CN101255430A - 编码糖原合成起始因子的基因及其用途 - Google Patents

编码糖原合成起始因子的基因及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN101255430A
CN101255430A CNA200710084680XA CN200710084680A CN101255430A CN 101255430 A CN101255430 A CN 101255430A CN A200710084680X A CNA200710084680X A CN A200710084680XA CN 200710084680 A CN200710084680 A CN 200710084680A CN 101255430 A CN101255430 A CN 101255430A
Authority
CN
China
Prior art keywords
yeast
polynucleotide
sequence number
sequence
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA200710084680XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN101255430B (zh
Inventor
中尾嘉宏
儿玉由纪子
下永朋子
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suntory Holdings Ltd
Original Assignee
Suntory Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suntory Ltd filed Critical Suntory Ltd
Publication of CN101255430A publication Critical patent/CN101255430A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101255430B publication Critical patent/CN101255430B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及编码糖原合成起始因子的基因及其用途，特别涉及耐干燥性及/或耐低温保存性良好的实用酵母、使用该酵母制造的酒精饮料、其制造方法等。更加具体地说，本发明涉及编码酿造酵母的糖原合成起始因子Glg1p或Glg2p的GLG1或GLG2基因，特别涉及通过提高啤酒酵母的特征基因non－ScGLG1或non－ScGLG2的表达量从而使耐干燥性及/或耐低温保存性提高的酵母、使用该酵母的酒精饮料制造方法等。

Description

编码糖原合成起始因子的基因及其用途
技术领域
本发明涉及编码糖原合成起始因子的基因及其用途，特别涉及耐干燥性及/或耐低温保存性良好的实用酵母、使用该酵母制造的酒精饮料、其制造方法等。更加具体地说，本发明涉及编码酿造酵母的具有糖原合成起始活性的蛋白质Glg1p或Glg2p的GLG1或GLG2基因，特别涉及通过提高啤酒酵母的特征基因non-ScGLG1或non-ScGLG2的表达量从而使耐干燥性及/或耐低温保存性提高的酵母、使用该酵母的酒精饮料制造方法等。此外，本发明的酵母也可应用于面包酵母、工业用酵母。
背景技术
啤酒酿造工序中具有的特征是，对发酵结束后的酵母进行回收并在下次发酵中使用(称为连续酿造)。在乙醇存在的条件下，将酵母保存在保持为0～3℃的槽内，而在此期间如果酵母死亡，不仅会影响下次发酵，而且因自溶流出的细胞构成物可能给产品带来不良气味。因此，使用耐低温保存性良好的酵母，可自由设计工序，对稳定生产高质量产品非常重要。
连续酿造的次数根据发酵条件、使用酵母的特性而不同，经过一定次数后终止。生产新使用酵母的工序称为繁殖，从小规模经过多阶段的规模放大进行放大培养，一般需要数日～数周时间，因此如果能够缩短工序时间、或使预先大量培养的菌体在低温或干燥状态下长期稳定保存，在生产效率方面将会有很大价值。
有关维持高活菌率的干燥酵母的制造方法，已经对干燥装置、温度、添加乳化剂等制造条件进行了各种研究。例如L-干燥法能够维持极高的活菌率，但另一方面，因为花费时间和成本高，在实际生产规模中使用不现实。
有关酵母的耐低温性，以面包酵母为中心，已报道了几种以提高耐冷冻性为目的的试验。这是因为与低温下能够发酵的啤酒、清酒等的酿造酵母相比较，面包酵母Saccharomyces cerevisiae的低温保存性差。例如：在日本国特开平11-155559号公报、日本国特开2003-304864号公报中，主要通过筛选法发现具有耐冷冻性及耐干燥性的面包酵母。此外，作为使用基因工程技术的例子，日本国特开平10-117771号公报中报道了破坏NTH1(海藻糖基因)的海藻糖高积累菌株，日本国特开2001-238665号公报中报道了破坏CAR1(精氨酸分解酶基因)的精氨酸等特定氨基酸高积累菌株。
发明内容
在上述状况下，期待利用编码与酿造酵母的耐干燥性及/或耐低温保存性相关的蛋白质的基因以及该蛋白质，能够高效率生产酒精饮料或有用物质。
本发明者为了解决上述课题进行了精心研究，结果从啤酒酵母中成功鉴定、分离出编码糖原合成起始因子的基因，并且确认将得到的基因导入酵母中制作使其表达的转化酵母，耐干燥性及/或耐低温保存性增强，从而完成了本发明。
本发明涉及编码啤酒酵母中存在的编码糖原合成起始因子的基因、该基因编码的蛋白质、该基因的表达受到调节的转化酵母、通过使用该基因表达受到调节的酵母从而强化酵母的耐干燥性及/或耐低温保存性的方法等。具体来说，本发明提供下述所示的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、导入该载体的转化酵母、使用该转化酵母的酒精饮料制造方法等。
(1)多核苷酸，其为从下述(a)～(f)组成的群组中选择的多核苷酸，
(a)多核苷酸，其含有由序列号1或序列号3的碱基序列所组成的多核苷酸；
(b)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质由序列号2或序列号4的氨基酸序列所组成；
(c)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质由在序列号2或序列号4的氨基酸序列中缺失、替换、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列所组成、且具有糖原合成起始活性；
(d)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序列号2或序列号4的氨基酸序列有60％以上一致性的氨基酸序列、且具有糖原合成起始活性；
(e)多核苷酸，其含有在严谨条件下与由序列号1或序列号3的碱基序列的互补碱基序列所组成的多核苷酸进行杂交、且编码具有糖原合成起始活性的蛋白质的多核苷酸；以及
(f)多核苷酸，其含有：在严谨条件下与由编码序列号2或序列号4的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的碱基序列的互补碱基序列所组成的多核苷酸进行杂交、且编码具有糖原合成起始活性的蛋白质的多核苷酸。
(2)如上述(1)所述的多核苷酸，其选自由下述(g)～(i)组成的群组，
(g)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质由序列号2或序列号4的氨基酸序列所组成、或者由在序列号2或序列号4的氨基酸序列中缺失、替换、插入及/或添加1～10个氨基酸后的氨基酸序列所组成、且具有糖原合成起始活性；
(h)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序列号2或序列号4的氨基酸序列有90％以上一致性的氨基酸序列、且具有糖原合成起始活性；以及
(i)多核苷酸，其含有：在高严谨条件下与由序列号1或序列号3的碱基序列所组成的多核苷酸进行杂交、或与由序列号1或序列号3的碱基序列的互补碱基序列所组成的多核苷酸进行杂交、且编码具有糖原合成起始活性的蛋白质的多核苷酸。
(3)如上述(1)所述的多核苷酸，其含有由序列号1或序列号3的碱基序列所组成的多核苷酸。
(4)如上述(1)所述的多核苷酸，其含有编码由序列号2或序列号4的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸。
(5)如上述(1)～(4)中任一项所述的多核苷酸，其为DNA。
(6)蛋白质，其为由上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸编码的蛋白质。
(7)载体，其含有上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸。
(7a)上述(7)所述的载体，其包含表达盒，该表达盒包含下述构成要素(x)～(z)：
(x)在酵母细胞内可转录的启动子；
(y)连接在该启动子的有义或反义方向的上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸；以及
(z)涉及RNA分子的转录终止及多聚腺苷酸化作用并在酵母内起作用的信号。
(7b)上述(7)所述的载体，其包含表达盒，该表达盒包含下述构成要素(x)～(z)：
(x)在酵母细胞内可转录的启动子；
(y)连接在该启动子的有义方向的上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸；以及
(z)涉及RNA分子的转录终止及多聚腺苷酸化作用并在酵母内起作用的信号。
(8)酵母，其为导入上述(7)～(7b)中任一项所述的载体的酵母。
(9)耐干燥性增强的上述(8)所述的酵母(实用酵母)，这里所述的“实用酵母”是指酿造用酵母、面包酵母、工业用酵母等具有实际使用价值的酵母。
(10)耐低温保存性增强的上述(8)所述的酵母。
(11)如上述(9)所述的酵母，其中，通过增大上述(6)所述的蛋白质的表达量，耐干燥性增强。
(12)如上述(10)所述的酵母，其中，通过增大上述(6)所述的蛋白质的表达量，耐低温保存性增强。
(12a)如上述(9)～(12)中任一项所述的酵母，其为酿造用酵母。
(13)酒精饮料制造方法，其使用上述(8)～(12a)中任一项所述的酵母。
(14)如上述(13)所述的酒精饮料制造方法，其中，酿造的酒精饮料是麦芽饮料。
(15)如上述(13)所述的酒精饮料制造方法，其中，酿造的酒精饮料是葡萄酒。
(16)酒精饮料，其为采用上述(13)～(15)任一项所述的方法制造的酒精饮料。
(17)评价方法，其为使用根据具有序列号1或序列号3的碱基序列、且编码糖原合成起始因子的基因的碱基序列设计的引物或探针，对被检酵母的耐干燥性及/或耐低温保存性进行评价的方法。
(17a)根据上述(17)所述的方法，选择耐干燥性及/或耐低温保存性增强的酵母的方法。
(17b)使用根据上述(17a)所述的方法选择的酵母，制造酒精饮料(如啤酒、工业用酒精)的方法。
(17c)使用根据上述(17a)所述的方法选择的酵母，制造有用物质(如蛋白质)的方法。
(18)评价方法，其为培养被检酵母，通过测定具有序列号1或序列号3的碱基序列、且编码糖原合成起始因子的基因的表达量，评价被检酵母的耐干燥性及/或耐低温保存性的方法。
(18a)根据上述(18)所述的方法评价被检酵母，选择编码糖原合成起始因子的基因表达量高的酵母，选择耐干燥性及/或耐低温保存性高的酵母。
(18b)使用根据上述(18a)所述的方法选择的酵母，制造酒精饮料(如啤酒)的方法。
(18c)使用根据上述(18a)所述的方法选择的酵母，制造有用物质(如蛋白质)的方法。
(19)酵母的选择方法，其为培养被检酵母，对上述(6)所述的蛋白质进行定量或者测定具有序列号1或序列号3的碱基序列、且编码糖原合成起始因子的基因的表达量，选择所述蛋白质的量或所述基因表达量与目标耐干燥性及/或耐低温保存性相应的被检酵母的方法。
(20)如上述(19)所述的酵母的选择方法，其为培养标准酵母和被检酵母，测定具有序列号1或序列号3的碱基序列、且编码糖原合成起始因子的基因在各酵母中的表达量，选择与标准酵母相比该基因为高表达的被检酵母的方法。
(21)如上述(19)所述的酵母的选择方法，其为培养标准酵母和被检酵母，对各酵母中的上述(6)所述蛋白质进行定量，选择与标准酵母相比，该蛋白质的量多的被检酵母的方法。
(22)酒精饮料制造方法，其特征在于，使用上述(8)～(12a)所述酵母和根据上述(19)～(21)所述的方法选择的酵母中的任一种酵母。
本发明的转化酵母能够在干燥保存或低温保存下维持高的活菌数，所以应用于酿造等时，能够消除烦杂的酵母管理，能够有助于质量的稳定化。进而，由于干燥酵母适合长期保存，而且其重量减轻，所以对流通运输非常有利，可应用于工业用酒精生产、有用蛋白质生产等的工业用微生物。此外，本发明的酵母也可应用于面包酵母、工业用酵母。
附图说明
图1表示啤酒酿造试验中酵母增殖量的经时变化，横轴表示发酵时间，纵轴表示OD660值。
图2表示啤酒酿造试验中浸出物消耗量的经时变化，横轴表示发酵时间，纵轴表示浸出物表观浓度(w/w％)。
图3表示啤酒酿造试验中的酵母中non-ScGLG1基因的表达行为，横轴表示发酵时间，纵轴表示检出的信号辉度。
图4表示亲株及non-ScGLG1高表达株的耐干燥性试验结果。
图5表示亲株及non-ScGLG1高表达株的耐低温保存性试验结果。
图6表示啤酒酿造试验中酵母增殖量的经时变化，横轴表示发酵时间，纵轴表示OD660值。
图7表示啤酒酿造试验中浸出物消耗量的经时变化，横轴表示发酵时间，纵轴表示浸出物表观浓度(w/w％)。
图8表示啤酒酿造试验中的酵母中non-ScGLG2基因的表达行为，横轴表示发酵时间，纵轴表示检出的信号辉度。
图9表示亲株及non-ScGLG2高表达株的耐干燥性试验结果。
图10表示亲株及non-ScGLG2高表达株的耐低温保存性试验结果。
具体实施方式
本发明者根据日本国特开2004-283169公开的方法解读的啤酒酵母基因组的信息，分离、鉴定出编码啤酒酵母的糖原合成起始因子的non-ScGLG1基因和non-ScGLG2基因。其碱基序列分别用序列号1和序列号3表示，此外由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列分别用序列号2和序列号4表示。
1.本发明的多核苷酸
首先，本发明提供：(a)多核苷酸，其含有具有序列号1或序列号3的碱基序列的多核苷酸；以及(b)多核苷酸，其含有编码具有序列号2或序列号4的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA也可以是RNA。
作为本发明对象的多核苷酸，并不限定于编码上述来源于啤酒酵母的具有糖原合成起始活性的蛋白质的多核苷酸，而且还包括编码与该蛋白质具有同等功能的蛋白质的其他多核苷酸。作为具有同等功能的蛋白质，例如可以为(c)蛋白质，其具有在序列号2或序列号4的氨基酸序列中缺失、替换、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列、且具有糖原合成起始活性。
此类蛋白质可以为：具有在序列号2或序列号4的氨基酸序列中如缺失、替换、插入及/或添加1～100个、1～90个、1～80个、1～70个、1～60个、1～50个、1～40个、1～39个、1～38个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个(1～数个)、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、1个氨基酸残基后的氨基酸序列、且具有糖原合成起始活性的蛋白质。上述缺失、替换、插入及/或添加的氨基酸残基的个数，一般优选小的数目。并且此类蛋白质还可以为：(d)蛋白质，其具有与序列号2或序列号4的氨基酸序列有约60％以上、约70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上的一致性的氨基酸序列、且具有糖原合成起始活性。上述同源性的数值一般优选大的数值。
糖原合成起始活性，例如可根据Cheng et al.，Mol.Cell.Biol.，15(12)，6632-6640(1995)中记载的方法，通过测定酵母菌体的糖原含量来进行评价。
本发明还包括：(e)多核苷酸，其含有在严谨条件下与具有序列号1或序列号3的碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸进行杂交、且编码具有糖原合成起始活性的蛋白质的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其含有在严谨条件下与具有编码具有序列号2或序列号4的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸进行杂交、且编码具有糖原合成起始活性的蛋白质的多核苷酸。
这里所述的“在严谨条件下进行杂交的多核苷酸”，是指将具有序列号1或序列号3的碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸、或将编码序列号2或序列号4的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分作为探针，使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法、Southern杂交法等得到的多核苷酸(如DNA)。杂交方法利用如MolecularCloning 3rd Ed.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons 1987-1997等记载的方法。
本说明书所述的“严谨条件”，可以为低严谨条件、中严谨条件、高严谨条件中的任一种。“低严谨条件”，如为5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件；此外，“中严谨条件”，如为5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件；“高严谨条件”，如为5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。在这些条件中，认为温度越高越能有效得到高同源性的多核苷酸(如DNA)。当然，一般认为影响杂交的严谨度的因素有温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多个因素，本领域技术人员可通过适当选择这些要素实现相同的严谨度。
使用市售的试剂盒进行杂交时，如可以使用Alkphos Direct LabellingReagents(Amersham Pharmacia公司制造)。这种情况下，按照试剂盒中附带的说明书，与标记探针过夜温育后，在55℃的条件下用含有0.1％(w/v)SDS的第1次洗涤缓冲液将膜洗涤后，能够检出杂交的多核苷酸(如DNA)。
除此之外可能杂交的多核苷酸还可以为，通过FASTA、BLAST等同源性检索软件用系统设定的默认参数进行计算时，与编码序列号2或序列号4的氨基酸序列的多核苷酸有约60％以上、约70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1以上％、99.2以上％、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上一致性的多核苷酸。
氨基酸序列、碱基序列的一致性，可以使用Karlin及Altschul的BLASTAlgorithm(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873，1993)来确定。以BLAST Algorithm为基础的称为BLASTN、BLASTX的程序已在开发(Altschul SF，et al：J Mol Biol215：403，1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，如使参数为score＝100、wordlength＝12；此外使用BLASTX分析氨基酸序列时，如使参数为score＝50、wordlength＝3；使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各程序的系统设定默认参数值。
2.本发明的蛋白质
本发明还提供由上述(a)～(i)中任一种多核苷酸所编码的蛋白质。本发明的优选蛋白质为：具有在序列号2或序列号4的氨基酸序列中缺失、替换、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列、且具有糖原合成起始活性的蛋白质。
此类蛋白质可以为具有在序列号2或序列号4的氨基酸序列中缺失、替换、插入及/或添加上述数量的氨基酸残基后的氨基酸序列、且具有糖原合成起始活性的蛋白质。此外，此类蛋白质还可以为具有与序列号2或序列号4的氨基酸序列有上述同源性的氨基酸序列、且具有糖原合成起始活性的蛋白质。
此类蛋白质可通过使用《Molecular Cloning 3》、《Current Protocols inMolecular Biology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等记载的定点诱变法获得。
本发明所述的在蛋白质的氨基酸序列中缺失、替换、插入及/或添加1个以上的氨基酸残基，是指在同一序列中的任意且1个或多个氨基酸序列中的位置上缺失、替换、插入及/或添加1个或多个氨基酸残基，并且缺失、替换、插入及添加中的2种以上可同时发生。
下面列举可互相替换的氨基酸残基，同一组中包含的氨基酸残基可互相替换。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯基丙氨酸、酪氨酸。
本发明的蛋白质也可以通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法制造，并且也可以利用Advanced Chem Tech公司、Perkin Elmer公司、Pharmacia公司、Protein Technology Installment公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、岛津制作所公司等制造的肽合成仪进行化学合成。
3.本发明的载体及导入该载体的转化酵母
本发明提供含有上述多核苷酸的载体，本发明的载体含有上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)。并且，构成的本发明的载体通常包含表达盒，该表达盒包括的结构要素为：(x)在酵母细胞内可转录的启动子，(y)连接在该启动子的有义或反义方向的上述(a)～(i)任一项所述的多核苷酸(DNA)，以及(z)涉及RNA分子的转录终止及多聚腺苷酸化作用并在酵母内起作用的信号。此外，要使上述本发明的蛋白质进行高表达时，优选将上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)以该启动子的有义方向导入，以促进这些多核苷酸的表达。
导入酵母时使用的载体可以是多拷贝型(YEp型)、单拷贝型(YCp型)、染色体整合型(YIp型)中的任一种。例如作为YEp型载体，已知有YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，AcademicPress，New York，83，1983)，作为YCp型载体，已知有YCp50(M.D.Rose etal.，gene，60，237，1987)，作为YIp型载体，已知有YIp5(K.Struhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USP，76，1035，1979)，且容易获得。
用于调节酵母中的基因表达的启动子/终止子，只要在实用酵母中起作用的同时不受醪液中的成分影响，可以任意组合。例如可使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的启动子等。这些基因均已克隆，如在M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中有详细记载，通过已知的方法能够容易地获得。
进行转化时使用的选择性标记，因实用酵母不能利用营养缺陷型标记，可利用氨基糖苷类抗生素(Geneticin)抗性基因(G418r)、耐铜基因(CUP1)(Marinet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，3371984)、抗浅蓝菌素基因(fas2m，PDR4)(猪腰淳嗣等，生物化学，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991)(日语原名：猪腰淳嗣ら，生化学，64，660，1992；Hussainet al.，gene，101，149，1991)等。
将上述构建的载体导入宿主酵母内，作为宿主酵母可以为任意酵母(实用酵母)，如啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母，面包酵母，工业用酒精生产酵母，有用蛋白质生产酵母等。具体可以为如酵母属(Saccharomyces)等酵母，在本发明中，可使用啤酒酵母，如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70等、Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、NCYC456等、Saccharomycescerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。并且还可使用威士忌酵母如Saccharomyces cerevisiae NCYC90等，葡萄酒酵母如协会葡萄酒用1号、葡萄酒用3号、葡萄酒用4号等，清酒酵母如协会酵母清酒用7号、清酒用9号等，面包酵母如NBRC 0555、NBRC 1346、NBRC 2043等，但并不限于这些酵母。在本发明中，优选使用啤酒酵母例如巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)。
酵母的转化方法可利用一般使用的公知方法。如电穿孔法“Meth.Enzym.，194，p182(1990)”、原生质球法(Spheroplast)“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)”、乙酸锂法“J.Bacteriology，153，p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)、Methods in yeast genetics，2000 Edition：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等记载的方法，但并不限于这些方法。
更加具体地说，将宿主酵母在标准酵母营养培养基(如YEPD培养基“GeneticEngineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等)中培养至OD600nm值为1～6。将该培养酵母离心分离并收集，洗净，用浓度约为1M～2M的碱金属离子进行前处理，优选用锂离子进行前处理。上述细胞在约30℃下，静置约60分钟后，与导入的DNA(约1μg～20μg)同时在约30℃下，静置约60分钟。添加聚乙二醇，优选添加约4,000道尔顿的聚乙二醇，使最终浓度约为20％～50％。约30℃下静置约30分钟后，将上述细胞在约42℃下加热处理约5分钟。优选用标准酵母营养培养基将上述细胞悬浮液洗净，加入到规定量的新鲜标准酵母营养培养基中，约30℃下静置约60分钟。然后，将其移植于含有作为选择性标记使用的抗生素等的标准琼脂培养基上，获得转化体。
一般克隆技术可参照《Molecular Cloning 3》、“Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold SpringHarbor，NY)”等。
4.本发明的酒精饮料制造方法以及根据该方法得到的酒精饮料
将上述本发明的载体导入酵母中，能够得到耐干燥性及/或耐低温保存性良好的酵母。此外，通过使用下述本发明的酵母的评价方法进行选择，也可以得到耐干燥性及/或耐低温保存性良好的酵母。本发明得到的酵母的应用对象，例如可以为啤酒、葡萄酒、威士忌、清酒等的酿造，面包制造，工业用酒精生产，有用蛋白质生产等有用物质的制造等，但并不限于这些。
生产这些物质时，除使用本发明得到的酿造酵母代替亲株之外，还可利用公知的技术手段。因此，使用的原料、制造设备、制造管理等可与以往的方法完全相同，不用增加成本就可实施。
5.本发明的酵母的评价方法
本发明涉及的评价方法是，使用根据具有序列号1或序列号3的碱基序列、且编码糖原合成起始因子的基因的碱基序列设计的引物或探针，评价被检酵母的耐干燥性及/或耐低温保存性。上述评价方法的一般方法是公知的，例如在WO01/040514号公报、日本国特开平8-205900号公报等中有记载。下面，对该评价方法进行简单说明。
首先，制备被检酵母的基因组。制备方法可采用Hereford法或乙酸钾法等任何一种公知方法(如Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，p130(1990))。以得到的基因组为对象，使用根据编码糖原合成起始因子的基因的碱基序列(优选ORF序列)设计的引物或探针，检测被检酵母的基因组中是否存在其基因或其基因的特异序列。可采用公知的方法设计引物或探针。
基因或特异序列的检出可采用公知的方法实施。例如，用含有特异序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有其碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸作为一个引物，用含有该序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有其碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸作为另一个引物，通过PCR法扩增酵母的核酸，测定扩增产物的有无、扩增产物分子量大小等。引物使用的多核苷酸的碱基数通常为10bp以上，优选15bp～25bp。此外，夹在两引物间的碱基数通常以300bp～2000bp为宜。
PCR法的反应条件无特别限定，如可采用变性温度：90℃～95℃，退火温度：40℃～60℃，延伸温度：60℃～75℃，循环数：10次以上等条件。得到的反应生成物通过使用琼脂糖凝胶等的电泳法等被分离，能够测定扩增产物的分子量。通过该方法，根据扩增产物的分子量包含特定DNA分子的大小，预测、评价该酵母的耐干燥性及/或耐低温保存性。并且，通过分析扩增产物的碱基序列，可以更准确地预测、评价上述性质。
在本发明中，培养被检酵母，通过测定具有序列号1或序列号3的碱基序列、且编码糖原合成起始因子的基因的表达量，也能够评价被检酵母的耐干燥性及/或耐低温保存性。此外，编码糖原合成起始因子的基因的表达量的测定，能够通过培养被检酵母，对该基因的转录产物mRNA或蛋白质进行定量来进行。mRNA或蛋白质的定量可采用公知的方法进行。mRNA的定量例如可通过Northern杂交法、定量RT-PCR进行，蛋白质的定量例如可通过Western印迹法进行(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons 1994-2003)。
培养被检酵母，测定具有序列号1或序列号3的碱基序列、且编码糖原合成起始因子的基因的表达量，通过选择与目标糖原合成能力相应的上述基因表达量的酵母，能够选择出适于酿造所期望酒精饮料的酵母。此外，也可以培养标准酵母及被检酵母，测定各酵母中上述基因的表达量，通过比较标准酵母和被检酵母中上述基因的表达量，从而选择所期望的酵母。具体来说，例如培养标准酵母及被检酵母，测定具有序列号1或序列号3的碱基序列、且编码糖原合成起始因子的基因在各酵母中的表达量，通过选择与标准酵母相比该基因为高表达的菌株，能够选择出适于酿造所期望酒精饮料、适于生产有用物质的酵母。
培养被检酵母，通过选择有高糖原合成起始活性的蛋白质的酵母，能够选择出适于酿造所期望酒精饮料、或适于生产有用物质的被检酵母。
所述情况下，作为被检酵母或标准酵母，例如可以使用导入上述本发明载体的酵母、实施突变处理的酵母、发生自然突变的酵母等。糖原合成起始活性，例如能够根据Cheng et al.，Mol.Cell.Biol.，15(12)，6632-6640(1995)中记载的方法，通过测定酵母菌体的糖原含量来进行评价。对于突变处理，例如可以使用紫外线照射、放射线照射等物理方法，EMS(甲基磺酸乙酯)、N-甲基-N-亚硝基胍等试剂处理的化学方法等任何方法(如参照大嶋泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法、p67-75、学会出版中心等)(日语原名：大嶋泰治编著、生物化学実験法39酵母分子遺伝学実験法、p 67-75、学会出版センタ一)。
能够作为标准酵母、被检酵母使用的酵母，可以为任意酵母(实用酵母)，如啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母，面包酵母，工业用酒精生产酵母，有用蛋白质生产酵母等。具体可以为酵母属(Saccharomyces)等酵母(例如Saccharomyces pastorianus、Saccharomyces cerevisiae及Saccharomycescarlsbergensis)等，在本发明中可以使用啤酒酵母如Saccharomycespastorianus W34/70等、Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、NCYC456等、Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。并且也可以使用威士忌酵母如Saccharomyces cerevisiae NCYC90等，葡萄酒酵母如协会葡萄酒用1号、葡萄酒用3号、葡萄酒用4号等，清酒酵母如协会酵母清酒用7号、清酒用9号等，面包酵母如NBRC 0555、NBRC 1346、NBRC 2043等，但并不限于这些酵母。在本发明中，优选使用啤酒酵母如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。标准酵母、被检酵母也可以从上述酵母组中任意组合选择。
实施例
下面根据实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不限于下述实施例。实施例1编码糖原合成起始因子的基因(non-ScGLG1)的克隆
使用日本国特开2004-283169所述的比较数据库进行检索，结果发现了编码啤酒酵母的特有糖原合成起始因子的non-ScGLG1基因(序列号1)。根据获得的碱基序列信息，分别设计用于扩增全长基因的引物non-ScGLG1_for(序列号5)/non-ScGLG1_rv(序列号6)，通过以基因组解读株Saccharomycespastorianus Weihenstepan34/70株(简称“W34/70株”)的染色体DNA为模板的PCR，取得包括non-ScGLG1全长基因的DNA片段。
将上述得到的non-ScGLG1基因片段，通过TA克隆插入pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen公司制造)。用Sanger法(F.Sanger，Science，214，1215，1981)分析并确定non-ScGLG1基因的碱基序列。
实施例2啤酒酿造试验中non-ScGLG1基因表达分析
使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株进行啤酒酿造试验造，从发酵中的啤酒酵母菌体中提取的mRNA通过啤酒酵母DNA微阵列进行检测。
麦芽汁浸出物浓度           12.69％
麦芽汁体积                 70L
麦芽汁中溶解氧浓度         8.6ppm
发酵温度                   15℃
酵母添加量                 12.8×106细胞/mL
对发酵液进行经时采样，观察酵母增殖量(图1)、浸出物表观浓度(图2)的经时变化。与此同时对酵母菌体进行采样，将制备的mRNA用生物素进行标记，使其与啤酒酵母DNA微阵列进行杂交。使用GeneChip Operating System(GCOS；GeneChip Operating Software 1.0，Affymetrix公司制造)进行信号检测，non-ScGLG1基因的表达模式如图3所示。根据该结果确认在通常的啤酒发酵中non-ScGLG1基因进行表达。
实施例3non-ScGLG1高表达株的制作
将实施例1所述方法得到的non-ScGLG1/pCR2.1-TOPO用限制酶SacI及NotI酶解，制备包括non-ScGLG1基因的DNA片段。将该片段连接于经限制酶SacI及NotI处理的pYCGPYNot上，构建non-ScGLG1高表达载体non-ScGLG1/pYCGPYNot。pYCGPYNot为YCp型酵母表达载体，导入的基因通过丙酮酸激酶基因PYK1的启动子进行高表达。酵母的选择性标记包括氨基糖苷类抗生素(Geneticin)抗性基因G418r，大肠杆菌的选择性标记包括氨苄青霉素抗性基因Ampr。
使用上述方法制作的高表达载体，采用日本国特开平07-303475记载的方法转化AJL4004株，采用含有氨基糖苷类抗生素(Geneticin)300mg/L的YPD平板培养基(1％酵母浸出物，2％多聚蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂)选择转化体。
实施例4non-ScGLG1高表达株的耐干燥性评价
亲株(AJL4004株)及根据实施例3中记载的方法得到的non-ScGLG1高表达株的耐干燥性采用以下方法评价。
取1白金耳酵母接种于10mL麦芽汁(含100mg/L氨基糖苷类抗生素(Geneticin))中，30℃振荡培养过夜。将该前培养液接种于10mL麦芽汁(同上)中，且OD660＝0.5，开始增菌培养，培养2天使酵母增殖至稳定期。测定结束时的菌体浊度，将其悬浮于灭菌水中且使OD660＝2。将如此调整的悬浮液100μL装入1.5mL微量管内，用减压干燥机(DNA110 SpeedVac(注册商标)、ThermoSavant公司制造)处理1小时，使菌体干燥固化。
活菌率的测定采用下述方法，将上述得到的干燥菌体再悬浮于50μL灭菌水中，加入50μL的0.02％亚甲蓝溶液(pH4.5)，将失去还原能力的被染成蓝色的菌体作为死菌体。接着，在显微镜下观察该悬浮液，使用鉴定细胞死活体系(DA细胞计数仪、Yamato科学株式会社制造)计算活菌率。为了减小实验误差，计算时使基数为2000个细胞以上。
如图4所示，亲株的活菌率为19.9％，而高表达株的活菌率为38.9％，由此表明non-ScGLG1高表达使酵母的耐干燥性提高。
实施例5non-ScGLG1高表达株的耐低温性评价
亲株(AJL4004株)及根据实施例3中记载的方法得到的non-ScGLG1高表达株的耐低温性采用以下方法评价。采用实施例4中记载的方法培养，将制成的OD660＝2的酵母悬浮液分别在2个微量管内各注入900μL，向其中一个微量管内加入100μL灭菌水，另一个微量管内加入100μL的99.5％的乙醇(最终浓度10％)。将其5℃保存4周时间，然后采用与实施例4同样的方法计算活菌率。
如图5所示，保存后的non-ScGLG1高表达株的活菌率比亲株高，其效果在10％乙醇存在下更明显。由此表明non-ScGLG1高表达使酵母的耐低温保存性得到了提高。
实施例6编码糖原合成起始因子的基因(non-ScGLG2)的克隆
使用日本国特开2004-283169所述的比较数据库进行检索，结果发现了编码啤酒酵母的糖原合成起始因子的non-ScGLG2基因(序列号3)。根据获得的碱基序列信息，分别设计用于扩增全长基因的引物non-ScGLG2_for(序列号7)/non-ScGLG2_rv(序列号8)，通过以基因组解读株Saccharomyces pastorianusWeihenstepan34/70株(简称“W34/70株”)的染色体DNA为模板的PCR，取得包括non-ScGLG2全长基因的DNA片段。
将上述得到的non-ScGLG2基因片段，通过TA克隆插入pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen公司制造)。用Sanger法(F.Sanger，Science，214，1215，1981)分析并确定non-ScGLG2基因的碱基序列。
实施例7啤酒酿造试验中non-ScGLG2基因表达分析
使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株进行啤酒酿造试验造，从发酵中的啤酒酵母菌体中提取的mRNA通过啤酒酵母DNA微阵列进行检测。
麦芽汁浸出物浓度              12.69％
麦芽汁体积                    70L
麦芽汁中溶解氧浓度            8.6ppm
发酵温度                      15℃
酵母添加量                    12.8×106细胞/mL
对发酵液进行经时采样，观察酵母增殖量(图6)、浸出物表观浓度(图7)的经时变化。与此同时对酵母菌体进行采样，将制备的mRNA用生物素进行标记，使其与啤酒酵母DNA微阵列进行杂交。使用GeneChip Operating System(GCOS；GeneChip Operating Software 1.0，Affymetrix公司制造)进行信号检测，non-ScGLG2基因的表达模式如图8所示。根据该结果确认在通常的啤酒发酵中non-ScGLG2基因进行表达。
实施例8non-ScGLG2高表达株的制作
将实施例6所述方法得到的non-ScGLG2/pCR2.1-TOPO用限制酶SacI及NotI酶解，制备包含non-ScGLG2基因的DNA片段。将该片段连接于经限制酶SacI及NotI处理的实施例3所述的酵母表达载体pYCGPYNot上，构建non-ScGLG2高表达载体non-ScGLG2/pYCGPYNot。
使用上述方法制作的高表达载体，采用日本国特开平07-303475记载的方法转化AJL4004株，采用含有氨基糖苷类抗生素(Geneticin)300mg/L的YPD平板培养基(1％酵母浸出物，2％多聚蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂)选择转化体。
实施例9 non-ScGLG2高表达株的耐干燥性评价
亲株(AJL4004株)及根据实施例8中记载的方法得到的non-ScGLG2高表达株的耐干燥性，采用与实施例4同样的方法进行评价。
如图9所示，亲株的活菌率为19.9％，而高表达株的活菌率为30.3％，由此表明non-ScGLG2高表达使酵母的耐干燥性提高。
实施例10 non-ScGLG2高表达株的耐低温性评价
亲株(AJL4004株)及根据实施例8中记载的方法得到的non-ScGLG2高表达株的耐低温性，采用与实施例5同样的方法进行评价。
如图10所示，保存后的non-ScGLG2高表达株的活菌率比亲株高，其效果在10％乙醇存在下更明显。由此表明non-ScGLG2高表达使酵母的耐低温保存性提高。
根据本发明，能够提高酵母的耐干燥性及/或耐低温保存性，因此能够使酵母长期稳定保存，能够提高酒精饮料(如啤酒)酿造、面包制造、工业用酒精生产、有用蛋白质生产等有用物质的制造等的效率。
序列表
<110>三得利株式会社(Suntory Limited)
<120>编码糖原合成起始因子的基因及其用途
(Gene encoding self-glucosylating initiator of glycogen synthesis and use thereof)
<130>G06-0107CN
<150>JP2006-55570
<151>2006-03-01
<160>8
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1680
<212>DNA
<213>酵母属(Saccharomyces sp.)
<400>1
atgtgtagaa aactagccat tgtcacacta ctgtactccg cggattattt accgggcgtg   60
tttgctcttg gtcatcaagt taacaaactg ttaaaggaag cgggtaggaa agatagaatt  120
gatgcatgcc ttgttgtgac aactccctta ttcaatgaca ttttgagcga tttggccaaa  180
gatcttttga aaacaatata cgacgatatc gtacttgtaa accctttgga atgccaagat  240
gaaagtattc agagaaacag tgaaaatcta gctcttttgg aaaggcccga attgtcgttt  300
gctctaataa aggcaagact atgggaacta acccagtacg aacaagttct atatttggat  360
tcagacactt tacccctgaa aaaagacttt ctaagattgt tcgacattat gtctaaacaa  420
actaagttac agattggtgc tgttgctgac attggctggc cagatatttt caatagcggc   480
gttatgatgc tgataccaga tgctgatact gcatctgttt tacagaacta tgttatcgaa   540
aatacttcaa ttgatggtgc tgatcagggc attttgaatc agttttttaa ccaaaactgc   600
tgcacggatg agctgctcaa agaaagcttt ccccgagagt gggtacagtt atcatttaca   660
tataatgtga ccacccctaa tcttggttat gaatcttcac ctgctatgaa ttattttaaa   720
ccaactatca aactgattca tttcattggc caacataaac catggtctct gtggtctcag   780
acaaactttg ttagaaacga atacaatacc caatggaatg gagtgtacga ggactttaag   840
caggaaaaca aattggtaga tgacgtctcg aagattgata tcagtgattt taatgaggac   900
aataatgttc aaacagcatc tcaagaaact attccgcaaa cagcatcttc aggggctatt   960
cctcaagata atgatttttc tactgaaaag gaagtcgaaa caatagacac aaagcaagaa  1020
gacaccagag tccagctcaa taagccagct cccgttcctg ttccactgaa tttcactgaa  1080
tggttgacaa ctttcataaa caaggataat gtgaattccc aggcaatgaa caaaatgcac  1140
gaacacgaag gaaatgatag tggttttgat aaagacgacg ctaaatcaga tgaagacatc  1200
tacgtgaata acagcgacgc taaaccagac caagaaagta ttgcggataa aaacgacgct  1260
aaatcagatc aagacggcca tgtgaataac aatgactcta atccagacca agagagtcac  1320
gcggatgtca cacaagaccc tattacttat aaagatgaca tatcagagga tatagaaccg  1380
cctgtgccta ccgaagacga cgtgaaactt ctggaacagg atgaggaggg ttacgatgaa  1440
ttccttctag acgtatgcga tgcagatgcg atcaacaacg aagaaggaga agatttcgat  1500
gtaggaaaag tgggaaggag tgttgaagat gcactcgaaa aagagaatcc gacagaggac  1560
gaacccaaaa attcacctca agaaatgccg aacttcaggt tcgactggga agattctgat  1620
tacctatcaa aagttgaaag gtatttccct gatgacgtct ttgaatatgc agtagaatga  1680
<210>2
<211>559
<212>PRT
<213>酵母属(Saccharomyces sp.)
<400>2
Met Cys Arg Lys Leu Ala Ile Val Thr Leu Leu Tyr Ser Ala Asp Tyr
1               5                   10                  15
Leu Pro Gly Val Phe Ala Leu Gly His Gln Val Asn Lys Leu Leu Lys
            20                  25                  30
Glu Ala Gly Arg Lys Asp Arg Ile Asp Ala Cys Leu Val Val Thr Thr
        35                  40                  45
Pro Leu Phe Asn Asp Ile Leu Ser Asp Leu Ala Lys Asp Leu Leu Lys
    50                  55                  60
Thr Ile Tyr Asp Asp Ile Val Leu Val Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp
65                  70                  75                  80
Glu Ser Ile Gln Arg Asn Ser Glu Asn Leu Ala Leu Leu Glu Arg Pro
                85                  90                  95
Glu Leu Ser Phe Ala Leu Ile Lys Ala Arg Leu Trp Glu Leu Thr Gln
            100                 105                 110
Tyr Glu Gln Val Leu Tyr Leu Asp Ser Asp Thr Leu Pro Leu Lys Lys
        115                 120                 125
Asp Phe Leu Arg Leu Phe Asp Ile Met Ser Lys Gln Thr Lys Leu Gln
    130                 135                 140
Ile Gly Ala Val Ala Asp Ile Gly Trp Pro Asp Ile Phe Asn Ser Gly
145                 150                 155                 160
Val Met Met Leu Ile Pro Asp Ala Asp Thr Ala Ser Val Leu Gln Asn
                165                 170                 175
Tyr Val Ile Glu Asn Thr Ser Ile Asp Gly Ala Asp Gln Gly Ile Leu
            180                 185                 190
Asn Gln Phe Phe Asn Gln Asn Cys Cys Thr Asp Glu Leu Leu Lys Glu
        195                 200                 205
Ser Phe Pro Arg Glu Trp Val Gln Leu Ser Phe Thr Tyr Asn Val Thr
    210                 215                 220
Thr Pro Asn Leu Gly Tyr Glu Ser Ser Pro Ala Met Asn Tyr Phe Lys
225                 230                 235                 240
Pro Thr Ile Lys Leu Ile His Phe Ile Gly Gln His Lys Pro Trp Ser
                245                 250                 255
Leu Trp Ser Gln Thr Asn Phe Val Arg Asn Glu Tyr Asn Thr Gln Trp
            260                 265                 270
Asn Gly Val Tyr Glu Asp Phe Lys Gln Glu Asn Lys Leu Val Asp Asp
        275                 280                 285
Val Ser Lys Ile Asp Ile Ser Asp Phe Asn Glu Asp Asn Asn Val Gln
    290                 295                 300
Thr Ala Ser Gln Glu Thr Ile Pro Gln Thr Ala Ser Ser Gly Ala Ile
305                 310                 315                 320
Pro Gln Asp Asn Asp Phe Ser Thr Glu Lys Glu Val Glu Thr Ile Asp
                325                 330                 335
Thr Lys Gln Glu Asp Thr Arg Val Gln Leu Asn Lys Pro Ala Pro Val
            340                 345                 350
Pro Val Pro Leu Asn Phe Thr Glu Trp Leu Thr Thr Phe Ile Asn Lys
        355                 360                 365
Asp Asn Val Asn Ser Gln Ala Met Asn Lys Met His Glu His Glu Gly
    370                 375                 380
Asn Asp Ser Gly Phe Asp Lys Asp Asp Ala Lys Ser Asp Glu Asp Ile
385                 390                 395                 400
Tyr Val Asn Asn Ser Asp Ala Lys Pro Asp Gln Glu Ser Ile Ala Asp
                405                 410                 415
Lys Asn Asp Ala Lys Ser Asp Gln Asp Gly His Val Asn Asn Asn Asp
            420                 425                 430
Ser Asn Pro Asp Gln Glu Ser His Ala Asp Val Thr Gln Asp Pro Ile
        435                 440                 445
Thr Tyr Lys Asp Asp Ile Ser Glu Asp Ile Glu Pro Pro Val Pro Thr
    450                 455                 460
Glu Asp Asp Val Lys Leu Leu Glu Gln Asp Glu Glu Gly Tyr Asp Glu
465                 470                 475                 480
Phe Leu Leu Asp Val Cys Asp Ala Asp Ala Ile Asn Asn Glu Glu Gly
                485                 490                 495
Glu Asp Phe Asp Val Gly Lys Val Gly Arg Ser Val Glu Asp Ala Leu
            500                 505                 510
Glu Lys Glu Asn Pro Thr Glu Asp Glu Pro Lys Asn Ser Pro Gln Glu
        515                 520                 525
Met Pro Asn Phe Arg Phe Asp Trp Glu Asp Ser Asp Tyr Leu Ser Lys
    530                 535                 540
Val Glu Arg Tyr Phe Pro Asp Asp Val Phe Glu Tyr Ala Val Glu
545                 550                 555
<210>3
<211>1143
<212>DNA
<213>酵母属(Saccharomyces sp.)
<400>3
atgattaaga aagttgctct ttgcacgtta ttatattcac gggggtattt acctggtgcc   60
ttaactttag cgtaccaatt acaaggactc ttgagccaga ctgtagtaga ggacgaaata  120
actatatgtc tattagttgc aagaacgttg ttcgaagatg aatttactcc ccaggaaata  180
gttttgataa gaagcctctt caaggagatc attatcatag aatcgttaga gggtcaagcg  240
aagagcgtcg aaaataacaa ggcaaatctt gacttgttga aaaggccgga gctatctttt  300
actttactaa aagccagatt atgggaactg gtgcagttcg atcaggtgct gtttttggat  360
gcggatactt taccattgaa caaggagttt tttaaaattc tacagctata tcctgaacaa  420
acgaggttcc agatcgctgc tgttcccgat atcggatggc ccgatatgtt taacaccggt  480
gtcttgctac tgattccaga tttggaaatg gcgaagagct tgcaggattt tttggtcaag  540
actgtatcga ttgacggggc tgatcaaggt attttcaatc aatttttcaa ccccgcatgc  600
aattacagca aggagatctt gcacaaaata tctccgctta tggagtggat acgacttccg  660
ttcatctata acgtaacaat gcccaattac ggataccagt cctcgcctgc gatgagcttt   720
ttccagcagc atatcaacct agttcatttc atcggaacgt tcaaaccgtg gtcacatagt   780
gcattcaacc acgataatta ttattatcaa ttatggaggg atacagagag ggatctacac   840
aacgaacacc acttgagtaa ttatttcaca cgcttgcaac tcggcaatct cgaaagggaa   900
acagatttcc atcacgaggc tccctgcatc aacacgctgc taaggcaaaa ctcaagggag   960
aatcaaaagc aggttagccc tgatgaaacc caggtaggtc ctaatgctgc acaaaatata  1020
cctatacaag aacacgatca aaaagtgaca actgctgata ctcaaagtgc cttcaagttt  1080
gagtgggaga atacggacta tttgcaccac gtccagagag cgttcccaga ctccgatatc  1140
taa                                                                1143
<210>4
<211>380
<212>PRT
<213>酵母属(Saccharomyces sp.)
<400>4
Met Ile Lys Lys Val Ala Leu Cys Thr Leu Leu Tyr Ser Arg Gly Tyr
1               5                   10                  15
Leu Pro Gly Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Gln Leu Gln Gly Leu Leu Ser
            20                  25                  30
Gln Thr Val Val Glu Asp Glu Ile Thr Ile Cys Leu Leu Val Ala Arg
        35                  40                  45
Thr Leu Phe Glu Asp Glu Phe Thr Pro Gln Glu Ile Val Leu Ile Arg
    50                  55                  60
Ser Leu Phe Lys Glu Ile Ile Ile Ile Glu Ser Leu Glu Gly Gln Ala
65                  70                  75                  80
Lys Ser Val Glu Asn Asn Lys Ala Asn Leu Asp Leu Leu Lys Arg Pro
                85                  90                  95
Glu Leu Ser Phe Thr Leu Leu Lys Ala Arg Leu Trp Glu Leu Val Gln
            100                 105                 110
Phe Asp Gln Val Leu Phe Leu Asp Ala Asp Thr Leu Pro Leu Asn Lys
        115                 120                 125
Glu Phe Phe Lys Ile Leu Gln Leu Tyr Pro Glu Gln Thr Arg Phe Gln
    130                 135                 140
Ile Ala Ala Val Pro Asp Ile Gly Trp Pro Asp Met Phe Asn Thr Gly
145                 150                 155                 160
Val Leu Leu Leu Ile Pro Asp Leu Glu Met Ala Lys Ser Leu Gln Asp
                165                 170                 175
Phe Leu Val Lys Thr Val Ser Ile Asp Gly Ala Asp Gln Gly Ile Phe
            180                 185                 190
Asn Gln Phe Phe Asn Pro Ala Cys Asn Tyr Ser Lys Glu Ile Leu His
        195                 200                 205
Lys Ile Ser Pro Leu Met Glu Trp Ile Arg Leu Pro Phe Ile Tyr Asn
    210                 215                 220
Val Thr Met Pro Asn Tyr Gly Tyr Gln Ser Ser Pro Ala Met Ser Phe
225                 230                 235                 240
Phe Gln Gln His Ile Asn Leu Val His Phe Ile Gly Thr Phe Lys Pro
                245                 250                 255
Trp Ser His Ser Ala Phe Asn His Asp Asn Tyr Tyr Tyr Gln Leu Trp
            260                 265                 270
Arg Asp Thr Glu Arg Asp Leu His Asn Glu His His Leu Ser Asn Tyr
        275                 280                 285
Phe Thr Arg Leu Gln Leu Gly Asn Leu Glu Arg Glu Thr Asp Phe His
    290                 295                 300
His Glu Ala Pro Cys Ile Asn Thr Leu Leu Arg Gln Asn Ser Arg Glu
305                 310                 315                 320
Asn Gln Lys Gln Val Ser Pro Asp Glu Thr Gln Val Gly Pro Asn Ala
                325                 330                 335
Ala Gln Asn Ile Pro Ile Gln Glu His Asp Gln Lys Val Thr Thr Ala
            340                 345                 350
Asp Thr Gln Ser Ala Phe Lys Phe Glu Trp Glu Asn Thr Asp Tyr Leu
        355                 360                 365
His His Val Gln Arg Ala Phe Pro Asp Ser Asp Ile
    370                 375                 380
<210>5
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>引物(Primer)
<400>5
gagctcatag cggccatgtg tagaaaacta gccattgtca       40
<210>6
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>引物(Primer)
<400>6
ggatcctatg cggccgcgta cgtgaaagaa ctacactttc tt    42
<210>7
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>引物(Primer)
<400>7
gagctcatag cggccatgat taagaaagtt gctctttgca       40
<210>8
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>引物(Primer)
<400>8
ggatcctatg cggccgccag cgaattgacc cggccttact at    42

Claims (22)

1. 多核苷酸，其为从下述(a)～(f)组成的群组中选择的多核苷酸，
(a)多核苷酸，其含有由序列号1或序列号3的碱基序列所组成的多核苷酸；
(b)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质由序列号2或序列号4的氨基酸序列所组成；
(c)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质由在序列号2或序列号4的氨基酸序列中缺失、替换、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列所组成、且具有糖原合成起始活性；
(d)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序列号2或序列号4的氨基酸序列有60％以上一致性的氨基酸序列、且具有糖原合成起始活性；
(e)多核苷酸，其含有：在严谨条件下与由序列号1或序列号3的碱基序列的互补碱基序列所组成的多核苷酸进行杂交、且编码具有糖原合成起始活性的蛋白质的多核苷酸；以及
(f)多核苷酸，其含有：在严谨条件下与编码由序列号2或序列号4的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的碱基序列的互补碱基序列所组成的多核苷酸进行杂交、且编码具有糖原合成起始活性的蛋白质的多核苷酸。
2. 如权利要求1所述的多核苷酸，其选自由下述(g)～(i)组成的群组，
(g)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质由序列号2或序列号4的氨基酸序列所组成、或者由在序列号2或序列号4的氨基酸序列中缺失、替换、插入及/或添加1～10个氨基酸后的氨基酸序列所组成、且具有糖原合成起始活性；
(h)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序列号2或序列号4的氨基酸序列有90％以上一致性的氨基酸序列、且具有糖原合成起始活性；以及
(i)多核苷酸，其含有：在高严谨条件下与由序列号1或序列号3的碱基序列所组成的多核苷酸进行杂交、或与由序列号1或序列号3的碱基序列的互补碱基序列所组成的多核苷酸进行杂交、且编码具有糖原合成起始活性的蛋白质的多核苷酸。
3. 如权利要求1所述的多核苷酸，其含有由序列号1或序列号3的碱基序列所组成的多核苷酸。
4. 如权利要求1所述的多核苷酸，其含有编码由序列号2或序列号4的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸。
5. 如权利要求1～4中任一项所述的多核苷酸，其为DNA。
6. 蛋白质，其为由权利要求1～5中任一项所述的多核苷酸编码的蛋白质。
7. 载体，其含有权利要求1～5中任一项所述的多核苷酸。
8. 酵母，其为导入权利要求7所述的载体的酵母。
9. 如权利要求8所述的酵母，其耐干燥性增强。
10. 如权利要求8所述的酵母，其耐低温保存性增强。
11. 如权利要求9所述的酵母，其中，通过增大权利要求6所述的蛋白质的表达量，增强耐干燥性。
12. 如权利要求10所述的酵母，其中，通过增大权利要求6所述的蛋白质的表达量，增强耐低温保存性。
13. 酒精饮料的制造方法，其使用权利要求8～12中任一项所述的酵母。
14. 如权利要求13所述的酒精饮料的制造方法，其中，酿造的酒精饮料是麦芽饮料。
15. 如权利要求13所述的酒精饮料的制造方法，其中，酿造的酒精饮料是葡萄酒。
16. 酒精饮料，其为采用权利要求13～15中任一项所述的方法制造的酒精饮料。
17. 评价方法，其为使用根据具有序列号1或序列号3的碱基序列、且编码糖原合成起始因子的基因的碱基序列设计的引物或探针，对被检酵母的耐干燥性及/或耐低温保存性进行评价的方法。
18. 评价方法，其为通过培养被检酵母，对具有序列号1或序列号3的碱基序列、且编码糖原合成起始因子的基因的表达量进行测定，来评价被检酵母的耐干燥性及/或耐低温保存性的方法。
19. 酵母的选择方法，其为通过培养被检酵母，对权利要求6所述的蛋白质进行定量，或者对具有序列号1或序列号3的碱基序列、且编码糖原合成起始因子的基因的表达量进行测定，来选择与目标耐干燥性及/或耐低温保存性相应的所述蛋白质的量或所述基因表达量的被检酵母的方法。
20. 如权利要求19所述的酵母的选择方法，其为通过培养标准酵母和被检酵母，对具有序列号1或序列号3的碱基序列、且编码糖原合成起始因子的基因在各酵母中的表达量进行测定，来选择与标准酵母相比该基因为高表达的被检酵母的方法。
21. 如权利要求19所述的酵母的选择方法，其为通过培养标准酵母和被检酵母，对各酵母中的权利要求6所述的蛋白质进行定量，来选择该蛋白质的量比标准酵母多的被检酵母的方法。
22. 酒精饮料制造方法，其特征在于，使用权利要求8～12中任一项所述的酵母或根据权利要求19～21中任一项所述的方法选择出的酵母。
CN200710084680XA 2006-03-01 2007-03-01 编码糖原合成起始因子的基因及其用途 Expired - Fee Related CN101255430B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006055570 2006-03-01
JP2006-055570 2006-03-01
JP2006055570 2006-03-01

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2012100987847A Division CN102643834B (zh) 2006-03-01 2007-03-01 编码糖原合成起始因子的基因及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101255430A true CN101255430A (zh) 2008-09-03
CN101255430B CN101255430B (zh) 2012-05-30

Family

ID=38101755

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200710084680XA Expired - Fee Related CN101255430B (zh) 2006-03-01 2007-03-01 编码糖原合成起始因子的基因及其用途
CN2012100987847A Expired - Fee Related CN102643834B (zh) 2006-03-01 2007-03-01 编码糖原合成起始因子的基因及其用途

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2012100987847A Expired - Fee Related CN102643834B (zh) 2006-03-01 2007-03-01 编码糖原合成起始因子的基因及其用途

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20090029002A1 (zh)
EP (1) EP1879915B1 (zh)
JP (1) JP4478718B2 (zh)
KR (1) KR20080021593A (zh)
CN (2) CN101255430B (zh)
AU (1) AU2007223596B2 (zh)
CA (1) CA2606130A1 (zh)
DK (1) DK1879915T3 (zh)
WO (1) WO2007102351A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5509822B2 (ja) * 2009-12-07 2014-06-04 株式会社リコー 画像形成装置

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5792921A (en) * 1992-02-14 1998-08-11 Londesborough; John Increasing the trehalose content of organisms by transforming them with combinations of the structural genes for trehalose synthase
GB9606187D0 (en) * 1996-03-23 1996-05-29 Inst Of Food Research Production of vanillin
US6753314B1 (en) * 1999-04-01 2004-06-22 Curagen Corporation Protein-protein complexes and methods of using same
DK1378565T3 (da) * 2001-02-02 2006-09-25 Suntory Ltd Fremgangsmåde til fremstilling af aktiv törgær
AU2002252093A1 (en) * 2001-02-27 2002-09-12 Genome Therapeutics Corporation Method for the systematic discovery of genes and genes discovered thereby
US20050220935A1 (en) * 2002-06-25 2005-10-06 Sapporo Breweries Limited Beer-like alcoholic beverage and process for producing the same
WO2004079008A1 (en) * 2003-03-04 2004-09-16 Suntory Limited Screening method for genes of brewing yeast
US20060046253A1 (en) * 2004-09-02 2006-03-02 Suntory Limited Method for analyzing genes of industrial yeasts

Also Published As

Publication number Publication date
DK1879915T3 (en) 2017-03-06
KR20080021593A (ko) 2008-03-07
US20090029002A1 (en) 2009-01-29
JP2008530976A (ja) 2008-08-14
CN102643834A (zh) 2012-08-22
CA2606130A1 (en) 2007-09-13
AU2007223596A1 (en) 2007-09-13
EP1879915B1 (en) 2016-12-21
WO2007102351A1 (en) 2007-09-13
AU2007223596B2 (en) 2010-07-01
JP4478718B2 (ja) 2010-06-09
EP1879915A1 (en) 2008-01-23
CN102643834B (zh) 2013-08-21
CN101255430B (zh) 2012-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101037699B (zh) 3-磷酸甘油脱氢酶基因及其用途
CN101238147A (zh) 二羟酸脱水酶基因及其用途
CN101029311B (zh) 过氧化氢酶基因及其用途
CN101024837A (zh) 酰基CoA:乙醇O－酰基转移酶/酯酶基因及其用途
CN101952425B (zh) 葡萄糖诱导性失活及降解抗性转运蛋白基因及其用途
JP2009060790A (ja) 酵母に乾燥耐性および／または低温保存耐性を付与する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子及びその用途
CN102643834B (zh) 编码糖原合成起始因子的基因及其用途
CN101024838A (zh) 编码乙酰乳酸合成酶的基因及其用途
CN101041829B (zh) 编码糖原分支酶的基因及其用途
CN101024833B (zh) 编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因及其用途
CN101024836B (zh) 编码与酵母的凝集性相关的蛋白质的基因及其用途
CN101029312B (zh) 过氧化氢酶基因及其用途
JP2009528019A (ja) トレハロース−６リン酸脱リン酸化酵素をコードする遺伝子及びその用途
CN101041822B (zh) 编码与酵母的凝集性相关的蛋白质的基因及其用途
CN101978053B (zh) 葡萄糖诱导性失活及降解抗性转运蛋白基因及其用途
CN101041826B (zh) 编码糖原合成酶的基因及其用途
CN101253266A (zh) 使低温发酵性及/或耐冷冻性增强的基因及其用途
CN1920043B (zh) 半胱氨酸合成酶基因及其用途
CN101041824B (zh) 编码与酵母的凝集性相关的蛋白质的基因及其用途
CN101029309B (zh) 编码与酵母的凝集性相关的蛋白质的基因及其用途
CN1936006A (zh) 编码细胞壁甘露糖蛋白的基因及其用途
CN101024835B (zh) 氨转运蛋白基因及其用途
CN101253265A (zh) 色氨酸转运蛋白基因及其用途
JP2009528018A (ja) トレハロース合成促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子及びその用途
CN101024834A (zh) 氨转运蛋白基因及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: SUNTORY HOLDINGS CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: SUNTORY LTD.

Effective date: 20090717

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20090717

Address after: Osaka City, Osaka of Japan

Applicant after: Suntory Holdings Limited

Address before: Osaka City, Osaka of Japan

Applicant before: Suntory Ltd.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20120530

Termination date: 20160301