CN101037699B

CN101037699B - 3-磷酸甘油脱氢酶基因及其用途

Info

Publication number: CN101037699B
Application number: CN2007100850398A
Authority: CN
Inventors: 中尾嘉宏; 儿玉由纪子; 下永朋子
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2006-03-01
Filing date: 2007-02-28
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2027-02-28
Also published as: JP2009528022A; AU2007223598A1; KR20090003273A; JP5091867B2; WO2007102353A1; EP1991669A1; CN101037699A; US20090004330A1; AU2007223598B2; CA2638789A1

Abstract

本发明涉及3-磷酸甘油脱氢酶基因及其用途，特别是涉及制造醇厚感、柔滑感等优异的酒精饮料的酿造酵母、使用该酵母制造的酒精饮料及其制造方法等。进一步具体地说，本发明涉及编码酿造酵母的3-磷酸甘油脱氢酶Gpd1p的基因GPD1或编码Gpd2p的基因GPD2，特别是通过提高啤酒酵母中特征性的non-ScGPD1基因或non-ScGPD2基因的表达量，提高对产品醇厚感、柔滑感等起作用的甘油的生成能力的酵母及使用该酵母的酒精饮料制造方法等。

Description

3-磷酸甘油脱氢酶基因及其用途

技术领域

本发明涉及3-磷酸甘油脱氢酶基因及其用途，特别是涉及制造醇厚感、柔滑感等优异的酒精饮料的酿造酵母、低温保存性、冷冻保存性、耐干燥性、耐渗透压性优异的酿造酵母，使用该酵母制造的酒精饮料及其制造方法等。进一步具体地说，本发明涉及编码酿造酵母的3-磷酸甘油脱氢酶Gpd1p的基因GPD1或编码Gpd2p的基因GPD2，特别是通过提高啤酒酵母中特征性的non-ScGPD1基因或non-ScGPD2基因的表达量，可提高产品的醇厚感、柔滑感等的酵母、低温保存性、冷冻保存性、耐干燥性、耐渗透压性优异的酿造酵母及使用该酵母的酒精饮料的制造方法等。

背景技术

甘油除对甜味有贡献以外还对酒的醇厚感、柔滑感等起作用，是重要的呈味成分之一。

至今为止一直在进行以提高酒中甘油含量为目的的甘油生产量高的酵母的育种。对酵母施行突变处理后，为高效分离甘油生产量高的酵母，已有以烯丙醇或吡唑抗性为指标的方法(日本特公平7-89901号公报)、以3-氯-1，2-丙二醇(对应的日文为グリセロ一ルモノクロロヒドリン)抗性为指标的方法(日本特开平10-210968号公报)、以耐盐性为指标的方法(日本特开平7-115956号公报)、以氨基酸类似物抗性为指标的方法(J.Ferment.Bioeng.，80，218-222(1995))的报道。

另外，还有在通过利用基因工程技术的酵母的育种方法中，使Saccharomyces cerevisiae的3-磷酸甘油脱氢酶GPD1或GPD2在啤酒酵母、葡萄酒酵母等中高表达的实例的报道(FEMS Yeast Res.2：225-232(2002)、ApplEnviron Microbiol.65：143-149(1999)、Austr.J.Grape Wine Res.6：208-215(2000))。

而且已知酵母受到高渗透压胁迫时，为解除细胞内外的渗透压差，合成、积累作为适合的溶质的甘油。还已知以3-磷酸甘油脱氢酶为代表的甘油合成体系的基因会被胁迫诱导(Microbiol Mol Biol Rev.66：300-372(2002))。

发明内容

如上所述，为使产品中甘油含量增大，获取了突变株，但有时会出现结果无法预料的发酵延迟和不受欢迎的香味成分等的增加，所以作为实用性酵母还存在着问题。由此，非常期望有既不影响发酵速度、不损害产品质量，又能生产充分量甘油的酵母的育种方法。

本发明者等为解决上述课题不断努力研究，结果从啤酒酵母中成功地鉴定、分离出了编码3-磷酸甘油脱氢酶的基因。且制备了将所得基因导入酵母并使其表达的转化酵母，确认了甘油生成量的增加，从而完成了本发明。

即本发明涉及啤酒酵母中存在3-磷酸甘油脱氢酶基因、该基因编码的蛋白质、调节了该基因表达的转化酵母、通过使用调节了该基因表达的酵母控制产品中甘油生成量的方法等。具体地说，本发明提供如下所示的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、导入了该载体的转化酵母、使用该转化酵母的酒精饮料的制造方法等。

(1)从以下(a)～(f)组成的群组中选择的多核苷酸，其为：

(a)多核苷酸，其含有由序列号：1或序列号：3的碱基序列组成的多核苷酸；

(b)多核苷酸，其含有编码由序列号：2或序列号：4的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸；

(c)多核苷酸，其含有编码由序列号：2或序列号：4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、且具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸；

(d)多核苷酸，其含有编码具有与序列号：2或序列号：4的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列、且具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸；

(e)多核苷酸，其含有与序列号：1或序列号：3的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸；以及

(f)多核苷酸，其含有与编码序列号：2或序列号：4的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸。

(2)上述(1)所述的多核苷酸，其从以下(g)～(i)组成的群组中选择：

(g)多核苷酸，其含有编码由序列号：2或序列号：4的氨基酸序列或序列号：2或序列号：4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10个氨基酸的氨基酸序列组成、且具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸；

(h)多核苷酸，其含有编码具有与序列号：2或序列号：4的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列、且具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸；及

(i)多核苷酸，其含有与序列号：1或序列号：3的碱基序列组成的多核苷酸、或序列号：1或序列号：3的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交、且编码具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸。

(3)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列号：1或序列号：3的碱基序列组成的多核苷酸。

(4)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有编码由序列号：2或序列号：4的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。

(5)上述(1)～(4)中任一项所述的多核苷酸，其是DNA。

(6)蛋白质，其由上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸编码。

(7)载体，其含有上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸。

(7a)上述(7)中所述的载体，其含有具有以下(x)～(z)组成要素的表达盒：

(x)在酵母细胞内可转录的启动子；

(y)上述(1)～(5)中所述的多核苷酸，其与该启动子以正义方向或反义方向结合；以及

(z)与RNA分子的转录终止及多聚腺苷酸化有关的、在酵母中起作用的信号。

(8)酵母，其中导入了上述(7)或(7a)中所述的载体。

(9)上述(8)中所述的酵母，其增强甘油生成能力。

(9a)酵母，其通过导入上述(8)中所述的载体，增强甘油生成能力。

(10)上述(8)～(9a)中任一项所述的酵母，其增强低温保存性、冷冻保存性或耐干燥性。

(11)上述(8)～(9a)中任一项所述的酵母，其增强耐渗透压性。

(12)上述(9)或(9a)中所述的酵母，其通过使上述(6)中所述蛋白质的表达量增加，提高甘油生成能力。

(13)上述(10)中所述的酵母，其通过使上述(6)中所述蛋白质的表达量增加，提高低温保存性、冷冻保存性或耐干燥性。

(14)上述(11)中所述的酵母，其通过使上述(6)中所述蛋白质的表达量增加，提高耐渗透压性。

(15)酒精饮料的制造方法，其使用上述(8)～(14)中任一项所述的酵母。

(16)上述(15)中所述的酒精饮料的制造方法，其酿造的酒精饮料是麦芽饮料。

(17)上述(15)中所述的酒精饮料的制造方法，其酿造的酒精饮料是葡萄酒。

(18)酒精饮料，其用上述(15)～(17)中任一项所述的方法制造。

(19)评价方法，其是使用根据具有序列号：1或序列号：3碱基序列的3-磷酸甘油脱氢酶基因的碱基序列设计的引物或探针，评价被检酵母的甘油生成能力的方法。

(19a)根据上述(19)中所述的方法，筛选甘油生成能力强的酵母的方法。

(19b)使用通过(19a)中所述方法筛选的酵母制造酒精饮料(例如啤酒)的方法。

(20)评价方法，其是通过培养被检酵母，测定具有序列号：1或序列号：3碱基序列的3-磷酸甘油脱氢酶基因的表达量，评价被检酵母的甘油生成能力的方法。

(20a)筛选方法，其使用上述(20)中所述方法，评价被检酵母，筛选3-磷酸甘油脱氢酶基因的表达量高的酵母，筛选甘油生成能力强的酵母的方法。

(20b)使用通过上述(20a)中所述方法筛选的酵母制造酒精饮料(例如啤酒)的方法。

(21)酵母的选择方法，其为培养被检酵母，对上述(6)中所述的蛋白质定量或测定具有序列号：1或序列号：3碱基序列的3-磷酸甘油脱氢酶基因的表达量，选择前述蛋白质的量或前述基因表达量与目标甘油生成能力相应的被检酵母。

(21a)酵母的选择方法，其为培养被检酵母，测定甘油生成能力或3-磷酸甘油脱氢酶基因的活性，选择具有目标甘油生成能力或3-磷酸甘油脱氢酶活性的被检酵母。

(22)上述(21)中所述的酵母的选择方法，其为培养标准酵母及被检酵母，测定具有序列号：1或序列号：3碱基序列的3-磷酸甘油脱氢酶基因在各酵母中的表达量，选择该基因比标准酵母高表达的被检酵母。

(23)上述(21)中所述的酵母的选择方法，其为培养标准酵母及被检酵母，对各酵母中的上述(6)中所述的蛋白质进行定量，选择该蛋白质的量比标准酵母多的被检酵母。

(24)酒精饮料的制造方法，其特征在于，使用上述(8)～(14)中所述的酵母及通过上述(21)～(23)中所述的方法选择的酵母中的任一种酵母，进行用于酒精饮料制造的发酵，调节甘油生成量。

(25)增强酵母的低温保存性的方法，其使用含有从由以下(j)～(l)组成的群组中选择的多核苷酸的载体。

(j)多核苷酸，其含有编码由序列号：10的氨基酸序列或序列号：10的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10个氨基酸的氨基酸序列组成、且具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸；

(k)多核苷酸，其含有编码具有与序列号：10的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列、且具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸；及

(l)多核苷酸，其含有与序列号：9的碱基序列组成的多核苷酸、或序列号：9的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交、且编码具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸。

根据使用本发明的转化酵母的酒精饮料制造方法，可增大赋予产品醇厚感、柔滑感的甘油的含量，所以可制造醇厚感、柔滑感优异的酒精饮料，且本发明的转化酵母甘油含量增加。因甘油生成量增加了的酵母对于以渗透压为代表的胁迫可迅速应付，所以，低温保存性、冷冻保存性、耐干燥性优异。而且，本发明的转化酵母具有耐渗透压性，在高浓度酿造中可缩短发酵时间。

附图说明

图1是啤酒试验酿造中酵母增殖量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660的值。

图2是啤酒试验酿造中浸出物消耗量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。

图3是啤酒试验酿造中酵母的non-ScGPD1基因表达行为的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示检测出的信号辉度。

图4是啤酒试验酿造中酵母增殖量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660的值。

图5是啤酒试验酿造中浸出物消耗量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。

图6是啤酒试验酿造中酵母的non-ScGPD2基因表达行为的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示检测出的信号辉度。

图7是啤酒试验酿造中酵母增殖量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660的值。

图8是啤酒试验酿造中浸出物消耗量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。

图9是啤酒试验酿造中甘油生成量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示甘油量(g/L)的值。

图10是啤酒试验酿造中酵母增殖量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660的值。

图11是啤酒试验酿造中浸出物消耗量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。

图12是啤酒试验酿造中乙醇生成量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示乙醇量(g/L)的值。

具体实施方式

本发明者认为，通过使酵母的3-磷酸甘油脱氢酶活性增大可更高效地生成甘油。基于此设想反复进行了研究，以用日本特开2004-283169号公报中公开的方法解读的啤酒酵母基因组信息为基础，分离、鉴定了编码啤酒酵母特有的3-磷酸甘油脱氢酶的non-ScGPD1基因及non-ScGPD2基因。此碱基序列分别如序列号：1及序列号：3所示。且由此基因编码的蛋白质的氨基酸序列分别如序列号：2及序列号：4所示。而且也分离、鉴定了编码啤酒酵母的3-磷酸甘油脱氢酶的ScGPD1基因。此碱基序列如序列号：9所示。由此基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列号：10所示。

1.本发明的多核苷酸

首先，本发明提供(a)多核苷酸，其含有由序列号：1、序列号：3或序列号：9的碱基序列组成的多核苷酸；及(b)多核苷酸，其含有编码由序列号：2、序列号：4或序列号：10的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA或RNA。

作为本发明对象的多核苷酸，不只限于编码来自上述啤酒酵母的3-磷酸甘油脱氢酶的多核苷酸，还包含编码与此蛋白质具同等功能的蛋白质的其他多核苷酸。作为功能相同的蛋白质，例如，可例举为(c)由序列号：2、序列号：4或序列号：10的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个的氨基酸的氨基酸序列组成的、且具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的蛋白质。

此种蛋白质，在序列号：2、序列号：4或序列号：10的氨基酸序列中，例如，可为由缺失、取代、插入及/或添加1～100个、1～90个、1～80个、1～70个、1～60个、1～50个、1～40个、1～39个、1～38个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个(1～数个)、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、1个的氨基酸残基的氨基酸序列组成的、且具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的蛋白质。上述氨基酸残基缺失、取代、插入及/或添加的数量，一般优选较小的数量。此种蛋白质可例举为具有(d)与序列号：2、序列号：4或序列号：10的氨基酸序列有约60％以上、约70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上同一性的氨基酸序列、且具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的蛋白质。上述同源性的数值一般越大越好。

3-磷酸甘油脱氢酶活性，例如可根据Yeast 12：1331-1337，1996中所述的方法测定。

另外，本发明也包含(e)多核苷酸，其含有与序列号：1、序列号：3或序列号：9碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其含有与编码由序列号：2、序列号：4或序列号：10的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸。

此处的“在严谨条件下杂交的多核苷酸”，是指由序列号：1、序列号：3或序列号：9的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸、或编码序列号：2、序列号：4或序列号：10的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分为探针，通过使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Southern杂交法等得到的多核苷酸(例如DNA)。杂交方法，例如可利用Molecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons 1987-1997等中所述的方法。

本说明书中所述的“严谨条件”可为低严谨条件、中严谨条件、高严谨条件中的任一种。“低严谨条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件。“中严谨条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件。“高严谨条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。在上述条件中，越提高温度，越能期待高效地获得具有高同源性的多核苷酸(例如DNA)。影响杂交严谨性的因素可为温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，本领域技术人员通过适宜选择这些因素，可实现同样的严谨条件。

且杂交中使用市售的试剂盒时，例如，可使用Alkphos Direct LabellingReagents(Amersham Pharmacia公司制)。此时，根据试剂盒中附带的说明方案，与标记了的探针进行一夜培养后，将膜在55℃的条件下，用含有0.1％(w/v)SDS的第1次洗涤缓冲液洗涤，之后可检测杂交后的多核苷酸(例如DNA)。

此外可杂交的多核苷酸，通过FASTA、BLAST等同源性搜索软件，使用默认参数计算时，可为与编码序列号：2、序列号：4或序列号：10的氨基酸序列的多核苷酸有约60％以上、约70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上同一性的多核苷酸。

且氨基酸序列、碱基序列的同一性，可使用根据Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873，1993)决定。开发了基于BLAST算法、被称为BLASTN、BLASTX的程序(Altschul SF，et al：J.Mol.Biol.215：403，1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，参数例如为score＝100、wordlength＝12。且使用BLASTX分析氨基酸序列时，参数例如为score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。

2.本发明的蛋白质

本发明也提供由上述多核苷酸(a)～(l)中任一个编码的蛋白质。本发明的优选蛋白质，是由序列号：2、序列号：4或序列号：10中的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的、且具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的蛋白质。此种蛋白质，例如，可例举为由序列号：2、序列号：4或序列号：10的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加上述数量的氨基酸残基的氨基酸序列组成的、且具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的蛋白质。且此种蛋白质，可例举为含有与序列号：2、序列号：4或序列号：10的氨基酸序列具有如上述同源性的氨基酸序列、且具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的蛋白质。

此种蛋白质，可使用《分子克隆》第3版、《Current Protocols in MolecularBiology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等中所述的定点诱变法获得。

本发明的蛋白质氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个以上的氨基酸残基，是指在同一序列中任意的、且1个或多数的氨基酸序列的位置上缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸残基之意，缺失、取代、插入及添加中的2种以上也可同时发生。

以下，举例表示可相互取代的氨基酸残基。同一组中包括的氨基酸残基可相互取代。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基丝氨酸(o-methylserine)、叔丁基甘氨酸(t-butyl glycine)、叔丁基丙氨酸(t-butyl alanine)、环己基丙氨酸(cyclohexyl alanine)；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸(isoglutamic acid)、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸(2-aminosubericacid)；C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯丙氨酸、酪氨酸。

本发明的蛋白质可通过Fmoc法(fluorenylmethoxycarbonyl)、tBoc法(t-Butyl Oxy Carbonyl)等的化学合成法制造。也可利用Advanced Chem Tech公司制、珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司制、Pharmacia公司制、ProteinTechnology Instruments公司制、Synthecell-Vega公司制、PerSeptive公司制、岛津制作所公司制等的肽合成仪进行化学合成。

3.本发明的载体及导入了该载体的转化酵母

其次，本发明提供含有上述多核苷酸的载体。本发明的载体含有上述(a)～(l)中任一项所述的多核苷酸(DNA)。本发明的载体通常如下构成，其含有(x)在酵母细胞内可转录的启动子；(y)与该启动子以正义方向或反义方向结合的、上述(a)～(l)中任一项所述的多核苷酸(DNA)；以及(z)与RNA分子的转录终止及多聚腺苷酸化有关的、在酵母中起作用的信号作为构成因子的表达盒。

导入酵母时使用的载体，可利用多拷贝型(YEp型)、单拷贝型(YCp型)、染色体整合型(YIp型)中的任一种。例如，YEp型载体中的YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，AcademicPress，New York，83，1983)、YCp型载体中的YCp50(M.D.Rose et al.，Gene，60，237，1987)、YIp型载体中的YIp5(K.Struhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1035，1979)均已为人所知，且易获得。

用于调节酵母中基因表达的启动子/终止子，如能在酿造用酵母中起作用，同时又不受醪液中的成分影响，可任意组合。例如可利用3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3-磷酸甘油酸激酶(PGK1)的启动子等。这些基因已被克隆，例如可通过M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中详细记载的已知方法很容易地获得。

因酿造用酵母不能利用营养缺陷型标记，所以，转化时使用的选择性标记可利用氨基糖苷类抗生素(Geneticin)抗性基因G418r、铜抗性基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)、浅蓝菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(分别为猪腰淳嗣等，生物化学，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991)(日语原名：猪腰淳嗣ら，生化学，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991)等。

如上所述构建的载体被导入宿主酵母。宿主酵母，为可用于酿造的任意的酵母，例如可为啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体地说，虽可例举为酵母属(Saccharomyces)等的酵母，但在本发明中，可使用啤酒酵母例如Saccharomyces pastorianus W34/70等，Saccharomyces carlsbergensisNCYC453、NCYC456等，Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。而且，可使用威士忌酵母，例如Saccharomycescerevisiae NCYC90等；还可使用例如协会葡萄酒用1号、同3号、同4号等的葡萄酒酵母；例如协会酵母、清酒用7号、同9号等的清酒酵母，但不限于此。本发明中，啤酒酵母例如可优选使用Saccharomyces pastorianus。

酵母的转化方法，可利用一般可使用的公知的方法。例如，可使用电穿孔法“Meth.Enzym.，194，p182(1990)”、原生质球法(Spheroplast法)“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75p1929(1978)”、醋酸锂法“J.Bacteriology，153，p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)、Methods inyeast genetics，2000 Edition：A Cold Spring Harbor Laboratory CourseManual等中所述的方法实施，但不限于此。

更具体地说，将宿主酵母置于标准酵母营养培养基(例如YEPD培养基“Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等)中培养，使OD600nm时的值为1～6。将此培养酵母离心分离后收集、洗涤，用浓度约为1～2M的碱金属离子、优选锂离子进行预处理。将此细胞在约30℃条件、静置约60分钟后，与导入的DNA(约1～20μg)同时在约30℃条件、静置约60分钟。加入聚乙二醇，优选加入约4,000道尔顿的聚乙二醇，使最终浓度约为20％～50％。在约30℃、静置约30分钟后，将此细胞在约42℃条件、加热处理约5分钟。优选将此细胞悬浮液用标准酵母营养培养基洗涤后，放入所定量的新鲜标准酵母营养培养基中，约30℃、静置约60分钟。之后，移植到含有作为选择性标记使用的抗生素等的标准琼脂培养基中，获得转化体。其他有关一般性的克隆技术，可参照(《分子克隆》第3版)、“Methods in yeastGenetics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor，NY)”等。

4.本发明的酒精饮料制造方法及根据其制造方法获得的酒精饮料

将上述本发明的载体导入适合酿造目标制造酒精饮料的酵母中，并可通过使用其酵母，制造所需要的、增大了甘油含量、增加了香味的酒精饮料。且通过下述本发明的酵母评价方法选择的酵母也可同样使用。因本发明中所得到的酿造酵母具有耐渗透压性，所以在高浓度酿造中可缩短发酵时间。

作为制造目标的酒精饮料并不限于此，例如可例举为啤酒、发泡酒等的啤酒味饮料、葡萄酒、威士忌、清酒等。本发明中，根据需要可通过使用靶基因表达受到抑制的酿造用酵母，制造使所需酒精饮料的甘油含量降低了的酒精饮料。即使用导入上述本发明的载体的酵母、上述本发明多核苷酸(DNA)的表达受到抑制的酵母或根据下述本发明的酵母的评价方法选择的酵母，进行用于酒精饮料制造的发酵，可通过调节(增加或减少)甘油生成量，制造所需的、且甘油含量受到调节(增加或减少)的酒精饮料。

制造上述酒精饮料时，除使用本发明中所得到的酿造酵母代替亲株以外，可利用公知的技术手段。因此，原料、制造设备、制造管理等可与以往完全相同，不会因制造增加甘油含量的酒精饮料而增加成本。即根据本发明，可在使用已有设施、不增加成本的情况下，制造出醇厚感、柔滑感等优异的酒精饮料。而且因使用已有设施即可缩短高浓度酿造中的发酵时间，所以可期待降低成本。

5.本发明的酵母的评价方法

本发明涉及使用根据具有序列号：1、序列号：3或序列号：9碱基序列的3-磷酸甘油脱氢酶基因的碱基序列设计的引物或探针，评价被检酵母的甘油生成能力的方法。此种评价方法的一般方法为公知，例如，如WO 01/040514号公报、日本特开平8-205900号公报等的记载。以下，就此评价方法进行简单说明。

首先，制备被检酵母的基因组。制备方法可使用Hereford法、醋酸钾法等公知的任何方法[例如，Methods in yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，p130(1990)]。以所得到的基因组为对象，使用根据3-磷酸甘油脱氢酶基因的碱基序列(优选ORF序列)设计的引物或探针，测定被检酵母的基因组中是否存在其基因或其基因的特异性序列。引物或探针的设计可使用公知的方法进行。

基因或特异性序列的检测，可使用公知的方法进行。例如，将含有包含特异性序列的一部分或全部的多核苷酸或其碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸作为一个引物使用，另一个引物使用含有包含此序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或其碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸，通过PCR法扩增酵母的核酸，并测定扩增物的有无、扩增物分子量的大小等。用于引物的多核苷酸的碱基数通常为10bp以上，优选为15～25bp。且夹在两引物间的碱基数，通常为300～2000bp较适当。

PCR法的反应条件无特别限定，例如，可使用变性温度：90～95℃、退火温度：40～60℃、延伸温度：60～75℃、循环数：10次以上等的条件。所得到的反应生成物可使用琼脂糖凝胶等的电泳法等分离测定扩增产物的分子量。根据此方法，通过扩增产物的分子量是否是含有特异部分的DNA分子的大小，来预测、评价其酵母的甘油生成能力。且通过分析扩增物的碱基序列，可进一步更正确地预测、评价上述特性。

本发明中，可通过培养被检酵母，测定具有序列号：1、序列号：3或序列号：9碱基序列的3-磷酸甘油脱氢酶基因的表达量，评价被检酵母的甘油生成能力。且3-磷酸甘油脱氢酶基因的表达量的测定，可通过培养被检酵母，对3-磷酸甘油脱氢酶基因的产物mRNA或蛋白质定量来进行。mRNA或蛋白质的定量，可使用公知的方法。mRNA的定量例如可通过Northern杂交法、定量RT-PCR等，蛋白质的定量例如可通过Western印迹法进行(Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons 1994-2003)。

而且，可通过培养被检酵母，测定具有序列号：1、序列号：3或序列号：9碱基序列的3-磷酸甘油脱氢酶基因的表达量，选择前述基因表达量与目标甘油生成能力相应的酵母，选择适合酿造所需酒精饮料的酵母。也可培养标准酵母及被检酵母，测定各酵母中前述基因的表达量，比较标准酵母和被检酵母的前述基因的表达量，以选择所需的酵母。具体地说，例如，可通过培养标准酵母及被检酵母，测定具有序列号：1、序列号：3或序列号：9碱基序列的3-磷酸甘油脱氢酶基因的各酵母中的表达量，选择该基因比标准酵母高表达或低表达的被检酵母，来选择适合所需酒精饮料酿造的酵母。

或者可通过培养被检酵母，选择甘油生成能力高或低、或3-磷酸甘油脱氢酶活性高或低的酵母，以选择适合所需酒精饮料酿造的被检酵母。

此时，被检酵母或标准酵母，例如可使用上述导入了本发明载体的酵母、上述本发明的多核苷酸(DNA)的表达受到抑制的酵母、实施了突变处理的酵母、自发突变的酵母等。甘油生成能力，例如可通过Method of EnzymaticAnalysis，vol.4 1825-1831，1974中所述的方法测定。3-磷酸甘油脱氢酶活性，例如可通过Yeast 12：1331-1337，1996中所述的方法测定。突变处理，例如可使用紫外线照射、放射线照射等的物理方法，通过甲基磺酸乙酯(EMS：Ethylmethanesulfonate)、N-甲基-N-亚硝基胍(N-methyl-N-nitrosoguanidine)等药剂处理的化学方法等的任何方法进行(例如，参照大岛泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法、p 67-75、学会出版中心等)。

且可作为标准酵母、被检酵母使用的酵母，可例举为酿造时可使用的任意的酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体地说，可例举为酵母属(Saccharomyces)等的酵母(例如，Saccharomyces pastorianus、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces carlsbergensis)，在本发明中，可使用啤酒酵母例如Saccharomyces pastorianus W34/70等，Saccharomycescarlsbergensis NCYC453、NCYC456等，Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。而且还可使用例如协会葡萄酒用1号、3号和4号等的葡萄酒酵母；例如协会酵母、清酒用7号和9号等的清酒酵母，但不限于此。本发明中，啤酒酵母例如可优选使用Saccharomycespastorianus。标准酵母、被检酵母可从上述酵母中以任意组合选择。

实施例

以下，通过实施例详细叙述本发明，但本发明不限于以下实施例。

实施例1：3-磷酸甘油脱氢酶基因(non-ScGPD1)的克隆

使用日本特开2004-283169中记载的比较数据库检索的结果，发现了啤酒酵母中的3-磷酸甘油脱氢酶基因non-ScGPD1(序列号：1)。以所得到的碱基序列信息为基础，设计用于扩增各自全长基因的引物non-ScGPD1_for(序列号：5)/non-ScGPD1_rv(序列号：6)，以基因组解读株Saccharomyces pastorianusWeihenstephan 34/70株(有时简写为“W34/70”株)的染色体DNA为模板，通过PCR，获得了含有non-ScGPD1全长基因的DNA片段(约1.2kb)。

将如上所述得到的non-ScGPD1基因片段通过TA克隆插入到pCR2.1-TOPO载体(invitrogen公司制)。将non-ScGPD1基因的碱基序列用Sanger方法(F.Sanger，Science，214，1215，1981)进行分析，以确认碱基序列。

实施例2：啤酒试验酿造中non-ScGPD1基因的表达分析

使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株进行啤酒试验酿造，将从发酵过程中的啤酒酵母菌体中提取的mRNA用啤酒酵母DNA微阵列检测。

麦芽汁浸出物浓度 12.69％

麦芽汁容量 70L

麦芽汁溶解氧浓度 8.6ppm

发酵温度 15℃

酵母投入量 12.8×10⁶细胞/mL

对发酵液经时取样，观察酵母增殖量(图1)、表观浸出物浓度(图2)的经时变化。与此同时对酵母菌体取样，对制备后的mRNA进行生物素标记，使其与啤酒酵母DNA微阵列杂交。信号检测使用GeneChip Operating System(GCOS；GeneChip Operating Software 1.0 AFFYMETRIX公司制)进行。non-ScGPD1基因的表达模式如图3所示。由此结果，可确认通常的啤酒发酵中non-ScGPD1基因进行了表达。

实施例3：non-ScGPD1高表达株的制备

将用实施例1中所述方法得到的non-ScGPD1/pCR2.1-TOPO用限制性内切酶SacI及BamHI酶切，制备包含蛋白质编码区域全长的DNA片段。使此片段与用限制性内切酶SacI及BamHI処理的pYEGNot连接，构建了non-ScGPD1高表达载体non-ScGPD1/pYEGNot。pYEGNot是YEp型的酵母表达载体，导入的基因通过丙酮酸激酶基因PYK1的启动子高表达。酵母中的选择性标记包含氨基糖苷类抗生素抗性基因G418^r、大肠杆菌中的选择性标记包含氨苄青霉素抗性基因Amp^r。

使用由上述方法制备的高表达载体，用日本特开平07-303475中所述的方法转化Saccharomyces pastorianus Weihenstephan 34/70株或Saccharomyces cerevisiae BH174株或Saccharomyces cerevisiae BH172株。用含有氨基糖苷类抗生素300mg/L的YPD平板培养基(1％酵母浸出物、2％多聚蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂)选择转化体。

实施例4：3-磷酸甘油脱氢酶基因(non-ScGPD2)的克隆

使用日本特开2004-283169中记载的比较数据库检索的结果，发现了啤酒酵母中的3-磷酸甘油脱氢酶基因non-ScGPD2(序列号：3)。以所得到的碱基序列信息为基础，设计用于扩增各自全长基因的引物non-ScGPD2_for(序列号：7)/non-ScGPD2_rv(序列号：8)，以基因组解读株Saccharomyces pastorianusWeihenstephan 34/70株的染色体DNA为模板，通过PCR，获得了含有non-ScGPD2全长基因的DNA片段(约1.3kb)。

将如上所述得到的non-ScGPD2基因片段通过TA克隆插入到pCR2.1-TOPO载体(invi trogen公司制)。将non-ScGPD2基因的碱基序列用Sanger方法(F.Sanger，Science，214，1215，1981)进行分析，以确认碱基序列。

实施例5：啤酒试验酿造中non-ScGPD2基因的表达分析

麦芽汁浸出物浓度 12.69％

麦芽汁容量 70L

麦芽汁溶解氧浓度 8.6ppm

发酵温度 15℃

酵母投入量 12.8×10⁶细胞/mL

对发酵液经时取样，观察酵母增殖量(图4)、表观浸出物浓度(图5)的经时变化。与此同时对酵母菌体取样，对制备后的mRNA进行生物素标记，使其与啤酒酵母DNA微阵列杂交。信号检测使用GeneChip Operating System(GCOS；GeneChip Operating Software 1.0 AFFYMETRIX公司制)进行。non-ScGPD2基因的表达模式如图6所示。由此结果，可确认通常的啤酒发酵中non-ScGPD2基因进行了表达。

实施例6：啤酒试验酿造中甘油生成量的分析

使用亲株(34/70株)及用实施例3中所述方法得到的non-ScGPD1高表达株，通过以下条件进行了发酵试验。

麦芽汁浸出物浓度 12％

麦芽汁容量 1L

麦芽汁溶解氧浓度约 10ppm

发酵温度 15℃一定

酵母投入量 5g湿酵母菌体/L麦芽汁

对发酵醪液经时抽样，观察酵母增殖量(OD660)(图7)、浸出物消耗量的经时变化(图8)、甘油生成量的经时变化(图9)。对醪液中甘油的定量使用F-试剂盒甘油(产品编号148270、Roche公司制)进行(文献Method ofEnzymatic Analysis，vol.4 1825-1831，1974)。发酵终止时醪液中的甘油，亲株为1.7g/L，non-ScGPD1高表达株为6.2g/L，约增加到3.6倍。

实施例7：使用高浓度麦芽汁的啤酒酿造试验

麦芽汁浸出物浓度 19.3％(在12％麦芽汁中添加糖浆)

麦芽汁容量 1L

麦芽汁溶解氧浓度约 10ppm

发酵温度 15℃一定

酵母投入量 5g湿酵母菌体/L麦芽汁

对发酵醪液经时抽样，观察酵母增殖量(OD660)(图10)、浸出物消耗量的经时变化(图11)、乙醇生成量的经时变化(图12)。乙醇生成量使用F-试剂盒乙醇(产品编号1 76290、Roche公司制)进行(文献Z.Anal.Chem.284：113-117，1977)。如图12所示，发酵184小时后乙醇生成量，亲株为68g/L，non-ScGPD1高表达株为74g/L，证明由于non-ScGPD1高表达而促进了发酵。

实施例8：低温保存性试验

使用亲株(BH174株)及用实施例3中所述方法得到的non-ScGPD1高表达株，通过以下条件进行了低温保存性试验。

在YPD液体培养基(1％酵母浸出物、2％多聚蛋白胨、2％葡萄糖)中30℃培养过夜，离心分离并收集菌体，于5％乙醇中悬浮，使其约为80细胞/ml，在4℃下保持29日后，将死亡菌数用亚甲基蓝染色(日本啤酒造组合编，BCOJ微生物分析法。日语原名：「ビ一ル酒造組合编、BCOJ微生物分析法」)判定，测定活菌率。同样用10％乙醇悬浮，4℃保持2日后，测定活菌率。如表1所示，亲株的活菌率用5％乙醇、29日后为45.1％，10％乙醇、2日后为54.1％，而non-ScGPD1高表达株分别为58.7％、76.6％，证明活菌率增加。

表1

低温保存后的活菌率

实施例9：冷冻保存性试验

使用亲株(BH174株)及用实施例3中所述方法得到的non-ScGPD1高表达株，通过以下条件进行了冷冻保存性试验。

在YPD液体培养基(1％酵母浸出物、2％多聚蛋白胨、2％葡萄糖)中30℃培养过夜，离心分离并收集菌体，悬浮于水中，使其为约80细胞/ml，在-20℃下保持29日后，将死亡菌数用亚甲基蓝染色(日本啤酒造组合编，BCOJ微生物分析法)判定，测定活菌率。如表2所示，亲株的活菌率为33.3％，non-ScGPD1高表达株为39.3％，证明活菌率增加了。

表2

冷冻保存后的活菌率

实施例10：耐干燥性试验

使用亲株(BH172株)及用实施例3所述方法得到的non-ScGPD1高表达株，通过以下条件进行了耐干燥性试验。

在YPD液体培养基(1％酵母浸出物、2％多聚蛋白胨、2％葡萄糖)中30℃培养过夜，离心分离并收集菌体，悬浮于水中，使其为约80细胞/ml，真空干燥，在4℃下保持29日后，复水(水で復水し)，将死亡菌数用亚甲基蓝染色(日本啤酒造组合编，BCOJ微生物分析法)判定，测定活菌率。如表3所示，亲株的活菌率为0％，non-ScGPD1高表达株为23.3％，证明活菌率增加了。

表3

干燥后的活菌率

实施例11：低温保存性试验

使用亲株(KN009F株)及用FEMS Yeast Res.2：225-232(2002)中所述方

法获得的ScGPD1高表达株，通过以下条件进行低温保存性试验。

在YPD液体培养基(1％酵母浸出物、2％多聚蛋白胨、2％葡萄糖)中30℃培养过夜，离心分离并收集菌体，悬浮于5％乙醇中，在4℃下保持10日后，将死亡菌数用亚甲基蓝染色(日本啤酒造组合编，BCOJ微生物分析法)判定，测定活菌率。如表4所示，亲株的活菌率为64％，ScGPD1高表达株为94％，证明活菌率增加了。

表4

低温保存后的活菌率

根据本发明的酒精饮料制造法，因产品中赋予醇厚感、柔滑感等的甘油含量增加，所以可制造出香味优异的酒精饮料。且根据本发明，可提供低温保存性、冷冻保存性、耐干燥性优异的酿造用酵母。而且，根据本发明的酿造用酵母，在高浓度酿造时可缩短发酵时间。

序列表

<110>三得利株式会社(Suntory Limited)

<120>3-磷酸甘油脱氢酶基因及其用途

(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase gene and use thereof

<130>G06-0104CN

<150>JP2006-55556

<151>2006-03-01

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1176

<212>DNA

<213>酵母属(Saccharomyces sp).

<400>1

atgtctgctg ctgctgatag attaaactta acctctggcc atttgaacgc cggtagaaag 60

agaagttctt cttctgtttc tttgaaggcc gctgaaaagc ctttcaaggt caccgtcatt 120

ggttccggta actggggtac caccattgca aaggtcgttg ctgaaaactg taagggttac 180

ccagaggttt tcgctccaga agttcaaatg tgggtgtttg aagaagacat taacggtgaa 240

aaacttaccg aaatcataaa taccagacac caaaacgtca agtacctgcc aaatatcact 300

cttccagaca acctggtcgc caacccagat ttgattgact ccgttaagga cgtcgacatt 360

ctagtgttca acatcccaca tcaatttttg ccacgtatct gtggccaatt gaagggtcac 420

gtcagctctc acgtcagagc tatctcctgt ttgaagggtt tcgaagtcgg tgccaagggt 480

gtccaattgt tgtcctctta catcaccgaa aacctaggca tccaatgtgg tgctttatcc 540

ggtgctaaca ttgccacaga ggtcgcccaa gaacattggt ctgaaaccac agttgcctac 600

cacattccaa aggactttag aggtgagggt aaggatgtcg accacaaggt cttgaaagcc 660

ttgttccaca gaccttactt ccacgtcagt gtcattgaag atgtcgccgg tatctccatc 720

tgtggtgctt tgaagaacgt cgtcgccttg ggttgcggtt tcgtcgaagg tctgggctgg 780

ggtaacaacg cttctgccgc cattcaaaga gtcggtctgg gtgagatcat aaggttcggc 840

caaatgtttt tcccagaatc tagagaagaa acctactatc aagaatccgc tggtgttgct 900

gacttgatca ccacctgtgc cggtggtaga aacgtcaagg ttgctagatt aatggctact 960

tctggtaagg atgcctggga gtgtgaaaaa gagttgttga acggccaatc cgctcaaggt 1020

ttgatcacct gtaaggaagt ccacgaatgg ttagaaacct gtgggtccgt tgaagatttc 1080

ccattgttcg aagccgtcta ccaaatcgtt tacaacaact acccaatgaa gaacctgccg 1140

gatatgattg aagaattaga tctacacgga gaatag 1176

<210>2

<211>391

<212>PRT

<213>酵母属(Saccharomyces sp).

<400>2

Met Ser Ala Ala Ala Asp Arg Leu Asn Leu Thr Ser Gly His Leu Asn

1 5 10 15

Ala Gly Arg Lys Arg Ser Ser Ser Ser Val Ser Leu Lys Ala Ala Glu

20 25 30

Lys Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr

35 40 45

Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Cys Lys Gly Tyr Pro Glu Val Phe

50 55 60

Ala Pro Glu Val Gln Met Trp Val Phe Glu Glu Asp Ile Asn Gly Glu

65 70 75 80

Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr Leu

85 90 95

Pro Asn Ile Thr Leu Pro Asp Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile

100 105 110

Asp Ser Val Lys Asp Val Asp Ile Leu Val Phe Asn Ile Pro His Gln

115 120 125

Phe Leu Pro Arg Ile Cys Gly Gln Leu Lys Gly His Val Ser Ser His

130 135 140

Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Ala Lys Gly

145 150 155 160

Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Ile Thr Glu Asn Leu Gly Ile Gln Cys

165 170 175

Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Ile Ala Thr Glu Val Ala Gln Glu His

180 185 190

Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr His Ile Pro Lys Asp Phe Arg Gly

195 200 205

Glu Gly Lys Asp Val Asp His Lys Val Leu Lys Ala Leu Phe His Arg

210 215 220

Pro Tyr Phe His Val Ser Val Ile Glu Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile

225 230 235 240

Cys Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Glu

245 250 255

Gly Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly

260 265 270

Leu Gly Glu Ile Ile Arg Phe Gly Gln Met Phe Phe Pro Glu Ser Arg

275 280 285

Glu Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr

290 295 300

Thr Cys Ala Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Leu Met Ala Thr

305 310 315 320

Ser Gly Lys Asp Ala Trp Glu Cys Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly Gln

325 330 335

Ser Ala Gln Gly Leu Ile Thr Cys Lys Glu Val His Glu Trp Leu Glu

340 345 350

Thr Cys Gty Ser Val Glu Asp Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln

355 360 365

Ile Val Tyr Asn Asn Tyr Pro Met Lys Asn Leu Pro Asp Met Ile Glu

370 375 380

Glu Leu Asp Leu His Gly Glu

385 390

<210>3

<211>1320

<212>DNA

<213>酵母属(Saccharomyces sp).

<400>3

atgcttgctc tcagacggtt aacaagatac acattcctca agcgaacgca tccggtgtta 60

tctgctcatc gtgcatataa atttttccct ttaagttcca cttgctcaag aagaacattt 120

cagatacaac tgcgctcaaa gatgactgct catatcaacc acaaatcgca caacggtaac 180

caagatgacc atccgttcaa aagatcagac tctgcggtgt cgattatgca tttgaaacgt 240

gagcctttca agatcacagt gattggttcc ggtaactggg ggaccaccat cgccaaagtt 300

attgcagaaa acacagagct gcattctcat attttcaacc cggaagtgag aatgtgggtg 360

tttgatgaga aaatcggtga cgaaaatcta acggatatca taaatacaag acatcaaaac 420

gtcaaatatc taccaaatat cgacctgccc cacaacttgg tggctgatcc cgatcttttg 480

cattccatca agggtgctga tatccttgtc ttcaacatcc ctcatcaatt cttacctaat 540

atagtcaaac agctacaagg ccacgtggcc cctcacgtaa gagccatctc gtgtctcaaa 600

gggttcgaac tgggctccaa gggtgttcag ttgctgtcct cctacgtcac cgacgagtta 660

ggagtccaat gtggtgcatt atccggcgcc aacctagccc ccgaagtggc caaggaacac 720

tggtccgaaa ccaccgtggc ctaccaactg ccaaaggact accaaggtga aggcaaggac 780

gtagaccaca aggttctaaa actactgttc cacagacctt acttccacgt caacgtcatc 840

gacgatgttg ctggtatctc cattgcaggt gctttgaaaa acgtcgtagc actggcctgc 900

gggttcgtag aaggcatggg atggggtaac aacgcctccg ctgccatcca gagactgggt 960

ctgggcgaga tcatcaagtt cgggagaatg ttcttcccgg aatccaaggt cgagacctac 1020

taccaggagt ccgctggtgt ggctgatcta atcaccacat gttcaggcgg cagaaacgtc 1080

aaggtcgcta cgtacatggc caagaccggc aagtccgccc tggaagcaga aaaggaactg 1140

ctaaacggcc agtccgccca ggggatcatc acatgcagag aagtccacga gtggctgcaa 1200

acgtgtgagt tgacccaaga atacccactg ttcgaggcgg tgtaccagat agtttacaac 1260

aacgtccgca tggaagacct accggaaatg attgaagaac tagacatcga ggacaaatag 1320

<210>4

<211>439

<212>PRT

<213>酵母属(Saccharomyces sp).

<400>4

Met Leu Ala Leu Arg Arg Leu Thr Arg Tyr Thr Phe Leu Lys Arg Thr

1 5 10 15

His Pro Val Leu Ser Ala His Arg Ala Tyr Lys Phe Phe Pro Leu Ser

20 25 30

Ser Thr Cys Ser Arg Arg Thr Phe Gln Ile Gln Leu Arg Ser Lys Met

35 40 45

Thr Ala His Ile Asn His Lys Ser His Asn Gly Asn Gln Asp Asp His

50 55 60

Pro Phe Lys Arg Ser Asp Ser Ala Val Ser Ile Met His Leu Lys Arg

65 70 75 80

Glu Pro Phe Lys Ile Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr

85 90 95

Ile Ala Lys Val Ile Ala Glu Asn Thr Glu Leu His Ser His Ile Phe

100 105 110

Asn Pro Glu Val Arg Met Trp Val Phe Asp Glu Lys Ile Gly Asp Glu

115 120 125

Asn Leu Thr Asp Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr Leu

130 135 140

Pro Asn Ile Asp Leu Pro His Asn Leu Val Ala Asp Pro Asp Leu Leu

145 150 155 160

His Ser Ile Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Phe Asn Ile Pro His Gln

1651 70 175

Phe Leu Pro Asn Ile Val Lys Gln Leu Gln Gly His Val Ala Pro His

180 185 190

Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Leu Gly Ser Lys Gly

195 200 205

Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Val Thr Asp Glu Leu Gly Val Gln Cys

210 215 220

Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala Lys Glu His

225 230 235 240

Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr Gln Leu Pro Lys Asp Tyr Gln Gly

245 250 255

Glu Gly Lys Asp Val Asp His Lys Val Leu Lys Leu Leu Phe His Arg

260 265 270

Pro Tyr Phe His Val Asn Val Ile Asp Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile

275 280 285

Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Ala Cys Gly Phe Val Glu

290 295 300

Gly Met Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Leu Gly

305 310 315 320

Leu Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Arg Met Phe Phe Pro Glu Ser Lys

325 330 335

Val Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr

340 345 350

Thr Cys Ser Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Thr Tyr Met Ala Lys

355 360 365

Thr Gly Lys Ser Ala Leu Glu Ala Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly Gln

370 375 380

Ser Ala Gln Gly Ile Ile Thr Cys Arg Glu Val His Glu Trp Leu Gln

385 390 395 400

Thr Cys Glu Leu Thr Gln Glu Tyr Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln

405 410 415

Ile Val Tyr Asn Asn Val Arg Met Glu Asp Leu Pro Glu Met Ile Glu

420 425 430

Glu Leu Asp Ile Glu Asp Lys

435

<210>5

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>5

gagctcatag cggccatgtc tgctgctgct gatagattaa 40

<210>6

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>6

ggatcctatg cggccgcgtt atgggaaatg acataatgct ag 42

<210>7

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>7

gagctcatag cggccatgct tgctctcaga cggttaacaa 40

<210>8

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>8

ggatcctatg cggccgcagt agtagtagta gtagtactag ag 42

<210>9

<211>1176

<212>DNA

<213>酵母属(Saccharomyces sp).

<400>9

atgtctgctg etgctgatag attaaactta acttccggcc acttgaatgc tggtagaaag 60

agaagttcct cttctgtttc tttgaaggct gccgaaaagc ctttcaaggt tactgtgatt 120

ggatctggta actggggtac tactattgcc aaggtggttg ccgaaaattg taagggatac 180

ccagaagttt tcgctccaat agtacaaatg tgggtgttcg aagaagagat caatggtgaa 240

aaattgactg aaatcataaa tactagacat caaaacgtga aatacttgcc tggcatcact 300

ctacccgaca atttggttgc taatccagac ttgattgatt cagtcaagga tgtcgacatc 360

atcgttttca acattccaca tcaatttttg ccccgtatct gtagccaatt gaaaggtcat 420

gttgattcac acgtcagagc tatctcctgt ctaaagggtt ttgaagttgg tgctaaaggt 480

gtccaattgc tatcctctta catcactgag gaactaggta ttcaatgtgg tgctctatct 540

ggtgctaaca ttgccaccga agtcgctcaa gaacactggt ctgaaacaac agttgcttac 600

cacattccaa aggatttcag aggcgagggc aaggacgtcg accataaggt tctaaaggcc 660

ttgttccaca gaccttactt ccacgttagt gtcatcgaag atgttgctgg tatctccatc 720

tgtggtgctt tgaagaacgt tgttgcctta ggttgtggtt tcgtcgaagg tctaggctgg 780

ggtaacaacg cttctgctgc catccaaaga gtcggtttgg gtgagatcat cagattcggt 840

caaatgtttt tcccagaatc tagagaagaa acatactacc aagagtctgc tggtgttgct 900

gatttgatca ccacctgcgc tggtggtaga aacgtcaagg ttgctaggct aatggctact 960

tctggtaagg acgcctggga atgtgaaaag gagttgttga atggccaatc cgctcaaggt 1020

ttaattacct gcaaagaagt tcacgaatgg ttggaaacat gtggctctgt cgaagacttc 1080

ccattatttg aagccgtata ccaaatcgtt tacaacaact acccaatgaa gaacctgccg 1140

gacatgattg aagaattaga tctacatgaa gattag 1176

<210>10

<211>391

<212>PRT

<213>酵母属(Saccharomyces sp).

<400>10

Met Ser Ala Ala Ala Asp Arg Leu Asn Leu Thr Ser Gly His Leu Asn

1 5 10 15

Ala Gly Arg Lys Arg Ser Ser Ser Ser Val Ser Leu Lys Ala Ala Glu

20 25 30

Lys Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr

35 40 45

Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Cys Lys Gly Tyr Pro Glu Val Phe

50 55 60

Ala Pro Ile Val Gln Met Trp Val Phe Glu Glu Glu Ile Asn Gly Glu

65 70 75 80

Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr Leu

85 90 95

Pro Gly Ile Thr Leu Pro Asp Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile

100 105 110

Asp Ser Val Lys Asp Val Asp Ile Ile Val Phe Asn Ile Pro His Gln

115 120 125

Phe Leu Pro Arg Ile Cys Ser Gln Leu Lys Gly His Val Asp Ser His

130 135 140

Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Ala Lys Gly

145 150 155 160

Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Ile Thr Glu Glu Leu Gly Ile Gln Cys

165 170 175

Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Ile Ala Thr Glu Val Ala Gln Glu His

180 185 190

Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr His Ile Pro Lys Asp Phe Arg Gly

195 200 205

Glu Gly Lys Asp Val Asp His Lys Val Leu Lys Ala Leu Phe His Arg

210 215 220

Pro Tyr Phe His Val Ser Val Ile Glu Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile

225 230 235 240

Cys Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Glu

245 250 255

Gly Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly

260 265 270

Leu Gly Glu Ile Ile Arg Phe Gly Gln Met Phe Phe Pro Glu Ser Arg

275 280 285

Glu Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr

290 295 300

Thr Cys Ala Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Leu Met Ala Thr

305 310 315 320

Ser Gly Lys Asp Ala Trp Glu Cys Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly Gln

325 330 335

Ser Ala Gln Gly Leu Ile Thr Cys Lys Glu Val His Glu Trp Leu Glu

340 345 350

Thr Cys Gly Ser Val Glu Asp Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln

355 360 365

Ile Val Tyr Asn Asn Tyr Pro Met Lys Asn Leu Pro Asp Met Ile Glu

370 375 380

Glu Leu Asp Leu His Glu Asp

385 390

Claims

1.多核苷酸，其编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其由序列号：1的碱基序列组成。

3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其是DNA。

4.蛋白质，其由权利要求1～3中任一项所述的多核苷酸编码。

5.载体，其含有权利要求1～3中任一项所述的多核苷酸。

6.酵母，其中导入权利要求5中所述的载体。

7.根据权利要求6中所述的酵母，其增强甘油生成能力。

8.根据权利要求6或7中所述的酵母，其增强低温保存性、冷冻保存性或耐干燥性。

9.根据权利要求6或7中所述的酵母，其增强耐渗透压性。

10.根据权利要求7中所述的酵母，其通过使权利要求4中所述蛋白质的表达量增加，提高甘油生成能力。

11.根据权利要求8中所述的酵母，其通过使权利要求4中所述蛋白质的表达量增加，增强低温保存性、冷冻保存性或耐干燥性。

12.根据权利要求9中所述的酵母，其通过使权利要求4中所述蛋白质的表达量增加，增强耐渗透压性。

13.酒精饮料的制造方法，其使用权利要求6～12中任一项所述的酵母。

14.根据权利要求13中所述的酒精饮料的制造方法，其酿造的酒精饮料是麦芽饮料。

15.根据权利要求13中所述的酒精饮料的制造方法，其酿造的酒精饮料是葡萄酒。

16.评价方法，其是使用根据由序列号：1的碱基序列组成的3-磷酸甘油脱氢酶基因的碱基序列设计的引物或探针，评价被检酵母的甘油生成能力的方法。

17.评价方法，其是通过培养被检酵母，测定由序列号：1的碱基序列组成的3-磷酸甘油脱氢酶基因的表达量，评价被检酵母的甘油生成能力的方法。

18.酵母的选择方法，其为培养被检酵母，对权利要求4中所述的蛋白质定量或测定由序列号：1的碱基序列组成的3-磷酸甘油脱氢酶基因的表达量，选择前述蛋白质的量或前述基因表达量与目标甘油生成能力相应的被检酵母。

19.根据权利要求18中所述的酵母的选择方法，其为培养标准酵母及被检酵母，测定由序列号：1的碱基序列组成的3-磷酸甘油脱氢酶基因在各酵母中的表达量，选择该基因比标准酵母高表达的被检酵母。

20.根据权利要求18中所述的酵母的选择方法，其为培养标准酵母及被检酵母，对各酵母中的权利要求4中所述的蛋白质进行定量，选择该蛋白质的量比标准酵母多的被检酵母。

21.酒精饮料的制造方法，其特征在于，使用权利要求6～12中的任意一项所述的酵母或通过权利要求18～20中的任意一项所述的方法选择出的酵母，进行用于酒精饮料制造的发酵，调节甘油生成量。