CN101041829B

CN101041829B - 编码糖原分支酶的基因及其用途

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Publication number: CN101041829B
Application number: CN2007100852656A
Authority: CN
Inventors: 中尾嘉宏; 儿玉由纪子; 下永朋子
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2006-02-28
Filing date: 2007-02-16
Publication date: 2011-07-27
Anticipated expiration: 2027-02-16
Also published as: EP1996703A1; EP1996703B1; AU2007219951B2; CN101041829A; CA2638771A1; US20100221383A1; WO2007099750A1; JP2009528020A; AU2007219951A1; DK1996703T3

Abstract

本发明涉及编码糖原分支酶的基因及其用途，特别涉及耐干燥性及/或耐低温保存性良好的酿造酵母、使用该酵母制造的酒精饮料及其制造方法等。更加具体地说，本发明涉及通过提高编码酿造酵母的糖原分支酶Glc3p的GLC3基因特别是啤酒酵母的特征基因nonScGLC3的表达量从而使耐干燥性及/或耐低温保存性提高的酵母、使用该酵母的酒精饮料制造方法等。

Description

编码糖原分支酶的基因及其用途

技术领域

本发明涉及编码糖原分支酶的基因及其用途，特别涉及耐干燥性及/或耐低温保存性良好的实用酵母、使用该酵母制造的酒精饮料及其制造方法。更加具体地说，本发明涉及通过提高编码酿造酵母的具有糖原分支酶活性的蛋白质Glc3p的基因GLC3特别是啤酒酵母的特征基因nonScGLC3的表达量从而使耐干燥性及/或耐低温保存性提高的酵母、使用该酵母制造酒精饮料的方法等。此外，本发明的酵母也可用作面包酵母或工业用酵母。

背景技术

啤酒酿造工序具有的特征是，对发酵结束后的酵母进行回收并在下次发酵中使用(称为连续酿造)。在酒精存在的条件下，将酵母保存在温度保持为约0～3℃的槽内，而在此期间如果酵母死亡不仅会影响下次发酵，而且因自溶流出的细胞构成物可能给产品带来不好的气味。因此，使用耐低温保存性良好的酵母，对自由设计工序、稳定生产高质量产品非常重要。

连续酿造的次数根据发酵条件、使用酵母的特性而不同，经过一定次数后终止。生产新的发酵酵母的工序称为繁殖，从小规模经过多阶段的规模放大进行放大培养，一般需要数日～数周时间，因此如果能够缩短工期、或使预先大量培养的菌体在低温或干燥状态下长期稳定保存，在生产效率方面将会有很大价值。

有关维持高活菌率的干燥酵母的制造方法，已经对干燥装置或温度、添加乳化剂等制造条件进行了各种研究。例如L-干燥法能够维持极高的活菌率，但另一方面，因为耗时长和成本高，在实际生产规模中使用不现实。

有关酵母的耐低温性，以面包酵母为中心，已报道了几种以提高耐冷冻性为目的的试验。这是因为与啤酒、清酒等的酿造酵母在低温发酵相比，面包酵母Saccharomyces cerevisiae的低温保存性差。例如：在JP特开平11-155559号公报、JP特开2003-304864号公报中，主要通过筛选法发现具有耐冷冻性及耐干燥性的面包酵母。此外，作为使用基因工程技术的例子，JP特开平10-117771号公报中报道了破坏NTH1(海藻糖基因)的海藻糖高积累菌株，JP特开2001-238665号公报中报道了破坏CAR1(精氨酸分解酶基因)的精氨酸等特定氨基酸的高积累菌株。

发明内容

在上述状况下，期待利用编码与酿造酵母的耐干燥性及/或耐低温保存性相关的蛋白质的基因以及该蛋白质，能够高效率生产酒精饮料或有用物质。

本发明者为了解决上述课题进行了精心研究，结果从啤酒酵母中成功鉴定、分离出编码糖原分支酶(glycogen branching enzyme)的基因，并且制备了将得到的基因导入酵母中使其表达的转化酵母，证实了耐干燥性及/或耐低温保存性得到增强，从而完成了本发明。

本发明涉及编码啤酒酵母中特征存在的新型糖原分支酶的基因、该基因编码的蛋白质、该基因的表达受到调节的转化酵母、通过使用该基因表达受到调节的酵母从而促进酵母的耐干燥性及/或耐低温保存性的方法等。具体来说，本发明提供下述所示的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、导入该载体的转化酵母、使用该转化酵母的酒精饮料的制造方法等。

(1)多核苷酸，其选自由下述(a)～(f)所组成的组：

(a)多核苷酸，其包括由序列号1的核苷酸序列所组成的多核苷酸；

(b)多核苷酸，其包括编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质由序列号2或的氨基酸序列组成；

(c)多核苷酸，其包括编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质由在序列号2的氨基酸序列中缺失、替换、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列组成，且具有糖原分支酶的活性；

(d)多核苷酸，其包括编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有的氨基酸序列与序列号2的氨基酸序列有60％以上的一致性，且具有糖原分支酶的活性；

(e)多核苷酸，其包括在严谨条件下与由序列号1的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸进行杂交，且编码具有糖原分支酶活性的蛋白质的多核苷酸；以及

(f)多核苷酸，其包括在严谨条件下与由编码具有序列号2的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸进行杂交，且编码具有糖原分支酶活性的蛋白质的多核苷酸。

(2)如上述(1)所述的多核苷酸，其选自由下述(g)～(i)所组成的组：

(g)多核苷酸，其包括编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质由序列号2的氨基酸序列或者在序列号2的氨基酸序列中缺失、替换、插入及/或添加1～10个氨基酸的氨基酸序列所组成，且具有糖原分支酶的活性；

(h)多核苷酸，其包括编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序列号2的氨基酸序列有90％以上一致性的氨基酸序列，且具有糖原分支酶的活性；以及

(i)多核苷酸，其包括在高严谨条件下与由序列号1的核苷酸序列组成的多核苷酸或与由序列号1的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸进行杂交，且编码具有糖原分支酶活性的蛋白质的多核苷酸。

(3)如上述(1)所述的多核苷酸，其包括由序列号1的核苷酸序列组成的多核苷酸。

(4)如上述(1)所述的多核苷酸，其包括编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。

(5)如上述(1)～(4)中任一项所述的多核苷酸，其为DNA。

(6)蛋白质，其为由上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸编码的蛋白质。

(7)载体，其包括上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸。

(7a)上述(7)所述的载体，其包括表达盒，该表达盒包括下述构成要素(x)～(z)：

(x)在酵母细胞内可转录的启动子，

(y)连接在该启动子的有义或反义方向的上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸，以及

(z)涉及RNA分子的转录终止及多聚腺苷化作用并在酵母内起作用的信号。

(7b)上述(7)所述的载体，其包括表达盒，该表达盒包括下述构成要素(x)～(z)：

(x)在酵母细胞内可转录的启动子，

(y)连接在该启动子的有义方向的上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸，以及

(8)酵母，其为导入上述(7)～(7b)中任一项所述的载体的酵母。

(9)上述(8)所述的酵母(实用酵母)，其耐干燥性得到增强。这里，“实用酵母”是指酿造用酵母、面包酵母、工业用酵母等具有实际使用价值的酵母。

(10)上述(8)所述的酵母，其耐低温保存性得到增强。

(11)如上述(9)所述的酵母，其中，通过增大上述(6)所述的蛋白质的表达量使其耐干燥性得到增强。

(12)如上述(10)所述的酵母，其中，通过增大上述(6)所述的蛋白质的表达量使耐低温保存性得到增强。

(12a)如上述(9)～(12)中任一项所述的酵母，其为酿造用酵母。

(13)酒精饮料的制造方法，其使用上述(8)～(12a)中任一项所述的酵母。

(14)如上述(13)所述的酒精饮料的制造方法，其中，酿造的酒精饮料是麦芽饮料。

(15)如上述(13)所述的酒精饮料的制造方法，其中，酿造的酒精饮料是葡萄酒。

(16)酒精饮料，其为采用上述(13)～(15)中任一项所述的方法制造的酒精饮料。

(17)被检酵母的耐干燥性及/或耐低温保存性的评价方法，其包括使用根据具有序列号1的核苷酸序列且编码糖原分支酶的基因的核苷酸序列设计的引物或探针。

(17a)使用上述(17)所述的方法选择耐干燥性及/或耐低温保存性增强的酵母的方法。

(17b)使用上述(17a)所述的方法所选择的酵母制造酒精饮料(如啤酒、工业用酒精)的方法。

(17c)使用上述(17a)所述的方法所选择的酵母制造有用物质(如蛋白质)的方法。

(18)评价被检酵母的耐干燥性及/或耐低温保存性的方法，其包括：培养被检酵母；测定具有序列号1的核苷酸序列且编码糖原分支酶的基因的表达量。

(18a)选择耐干燥性及/或耐低温保存性高的酵母的方法，其包括使用上述(18)所述的方法评价被检酵母，并选择编码糖原分支酶的基因的表达量高的酵母。

(18b)使用上述(18a)所述的方法所选择的酵母制造酒精饮料(如啤酒)的方法。

(18c)使用上述(18a)所述的方法所选择的酵母制造有用物质(如蛋白质)的方法。

(19)酵母的选择方法，其包括：培养被检酵母；对上述(6)所述的蛋白质进行定量或者测定具有序列号1的核苷酸序列且编码糖原分支酶的基因的表达量；选择上述蛋白质的量或基因表达量与目标耐干燥性及/或耐低温保存性相应的被检酵母。

(20)如上述(19)所述的酵母的选择方法，其包括：培养标准酵母和被检酵母；测定具有序列号1的核苷酸序列且编码糖原分支酶的基因在各酵母中的表达量；选择与标准酵母相比该基因为高表达的被检酵母。

(21)如上述(19)所述的酵母的选择方法，其包括：培养标准酵母和被检酵母；对各酵母中的上述(6)所述蛋白质进行定量；选择其具有的蛋白质的量多于标准酵母的被检酵母。

(22)酒精饮料的制造方法，其包括：使用上述(8)～(12a)所述的任一酵母或根据上述(19)～(21)所述的任一方法所选择的酵母进行发酵。

本发明的转化酵母能够在干燥保存或低温保存下维持高的活菌数，所以应用于酿造等时，能够消除酵母贮存的棘手问题，能够有助于质量的稳定化。进而，由于干燥酵母适合长期保存，而且其重量减轻，所以对流通运输非常有利，可用作工业用酒精生产、有用蛋白质生产等的工业用微生物。此外，本发明的酵母也可应用于面包酵母、工业用酵母。

附图说明

图1表示啤酒酿造试验中酵母增殖量的经时变化，横轴表示发酵时间，纵轴表示660nm处的光密度(OD660)值。

图2表示啤酒酿造试验中浸出物(糖)消耗量的经时变化，横轴表示发酵时间，纵轴表示浸出物的表观浓度(w/w％)。

图3表示啤酒酿造试验中的酵母中nonScGLC3基因的表达行为，横轴表示发酵时间，纵轴表示检出的信号强度。

图4表示亲株及nonScGLC3高表达株的耐干燥性试验结果。

具体实施方式

本发明人根据JP特开2004-283169公开的方法中的啤酒酵母基因组的信息，分离、鉴定出编码啤酒酵母特有的糖原分支酶的non基因和nonScGLC3基因。该核苷酸序列用序列号1表示，此外由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列用序列号2表示。

1.本发明的多核苷酸

首先，本发明提供：(a)多核苷酸，其包括由序列号1的核苷酸序列组成的多核苷酸；以及(b)多核苷酸，其包括编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质由序列号2的氨基酸序列组成。多核苷酸可以是DNA也可以是RNA。

作为本发明对象的多核苷酸，并不限定于编码上述具有糖原分支酶活性的蛋白质的多核苷酸，而且还包括编码与该蛋白质具有同等功能的蛋白质的其他多核苷酸。作为具有同等功能的蛋白质，其包括例如可以为(c)蛋白质，其由在序列号2的氨基酸序列中缺失、替换、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列组成，且具有糖原分支酶活性。此类蛋白质包括由在序列号2的氨基酸序列中，例如，缺失、替换、插入及/或添加1～100个、1～90个、1～80个、1～70个、1～60个、1～50个、1～40个、1～39个、1～38个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个(1～数个)、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个氨基酸残基后的氨基酸序列组成，且具有糖原分支酶活性的蛋白质。上述缺失、替换、插入及/或添加的氨基酸残基的个数，一般优选小的数目。并且此类蛋白质还包括：(d)蛋白质，其含有与序列号2的氨基酸序列有约60％以上、约70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、或99.9％以上的一致性的氨基酸序列，且具有糖原分支酶活性。上述一致性的数值一般优选大的数值。

糖原分支酶活性，例如可根据Mol.Cell.Biol.，1992 Jan；12(1)：22-9中记载的方法进行评价。

本发明还包括：(e)多核苷酸，其包括在严谨条件下与由序列号1的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸进行杂交，且编码具有糖原分支酶活性的蛋白质的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其包括在严谨条件下与由编码具有序列号2的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸进行杂交，且编码具有糖原分支酶活性的蛋白质的多核苷酸。

这里所述的“在严谨条件下进行杂交的多核苷酸”，是指将含有序列号1的核苷酸序列的互补核苷酸序列的多核苷酸的全部或一部分、或将编码序列号2的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分作为探针，使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法(plaque hybridization)、Southern杂交法等得到的多核苷酸(如DNA)。杂交方法可利用如Molecular Cloning 3rd Ed.，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons 1987-1997等记载的方法。

本说明书所述的“严谨条件”，可以为低严谨条件、中严谨条件、高严谨条件中的任一种。“低严谨条件”，例如为5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件；此外，“中严谨条件”，例如为5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件；“高严谨条件”，例如为5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。在这些条件中，认为温度越高越能有效得到高同源性的多核苷酸(如DNA)。当然，一般认为影响杂交严谨度的因素有温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多个因素，本领域技术人员可通过适当选择这些要素实现相同的严谨度。

使用市售的试剂盒进行杂交时，例如，可以使用Alkphos Direct LabellingReagents(Amersham Pharmacia公司制造)。这种情况下，按照试剂盒中附带的说明书，与标记探针过夜温育后，在55℃的条件下用含有0.1％(w/v)SDS的首次洗涤缓冲液将膜洗涤后，由此检测被杂交的多核苷酸(如DNA)。

除此之外，可被杂交的多核苷酸还包括，与编码序列号2的氨基酸序列的多核苷酸有约60％以上、约70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1以上％、99.2以上％、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、或99.9％以上一致性的多核苷酸，上述一致性是通过FASTA、BLAST等同源性检索软件，利用系统设定的默认参数计算获得。

氨基酸序列、核苷酸序列的一致性，可以使用Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873，1993)来确定。以BLAST算法为基础的称为BLASTN、BLASTX的程序也已开发出(Altschul SF，et al：J Mol Biol 215：403，1990)。使用BLASTN分析核苷酸序列时，例如，使参数为score＝100、word length＝12；此外使用BLASTX分析氨基酸序列时，例如，使参数为score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各程序的系统设定默认参数值。

2.本发明的蛋白质

本发明还提供由上述(a)～(i)中任一种多核苷酸所编码的蛋白质。本发明的优选蛋白质包括由在序列号2的氨基酸序列中缺失、替换、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列组成、且具有糖原分支酶活性的蛋白质。

此类蛋白质包括由在序列号2的氨基酸序列中缺失、替换、插入及/或添加上述数量的氨基酸残基后的氨基酸序列组成、且具有糖原分支酶活性的蛋白质。此外，此类蛋白质还包括含有与序列号2的氨基酸序列有上述同源性的氨基酸序列、且具有糖原分支酶活性的蛋白质。

此类蛋白质可通过使用《Molecular Cloning 3》、《Current Protocols inMolecular Biology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等记载的定点诱变法获得。

本发明所述的在蛋白质的氨基酸序列中缺失、替换、插入及/或添加1个以上的氨基酸残基，是指在同一序列中的任意1个或多个位置上缺失、替换、插入及/或添加1个或多个氨基酸残基，并且缺失、替换、插入及添加中的2种以上可同时发生。

下面列举可互相替换的氨基酸残基，同一组中包含的氨基酸残基可互相替换。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯丙氨酸、酪氨酸。

本发明的蛋白质也可以通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法制造，并且也可以利用Advanced Chem Tech公司、PerkinElmer公司、Pharmacia公司、Protein Technology Installment公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、Shimazu公司等制造的肽合成仪进行化学合成。

3.本发明的载体及导入该载体的转化酵母

本发明提供含有上述多核苷酸的载体，本发明的载体包括上述(a)～(i)中所述的任一多核苷酸(DNA)。并且，构成的本发明的载体通常包含表达盒，该表达盒包括的组成要素为：(x)在酵母细胞内可转录的启动子，(y)连接在该启动子的有义或反义方向的上述(a)～(i)任一项所述的多核苷酸(DNA)，以及(z)涉及RNA分子的转录终止及多聚腺苷化作用并在酵母内起作用的信号。此外，要使上述本发明的蛋白质进行高表达时，优选将上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)以有义方向导入该启动子，以促进这些多核苷酸(DNA)的表达。

导入酵母时使用的载体可以是多拷贝型(YEp型)、单拷贝型(YCp型)、染色体整合型(YIp型)中的任一种。例如作为YEp型载体，已知有YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，AcademicPress，New York，83，1983)，作为YCp型载体，已知有YCp50(M.D.Roseet al.，gene，60，237，1987)，作为YIp型载体，已知有YIp5(K.Struhl etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1035，1979)，且均容易获得。

用于调节酵母中的基因表达的启动子/终止子，只要在实用酵母中起作用的同时不受发酵液中的成分影响，可以任意组合。例如可使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的启动子等。这些基因均已克隆，例如，在M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中有详细记载，通过已知的方法能够容易地获得。

因实用酵母不能利用营养缺陷型标记，因而转化时使用的选择性标记可利用氨基糖苷类抗生素(Geneticin)抗性基因(G418r)、铜抗性基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)或浅蓝菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(Junji Inokoshi et al.，Biochemistry，64，660，1992；Hussainet al.，gene，101，149，1991)(猪腰淳嗣ら，生化学，64，660，1992；Hussainet al.，gene，101，149，1991)等。

将上述构建的载体导入宿主酵母内，作为宿主酵母可以为任意酵母(实用酵母)，例如，啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母，面包酵母，工业用酒精生产酵母，有用蛋白质生产酵母等。具体可以为例如酵母属(Saccharomyces)等酵母，在本发明中，可使用啤酒酵母，如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70等、Saccharomyces carlsbergensisNCYC453、NCYC456等、Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。并且还可使用威士忌酵母，例如Saccharomycescerevisiae NCYC90等；葡萄酒酵母，例如协会葡萄酒用1号、葡萄酒用3号、葡萄酒用4号等；清酒酵母，例如协会酵母清酒用7号、清酒用9号等；面包酵母，例如NBRC 0555、NBRC 1346、NBRC 2043等，但并不限于这些酵母。在本发明中，优选使用啤酒酵母例如巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)。

酵母的转化方法可利用一般使用的公知方法，如电穿孔法“Meth.Enzym.，194，p182(1990)”、原生质球法(Spheroplast)“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75p1929(1978)”、乙酸锂法“J.Bacteriology，153，p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75p 1929(1978)、Methods in yeast genetics，2000Edition：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等记载的方法，但并不限于这些方法。

更具体地说，将宿主酵母在标准酵母营养培养基(如YEPD培养基“Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等)中培养至OD600nm值为1～6。将该培养酵母离心分离并收集，洗净，用浓度约为1M～2M的碱金属离子进行前处理，优选用锂离子进行前处理。上述细胞在约30℃下，静置约60分钟后，与要导入的DNA(约1μg～20μg)同时在约30℃下，再静置约60分钟。添加聚乙二醇，优选添加约4,000道尔顿的聚乙二醇，使最终浓度约为20％～50％。约30℃下静置约30分钟后，将上述细胞在约42℃下加热处理约5分钟。优选用标准酵母营养培养基将上述细胞悬浮液洗净，加入到规定量的新鲜标准酵母营养培养基中，约30℃下静置约60分钟。然后，将其接种于含有作为选择性标记使用的抗生素等的标准琼脂培养基上，获得转化体。此外，一般克隆技术可参照《MolecularCloning 3》、“Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor，NY)”等。

4.本发明的酒精饮料的制造方法以及根据该方法得到的酒精饮料

将上述本发明的载体导入酵母中，能够得到耐干燥性及/或耐低温保存性良好的酵母。并且通过使用下述本发明的酵母的评价方法进行选择，可以得到耐干燥性及/或耐低温保存性良好的酵母。本发明得到的酵母的应用对象，例如可以为啤酒、葡萄酒、威士忌、清酒等酒精饮料的酿造；面包制造；工业用酒精生产、有用蛋白质生产等有用物质的制造等，但并不限于这些。

生产这些物质时，除使用本发明得到的实用酵母代替亲株之外，可利用公知的方法。由于使用的原料、制造设备、制造管理等可与以往的方法完全相同，因而不会增加成本就可实施。

5.本发明的酵母的评价方法

本发明涉及的评价方法是，使用根据具有序列号1的核苷酸序列且编码糖原分支酶的基因的核苷酸序列设计的引物或探针，对被检酵母的耐干燥性及/或耐低温保存性进行评价。上述评价方法的一般方法是公知的，例如在WO01/040514号公报、JP特开平8-205900号公报等中有记载。下面，对该评价方法进行简单说明。

首先，制备被检酵母的基因组。制备方法可采用Hereford法或乙酸钾法等任何一种公知方法(如Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，130(1990))。使用根据编码糖原分支酶的基因的核苷酸序列(优选ORF序列)设计的引物或探针，检测被检酵母的基因组中是否存在其基因或其基因的特异序列。可采用公知的方法设计引物或探针。

基因或特异序列的检出可采用公知的方法实施。例如，用含有特异序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有与该核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸作为一个引物，用含有该序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有与该核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸作为另一个引物，通过PCR法扩增酵母的核酸，测定扩增产物的有无、扩增产物分子量大小等。引物使用的多核苷酸的碱基数通常为10bp以上，优选15bp～25bp。此外，夹在两引物间的碱基数通常以300bp～2000bp为宜。

PCR法的反应条件无特别限定，例如可采用变性温度：90℃～95℃，退火温度：40℃～60℃，延伸温度：60℃～75℃，循环数：10次以上等条件。得到的反应生成物通过使用琼脂糖凝胶等的电泳法等被分离，能够测定扩增产物的分子量。通过该方法，根据扩增产物的分子量包含特定DNA分子的大小，预测、评价该酵母的耐干燥性及/或耐低温保存性。并且，通过分析扩增产物的核苷酸序列，可以更准确地预测、评价上述性质。

在本发明中，通过培养被检酵母，测定具有序列号1的核苷酸序列且编码糖原分支酶的基因的表达量，也能够评价被检酵母的耐干燥性及/或耐低温保存性。此外，编码糖原分支酶的基因的表达量的测定，能够通过培养被检酵母，对该基因的转录产物mRNA或蛋白质进行定量来进行。mRNA或蛋白质的定量可采用公知的方法进行。mRNA的定量例如可通过Northern杂交法或定量RT-PCR进行，蛋白质的定量例如可通过Western印迹法进行(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons 1994-2003)。

通过培养被检酵母，测定具有序列号1的核苷酸序列且编码糖原分支酶的基因的表达量，选择与目标糖原合成能力相应的上述基因表达量的酵母，能够选择出适于酿造所期望的酒精饮料的酵母。此外，也可以培养标准酵母及被检酵母，测定各酵母中上述基因的表达量，通过比较标准酵母和被检酵母中上述基因的表达量，从而选择所期望的酵母。具体来说，例如通过培养标准酵母及被检酵母，测定具有序列号1的核苷酸序列且编码糖原分支酶的基因在各酵母中的表达量，选择该基因的表达高于标准酵母的被检酵母，从而选择出适于酿造所期望酒精饮料、适于生产有用物质的酵母。

通过培养被检酵母，选择含有糖原分支酶活性高的蛋白质的酵母，从而选择出适于酿造所期望酒精饮料、或适于生产有用物质的被检酵母。

所述情况下，作为被检酵母或标准酵母，例如可以使用导入上述本发明载体的酵母、实施突变处理的酵母、发生自然突变的酵母等。糖原分支酶的活性，例如，可根据Eur J Biochem.1993 Mar 1：212(2)：315-23中记载的方法进行评价。对于突变处理，例如可以使用紫外线照射、放射线照射等物理方法，以及如EMS(甲基磺酸乙酯)、N-甲基-N-亚硝基胍等试剂处理的化学方法等任何方法(例如，参照大嶋泰治编著，生物化学实验法39，酵母分子遗传学实验法，p67-75，学会出版中心等)(大嶋泰治编著、生物化学実験法39酵母分子遺伝学実験法、p 67-75、学会出版センタ一)。

能够作为标准酵母、被检酵母使用的酵母，可以为任意酵母(实用酵母)，例如，啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母，面包酵母，工业用酒精生产酵母或有用蛋白质生产酵母等。具体可以为酵母属(Saccharomyces)等酵母(例如Saccharomyces pastorianus、Saccharomyces cerevisiae及Saccharomycescarlsbergensis)等。在本发明中可以使用啤酒酵母，例如，Saccharomycespastorianus W34/70等、Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、NCYC456等、Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等；并且也可以使用威士忌酵母，例如，Saccharomyces cerevisiae NCYC90等；葡萄酒酵母，例如协会葡萄酒用1号、葡萄酒用3号、葡萄酒用4号等；清酒酵母，例如，协会酵母清酒用7号、清酒用9号等；面包酵母，例如，NBRC 0555、NBRC 1346、NBRC 2043等，但并不限于这些酵母。在本发明中，优选使用啤酒酵母，例如，巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。标准酵母、被检酵母也可以从上述酵母组中任意组合选择。

下面根据实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不限于下述实施例。

实施例1 编码糖原分支酶的基因(nonScGLC3)的克隆

使用JP特开2004-283169所述的比较数据库进行检索，结果发现了编码啤酒酵母的糖原分支酶的nonScGLC3基因(序列号1)。根据获得的核苷酸序列信息，分别设计用于扩增全长基因的引物non ScGLC3_for(序列号3)/nonScGLC3_rv(序列号4)，通过以基因组解读株Saccharomyces pastorianusWeihenstepan34/70株(简称“W34/70株”)的染色体DNA为模板的PCR，获得包括non ScGLC3全长基因的DNA片段。

将上述得到的nonScGLC3基因片段，通过TA克隆插入pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen公司制造)。用Sanger法(F.Sanger，Science，214，1215，1981)分析并确定nonScGLC3基因的核苷酸序列。

实施例2 啤酒试酿中nonScGLC3基因的表达分析

使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株进行啤酒试酿造，从发酵中的啤酒酵母菌体中提取的mRNA通过啤酒酵母DNA微阵列进行检测。

麦芽汁浸出物浓度 12.69％

麦芽汁体积 70L

麦芽汁中溶解氧浓度 8.6ppm

发酵温度 15℃

酵母添加量 12.8×10⁶cells/mL

对发酵液进行经时采样，观察酵母增殖量(图1)、浸出物表观浓度(图2)的经时变化。与此同时对酵母菌体进行采样以制备mRNA，将制备的mRNA用生物素进行标记，使其与啤酒酵母DNA微阵列进行杂交。使用GeneChip Operating System(GCOS；GeneChip Operating Software 1.0，Affymetrix公司制造)进行信号检测，nonScGLC3基因的表达模式如图3所示。根据该结果确认在通常的啤酒发酵中nonScGLC3基因进行表达。

实施例3 non ScGLC3高表达株的构建

将实施例1所述方法得到的nonScGLC3/pCR2.1-TOPO用限制性内切酶SacI及NotI酶解，制备含有nonScGLC3基因的DNA片段。将该片段连接于经限制酶SacI及NotI处理的pYCGPYNot上，构建non ScGLC3高表达载体nonScGLC3/pYCGPYNot。pYCGPYNot为YCp型酵母表达载体，导入的基因通过丙酮酸激酶基因PYK1的启动子进行高表达。酵母的选择性标记包括氨基糖苷类抗生素(Geneticin)抗性基因G418^r，大肠菌的选择性标记包括氨苄青霉素抗性基因Amp^r。

使用上述方法制得的高表达载体，采用JP特开平07-303475记载的方法转化AJL4004株，采用含有氨基糖苷类抗生素(Geneticin)300mg/L的YPD平板培养基(1％酵母浸出物，2％多聚蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂)选择转化体。

实施例4 nonScGLC3高表达株的耐干燥性评价

采用以下方法评价亲株(AJL4004株)及根据实施例3中记载的方法得到的nonScGLC3高表达株的耐干燥性。

每种酵母分别取1白金耳，接种于10mL麦芽汁(含有100mg/L的氨基糖苷类抗生素(Geneticin))中，30℃振荡培养过夜。将该前培养液接种于10mL麦芽汁(同上)中，且使OD660＝0.5，然后开始增菌培养，培养2天使酵母增殖至稳定期。测定结束时的菌体浊度，将其悬浮于灭菌水中且使OD660＝2。将如此调整的悬浮液100μL装入1.5mL微量管内，用减压浓缩机(DNA110SpeedVac(日本国注册商标)、ThermoSavant公司制造)处理1小时，使菌体干燥固化。

活菌率的测定采用下述方法进行。将上述得到的干燥菌体再悬浮于50μL灭菌水中，向该悬浮液中再加入50μL的0.02％亚甲蓝溶液(pH值为4.5)，将失去还原能力染成蓝色的菌体作为死菌体。接着，在显微镜下观察该悬浮液，使用鉴定细胞死活体系(Cell Vital Analyzer System)(DA细胞计数仪、Yamato科学株式会社制造)计算活菌率。为了减小实验误差，计算时使基数为2000个细胞以上。

如图4所示，亲株的活菌率为19.9％，而高表达株的活菌率为30.2％，由此表明nonScGLC3高表达使酵母的耐干燥性提高。

实施例5 nonScGLC3高表达株的耐低温性评价

采用以下方法评价亲株(AJL4004株)及根据实施例3中记载的方法得到的nonScGLC3高表达株的耐低温性。采用实施例4中记载的方法培养，将制成的OD660＝2的酵母悬浮液分别在2个微量管内各注入900μL，向其中一个微量管内加入100μL灭菌水，另一个微量管内加入100μL的99.5％的乙醇(最终浓度10％)。将其于5℃下保存4周时间，然后采用与实施例4同样的方法计算活菌率。

工业实用性

根据本发明，能够提高酵母的耐干燥性及/或耐低温保存性，因此能够使酵母长期稳定保存，能够提高酒精饮料(例如啤酒)酿造、面包制造、工业用酒精生产、有用蛋白质生产等有用物质的生产效率。

序列表

<110>三得利株式会社(Suntory Limited)

<120>编码糖原分支酶的基因及其用途

(Gene encoding glycogen branching enzyme and use thereof)

<130>G06-0101CN

<150>JP2006-54196

<151>2006-02-28

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2115

<212>DNA

<213>酵母属(Saccharomyces sp.)

<400>1

atgtacaacg ttcctgataa tgtcaaaggt gcagtcgaat tcgatccgtg gctgaaaccc 60

tttgcggatg tgctatccga gagaagatac ctggccgaca agtggtctta cgatatcact 120

catgccacgc ccgatggttc gtaccagtcg ctgagtaaat tctctagaga ttcatataag 180

tcgtatgggt tgcatgccaa cccagatact aaggatatta cctacaaaga atgggcaccc 240

aatgctcaac gtgcatattt agtgggggag tttaacaact ggaatactac atctcatgag 300

ctcaaggaca aggacgagtt cggaaatttc accatcacta tccctcccct atcgaatggt 360

gactttgcca ttcctcatga ctctaagatt aaggtgatgt ttgttttgcc ggatggttct 420

gagatcttcc gtttacctgc atggattaca agagccactc aaccttctaa ggaaacttcc 480

aaacaattcg gacctgttta tgaaggaaga ttttggaacc cacaaacctc ttacaatttt 540

gttaatccaa ggccaaagtt taacggatct gtagactctt taagaatcta cgaagcgcat 600

gtaggtattt caagtcctga gccaaaggtc actacatata aggaatttac tgaaaaggtt 660

ttgcccagga ttaaatacct cggttatgat gccattcaat tgatggctat tatggaacat 720

gcctactatg catcatttgg ttaccaagtg actaatttct ttgcggcaag ctctcgtttt 780

ggtacccctg aagagttgaa agagctggtc gataccgcac atggaatggg tatcatagtc 840

ttattggacg ttgttcatag tcacgcttct aaaaatgtag aagatgggct gaatatgttc 900

gatggctccg atcatcaata tttccattct gtaagttccg gtagaggtga acatccatta 960

tgggattctc gtctttttaa ctacggtaaa tttgaagtac aacgatttct attggcaaat 1020

ctggcttttt atgtcgacgt ttatcagttt gatggtttta gattcgacgg tgtcacttcc 1080

atgctatatg ttcatcatgg tgttggtgaa ggcggttcct ttagtggtga ctacaacgaa 1140

tacctttctc gtgatagatc ttctgtcgac catgaggctt tagcttattt gatgttagcc 1200

aacgatttag ttcacgaatt actgcctcag tcggctgtca ctattgcgga agatgtgtct 1260

ggttacccaa ctctctgtct accccgttcc attggtggta gtggtttcga ctacagattg 1320

gccatggctt tacccgatat gtggattaaa ttaatcaagg agaaagcaga cgatgaatgg 1380

gaaatgggcg gtatcgttta cactttgact aatagacgtc atggtgaaaa agtcgttgcc 1440

tattgtgaat ctcacgatca agctttggtt ggtgacaaga ccttagcatt ttggttgatg 1500

gatgcctcaa tgtataccga tatgactgta ttgaaggaac ctaccattat cattgatcgt 1560

ggtattgccc tacacaagat gattaggtta attactcatt cattgggtgg tgaagcttat 1620

ttgaacttcg aaggtaacga gtttggccac ccagaatggt tggatttccc caatgctaac 1680

aatggcgaca gttataagta cgctcggaga caatttaatt tggcagatga tcctttgtta 1740

cgctaccaga atttgaatga atttgataga tcaatgcagt tatgtgagaa aaaacataag 1800

tggttgaaca cagaacaagc atatgtctca ttaaagaatg aaaaagacaa aatgattgtg 1860

tttgaaagaa ataatttact atttattttc aactttcatc ccacagacag ctacagtgat 1920

tatagagttg gtgttgaaaa agctggtact tatcacatcg tattaaactc ggatcgtgct 1980

gaatttggcg gacataacag aatcaacgaa acttccgaat tctttaccac tgacttagaa 2040

tggaataaca ggagaaattt tattcaggta tacattccta gcagagtttg tttggttctt 2100

gctttgaaag aatga 2115

<210>2

<211>704

<212>PRT

<213>酵母属(Saccharomyces sp.)

<400>2

Met Tyr Asn Val Pro Asp Asn Val Lys Gly Ala Val Glu Phe Asp Pro

1 5 10 15

Trp Leu Lys Pro Phe Ala Asp Val Leu Ser Glu Arg Arg Tyr Leu Ala

20 25 30

Asp Lys Trp Ser Tyr Asp Ile Thr His Ala Thr Pro Asp Gly Ser Tyr

35 40 45

Gln Ser Leu Ser Lys Phe Ser Arg Asp Ser Tyr Lys Ser Tyr Gly Leu

50 55 60

His Ala Asn Pro Asp Thr Lys Asp Ile Thr Tyr Lys Glu Trp Ala Pro

65 70 75 80

Asn Ala Gln Arg Ala Tyr Leu Val Gly Glu Phe Asn Asn Trp Asn Thr

85 90 95

Thr Ser His Glu Leu Lys Asp Lys Asp Glu Phe Gly Asn Phe Thr Ile

100 105 110

Thr Ile Pro Pro Leu Ser Asn Gly Asp Phe Ala Ile Pro His Asp Ser

115 120 125

Lys Ile Lys Val Met Phe Val Leu Pro Asp Gly Ser Glu Ile Phe Arg

130 135 140

Leu Pro Ala Trp Ile Thr Arg Ala Thr Gln Pro Ser Lys Glu Thr Ser

145 150 155 160

Lys Gln Phe Gly Pro Val Tyr Glu Gly Arg Phe Trp Asn Pro Gln Thr

165 170 175

Ser Tyr Asn Phe Val Asn Pro Arg Pro Lys Phe Asn Gly Ser Val Asp

180 185 190

Ser Leu Arg Ile Tyr Glu Ala His Val Gly Ile Ser Ser Pro Glu Pro

195 200 205

Lys Val Thr Thr Tyr Lys Glu Phe Thr Glu Lys Val Leu Pro Arg Ile

210 215 220

Lys Tyr Leu Gly Tyr Asp Ala Ile Gln Leu Met Ala Ile Met Glu His

225 230 235 240

Ala Tyr Tyr Ala Ser Phe Gly Tyr Gln Val Thr Asn Phe Phe Ala Ala

245 250 255

Ser Ser Arg Phe Gly Thr Pro Glu Glu Leu Lys Glu Leu Val Asp Thr

260 265 270

Ala His Gly Met Gly Ile Ile Val Leu Leu Asp Val Val His Ser His

275 280 285

Ala Ser Lys Asn Val Glu Asp Gly Leu Asn Met Phe Asp Gly Ser Asp

290 295 300

His Gln Tyr Phe His Ser Val Ser Ser Gly Arg Gly Glu His Pro Leu

305 310 315 320

Trp Asp Ser Arg Leu Phe Asn Tyr Gly Lys Phe Glu Val Gln Arg Phe

325 330 335

Leu Leu Ala Asn Leu Ala Phe Tyr Val Asp Val Tyr Gln Phe Asp Gly

340 345 350

Phe Arg Phe Asp Gly Val Thr Ser Met Leu Tyr Val His His Gly Val

355 360 365

Gly Glu Gly Gly Ser Phe Ser Gly Asp Tyr Asn Glu Tyr Leu Ser Arg

370 375 380

Asp Arg Ser Ser Val Asp His Glu Ala Leu Ala Tyr Leu Met Leu Ala

385 390 395 400

Asn Asp Leu Val His Glu Leu Leu Pro Gln Ser Ala Val Thr Ile Ala

405 410 415

Glu Asp Val Ser Gly Tyr Pro Thr Leu Cys Leu Pro Arg Ser Ile Gly

420 425 430

Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Arg Leu Ala Met Ala Leu Pro Asp Met Trp

435 440 445

Ile Lys Leu Ile Lys Glu Lys Ala Asp Asp Glu Trp Glu Met Gly Gly

450 455 460

Ile Val Tyr Thr Leu Thr Asn Arg Arg His Gly Glu Lys Val Val Ala

465 470 475 480

Tyr Cys Glu Ser His Asp Gln Ala Leu Val Gly Asp Lys Thr Leu Ala

485 490 495

Phe Trp Leu Met Asp Ala Ser Met Tyr Thr Asp Met Thr Val Leu Lys

500 505 510

Glu Pro Thr Ile IleIle Asp Arg Gly Ile Ala Leu His Lys Met Ile

515 520 525

Arg Leu Ile Thr His Ser Leu Gly Gly Glu Ala Tyr Leu Asn Phe Glu

530 535 540

Gly Asn Glu Phe Gly His Pro Glu Trp Leu Asp Phe Pro Asn Ala Asn

545 550 555 560

Asn Gly Asp Ser Tyr Lys Tyr Ala Arg Arg Gln Phe Asn Leu Ala Asp

565 570 575

Asp Pro Leu Leu Arg Tyr Gln Asn Leu Asn Glu Phe Asp Arg Ser Met

580 585 590

Gln Leu Cys Glu Lys Lys His Lys Trp Leu Asn Thr Glu Gln Ala Tyr

595 600 605

Val Ser Leu Lys Asn Glu Lys Asp Lys Met Ile Val Phe Glu Arg Asn

610 615 620

Asn Leu Leu Phe Ile Phe Asn Phe His Pro Thr Asp Ser Tyr Ser Asp

625 630 635 640

Tyr Arg Val Gly Val Glu Lys Ala Gly Thr Tyr His Ile Val Leu Asn

645 650 655

Ser Asp Arg Ala Glu Phe Gly Gly His Asn Arg Ile Asn Glu Thr Ser

660 665 670

Glu Phe Phe Thr Thr Asp Leu Glu Trp Asn Asn Arg Arg Asn Phe Ile

675 680 685

Gln Val Tyr Ile Pro Ser Arg Val Cys Leu Val Leu Ala Leu Lys Glu

690 695 700

<210>3

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>3

gagctcatag cggccatgta caacgttcct gataatgtca 40

<210>4

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>4

ggatcctatg cggccgcttt atatatgaaa aggaaggaag ca 42

Claims

1.多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其由序列号1的碱基序列组成。

3.如权利要求1所述的多核苷酸，其为DNA。

4.蛋白质，其为由权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸编码的蛋白质。

5.载体，其包括权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸。

6.酵母，其为导入权利要求5所述的载体的酵母。

7.如权利要求6所述的酵母，其耐干燥性得到增强。

8.如权利要求7所述的酵母，其中，通过增大权利要求4所述的蛋白质的表达量使其耐干燥性得到增强。

9.酒精饮料的制造方法，其使用权利要求6～8中任一项所述的酵母。

10.如权利要求9所述的方法，其中，酿造的酒精饮料是麦芽饮料。

11.如权利要求9所述的方法，其中，酿造的酒精饮料是葡萄酒。