은 혼성화된 폴리뉴클레오티드를 검출한다.

혼성화될 수 있는 기타 폴리뉴클레오티드는 디폴트 변수를 사용하는 FASTA 및 BLAST 와 같은 상동성 연구 소프트웨어에 의해 계산된 바와 같이, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 약 60% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상의 동일성을 가진 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성은 Karlin 및 Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST 를 사용해 측정될 수 있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990 ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873, 1993). BLAST 알고리즘을 바탕으로 한 BLASTN 및 BLASTX 라고 하는 프로그램을 개발하였다 (Altschul SF 등, J. Mol. Biol. 215: 403, 1990). 뉴클레오티드 서열이 BLASTN 을 사용하여 서열화되는 경우, 변수는 예를 들어, 스코어 = 100 이고, 워드 길이 = 12 이다. 아미노산 서열이 BLASTX 를 사용하여 서열화되는 경우, 변수 는 예를 들어, 스코어 = 50 이고 워드 길이 = 3 이다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램이 사용되는 경우, 각각의 프로그램에 대해 디폴트 변수가 적용된다.

2. 본 발명의 단백질

본 발명은 또한 상기 (a) 내지 (i) 의 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나에 의해 암호화되는 단백질을 제공한다. 본 발명의 바람직한 단백질은 하나 또는 다수의 아미노산이 소실, 치환, 삽입 및/또는 첨가되고 글리코겐 합성 개시 활성을 가진 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 포함한다.

그러한 단백질은 상기 언급된 번호의 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입 및/또는 첨가되고, 글리코겐 합성 개시 활성을 가진 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 가진 것을 포함한다. 또한, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열과 상기 기술된 바와 같은 상동성을 가지고, 글리코겐 합성 개시 활성을 가진 것을 포함한다.

그러한 단백질은 예를 들어, [MOLECULAR CLONING 3rd Ed., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Nuc. Acids. Res., 10: 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6409 (1982), Gene 34: 315 (1985), Nuc. Acids. Res., 13 : 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1985)] 에서 기술된 부위-특이적 돌연변이를 적용함으로써 수득될 수 있다.

본 발명의 단백질의 아미노산 서열 내 하나 이상의 아미노산 잔기의 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 동일한 아미노산 서열 내 임의의 하나 이상의 위치에서 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가되는 것을 의미한 다. 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가 중 2 가지 이상의 유형은 동시에 발생할 수 있다.

이후, 서로 치환가능한 아미노산 잔기의 예가 열거된다. 동일한 군 내의 아미노산 잔기는 서로 치환가능하다. 군은 하기 제공된다.

A 군 : 루신, 이소루신, 노르루신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, o-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌 ;

B 군 : 아스파르트산, 글루탐산, 이소아스파르트산, 이소글루탐산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산 ;

C 군 : 아스파라긴, 글루타민 ;

D 군 : 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산 ;

E 군 : 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린 ;

F 군 : 세린, 트레오닌, 호모세린 ; 및

G 군 : 페닐알라닌, 티로신.

본 발명의 단백질은 또한 Fmoc 방법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐 방법) 및 tBoc 방법 (t-부틸옥시카르보닐 방법) 과 같은 화학 합성 방법에 의해 생성될 수 있다. 또한, [Advanced ChemTech, PerkinElmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimazu Corp.] 사의 펩티드 합성화제가 또한 예를 들어, 화학 합성에 사용될 수 있다.

3. 본 발명의 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 효모

다음, 본 발명은 상기 기술된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 상기 (a) 내지 (i) 에서 기술된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 (j) 내지 (m) 에서 기술된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 일반적으로, 본 발명의 벡터는 성분으로서 (x) 효모 세포에서 전사할 수 있는 프로모터 ; (y) 센스 또는 안티센스 방향으로 프로모터에 연결된 상기 (a) 내지 (i) 중 임의에서 기술된 폴리뉴클레오티드 ; 및 (z) 전사 종료 및 RNA 분자의 폴리아데닐화에 대해 효모에서 작용하는 신호를 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 추가로, 본 발명의 단백질을 고도로 발현시키기 위해, 상기 폴리뉴클레오티드를 바람직하게는 상기 (a) 내지 (i) 중 임의에서 기술된 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 촉진시키기 위해, 프로모터에 센스 방향으로 도입한다.

효모에 도입된 벡터는 멀티카피 유형 (YEp 유형), 단일카피 유형 (YCp 유형), 또는 염색체 통합 유형 (YIp 유형) 중 임의의 유형일 수 있다. 예를 들어, YEp24 (J. R. Broach 등, EXPERIMENTAL MANIPULATION OF GENE EXPRESSION, Academic Press, New York, 83, 1983) 는 YEp 유형 벡터로서 알려져 있고, YCp50 (M. D. Rose 등, Gene 60: 237, 1987) 은 YCp 유형 벡터로서 알려져 있으며, YIp5 (K. Struhl 등, Proc. Natl. Acad Sd. USA, 76: 1035, 1979) 는 YIp 유형 벡터로서 알려져 있고, 이들 모두는 쉽게 이용가능하다.

효모 내 유전자 발현을 조정하는 프로모터/종결자는 그것들이 실용적 용도를 위한 효모에서 작용하고, 발효액 내 구성성분에 의해 영향을 받지 않는 한, 임의로 병용해서 있을 수 있다. 예를 들어, 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디하이드로게나제 유전자 (TDH3) 의 프로모터, 또는 3-포스포글리세레이트 키나아제 유전자 (PGK1) 의 프로모터가 사용될 수 있다. 이들 유전자는 이전에 클로닝되었고, 예를 들어, [M. F. Tuite 등, EMBO J, 1, 603 (1982)] 에 상세히 기술되어 있고, 공지된 방법에 의해 쉽게 이용가능하다.

영양요구성 마커가 실용적 용도를 위한 효모에 대한 형질전환 시 선택성 마커로서 사용될 수 없기 때문에, 예를 들어, 제네시틴-내성 유전자 (G418r), 구리-내성 유전자 (CUP1) (Marin 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984) 또는 세룰레닌-내성 유전자 (fas2m, PDR4) (각각 [Junji Inokoshi 등, Biochemistry, 64, 660, 1992] ; 및 [Hussain 등, Gene, 101 : 149, 1991]) 가 사용될 수 있다.

상기 기술된 바와 같이 구축된 벡터를 숙주 효모에 도입한다. 숙주 효모의 예는 양조에 사용될 수 있는 임의의 효모 (실용적 용도를 위한 효모), 예를 들어, 맥주, 와인, 및 쉐이크용 양조 효모, 제빵 효모, 산업용 알콜 제조용 효모 또는 유용한 단백질 제조용 효모 등을 포함한다. 구체적으로는, 속 (genus) 사카로미세스 (Saccharomyces) 가 사용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 사칼로미세스 파스토리아누스 (Saccharomyces pastorianus) W34/70 등, 사카로미세스 칼스베르게니스 (Saccharomyces carlsbergenis) NCYC453 또는 NCYC456 등, 또는 사카로미세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae) NBRC 1951, NBRC 1952, NBRC 1953 또는 NBRC 1954 등과 같은 라거 양조 효모가 사용될 수 있다. 또한, 사카로미세스 세레비시애 NCYC90 과 같은 위스키 효모, 일본 양조 협회 (Brewing Society of Japan) 의 와인 효모 #1, 3 및 4 와 같은 와인 효모, 및 일본 양조 협회의 쉐이크 효모 #7 및 9 와 같은 쉐이크 효모, NBRC 0555, NBRC 1346 또는 NBRC 2043 과 같은 제빵 효소가 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서, 사카로미세스 파스토리아누스와 같은 라거 양조 효모가 바람직하게 사용될 수 있다.

효모 형질전환 방법은 일반적으로 사용되는 공지된 방법일 수 있다. 예를 들어, 사용될 수 있는 방법에는 전기영동 방법 (Meth. Enzym., 194 : 182 (1990)), 스페로플라스트 방법 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 : 1929(1978)), 리튬 아세테이트 방법 (J. Bacteriology, 153 : 163 (1983)), 및 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929 (1978), METHODS IN YEAST GENETICS, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual] 에 기술된 방법이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

더욱 구체적으로는, 숙주 효모는 OD600 nm 가 1 내지 6 일 표준 효모 배양 배지 (예를 들어, YEPD 배지 (Genetic Engineering. Vol. 1, Plenum Press, New York, 117(1979)) 등) 내에서 배양된다 . 상기 배양 효모를 원심분리에 의해 수합하고, 세정하고, 약 1 내지 2 M 의 농도에서 알칼리 금속 이온, 바람직하게는 리튬 이온으로 전-처리한다. 세포를 약 30℃ 에서 약 60 분 동안 방치한 후, DNA (약 1 내지 20 μg) 가 도입되도록 약 30℃ 에서 약 추가의 60 분 동안 방치한다. 폴리에틸렌글리콜, 바람직하게는 약 4,000 달톤의 폴리에틸렌글리콜을 약 20% 내지 50% 의 최종 농도로 첨가한다. 약 30℃ 에서 약 30 분 동안 방치한 후, 세포를 약 42℃ 에서 약 5 분 동안 가열한다. 바람직하게는, 상기 세포 현탁액을 표준 효모 영양 배지로 세정하고, 예정된 양의 새로운 효모 영양 배지에 첨가하고, 약 30℃ 에서 약 60 분 동안 방치한다. 그런 후, 선택성 마커로서 항생제 등을 함유하는 표준 한천 배지에 심어서, 형질전환체를 수득한다.

다른 일반적인 클로닝 기술은 예를 들어, [MOLECULAR CLONING 3rd Ed., and METHODS IN YEAST GENEICS, A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)] 에서 찾을 수 있다.

4. 본 발명에 따른 알콜 음료의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조되는 알콜 음료

우수한 내건조성 및/또는 내 저온 저장성을 가진 효모를 상기 기술된 본 발명의 벡터를 효모에 도입함으로서 수득할 수 있다. 또한, 우수한 내건조성 및/또는 내 저온 저장성을 가진 효모를 하기 기술된 본 발명의 효모 평가 방법에 의해 효모를 선별함으로써 수득할 수 있다. 본 발명에서 수득되는 효모의 표적 용도는 예를 들어, 맥주, 와인, 위스키, 쉐이크 등과 같은 알콜 음료를 양조하고, 제빵하고, 산업용 알콜 제조 및 유용한 단백질의 제조와 같은 유용한 물질을 제조하는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

이러한 제품을 제조하기 위해서, 본 발명에 따라 수득된 실용적 용도를 위한 효모를 모 계통 대신에 사용하는 것을 제외하고는, 공지된 방법을 사용할 수 있다. 물질, 제조 장치, 제조 조건 등이 통상의 것과 정확히 동일할 수 있기 때문에, 비용 증가 없이 제조될 수 있다.

5. 본 발명의 효모 평가 방법

본 발명은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열을 갖고 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 바탕으로 디자인된 프로브 또는 프라이머를 사용해 내건조성 및/또는 내 저온 저장성에 대해 테스트 효모를 평가하는 방법에 관한 것이다. 상기 평가 방법에 대한 일반적인 기술은 알려져 있으며, 예를 들어, [WO 01/040514, 일본 공개 공보 특허 출원 제 HS-205900 호] 등에 기술되어 있다. 이러한 평가 방법은 하기에 기술된다.

첫째, 테스트 효모의 게놈을 제조한다. 이러한 제조를 위해, Hereford 방법 또는 칼륨 아세테이트 방법과 같은 임의의 공지된 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어, METHODS IN YEAST GENEICS, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 130 (1990)). 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자의 뉴클레오티드 서열 (바람직하게는, ORF 서열) 을 바탕으로 디자인된 프로브 또는 프라이머를 사용해, 상기 유전자 또는 상기 유전자에 특이적인 서열의 존재를 수득된 테스트 효모 게놈에서 측정한다. 프라이머 또는 프로브를 공지 기술에 따라 디자인할 수 있다.

유전자 또는 특정 서열의 검출을 공지된 기술을 적용해 수행할 수 있다. 예를 들어, 특정 서열 모두 또는 전부를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 하나의 프라이머로서 사용하고, 한편 상기 서열의 상부 또는 하부 서열 일부 또는 전부를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 또다른 프라이머로서 사용하여, PCR 방법에 의해 효모의 핵산을 증폭시켜서, 증폭된 생성물의 존재 및 증폭된 생성물의 분자량을 측정한다. 프라이머에 사용되는 폴리뉴클레오티드의 염기 수는 일반적으로 10 개 염기 (bp) 이상, 및 바람직하게는 15 내지 25 bp 이다. 일반적으로, 프라이머 사이의 염기의 수는 적합하게는 300 내지 2000 bp 이다.

PCR 반응 조건은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어, 변성 온도가 90 내지 95℃, 어닐링 온도가 40 내지 6O℃, 신장 온도가 60 내지 75℃ 이고, 순환 수가 10 회 이상일 수 있다. 생성 반응 생성물은 예를 들어, 아가로스 겔을 사용한 전기영동에 의해 분리되어, 증폭된 생성물의 분자량을 측정할 수 있다. 이러한 방법은 증폭된 생성물의 분자량이 특정 부분의 DNA 분자를 함유하는 크기인지에 의해 결정되어, 효모의 내건조성 및/또는 내 저온 저장성을 예견 및 추정하게 한다. 또한, 증폭된 생성물의 뉴클레오티드 서열을 분석함으로써, 특성을 더욱 정확하게 예견하고/하거나 또는 추정할 수 있다.

더욱이, 본 발명에서, 테스트 효모를 배양하여, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가진 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하고, 내건조성 및/또는 내 저온 저장성에 대해 테스트 효모를 평가한다. 테스트 효모를 배양한 다음, 유전자로부터 생성되는 mRNA 또는 단백질의 양을 정량화함으로써 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있다. mRNA 또는 단백질의 정량화는 공지된 기술을 사용해 수행할 수 있다. 예를 들어, mRNA 는 노던 혼성화 또는 정량화 RT-PCR 에 의해 정량화될 수 있고, 한편 단백질은 예를 들어, 웨스턴 블로팅에 의해 정량화될 수 있다 (CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons 1994-2003).

더욱이, 테스트 효모를 배양하고, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하여, 표적 글리코겐-생성 능력에 따라 유전자 발현 수준을 가진 테스트 효모를 선별하여, 목적하는 알콜 음료를 양조하기에 바람직한 효모를 선별할 수 있다. 또한, 대조군 효모 및 테스트 효모를 배양하여, 효모의 각각에 있는 유전자의 발현 수준을 측정 및 비교할 수 있어서, 바람직한 테스트 효모를 선별할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 예를 들어, 대조군 효모 및 하나 이상의 테스트 효모를 배양하고, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가진 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 각각의 효모에서 측정한다. 대조군 효모의 것보다 더 높게 발현되는 유전자가 있는 테스트 효모를 선별함으로써, 목적하는 알콜 음료 양조, 또는 유용한 물질의 제조에 적합한 효모를 선별할 수 있다.

대안적으로, 테스트 효모를 배양하고, 높은 글리코겐 합성 개시 활성을 가진 효모를 선별하여, 목적하는 알콜 음료의 양조 또는 유용한 물질의 제조에 적합한 효모를 선별할 수 있다.

이러한 경우, 테스트 효모 또는 대조군 효모는 예를 들어, 본 발명의 벡터가 도입된 효모, 인공적으로 돌연변이된 효모, 또는 자연적으로 돌연변이된 효모일 수 있다. 글리코겐 합성 개시 활성은 예를 들어, [Cheng 등, Mol. Cell. Biol. 15 (12), 6632-6640 (1995)] 에 기술된 방법에 의해 효모 세포 내 글리코겐 함량을 측정함으로써 평가될 수 있다. 돌연변이 처리는 예를 들어, 자외선 조사 및 방사 선 조사와 같은 물리적 방법, 및 EMS (에틸메탄 술포네이트) 및 N-메틸-N-니트로소구아니딘과 같은 약물로의 처리와 연관된 화학적 방법을 포함하여, 임의의 방법을 적용할 수 있다 (예를 들어, [Yasuji Oshima Ed., BIOCHEMISTRY EXPERIMENTS vol. 39, Yeast Molecular Genetic Experiments, pp. 67-75, JSSP] 참조).

또한, 대조군 효모 또는 테스트 효모로서 사용되는 효모의 예는 맥주, 와인, 쉐이크 등에 대한 양조 효모, 또는 제빵 효모, 산업용 알콜 제조용 효모, 또는 유용한 단백질 제조용 효모 등의 임의의 효모를 포함한다. 더욱 구체적으로는, 속 사카로미세스와 같은 효모가 사용될 수 있다 (예를 들어, S. 파스토리아누스, S. 세레비시애, 및 S. 칼스베르게니스). 본 발명에 따르면, 사카로미세스 파스토리아누스 W34/70 ; 사카로미세스 칼스베르게니스 NCYC453 또는 NCYC456 ; 또는 사카로미세스 세레비시애 NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953 또는 NBRC1954 등과 같은 라거 양조 효모가 사용될 수 있다. 추가로, 일본 양조 협회의 와인 효모 #1, 3 및 4 와 같은 와인 효모 ; 및 일본 양조 협회의 쉐이크 효모 #7 및 9 와 같은 쉐이크 효모, NBRC0555, NBRC1346 및 NBRC2043 등과 같은 제빵 효모가 또한 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서, 사카로미세스 파스토리아누스와 같은 라거 양조 효모가 바람직하게는 사용될 수 있다. 대조군 효모 및 테스트 효모는 임의로 병용해서 상기 효모로부터 선택될 수 있다.

이후, 본 발명은 작동 실시예를 참조로 더욱 상세히 기술될 것이다. 그러나, 본 발명은 하기 기술된 실시예에 제한되지 않는다.

실시예 1 : 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자 (비- ScGLG1 ) 의 클로닝

라거 양조 효모의 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자 (비-ScGLG1) (SEQ ID NO: 1) 는 일본 특허 출원 공개 공보 제 2004-283169 호에서 기술된 비교 데이타베이스를 활용한 연구 결과, 발견되었다. 획득된 뉴클레오티드 서열 정보를 바탕으로, 프라이머 비-ScGLG1_for (SEQ ID NO: 5) 및 비-ScGLG1_rv (SEQ ID NO: 6) 를 유전자의 전장을 증폭시키기 위해 디자인하였다. 게놈 서열화 계통인 사카로미세스 파스토리아누스 바이헨슈테판 (Weihenstephan) 34/70 (종종 "W34/79 계통" 이라고 줄여서 말함) 의 염색체 DNA 를 주형으로서 사용하여 PCR 을 수행하여, 비-ScGLG1 의 전장 유전자를 포함하는 DNA 절편을 수득하였다.

그렇게 해서 수득된 비-ScGLG1 유전자 절편을 TA 클로닝에 의해 pCR2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen) 에 삽입하였다. 비-ScGLG1 유전자의 뉴클레오티드 서열을 Sanger's 방법 (F. Sanger, Science, 214: 1215, 1981) 에 의해 분석하여, 뉴클레오티드 서열을 확인하였다.

실시예 2 : 맥주 발효 동안의 비- ScGLG1 유전자의 발현 분석

맥주 발효 테스트를 라거 양조 효모인 사카로미세스 파스토리아누스 W34/70 을 사용하여 수행하고, 발효 동안에 라거 양조 효모로부터 추출되는 mRNA 를 맥주효모 DNA 마이크로어레이에 의해 검출하였다.

맥아즙 추출물 농도 12.69%

맥아즙 함량 70 L

맥아즙 용존 산소 농도 8.6 ppm

발효 온도 15℃

효모 피칭률 12.8 x 10⁶ 세포/mL

발효액을 시간 경과에 따라 샘플링하고, 효모 세포 성장의 양 (도 1) 및 명확한 추출물 농도 (도 2) 에 있어서의 시간-경과 변화를 관찰하였다. 동시에, 효모 세포를 샘플링하여, mRNA 를 제조하고, 제조된 mRNA 를 비오틴으로 표지하고, 맥주 효모 DNA 마이크로어레이에 혼성화하였다. 유전자칩 조작 시스템 (GCOS; GeneChip Operating Software 1.0, Affymetrix Co 에 의해 제조됨) 을 사용해 신호를 검출하였다. 비-ScGLG1 유전자의 발현 패턴을 도 3 에 나타낸다. 상기 결과는 일반적인 맥주 발효에서 비-ScGLG1 유전자의 발현을 확인시켜 주었다.

실시예 3 : 비- ScGLG1 고도 발현 계통의 구축

실시예 1 에서 기술된 비-ScGLG1/pCR2.1-TOPO 를 제한 효소 SacI 및 NotI 로 절단하여, 단백질-암호화 영역 전장을 함유하는 DNA 절편을 제조하였다. 이 절편을 제한 효소 SacI 및 NotI 로 처리한 pYCGPYNot 에 연결하여, 비-ScGLG1 고도 발현 벡터 비-ScGLG1/pYCGPYNot 를 구축하였다. pYCGPYNot 는 YCp-유형 효모 발현 벡터이다. 삽입된 유전자를 피루베이트 키나아제 유전자 PYK1 프로모터에 의해 고도 발현시켰다. 제네티신-내성 유전자 G418^r 을 효모에 선별 마커로서 포함하고, 앰피실린-내성 유전자 Amp^r 을 대장균 (Escherichia coli) 내에 선별 마커로서 포함하였다.

상기 방법에 의해 제조한 고도 발현 벡터를 사용하여, AJL4004 계통을 일본 특허 출원 공개 공보 제 H07-303475 호에 기술된 방법에 의해 형질전환시켰다. 형질전환체를 제네티신 300 mg/L 을 함유하는 YPD 플레이트 배지 (1% 효모 추출물, 2% 폴리펩톤, 2% 글루코스 및 2% 한천) 상에서 선별하였다.

실시예 4 : 비- ScGLG1 고도 발현 계통의 내건조성의 평가

모 계통 (AJL4004 계통) 및 실시예 3 에서 기술된 방법에 의해 수득된 비-ScGLG1 고도 발현 계통의 내건조성을 하기 기술된 방법에 의해 평가하였다.

각 효모가 루프를 이룬 하나의 백금을 제네티신 100 mg/L 을 함유하는 맥아즙 10 mL 에 주입하고, 30℃ 에서 밤새 교반하였다 (예비배양). 예비배양액을 제네티신 100 mg/L 를 함유하는 맥아즙 10 mL 에 주입하여, 그의 OD660 = 0.5 로 만든 다음, 주 배양을 시작하였다. 효모의 성장이 안정기에 도달할 때까지, 배양을 2 일 동안 계속하였다. 배양의 혼탁도를 배양 완료 시에 측정한 다음, 배양액을 멸균수 중에서 현탁시켜, 그의 OD = 2 로 하였다. 그렇게 해서 수득된 현탁액 100 마이크로리터 (100 ㎕) 를 1.5 mL 마이크로튜브에서 분산시킨 다음, 감압 농축기 (DNA110 SpeedVac (등록 상표명), ThermoSavant 제조) 를 사용해 효모 세포를 1 시간 동안 증발 건조시켰다.

생존 세포비를 하기 기술된 방법에 의해 측정하였다. 상기 수득된 건조된 효모 세포를 멸균수 50 ㎕ 중에 재현탁시킨 다음, 0.02% 메틸렌 블루 용액 (pH 4.5) 50 ㎕ 를 현탁액에 첨가하였다. 환원력을 상실한 청색으로 염색된 효모 세포를 죽은 효모 세포로서 간주하였다. 다음, 현탁액을 현미경 하에 관찰하고, 생존 세포비를 Cell Vital Analyzer System (DA 세포 계수기, Yamato Scientific Co., Ltd. 제조) 을 사용해 측정하였다. 실험 오차를 최소화하기 위해 세포군의 세포수가 2000 개 초과가 될 때까지, 세포를 세었다.

도 4 에서 지시한 바와 같이, 고도 발현 계통의 생존 세포비는 38.9% 였고, 반면, 모 계통의 생존 세포비는 19.9% 였다. 효모의 내건조성이 비-ScGLG1 의 고도 발현에 의해 증가되었음이 결과에 의해 나타났다.

실시예 5 : 비- ScGLG1 고도 발현 계통의 내저온성 평가

모 계통 (AJL4004 계통) 및 실시예 3 에서 기술된 방법에 의해 수득된 비-ScGLG1 고도 발현 계통의 내 저온성을 하기 기술된 방법에 의해 평가하였다. 실시예 4 에서 기술된 방법에 의해 배양되고 OD660=2 로서 제조된 효모 현탁액 중 900 마이크로리터 (900 ㎕) 를 각각 2 개의 마이크로튜브에 분산시켰다. 멸균수 100 마이크로리터 (100 ㎕) 를 마이크로튜브 중 하나에 첨가하고, 한편, 99.5% 에탄올 100 ㎕ 를 또다른 마이크로튜브에 첨가하였다 (최종 농도 10% 임). 현탁액을 5℃ 에서 4 주 동안 저장한 다음, 생존 세포비를 실시예 4 와 동일한 방법에 의해 측정하였다.

도 5 에서 나타낸 바와 같이, 저장 후의 비-ScGLG1 고도 발현 계통의 생존 세포비는 모 계통의 것보다 더 높았다. 상기 효과는 10% 에탄올 하에 더욱 분명하였다. 효모의 내 저온 저장성이 비-ScGLG1 의 고도 발현에 의해 증가된다는 것을 결과로부터 알았다.

실시예 6 : 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자 (비- ScGLG2 )

일본 특허 출원 공개 공보 제 2004-283169 호에 기술된 비교 데이타베이스를 활용한 연구 결과, 라거 양조 효모의 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자 (비-ScGLG2) (SEQ ID NO: 3) 를 발견하였다. 상기 유전자 전장을 증폭시키기 위해, 획득된 뉴클레오티드 서열 정보를 바탕으로, 프라이머 비-ScGLG2_for (SEQ ID NO: 7) 및 비-ScGLG2_rv (SEQ ID NO: 8) 를 디자인하였다. 게놈 서열화 계통인 사카로미세스 파스토리아누스 바이헨슈테판 34/70 의 염색체 DNA 를 주형으로서 사용하여 PCR 을 수행하여, 비-ScGLG2 의 전장 유전자를 포함하는 DNA 절편을 수득하였다.

그렇게 해서 수득된 비-ScGLG2 유전자를 TA 클로닝에 의해 pCR2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen) 에 삽입하였다. 비-ScGLG2 유전자의 뉴클레오티드 서열을 Sanger's (F. Sanger, Science, 214: 1215, 1981) 방법에 의해 분석하여, 뉴클레오티드 서열을 확인하였다.

실시예 7 : 맥주 발효 동안의 비- ScGLG2 유전자의 발현 분석

라거 양조 효모인 사카로미세스 파스토리아누스 W34/70 를 사용하여 맥주 발효 테스트를 수행하고, 발효 동안에 라거 양조 효모로부터 추출된 mRNA 를 맥주 효모 DNA 마이크로어레이에 의해 검출하였다.

맥아즙 추출물 농도 12.69%

맥아즙 함량 70 L

맥아즙 용존 산소 함량 8.6 ppm

발효 온도 15℃

효모 피칭률 12.8 x 10⁶ 세포/mL

발효액을 시간에 따라 샘플링하고, 효모 세포 성장의 양 (도 6) 및 명확한 추출물 농도 (도 7) 에 있어서의 시간-경과 변화를 관찰하였다. 동시에, 효모 세포를 샘플링하여 mRNA 를 제조하고, 제조된 mRNA 를 비오틴으로 표지하고, 맥주 효모 DNA 마이크로어레이에 혼성화하였다. 유전자칩 조작 시스템 (GCOS; GeneChip Operating Software 1.0, Affymetrix Co 에 의해 제조됨) 을 사용해 신호를 검출하였다. 비-ScGLG2 유전자의 발현 패턴을 도 8 에 나타내었다. 상기 결과는 일반적인 맥주 발효에서 비-ScGLG2 유전자의 발현을 확인시켜 주었다.

실시예 8 : 비- ScGLG2 고도 발현 계통의 구축

실시예 6 에서 기술된 비-ScGLG2/pCR2.1-TOPO 를 제한 효소 SacI 및 NotI 로 절단하여, 단백질-암호화 영역의 전장을 함유하는 DNA 절편을 제조하였다. 상기 절편을 제한 효소 SacI 및 NotI 로 처리한 pYCGPYNot 에 연결하여, 비-ScGLG2 고도 발현 벡터 비-ScGLG2/pYCGPYNot 를 구축하였다.

상기 방법에 의해 제조된 고도 발현 벡터를 사용하여, AJL4004 계통을 일본 특허 출원 공개 공보 제 H07-303475 호에서 기술된 방법에 의해 형질전환시켰다. 형질전환체를 제네티신 300 mg/L 을 함유하는 YPD 플레이트 배지 (1% 효모 추출물, 2% 폴리펩톤, 2% 글루코스 및 2% 한천) 상에서 선별하였다.

실시예 9 : 비- ScGLG2 고도 발현 계통의 내건조성 평가

모 계통 (AJL4004 계통) 및 실시예 8 에서 기술된 방법에 의해 수득된 비- ScGLG2 고도 발현 계통의 내건조성을 실시예 4 에서 기술된 것과 동일한 방법에 의해 평가하였다.

도 9 에서 나타낸 바와 같이, 고도 발현 계통의 생존 세포비는 30.3% 였고, 한편, 모 계통의 생존 세포비는 19.9% 였다. 효모의 내건조성이 비-ScGLG2 의 고도 발현에 의해 증가되었음이 결과에서 나타났다.

실시예 10 : 비- ScGLG2 고도 발현 계통의 내 저온성 평가

모 계통 (AJL4004 계통) 및 실시예 8 에서 기술된 방법에 의해 수득된 비-ScGLG2 고도 발현 계통의 내 저온성을 실시예 5 에서와 동일한 방법에 의해 평가하였다.

도 10 에서 나타낸 바와 같이, 비-ScGLG2 고도 발현 계통의 생존 세포비는 모 계통의 것보다 더 높았다. 상기 효과는 10% 에탄올 하에 더욱 분명하였다. 효모의 내 저온 저장성이 비-ScGLG2 의 고도 발현에 의해 증가되었음이 결과에서 나타났다.

본 발명에 따르면, 효모는 연장된 기간 동안 안정하게 저장될 수 있는데, 그 이유는 내건조성 및/또는 내 저온 저장성이 본 발명에 의해 향상될 수 있기 때문이다. 따라서, 알콜 음료 (예를 들어, 맥주) 의 양조, 빵 제조, 또는 산업용 알콜 제조 또는 유용한 단백질의 제조와 같은 유용한 물질의 제조 등의 효율이 본 발명에 의해 향상될 수 있다.

<110> Suntory Limited <120> Gene encoding glycogen synthesis initiator and use thereof <130> G07-0110 <140> PCT/JP2007/053698 <141> 2007-02-21 <150> JP2006-55570 <151> 2006-03-01 <160> 8 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1680 <212> DNA <213> Saccharomyces sp. <400> 1 atgtgtagaa aactagccat tgtcacacta ctgtactccg cggattattt accgggcgtg 60 tttgctcttg gtcatcaagt taacaaactg ttaaaggaag cgggtaggaa agatagaatt 120 gatgcatgcc ttgttgtgac aactccctta ttcaatgaca ttttgagcga tttggccaaa 180 gatcttttga aaacaatata cgacgatatc gtacttgtaa accctttgga atgccaagat 240 gaaagtattc agagaaacag tgaaaatcta gctcttttgg aaaggcccga attgtcgttt 300 gctctaataa aggcaagact atgggaacta acccagtacg aacaagttct atatttggat 360 tcagacactt tacccctgaa aaaagacttt ctaagattgt tcgacattat gtctaaacaa 420 actaagttac agattggtgc tgttgctgac attggctggc cagatatttt caatagcggc 480 gttatgatgc tgataccaga tgctgatact gcatctgttt tacagaacta tgttatcgaa 540 aatacttcaa ttgatggtgc tgatcagggc attttgaatc agttttttaa ccaaaactgc 600 tgcacggatg agctgctcaa 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atcaacaacg aagaaggaga agatttcgat 1500 gtaggaaaag tgggaaggag tgttgaagat gcactcgaaa aagagaatcc gacagaggac 1560 gaacccaaaa attcacctca agaaatgccg aacttcaggt tcgactggga agattctgat 1620 tacctatcaa aagttgaaag gtatttccct gatgacgtct ttgaatatgc agtagaatga 1680 1680 <210> 2 <211> 559 <212> PRT <213> Saccharomyces sp. <400> 2 Met Cys Arg Lys Leu Ala Ile Val Thr Leu Leu Tyr Ser Ala Asp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Gly Val Phe Ala Leu Gly His Gln Val Asn Lys Leu Leu Lys 20 25 30 Glu Ala Gly Arg Lys Asp Arg Ile Asp Ala Cys Leu Val Val Thr Thr 35 40 45 Pro Leu Phe Asn Asp Ile Leu Ser Asp Leu Ala Lys Asp Leu Leu Lys 50 55 60 Thr Ile Tyr Asp Asp Ile Val Leu Val Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp 65 70 75 80 Glu Ser Ile Gln Arg Asn Ser Glu Asn Leu Ala Leu Leu Glu Arg Pro 85 90 95 Glu Leu Ser Phe Ala Leu Ile Lys Ala Arg Leu Trp Glu Leu Thr Gln 100 105 110 Tyr Glu Gln Val Leu Tyr Leu Asp Ser Asp Thr Leu Pro Leu Lys Lys 115 120 125 Asp Phe Leu Arg Leu Phe Asp Ile Met Ser Lys Gln Thr Lys Leu Gln 130 135 140 Ile Gly Ala Val Ala Asp Ile Gly Trp Pro Asp Ile Phe Asn Ser Gly 145 150 155 160 Val Met Met Leu Ile Pro Asp Ala Asp Thr Ala Ser Val Leu Gln Asn 165 170 175 Tyr Val Ile Glu Asn Thr Ser Ile Asp Gly Ala Asp Gln Gly Ile Leu 180 185 190 Asn Gln Phe Phe Asn Gln Asn Cys Cys Thr Asp Glu Leu Leu Lys Glu 195 200 205 Ser Phe Pro Arg Glu Trp Val Gln Leu Ser Phe Thr Tyr Asn Val Thr 210 215 220 Thr Pro Asn Leu Gly Tyr Glu Ser Ser Pro Ala Met Asn Tyr Phe Lys 225 230 235 240 Pro Thr Ile Lys Leu Ile His Phe Ile Gly Gln His Lys Pro Trp Ser 245 250 255 Leu Trp Ser Gln Thr Asn Phe Val Arg Asn Glu Tyr Asn Thr Gln Trp 260 265 270 Asn Gly Val Tyr Glu Asp Phe Lys Gln Glu Asn Lys Leu Val Asp Asp 275 280 285 Val Ser Lys Ile Asp Ile Ser Asp Phe Asn Glu Asp Asn Asn Val Gln 290 295 300 Thr Ala Ser Gln Glu Thr Ile Pro Gln Thr Ala Ser Ser Gly Ala Ile 305 310 315 320 Pro Gln Asp Asn Asp Phe Ser Thr Glu Lys Glu Val Glu Thr Ile Asp 325 330 335 Thr Lys Gln Glu Asp Thr Arg Val Gln Leu Asn Lys Pro Ala Pro Val 340 345 350 Pro Val Pro Leu Asn Phe Thr Glu Trp Leu Thr Thr Phe Ile Asn Lys 355 360 365 Asp Asn Val Asn Ser Gln Ala Met Asn Lys Met His Glu His Glu Gly 370 375 380 Asn Asp Ser Gly Phe Asp Lys Asp Asp Ala Lys Ser Asp Glu Asp Ile 385 390 395 400 Tyr Val Asn Asn Ser Asp Ala Lys Pro Asp Gln Glu Ser Ile Ala Asp 405 410 415 Lys Asn Asp Ala Lys Ser Asp Gln Asp Gly His Val Asn Asn Asn Asp 420 425 430 Ser Asn Pro Asp Gln Glu Ser His Ala Asp Val Thr Gln Asp Pro Ile 435 440 445 Thr Tyr Lys Asp Asp Ile Ser Glu Asp Ile Glu Pro Pro Val Pro Thr 450 455 460 Glu Asp Asp Val Lys Leu Leu Glu Gln Asp Glu Glu Gly Tyr Asp Glu 465 470 475 480 Phe Leu Leu Asp Val Cys Asp Ala Asp Ala Ile Asn Asn Glu Glu Gly 485 490 495 Glu Asp Phe Asp Val Gly Lys Val Gly Arg Ser Val Glu Asp Ala Leu 500 505 510 Glu Lys Glu Asn Pro Thr Glu Asp Glu Pro Lys Asn Ser Pro Gln Glu 515 520 525 Met Pro Asn Phe Arg Phe Asp Trp Glu Asp Ser Asp Tyr Leu Ser Lys 530 535 540 Val Glu Arg Tyr Phe Pro Asp Asp Val Phe Glu Tyr Ala Val Glu 545 550 555 <210> 3 <211> 1143 <212> DNA <213> Saccharomyces sp. <400> 3 atgattaaga aagttgctct ttgcacgtta ttatattcac gggggtattt acctggtgcc 60 ttaactttag cgtaccaatt acaaggactc ttgagccaga ctgtagtaga ggacgaaata 120 actatatgtc tattagttgc aagaacgttg ttcgaagatg aatttactcc ccaggaaata 180 gttttgataa gaagcctctt caaggagatc attatcatag aatcgttaga gggtcaagcg 240 aagagcgtcg aaaataacaa ggcaaatctt gacttgttga aaaggccgga gctatctttt 300 actttactaa aagccagatt atgggaactg gtgcagttcg atcaggtgct gtttttggat 360 gcggatactt taccattgaa caaggagttt tttaaaattc tacagctata tcctgaacaa 420 acgaggttcc agatcgctgc tgttcccgat atcggatggc ccgatatgtt taacaccggt 480 gtcttgctac tgattccaga tttggaaatg gcgaagagct tgcaggattt tttggtcaag 540 actgtatcga ttgacggggc tgatcaaggt attttcaatc aatttttcaa ccccgcatgc 600 aattacagca aggagatctt gcacaaaata tctccgctta tggagtggat acgacttccg 660 ttcatctata acgtaacaat gcccaattac ggataccagt cctcgcctgc gatgagcttt 720 ttccagcagc atatcaacct agttcatttc atcggaacgt tcaaaccgtg gtcacatagt 780 gcattcaacc acgataatta ttattatcaa ttatggaggg atacagagag ggatctacac 840 aacgaacacc acttgagtaa ttatttcaca cgcttgcaac tcggcaatct cgaaagggaa 900 acagatttcc atcacgaggc tccctgcatc aacacgctgc taaggcaaaa ctcaagggag 960 aatcaaaagc aggttagccc tgatgaaacc caggtaggtc ctaatgctgc acaaaatata 1020 cctatacaag aacacgatca aaaagtgaca actgctgata ctcaaagtgc cttcaagttt 1080 gagtgggaga atacggacta tttgcaccac gtccagagag cgttcccaga ctccgatatc 1140 taa 1143 <210> 4 <211> 380 <212> PRT <213> Saccharomyces sp. <400> 4 Met Ile Lys Lys Val Ala Leu Cys Thr Leu Leu Tyr Ser Arg Gly Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Gln Leu Gln Gly Leu Leu Ser 20 25 30 Gln Thr Val Val Glu Asp Glu Ile Thr Ile Cys Leu Leu Val Ala Arg 35 40 45 Thr Leu Phe Glu Asp Glu Phe Thr Pro Gln Glu Ile Val Leu Ile Arg 50 55 60 Ser Leu Phe Lys Glu Ile Ile Ile Ile Glu Ser Leu Glu Gly Gln Ala 65 70 75 80 Lys Ser Val Glu Asn Asn Lys Ala Asn Leu Asp Leu Leu Lys Arg Pro 85 90 95 Glu Leu Ser Phe Thr Leu Leu Lys Ala Arg Leu Trp Glu Leu Val Gln 100 105 110 Phe Asp Gln Val Leu Phe Leu Asp Ala Asp Thr Leu Pro Leu Asn Lys 115 120 125 Glu Phe Phe Lys Ile Leu Gln Leu Tyr Pro Glu Gln Thr Arg Phe Gln 130 135 140 Ile Ala Ala Val Pro Asp Ile Gly Trp Pro Asp Met Phe Asn Thr Gly 145 150 155 160 Val Leu Leu Leu Ile Pro Asp Leu Glu Met Ala Lys Ser Leu Gln Asp 165 170 175 Phe Leu Val Lys Thr Val Ser Ile Asp Gly Ala Asp Gln Gly Ile Phe 180 185 190 Asn Gln Phe Phe Asn Pro Ala Cys Asn Tyr Ser Lys Glu Ile Leu His 195 200 205 Lys Ile Ser Pro Leu Met Glu Trp Ile Arg Leu Pro Phe Ile Tyr Asn 210 215 220 Val Thr Met Pro Asn Tyr Gly Tyr Gln Ser Ser Pro Ala Met Ser Phe 225 230 235 240 Phe Gln Gln His Ile Asn Leu Val His Phe Ile Gly Thr Phe Lys Pro 245 250 255 Trp Ser His Ser Ala Phe Asn His Asp Asn Tyr Tyr Tyr Gln Leu Trp 260 265 270 Arg Asp Thr Glu Arg Asp Leu His Asn Glu His His Leu Ser Asn Tyr 275 280 285 Phe Thr Arg Leu Gln Leu Gly Asn Leu Glu Arg Glu Thr Asp Phe His 290 295 300 His Glu Ala Pro Cys Ile Asn Thr Leu Leu Arg Gln Asn Ser Arg Glu 305 310 315 320 Asn Gln Lys Gln Val Ser Pro Asp Glu Thr Gln Val Gly Pro Asn Ala 325 330 335 Ala Gln Asn Ile Pro Ile Gln Glu His Asp Gln Lys Val Thr Thr Ala 340 345 350 Asp Thr Gln Ser Ala Phe Lys Phe Glu Trp Glu Asn Thr Asp Tyr Leu 355 360 365 His His Val Gln Arg Ala Phe Pro Asp Ser Asp Ile 370 375 380 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gagctcatag cggccatgtg tagaaaacta gccattgtca 40 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ggatcctatg cggccgcgta cgtgaaagaa ctacactttc tt 42 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gagctcatag cggccatgat taagaaagtt gctctttgca 40 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ggatcctatg cggccgccag cgaattgacc cggccttact at 42

Claims

하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 :

(a) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ;

(b) SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ;

(c) 하나 이상의 아미노산이 소실, 치환, 삽입 및/또는 첨가되는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열로 이루어지고, 글리코겐 합성 개시 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ;

(d) SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열과 60% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열을 가지고, 글리코겐 합성 개시 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ;

(e) 엄격한 조건 하에, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고, 글리코겐 합성 개시 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ; 및

(f) 엄격한 조건 하에, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고, 글리코겐 합성 개시 활 성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 :

(g) SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하거나, 또는 1 내지 10 개의 아미노산이 소실, 치환, 삽입 및/또는 첨가되는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, 상기 단백질은 글리코겐 합성 개시 활성을 가짐 ;

(h) SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 가지고 글리코겐 합성 개시 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ; 및

(i) 높은 엄격한 조건 하에, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하거나, 또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고, 글리코겐 합성 개시 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 DNA 인 폴리뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 단백질.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터.
제 7 항에 따른 벡터가 도입된 효모.
제 8 항에 있어서, 내건조성이 증가된 효모.
제 8 항에 있어서, 내 저온 저장성이 증가된 효모.
제 9 항에 있어서, 제 6 항의 단백질의 발현 수준을 증가시킴으로써 내건조 성이 증가된 효모.
제 10 항에 있어서, 제 6 항의 단백질의 발현 수준을 증가시킴으로써 내 저온 저장성이 증가된 효모.
제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 효모를 사용하여 알콜 음료를 제조하는 방법.
제 13 항에 있어서, 양조된 알콜 음료가 맥아 음료인 방법.
제 13 항에 있어서, 양조된 알콜 음료가 와인인 방법.
제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는 알콜 음료.
SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열을 갖고 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 바탕으로 디자인된 프라이머 또는 프로브를 사용하는 것을 포함하는, 내건조성 및/또는 내 저온 저장성에 대해 테스트 효모를 평가하는 방법.
하기를 포함하는, 내건조성 및/또는 내 저온 저장성에 대해 테스트 효모를 평가하는 방법 :

테스트 효모를 배양함 ; 및

SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열을 갖고 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정함.
하기를 포함하는, 효모 선별 방법 :

테스트 효모를 배양함 ;

제 6 항의 단백질을 정량화하거나, 또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열을 갖고 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정함 ; 및

바람직한 내건조성 및/또는 내 저온 저장성에 따른 유전자 발현 수준 또는 단백질 양을 가진 테스트 효모를 선별함.
제 19 항에 있어서, 하기를 포함하는 효모 선별 방법 :

대조군 효모 및 테스트 효모를 배양함 ;

각각의 효모에 대해, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열을 갖고 글리코겐 합성 개시제를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정함 ; 및

대조군 효모보다 더 높은 유전자 발현을 가진 테스트 효모를 선별함.
제 19 항에 있어서, 하기를 포함하는 효모 선별 방법 :

대조군 효모 및 테스트 효모를 배양함 ;

각각의 효모에서 제 6 항에 따른 단백질을 정량화함 ; 및

대조군 효모보다 더 많은 양의 단백질을 가진 테스트 효모를 선별함.
제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 효모, 또는 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 선별되는 효모를 사용하여 발효를 수행하는 것을 포함하는, 알콜 음료 제조 방법.