CN101978053B

CN101978053B - 葡萄糖诱导性失活及降解抗性转运蛋白基因及其用途

Info

Publication number: CN101978053B
Application number: CN2008800006335A
Authority: CN
Inventors: 畠中治代; 大村文彦
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2008-09-09
Filing date: 2008-09-09
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2028-09-09
Also published as: CN101978053A; US20100285173A1; DK2246421T3; EP2246421A1; EP2246421B1; EP2246421A4; JP4430133B1; WO2010029612A1; JPWO2010029612A1; US8053224B2

Abstract

本发明涉及对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白的基因及其用途，特别涉及具有优异的低聚糖(麦芽糖、麦芽三糖等)分解性的酿造酵母、使用该酵母制造的酒类、其制造方法等。特别是本发明涉及Mal21p等对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白、编码该转运蛋白的基因、利用该转运蛋白的酒类的制造方法等。

Description

葡萄糖诱导性失活及降解抗性转运蛋白基因及其用途

技术领域

本发明涉及葡萄糖诱导性失活/降解抗性转运蛋白基因及其用途，特别涉及具有优异的低聚糖(麦芽糖、麦芽三糖等)分解性的酿造酵母、使用该酵母制造的酒类及其制造方法等。

背景技术

在制造啤酒、发泡酒、威士忌等麦芽发酵饮料时，将麦芽等进行糖化后的麦汁中含有的糖主要为葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖这3种。这些来自麦芽的糖的比率，可根据糖化方法发生若干变化，但在不添加酶剂、不添加糖化淀粉等的情况下，没有大的改变，可以说为大约1∶5∶1的比例。其中，葡萄糖是单糖，是最适合于酵母的糖，首先被分解。

在葡萄糖存在下，酵母中有多种基因的转录过程受到抑制。将这种抑制控制称为葡萄糖阻遏。将麦芽糖、麦芽三糖转运到酵母中时所必须的多种转运蛋白均受到此抑制。并且已知受到葡萄糖阻遏的基因的产物，进一步被翻译后，在葡萄糖存在下也会失活。已知α-葡萄糖苷转运蛋白也属于这一类，在葡萄糖存在下被快速降解。因为麦芽糖、麦芽三糖分解的第一步骤是，通过该转运蛋白将其转运到酵母细胞内，所以如果转运蛋白被降解，那么这些分解也会停止。这就是将转运蛋白的表达称为分解的限速步骤的理由。

非专利文献1：Brondijk，T.H.，van der Rest，M.E.，Pluim，D.，de Vries，Y.de.，Stingl，K.，Poolman，B.，and Konings，W.N.(1998)J Biol Chem 273(25)，15352-15357

非专利文献2：Medintz，I.，Wang，X.，Hradek，T.，and Michels，C.A.(2000)Biochemistry 39(15)，4518-4526

非专利文献3：Gadura，N.，and Michels，C.A.(2006)Curr Genet 50(2)，101-114

发明内容

发明要解决的课题

在这种情况下，期望提供表达不易因葡萄糖导致失活或降解的低聚糖转运蛋白、使麦芽糖等低聚糖的分解性提高的酵母。

解决课题的方法

本发明者为了解决上述课题进行了精心研究，开发出了用于筛选不易因葡萄糖导致失活、降解的转运蛋白(以下称为“对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性转运蛋白”)或筛选使其表达的酵母的新方法，并且根据该筛选方法，找到了对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白或包含其的酵母，从而完成了本发明。

即：本发明涉及编码对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白的基因、被该基因编码的转运蛋白、该基因的表达受到调控的转化酵母、通过使用该基因的表达受到调控的酵母制造酒类的方法等。更加具体地说，本发明提供以下所示的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、导入了该载体的转化酵母、使用该转化酵母的酒类的制造方法等。

(1)多核苷酸，其为选自由下述(a)～(f)所组成的组中的多核苷酸，

(a)多核苷酸，其含有由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸，

(b)多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸，

(c)多核苷酸，其含有编码转运蛋白的多核苷酸，该转运蛋白由序列号2的氨基酸序列中1～15个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列组成、且对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性，

(d)多核苷酸，其含有编码转运蛋白的多核苷酸，该转运蛋白具有与序列号2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列、且对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性，

(e)多核苷酸，其含有与由序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白的多核苷酸，以及

(f)多核苷酸，其含有与编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的碱基序列的互补碱基序列所组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白的多核苷酸。

(2)如上述(1)所述的多核苷酸，其为选自由下述(g)～(i)所组成的组中的多核苷酸，

(g)多核苷酸，其含有编码转运蛋白的多核苷酸，该转运蛋白由序列号2的氨基酸序列或序列号2的氨基酸序列中1～5个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列组成、且对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性，

(h)多核苷酸，其含有编码转运蛋白的多核苷酸，该转运蛋白具有与序列号2的氨基酸序列有97％以上的同一性的氨基酸序列、且对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性，

(i)多核苷酸，其含有与由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸，或者含有与由序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交、且编码对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白的多核苷酸。

(3)如上述(1)或(2)所述的多核苷酸，其含有由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸。

(4)如上述(1)或(2)所述的多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。

(5)如上述(1)～(4)中任一项所述的多核苷酸，其为DNA。

(6)蛋白质，其为被上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸编码的蛋白质。

(7)载体，其含有上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸。

(8)转化酵母，其中导入了上述(7)所述的载体。

(9)如上述(8)所述的酿造用酵母，其中，通过导入上述(7)所述的载体，低聚糖分解能力提高。

(10)如上述(8)所述的酿造用酵母，其中，通过增加上述(6)所述的蛋白质的表达量，低聚糖分解能力提高。

(11)酒类的制造方法，其中，使用上述(8)～(10)中任一项所述的酵母。

(12)如上述(11)所述的酒类的制造方法，其中，酿造的酒类是麦芽饮料。

(13)如上述(12)所述的酒类的制造方法，其中，酿造的酒类是葡萄酒。

(14)酒类，其为利用上述(11)～(13)中任一项所述的方法制造的酒类。

发明的效果

通过使用本发明涉及的酵母，具有可加快含有麦芽糖等低聚糖的酒醪的发酵速度的优点。本发明涉及的转运蛋白基因，可导入任何酿造用酵母或实验室酵母中。特别是在大量含有葡萄糖、果糖等单糖的发酵原液中含有本发明涉及的转运蛋白可转运的低聚糖(麦芽糖、麦芽三糖、松二糖(Turanose)、海藻糖(trehalose)等)的情况下，更加有效。

附图说明

图1是表示实验室酵母株在2-脱氧葡萄糖存在下生长繁殖的不同的图。

图2表示MAL21基因的碱基序列。

图3表示Mal21p的氨基酸序列。

图4-1是Mal21p/Mal31p/Mal61p的氨基酸序列的比对图。

图4-2是Mal21p/Mal31p/Mal61p的核苷酸序列的比对图。

图4-3是接续图4-2。

图4-4是接续图4-3。

图5是表示具有MAL21/MAL61基因的菌株在2-脱氧葡萄糖存在下生长繁殖的不同的图。

图6是表示Mal21p及Mal61p在葡萄糖存在下的降解速度的图。

图7是表示使MAL21/MAL61基因高表达的实验室株在麦芽糖培养基上的生长繁殖的图。

图8是表示使MAL21基因高表达的下面啤酒酵母株的发泡酒或者发泡酒(富含葡萄糖)麦汁中的麦芽糖发酵速度的图。

图9是表示使Mal21p转运蛋白高表达的上面啤酒酵母的麦汁中的麦芽糖发酵速度的图。

图10是表示质粒pJHXSB的组成的图。

图11是表示质粒pJHIXSB的组成的图。

图12是表示质粒pYCGPY的组成的图。

图13是表示质粒pUP3GLP的组成的图。

具体实施方式

本发明者认为，如果能够控制翻译后的转运蛋白因葡萄糖导致的失活或降解，即使在葡萄糖存在下，麦芽糖及麦芽三糖也可被酵母更高效地分解。基于这种想法进行精心研究，结果从自然界中发现了不易被降解的α-葡萄糖苷转运蛋白Mal21p，并且确认Mal21p的降解速度远远低于其他转运蛋白。

此外，通过使新获取的不易因葡萄糖导致失活或降解的转运蛋白进行高表达，确实成功地提高了在麦芽糖培养基上的增殖速度，并且在啤酒酿造中可加快麦芽糖的分解速度。本发明根据这种设想和研究成果而得以完成。

本发明中序列号1～6表示以下基因的碱基序列或以下转运蛋白的氨基酸序列。

序列号：1 MAL21核苷酸序列

序列号：2 Mal21p α-葡萄糖苷转运蛋白氨基酸序列

序列号：3 MAL31核苷酸序列

序列号：4 Mal31p α-葡萄糖苷转运蛋白氨基酸序列

序列号：5 MAL61核苷酸序列

序列号：6 Mal61p α-葡萄糖苷转运蛋白氨基酸序列

本说明书中使用的“α-葡萄糖苷转运蛋白”是指与α-葡萄糖苷的转运相关的蛋白质，作为α-葡萄糖苷转运蛋白，包括麦芽糖转运蛋白、麦芽三糖转运蛋白等。

1.本发明的多核苷酸

首先，本发明提供的多核苷酸是：(a)多核苷酸，含有由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸；以及(b)多核苷酸，含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA，也可以是RNA。

在本发明中作为对象的多核苷酸，并不限定于编码上述序列的蛋白质的多核苷酸，还包括编码与该蛋白质具有同等功能的蛋白质的其他多核苷酸。作为功能同等的蛋白质，可例举出，例如(c)由序列号2的氨基酸序列中1～15个(优选为1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列组成、且对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白。

作为这种蛋白质，可例举出，由序列号2的氨基酸序列中例如1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个(1～数个)、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、1个氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列组成、且对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白。上述氨基酸残基的缺失、取代、插入及/或添加的数量，通常情况下越小越好。此外，作为这种蛋白质，可例举，(d)具有与序列号2的氨基酸序列有90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上或99.9％以上同一性的氨基酸序列，且对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白。上述同源性的数值通常情况下越大越好。

<葡萄糖诱导性失活/降解抗性的评价>

在本发明中，对葡萄糖诱导性失活/降解的抗性，例如，可按以下方法进行评价。首先，确认表达各转运蛋白的菌株在含有0～2mM的2-脱氧葡萄糖的包含2％麦芽糖的完全合成培养基(SCM)(无氨基酸酵母氮源(Yeast Nitrogen Basew/o amino acids)6.7g/L、麦芽糖20g/L、硫酸腺嘌呤20mg/ml、尿嘧啶20mg/ml、L-色氨酸20mg/ml、L-组氨酸盐酸盐20mg/ml、L-精氨酸盐酸盐20mg/ml、L-蛋氨酸20mg/ml、L-酪氨酸30mg/ml、L-亮氨酸30mg/ml、L-异亮氨酸30mg/ml、L-赖氨酸盐酸盐30mg/ml、L-苯丙氨酸50mg/ml、L-谷氨酸100mg/ml、L-天冬氨酸100mg/ml、L-缬氨酸150mg/ml、L-苏氨酸200mg/ml、L-丝氨酸400mg/ml)或者在含有0～2mM的2-脱氧葡萄糖的麦芽糖等的最小必需培养基(无氨基酸酵母氮源(Yeast Nitrogen Base w/o amino acids)6.7g/L、麦芽糖等5g/L，但对于营养缺陷型转化株，含有其营养素)上的生长繁殖状况，即使产生葡萄糖诱导性失活/降解信号的状态的酵母，也要筛选其转运蛋白具有麦芽糖转运活性并发挥作用的菌株。接着，将该菌株接种到YPD(酵母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L)中，30℃振荡培养一夜。将培养液接种到YPM培养基(酵母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L)中，30℃振荡培养一夜。将培养液接种到YPM培养基(酵母浸膏 10g/L、多聚蛋白胨20g/L、麦芽糖5g/L)中，使OD660＝1.0，30℃振荡培养2.5小时，并进行集菌。测取60个OD660单位的细胞，使其悬浮于预先在30℃保温的降解速度测定用培养基[无氨基酸酵母氮源(不含氨)(Yeast Nitrogen Basew/o amino acids and ammonia)1.7g/L、葡萄糖20g/L、环己酰亚胺25μg/L]30ml中，30℃进行温育。在适当的时间(0、10、20、30及40分钟或者0、30、60、90及120分钟)抽取细胞悬浮液样品5ml，快速离心弃除上清液，将细胞用乙醇干冰冷冻。根据通常方法从冷冻细胞中检测转运蛋白，测定蛋白条带的强度，由其减少速度计算半衰期。在本发明中优选的转运蛋白，例如，与Mal31p或Mal61p比较，具有2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上或8倍以上的半衰期。

本发明还提供：(e)多核苷酸，其含有与由序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其含有与编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白的多核苷酸。

在本发明中优选的多核苷酸为：上述(a)～(f)中规定的多核苷酸、含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸、或者含有由序列号1的核苷酸序列组成的多核苷酸的多核苷酸。更优选为由序列号1特定的多核苷酸。

在此，“在严谨条件下进行杂交的多核苷酸”是指，例如，以由序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸、或者编码序列号2的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分作为探针，通过使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Southern杂交法等所得到的多核苷酸(例如DNA)。作为杂交的方法，例如可使用Molecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons 1987-1997等中所记载的方法。

本说明书中所述的“严谨条件”，可以为低严谨条件、中严谨条件及高严谨条件中的任一种。“低严谨条件”，例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件。此外，“中严谨条件”，例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件。“高严谨条件”，例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。在上述条件中，越提高温度，越能期待高效获得具有高同源性的DNA。但是，作为影响杂交的严谨性的因素，认为有温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，如果是本领域技术人员，通过适当选择这些因素可实现同样的严谨性。

此外，杂交中使用市售的试剂盒时，例如可使用Alkphos Direct LabellingReagents(Amersham Pharmacia公司制)。此时，根据试剂盒中附带的说明方案，与标记后的探针保温过夜后，在55℃的条件下用含有0.1％(w/v)SDS的1次洗涤缓冲液洗涤膜后，可检出杂交后的DNA。

除上述以外，作为可杂交的DNA，可例举，通过FASTA、BLAST等同源性搜索软件，使用默认参数计算时，与编码序列号2或4的氨基酸序列的DNA有约90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上99.8％以上、99.9％以上同一性的DNA。

此外，氨基酸序列、碱基序列的同一性，可使用根据Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873，1993)决定。已开发了基于BLAST算法的被称为BLASTN、BLASTX的程序(Altschul SF，et al：J.Mol.Biol.215：403，1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，参数例如为score＝100、wordlength＝12。此外，使用BLASTX分析氨基酸序列时，参数例如为score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。

2.本发明的蛋白质

本发明提供被上述(a)～(i)中任一个多核苷酸所编码的蛋白质。本发明的优选蛋白质为：由序列号2的氨基酸序列中1～15个(优选1～14个、1～1 3个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列组成，且对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白。

作为这种蛋白质，可例举，由序列号2的氨基酸序列中上述数量的氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列组成，且对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白。此外，作为这种蛋白质，可例举，具有与序列号2的氨基酸序列有上述同源性的氨基酸序列，且对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白。这种蛋白质，可使用《Molecular Cloning 3》、C《urrent Protocolsin Molecular Biology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等所述的定点突变引入法而获得。

本发明的多核苷酸涉及的蛋白质的氨基酸序列中1～15个(优选为1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或添加，是指在同一序列中的任意并且1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个的氨基酸序列中的位置上，缺失、取代、插入及/或添加1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个的氨基酸残基，缺失、取代、插入及添加中的2种以上可同时发生。

下面列举可互相取代的氨基酸残基，同一组中包含的氨基酸残基可互相取代。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己丙氨酸；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯丙氨酸、酪氨酸。

本发明的蛋白质，也可以通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法制造。此外，也可以利用Advanced Chem Tech公司、Perkin Elmer公司、Pharmacia公司、Protein Technology Installment公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、岛津制作所等制造的肽合成仪进行化学合成。

3.本发明的载体及导入该载体的转化酵母

本发明提供含有上述多核苷酸的载体。本发明的载体，优选含有：上述 (a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)、或由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸、或者编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。并且，本发明的载体通常以包含表达盒的形式构成，该表达盒包含的结构要素为：(x)在酵母细胞内可转录的启动子；(y)与该启动子以正向或反向连接的上述任一项所述的多核苷酸(DNA)；以及(z)与RNA分子的转录终止及多聚腺苷化作用相关，在酵母内发挥作用的信号。此外，要使上述本发明的蛋白质进行高表达时，优选将上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)以相对于该启动子的正向导入，以促进这些多核苷酸的表达。

作为向酵母中导入时使用的载体，可利用多拷贝型(YEp型)、单拷贝型(YCp型)、染色体整合型(YIp型)中的任一种。例如，作为YEp型载体，已知有YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，Academic Press，New York，83，1983)，作为YCp型载体，已知有YCp50(M.D.Rose et al.，gene，60，237，1987)，作为YIp型载体，已知有YIp5(K.Struhlet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USP，76，1035，1979)，且容易获得。此外，也可使用染色体整合型的pUP3GLP(Omura，F.et al.，FEMS Microbiol.Lett.，194，207，2001)(图13)、pJHIXSB(图11)、pYCGPY(Kodama，Y.et al.，Appl.Environ.Microbiol.，67，3455，2001)(图12)、pJHXSB(图10)等单拷贝复制型的质粒。

作为用于调控酵母中的基因表达的启动子/终止子，只要在酿造用酵母中发挥作用的同时不受醪液中的糖、氨基酸等成分的浓度影响，可以任意组合。例如可利用甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的启动子等。这些基因均已被克隆，如在M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中有详细记载，通过已知的方法可容易地获得。在表达载体中使用的启动子，根据发酵醪液的糖组成、糖浓度、多种转运蛋白的组合等，可有效地改变成具有适当转录活性的启动子。

作为转化时使用的选择性标记，因酿造用酵母不能利用营养缺陷型标记，因此，可利用遗传霉素(Geneticin)抗性基因(G418r)、铜抗性基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)、浅蓝菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(猪腰淳嗣等，生物化学，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991)(日语原名：それぞれ猪腰淳嗣ら，生化学，64，660，1992；Hussain etet al.，gene，101，149，1991)等。将上述构建的载体导入宿主酵母内。

作为本发明中利用的宿主酵母，可例举，可用于酿造的任何酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体可例举，酵母属(Saccharomyces)等的酵母，在本发明中，可使用啤酒酵母如巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)W34/70等、卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)NCYC453、NCYC456等、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。并且还可使用威士忌酵母，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NCYC90等；葡萄酒酵母，如协会葡萄酒用1号、葡萄酒用3号、葡萄酒用4号等；清酒酵母，如协会酵母清酒用7号、清酒用9号等，但并不限于这些酵母。在本发明中，优选使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。

制备本说明书中所述的各转运蛋白基因时使用的染色体DNA，并不限定于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ATCC20598、ATCC96955等的菌株，只要是属于具有各基因的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母，可以从任何酵母中制备。

作为酵母的转化方法，可利用通常使用的公知方法。例如，可实施电穿孔法“Meth.Enzym.，194，p182(1990)”、原生质球法(Spheroplast)“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)”、乙酸锂法“J.Bacteriology，153，p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)、Methods in yeastgenetics，2000 Edition：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等记载的方法，但并不限于这些方法。

此外，转化菌株，通过将宿主的营养缺陷型互补基因例如URA3整合到表达质粒中，可以用不含尿嘧啶的琼脂培养基来筛选。或者通过将抗药性基因例如对于环己酰亚胺的抗药性基因YAP1、或者遗传霉素抗生素(Geneticin)抗性基因G418R整合到表达质粒中，可以用含有环己酰亚胺(例如0.3μg/ml)、或者遗传霉素抗生素(Geneticin)(例如300μg/ml)的琼脂培养基来筛选。

更具体地说，将宿主酵母在标准酵母营养培养基(如YEPD培养基“GeneticEngineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等)中培养至OD600nm值为1～6。将该培养酵母离心分离并收集、洗涤，用浓度约为1M～2M的碱性金属离子、优选用锂离子进行预处理。将上述细胞在约30℃下静置约60分钟，然后，与导入的DNA(约1～20μg)同时在约30℃下，静置约60分钟。添加聚乙二醇，优选添加约4,000道尔顿的聚乙二醇，使最终浓度为约20％～50％。在约30℃下静置约30分钟后，将上述细胞在约42℃下加热处理约5分钟。优选用标准酵母营养培养基将上述细胞悬浮液洗涤，加入到规定量的新鲜标准酵母营养培养基中，约30℃下静置约60分钟。然后，将其移植到含有作为选择性标记使用的抗生素等的标准琼脂培养基上，获得转化体。

此外，对于通常的克隆技术，可参照《Molecular Cloning 3》、“Methods inYeast Genitics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、ColdSpring Harbor，NY)”等。

4.本发明的酒类制造方法以及通过该方法获得的酒类

将上述本发明的载体导入适合酿造作为制造对象的酒类的酵母中，通过使用该酵母，可制造具有氨基酸组成特征的酒类。作为对象的酒类，可以为啤酒、葡萄酒、威士忌、清酒等，但并不限于这些。

在制造上述酒类时，除使用本发明获得的酿造酵母代替亲株之外，可利用公知的方法。因此，原料、制造设备、制造管理等可与以往的方法完全相同，不会因制造发酵时间缩短的酒类而增加成本。也就是说，根据本发明能够使用已有的设备不增加成本地进行制造。

5.本发明的酵母的评价方法

构建含有获取的多核苷酸的表达载体，根据常规方法将其导入酵母中，将导入了该基因的酵母在低聚糖培养基(例如麦芽糖、麦芽三糖培养基)上进行培养。通过测定培养时该酵母中包含的转运蛋白对葡萄糖诱导性失活/降解的抗性、该酵母的低聚糖分解能力、增殖速度、在麦汁中的发酵速度等，可评价该酵母的适应性。对葡萄糖诱导性失活/降解的抗性、低聚糖分解能力、增殖速度、在麦汁中的发酵速度等，可通过下述实施例中使用的方法进行评价。

实施例

以下通过实施例对本发明更加详细地说明，但应该注意到本发明并不限于这些实施例。

[试验方法]

在本实施例中使用的试验项目和试验方法如下所示。只要无特别限制，本实施例中的试验方法以此为标准。

<MAL61，MAL31及MAL21基因的获取>

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的MAL61及MAL31基因己被克隆，其碱基序列已被报道。本说明书中使用的MAL31(序列号3)从酵母基因组数据库(Saccharomyces Genome Database)注册号：YBR298C中获得，MAL61(序列号5)从基因库(GenBank)注册号：X17391中获得。MAL61及MAL31基因，是通过以其碱基序列信息为基础，使用从具有各基因的酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中制备的染色体DNA作为PCR模板，通过PCR扩增、分离MAL61、及MAL31基因而获取。

对于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的MAL21，已知其被III号染色体编码，可并不知道DNA序列。但是因为考虑到被II号染色体编码的MAL31、被VIII号染色体编码的MAL61基因具有99％以上的同一性，所以预测MAL21也具有相当高的同一性。

事实上我们利用从GENBANK注册号X17391中获得的MAL61的DNA序列设计了引物5’AGAGCTCAGCATATAAAGAGACA3’(序列号7)和5’TGGATCCGTATCTACCTACTGG 3’(序列号8)。然后，以具有MAL21基因、但不具有其他α-葡萄糖苷转运蛋白基因的酵母的染色体DNA为模板，通过PCR可获取MAL21。具体来说，MAL31是由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288C(ATCC204508(Rose，M.D.，Winston，F.and Hieter，P.(1990)：Methods inYeast Genetics：A Laboratory Course Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY))、MAL21是由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ATCC20598、而且MAL61是由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ATCC96955，使用相同的引物通过PCR获取。使用Invitrogen公司的TOPO TA cloning kit，将获取的DNA片段插入载体pCR(注册商标)2.1-TOPO后，通过DNA测序确认插入的基因序列。

对于MAL31及MAL61，确认与数据库中注册的序列(分别为基因组数据库注册号：YBR298C及GenBank注册号：X17391)相同。对于MAL21，独立地对10个克隆以上测序，确定了其序列(序列号1)。

此外，使用的引物中起始密码子的上游有XbaI或者SacI位点，终止密码子的下游有BamHI位点，并已整合到表达载体内。通过使用染色体DNA的PCR的目标基因的扩增以及其后的分离，包括PCR引物的制备，均可利用本领域技术人员公知的方法进行。MAL21的碱基序列如图2所示，氨基酸序列如图3所示。

<表达质粒、文库构建质粒>

在本发明中，使用(1)～(4)的4个表达载体。

(1)pJHXSB(图10)

(2)pJHIXSB(图11)

(3)pYCGPY(图12)

(4)pUP3GLP(图13)

<酵母株>

在本发明中，在获取转运蛋白基因和进行菌株之间比较时，使用菌株(1)～(5)，在利用转运蛋白高表达的菌株确认生长繁殖速度、发酵速度时，使用菌株(6)～(8)。

(1)酿酒酵母S288C(ATCC204508)(MATalpha SUC2 mal mel gal2 CUP1)

(2)酿酒酵母ATCC96955(MATa MAL61 MAL62 MAL63 mal64 mal 11MAL12 mal13 ura3-52 leu2-3 leu2-112 trp1 his)

(3)酿酒酵母ATCC20598(MATa suc MAL2 MEL1 his4 leu2)

(4)酿酒酵母CB11(Berkley Stock Center)(MATa ade1 MAL61 MAL62MAL63 AGT1 MAL12 MAL31 MAL32)

(5)酿酒酵母HH1001(MATa SUC2 mal mel gal2 CUP1 TPI1::TPI1pr-MAL32-G418R ura3)

(6)酿酒酵母Δ152MS(MATa mal61::TRP1 MAL62 MAL63 mal64 mal11MAL12 mal13 leu2-3 leu2-112 his URA3::TDH3p::MAL62)

(7)上面啤酒酵母AH135

(8)下面啤酒酵母Weihenstephan 194

<转运蛋白的麦芽糖或麦芽三糖转运活性的评价>

天然型转运蛋白的转化株(以不具有α-葡萄糖苷转运蛋白基因的菌株作为宿主)中导入的转运蛋白基因的表达，可通过在以0.5％的麦芽糖或者麦芽三糖为唯一碳源，含有抗霉素3mg/L的最小必需培养基(无氨基酸酵母氮源(Yeast Nitrogen Base w/o amino acids)6.7g/L、麦芽糖或者麦芽三糖5g/L、抗霉素3mg/L)上有无生长繁殖来检验。即使是α-葡萄糖苷转运蛋白不发挥作用的菌株，在以麦芽糖或者麦芽三糖为唯一碳源的最小必需培养基上，也会有略微增殖。但是，如果加入呼吸阻断剂的抗霉素，在以麦芽糖或者麦芽三糖为唯一碳源的最小必需培养基上，该菌株无法生长繁殖，所以可明确地判断α-葡萄糖苷转运蛋白的功能。例如，使用铂金勺从YPD平板(酵母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L)上挑取一供试菌株，在1ml的灭菌水中一次洗涤后，再悬浮于灭菌水中使OD660＝0.2。将其进行集菌，再次悬浮于1ml的灭菌水中，然后将细胞悬浮液在以麦芽糖或麦芽三糖为唯一碳源的试验培养基上直接划线确认生长繁殖状况，通过这样确认具有麦芽糖或麦芽三糖的转运活性。

<转运蛋白的2-脱氧葡萄糖抗性的评价>

已知2-脱氧葡萄糖(2-DOG)只能代谢为2-DOG-6-磷酸，所以是不能作为碳源的糖类似物，但与葡萄糖产生同样水平的葡萄糖阻遏或者同样水平的葡萄糖诱导失活。因此，在这种平板上生长繁殖的菌株，具有不易因葡萄糖导致失活的α-葡萄糖苷转运蛋白的可能性高。为了检验对于2-DOG的抗性，制作了：麦芽糖最小必需培养基(无氨基酸酵母氮源(Yeast Nitrogen Base w/o aminoacids)6.7g/L、麦芽糖20g/L、0-2.0mM 2-脱氧葡萄糖)，或在含有麦芽糖的完全合成培养基(SCM)(无氨基酸酵母氮源(Yeast Nitrogen Base w/o amino acids)6.7g/L、麦芽糖20g/L、硫酸腺嘌呤20mg/ml、尿嘧啶20mg/ml、L-色氨酸20mg/ml、L-组氨酸盐酸盐20mg/ml、L-精氨酸盐酸盐20mg/ml、L-蛋氨酸20mg/ml、L-酪氨酸30mg/ml、L-亮氨酸30mg/ml、L-异亮氨酸30mg/ml、L-赖氨酸盐酸盐30mg/ml、L-苯丙氨酸50mg/ml、L-谷氨酸100mg/ml、L-天冬氨酸100mg/ml、L-缬氨酸150mg/ml、L-苏氨酸200mg/ml、L-丝氨酸400mg/ml)上加入0mM～2.0mM的2-脱氧葡萄糖(2-DOG)的平板。通过将各转运蛋白表达株的OD660＝0.2的细胞悬浮液的稀释系列在试验培养基上分别点样3μl，30℃培养2～3天来检验。

<转运蛋白的菌体内蓄积量的测定>

转运蛋白的菌体内的蓄积量，例如可通过Western印迹法进行测定。例如从10ml的培养液中回收对数增殖期的供试菌株，在溶解缓冲液中(8M尿素、5％(w/v)SDS、40mM Tris-HCl(pH6.8)、0.1mM EDTA、1％β-巯基乙醇)通过用玻璃珠搅拌破碎，获得细胞提取液。将总蛋白质为60μg的试样用SDS-凝胶电泳展开，转印到硝基纤维素膜上后使用兔多克隆抗Mal61p抗体，进行Western印迹分析。兔多克隆抗Mal61p抗体根据以下方法获取。将编码Mal61p的N末端区域(Met1-Leu181)的DNA与pET表达载体(Expression vector)(Novagen公司)的GST tag的下游连接，转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，将其转化体的细胞破碎液加入GST结合树脂柱中，通过洗脱制备与柱子结合的蛋白质。详细内容根据Novagen公司的pET Expression System，GST·Bind^TM Affinity Resins(Novagen社)内附加的操作指南。制备的融合蛋白质，通过SDS-PAGE确认纯度后，将其作为抗原免疫兔子，获得多克隆抗体。对于抗体的有效性，通过下述方法确认，即：将表达了α-葡萄糖苷转运蛋白基因的酵母株和不具有该基因的其宿主株在YPM培养基(酵母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/L、麦芽糖5.0g/L)上培养，使用其细胞破碎液、本抗体利用上述方法进行Western印迹分析。利用本抗体仅在表达了α-葡萄糖苷转运蛋白基因的酵母株破碎液中，检测出与68kDa的α-葡萄糖苷转运蛋白分子量一致的阳性条带。

<转运蛋白的降解速度的测定>

将表达各转运蛋白的菌株接种于YPD中，30℃振荡培养一夜。将培养液接种于YPM培养基中，使OD660＝1.0，30℃振荡培养2.5小时，并进行集菌。测取60个OD660单位的细胞，使其悬浮于预先在30℃保温的降解速度测定用培养基[无氨基酸酵母氮源(不含氨)(Yeast Nitrogen Base w/o amino acids andammonia)1.6g/L、葡萄糖20g/L、环己酰亚胺25μg/L]30ml中，30℃进行温育。在适当的时间(0、10、20、30及40分钟或者0、30、60、90及120分钟)抽取细胞悬浮液样品5ml，快速离心弃除上清液，将细胞用乙醇干冰冷冻。根据上述方法从冷冻细胞中检测转运蛋白，测定蛋白条带的强度，由其减少速度计算半衰期。

<麦芽糖分解能力的评价>

使转运蛋白进行组成型表达的酵母对麦芽糖的分解，通过在适合该酵母的条件下，使酵母进行有氧培养或发酵，测定培养基中的麦芽糖量，由此进行评价。糖的测定，可利用本领域技术人员公知的方法，例如通过使用IR检测器的液相色谱法进行测定。下述含有本发明的核苷酸序列的转化酵母中，麦芽糖的吸收能力得到改善。

实施例1：具有葡萄糖诱导性失活/降解抗性的α-葡萄糖苷转运蛋白的筛选

制作在含有2％麦芽糖的完全合成培养基(SCM)中加入2-脱氧葡萄糖(2-DOG)0mM～2mM的平板。已知2-脱氧葡萄糖(2-DOG)只能代谢为2-DOG-6-磷酸，所以是不能作为碳源的糖类似物，但与葡萄糖产生同样水平的葡萄糖阻遏或者同样水平的葡萄糖诱导失活。因此，在该平板上生长繁殖的菌株，具有不易因葡萄糖导致失活的α-葡萄糖苷转运蛋白的可能性高。对于各种酵母株，用细胞悬浮液点样，在30℃进行温育。其结果，具有MAL21的酵母株ATCC20598与其他菌株不同，在含有1mM的2-DOG的平板上也生长繁殖，因此可预测MAL21是不易因葡萄糖导致降解的转运蛋白(图1)。于是，根据MAL61的5’上游和3’下游的碱基序列信息设计引物(序列号7及8)，以ATCC20598的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增MAL21基因，克隆入Invitrogen公司的pCR2.1-TOPO内，进行DNA测序。碱基序列(序列号1)如图2所示，氨基酸序列(序列号2)如图3所示。Mal21p/Mal31p/Mal61p/的氨基酸序列的比对如图4-1、Mal21p/Mal31p/Mal61p/的核苷酸序列的比对如图4-2～4-4所示。

将该MAL21基因整合到质粒pJHIXSB(图11)的SacI-BamHI位点。将该质粒pJHIMAL21经URA3基因上的EcoRV切割后，通过TPI1启动子作为组成型转录的表达单元，整合到酵母HH1001内，作为HH206株。因为HH1001是mal-株的X2180-1A的ura3-的姐妹株，整合了TPI1p::MAL32(编码麦芽糖酶基因)，所以麦芽糖酶进行组成型表达。通过对HH206株在含有0mM～2mM 2-DOG的SCM平板上的生长繁殖状况进行检验，结果，具有MAL61及MAL31基因的HH108及HH227株，在1.0mM的2-DOG平板上均不能生长繁殖，而HH206株在2.0mM的2-DOG平板上生长繁殖(图5)。

并且，使用抗Mal61p抗体，通过Western印迹法检验Mal21p的葡萄糖诱导降解速度，结果半衰期约为2小时。与此相对，Mal31p和Mal61p的半衰期约为20分钟，与其他转运蛋白相比，确认Mal21p具有相当长的半衰期(图6)。

实施例2：MAL61高表达株和MAL21株高表达株在麦芽糖培养基上的生长繁殖

将MAL61和MAL21整合到质粒pYCGPY的TDH3启动子的下游SacI-BamHI位点，将各质粒作为pYCGPYMAL61及pYCGPYMAL21。质粒pYCGPY是具有CEN-ARS的YCp型质粒，具有G418抗性基因、Ap抗性基因等(图12)。将pYCGPYMAL61及pYCGPYMAL21转化入Δ152MS株。Δ152MS株是通过TRP1标记物破坏ATCC96955具有的MAL61，导入TDH3启动子控制下的MAL62(麦芽糖酶基因)的菌株。将Δ152MS(pYCGPYMAL61)和Δ152MS(pYCGPYMAL21)接种到YPM(酵母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/L、麦芽糖5.0g/L)中，在30℃振荡培养，使OD660＝约0.5。每1.5小时测定OD660(图7)。Δ152MS(pYCGPYMAL21)与Δ152MS(pYCGPYMAL61)相比，在麦芽糖中生长繁殖快，在实验室株中，证实了对于葡萄糖诱导性降解具有抗性的转运蛋白的效果。

实施例3：使MAL21高表达的下面啤酒酵母的发泡酒麦汁发酵试验

将对于葡萄糖诱导性降解具有抗性的转运蛋白MAL21整合到质粒pUP3GLP的XbaI(或者SacI)-BamHI位点。pUP3GLP用图13表示。pUP3GLP是YIp型质粒，转运蛋白基因通过甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(TDH3p)表达。将各质粒经URA3中的EcoRV位点切割后，转化入下面啤酒酵母(Weihenstephan194)，涂布于含有0.3μg/ml的环己酰亚胺的YPG平板(酵母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/L、半乳糖20g/L)上。通过PCR来确认目标表达盒已插入Weihenstephan 194的染色体上的URA3基因内。

将Weihenstephan 194(URA3::TDH3p::MAL21)和亲株Weihenstephan 194接种到2种发泡酒麦汁中。发泡酒麦汁是除水之外的原料中的麦芽使用比率低于25％且使用了糖化淀粉、啤酒花等的麦汁。发泡酒用麦汁的一种是初期浸出物浓度为14.0％，含有组成比为葡萄糖1.2％、麦芽糖6.6％、麦芽三糖2.2％的糖。另一种富含葡萄糖的发泡酒麦汁是初期浸出物浓度为15.6％，含有组成比为葡萄糖4.7％、麦芽糖5.4％、麦芽三糖1.7％的糖。分别通过在相同量的麦汁(终浓度、麦芽比率低于25％)中，加入糖组成不同的糖化淀粉来制备。在各发泡酒麦汁中加入湿菌体，使其为7.5g/L，在15℃进行发酵，测定发酵中酒醪的麦芽糖浓度。其结果如图8所示。

在任一种发泡酒麦汁中，MAL21高表达株对麦芽糖的分解速度均比亲株 Weihenstephan 194显著加快。特别是富含葡萄糖的发泡酒麦汁，其效果显著。初期浸出物浓度高是指葡萄糖浓度高，充分体现了对于葡萄糖诱导性降解具有抗性的转运蛋白的效果。

实施例4：使MAL21高表达的上面啤酒酵母的麦汁发酵试验

将对于葡萄糖诱导性降解具有抗性的转运蛋白MAL21整合到质粒pUP3GLP的XbaI(或者SacI)-BamHI位点。pUP3GLP用图13表示。pUP3GLP是YIp型质粒，转运蛋白基因通过甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(TDH3p)表达。将各质粒经URA3中的EcoRV位点切割后，转化入上面啤酒酵母AH135中，涂布于含有0.3μg/ml的环己酰亚胺的YPG平板(酵母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/L、半乳糖20g/L)上。通过PCR来确认目标表达盒已插入到AH135的染色体上的URA3基因内。将AH135(URA3::TDH3p::MAL21)加入初期浸出物浓度为13％或者20％的100％麦芽麦汁中，使湿菌体为5g/L，15℃进行发酵，测定发酵中的酒醪的麦芽糖浓度，其结果如图9所示。

不论使用哪一种菌株，麦芽糖的分解速度均比亲株AH135加快。特别是初期浸出物浓度为20％时，其效果显著。初期浸出物浓度高是指葡萄糖浓度高，可以说体现了对于葡萄糖诱导性降解具有抗性的转运蛋白的效果。并且确认对于葡萄糖诱导性降解具有抗性的转运蛋白的高表达，不仅对下面啤酒酵母有效，而且对上面啤酒酵母也有效。

综上所述，发现在几种酵母中原来存在的Mal21p与其它α-葡萄糖苷转运蛋白不同，不易因葡萄糖导致降解。并且确认，使用表达该转运蛋白的酵母(实验室株、酿造用酵母均可)时，可加快酒醪中的麦芽糖等该转运蛋白可转运的糖的分解。特别是葡萄糖等单糖浓度高时更加有效。

工业实用性

包含本发明涉及的具有葡萄糖诱导性失活/降解抗性的转运蛋白的酵母，低聚糖分解能力提高，分解麦芽糖等低聚糖的能力优异。这种酵母可有效利用于啤酒、葡萄酒的酿造中。

序列表

(SEQUENCE LISTING)

<110>三得利株式会社(SUNTORY，LTD)

<120>葡萄糖诱导性失活/降解抗性转运蛋白基因及其用途(Transporter gene resistant to glucose-inducive inactivationand/or degradation and use thereof)

<130>PCF090234C

<160>8

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1842

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1842)

<223>Ma121转运蛋白(Transporter Protein)

<400>1

atg aag gga tta tcc tca tta ata aac aga aaa aaa gac agg aac gac 48

Met Lys Gly Leu Ser Ser Leu Ile Asn Arg Lys Lys Asp Arg Asn Asp

1 5 10 15

tca cac tta gat gag atc gag aat ggc gtg aac gct acc gaa ttc aac 96

Ser His Leu Asp Glu Ile Glu Asn Gly Val Asn Ala Thr Glu Phe Asn

20 25 30

tcg ata gag atg gag gag caa ggt aag aaa agt gat ttt ggt ctt tcc 144

Ser Ile Glu Met Glu Glu Gln Gly Lys Lys Ser Asp Phe Gly Leu Ser

35 40 45

cat cat gag tac ggt cca ggt tca cta ata cca aac gat aat aat gaa 192

His His Glu Tyr Gly Pro Gly Ser Leu Ile Pro Asn Asp Asn Asn Glu

50 55 60

gaa gtc ccc gac ctt ctc gat gaa gct atg cag gac gcc aaa gag gca 240

Glu Val Pro Asp Leu Leu Asp Glu Ala Met Gln Asp Ala Lys Glu Ala

65 70 75 80

gat gaa agt gag agg gga atg cca ctc atg aca gct ttg aag aca tat 288

Asp Glu Ser Glu Arg Gly Met Pro Leu Met Thr Ala Leu Lys Thr Tyr

85 90 95

cca aaa gct gct gct tgg tca cta tta gtt tcc aca aca ttg att caa 336

Pro Lys Ala Ala Ala Trp Ser Leu Leu Val Ser Thr Thr Leu Ile Gln

100 105 110

gag ggt tat gac aca gcc att cta gga gct ttc tat gcc ctg cct gtt 384

Glu Gly Tyr Asp Thr Ala Ile Leu Gly Ala Phe Tyr Ala Leu Pro Val

115 120 125

ttt caa aaa aaa tat ggt tct ttg aat agc aat aca gga gat tat gaa 432

Phe Gln Lys Lys Tyr Gly Ser Leu Asn Ser Asn Thr Gly Asp Tyr Glu

130 135 140

att tca gtt tct tgg caa atc ggt cta tgt cta tgc tac atg gca ggt 480

Ile Ser Val Ser Trp Gln Ile Gly Leu Cys Leu Cys Tyr Met Ala Gly

145 150 155 160

gaa att gtg ggg cta cag cta acg ggg ccc tcc gtg gat ctt gtt gga 528

Glu Ile Val Gly Leu Gln Leu Thr Gly Pro Ser Val Asp Leu Val Gly

165 170 175

aat cgt tac aca ttg atc atg gcg ttg ttc ttt tta gcg gct ttc att 576

Asn Arg Tyr Thr Leu Ile Met Ala Leu Phe Phe Leu Ala Ala Phe Ile

180 185 190

ttc att ctg tat ttt tgc aag agt ttg ggt atg att gcc gtg gga cag 624

Phe Ile Leu Tyr Phe Cys Lys Ser Leu Gly Met Ile Ala Val Gly Gln

195 200 205

gca ttg tgt ggt atg cca tgg ggt tgt ttc caa tgt ttg acc gtt tct 672

Ala Leu Cys Gly Met Pro Trp Gly Cys Phe Gln Cys Leu Thr Val Ser

210 215 220

tat gct tct gaa att tgt cct ttg gcc cta aga tac tat ttg acg act 720

Tyr Ala Ser Glu Ile Cys Pro Leu Ala Leu Arg Tyr Tyr Leu Thr Thr

225 230 235 240

tat tct aat tta tgt tgg acg ttc ggt caa ctt ttc gct gct ggt att 768

Tyr Ser Asn Leu Cys Trp Thr Phe Gly Gln Leu Phe Ala Ala Gly lle

245 250 255

atg aaa aat tcc cag aac aaa tat gcc aac tca gaa cta gga tat aag 816

Met Lys Asn Ser Gln Asn Lys Tyr Ala Asn Ser Glu Leu Gly Tyr Lys

260 265 270

cta cct ttt gct ttg cag tgg atc tgg ccc ctt cct ttg gcg gta ggt 864

Leu Pro Phe Ala Leu Gln Trp Ile Trp Pro Leu Pro Leu Ala Val Gly

275 280 285

att ttt ttt gca cca gag tct cca tgg tgg ctg gtt aaa aaa gga agg 912

Ile Phe Phe Ala Pro Glu Ser Pro Trp Trp Leu Val Lys Lys Gly Arg

290 295 300

att gat caa gcg agg aga tca ctt gaa aga aca tta agt ggt aaa gga 960

Ile Asp Gln Ala Arg Arg Ser Leu Glu Arg Thr Leu Ser Gly Lys Gly

305 310 315 320

ccc gag aaa gaa tta cta gtg act atg gaa ctc gat aaa atc aaa act 1008

Pro Glu Lys Glu Leu Leu Val Thr Met Glu Leu Asp Lys Ile Lys Thr

325 330 335

act ata gaa aag gag cag aaa atg tct gat gaa gga act tac tgg gat 1056

Thr Ile Glu Lys Glu Gln Lys Met Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Trp Asp

340 345 350

tgt gtg aaa gat ggt att aac agg aga aga acg aga ata gct tgt tta 1104

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450 455 460

gtc gcg ttc ttt tac aac ctc ggt att gca cct gtt gtt ttt tgc tta 1440

Val Ala Phe Phe Tyr Asn Leu Gly Ile Ala Pro Val Val Phe Cys Leu

465 470 475 480

gtg tct gaa atg ccg tct tca agg cta aga acc aaa aca att att ttg 1488

Val Ser Glu Met Pro Ser Ser Arg Leu Arg Thr Lys Thr Ile Ile Leu

485 490 495

gct cgt aat gct tac aat gtg atc caa gtt gta gtt aca gtt ttg atc 1536

Ala Arg Asn Ala Tyr Asn Val Ile Gln Val Val Val Thr Val Leu Ile

500 505 510

atg tac caa ttg aac tca gag aaa tgg aat tgg ggt gct aaa tca ggc 1584

Met Tyr Gln Leu Asn Ser Glu Lys Trp Asn Trp Gly Ala Lys Ser Gly

515 520 525

ttt ttc tgg gga gga ttt tgt ctg gcc act tta gct tgg gct gtt gtc 1632

Phe Phe Trp Gly Gly Phe Cys Leu Ala Thr Leu Ala Trp Ala Val Val

530 535 540

gat tta cca gaa acc gct ggc agg act ttt att gag ata aat gaa ttg 1680

Asp Leu Pro Glu Thr Ala Gly Arg Thr Phe Ile Glu Ile Asn Glu Leu

545 550 555 560

ttt aga ctt ggt gtt cca gca aga aag ttc aag tcg act aaa gtc gac 1728

Phe Arg Leu Gly Val Pro Ala Arg Lys Phe Lys Ser Thr Lys Val Asp

565 570 575

cct ttt gca gct gcc aaa gca gca gct gca gaa att aat gtt aaa gat 1776

Pro Phe Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala Glu Ile Asn Val Lys Asp

580 585 590

ccg aag gaa gat ttg gaa act tct gtg gta gat gaa ggg cga agc acc 1824

Pro Lys Glu Asp Leu Glu Thr Ser Val Val Asp Glu Gly Arg Ser Thr

595 600 605

cca tct gtt gtg aac aaa 1842

Pro Ser Val Val Asn Lys

610

<210>6

<211>614

<212>PRT

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>6

Met Lys Gly Leu Ser Ser Leu Ile Asn Arg Lys Lys Asp Arg Asn Asp

1 5 10 15

Ser His Leu Asp Glu Ile Glu Asn Gly Val Asn Ala Thr Glu Phe Asn

20 25 30

Ser Ile Glu Met Glu Glu Gln Gly Lys Lys Ser Asp Phe Asp Leu Ser

35 40 45

His Leu Glu Tyr Gly Pro Gly Ser Leu Ile Pro Asn Asp Asn Asn Glu

50 55 60

Glu Val Pro Asp Leu Leu Asp Glu Ala Met Gln Asp Ala Lys Glu Ala

65 70 75 80

Asp Glu Ser Glu Arg Gly Met Pro Leu Met Thr Ala Leu Lys Thr Tyr

85 90 95

Pro Lys Ala Ala Ala Trp Ser Leu Leu Val Ser Thr Thr Leu Ile Gln

100 105 110

Glu Gly Tyr Asp Thr Ala Ile Leu Gly Ala Phe Tyr Ala Leu Pro Val

115 120 125

Phe Gln Lys Lys Tyr Gly Ser Leu Asn Ser Asn Thr Gly Asp Tyr Glu

130 135 140

Ile Ser Val Ser Trp Gln Ile Gly Leu Cys Leu Cys Tyr Met Ala Gly

145 150 155 160

Glu Ile Val Gly Leu Gln Val Thr Gly Pro Ser Val Asp Tyr Met Gly

165 170 175

Asn Arg Tyr Thr Leu Ile Met Ala Leu Phe Phe Leu Ala Ala Phe Ile

180 185 190

Phe Ile Leu Tyr Phe Cys Lys Ser Leu Gly Met Ile Ala Val Gly Gln

195 200 205

Ala Leu Cys Gly Met Pro Trp Gly Cys Phe Gln Cys Leu Thr Val Ser

210 215 220

Tyr Ala Ser Glu Ile Cys Pro Leu Ala Leu Arg Tyr Tyr Leu Thr Thr

225 230 235 240

Tyr Ser Asn Leu Cys Trp Thr Phe Gly Gln Leu Phe Ala Ala Gly Ile

245 250 255

Met Lys Asn Ser Gln Asn Lys Tyr Ala Asn Ser Glu Leu Gly Tyr Lys

260 265 270

Leu Pro Phe Ala Leu Gln Trp Ile Trp Pro Leu Pro Leu Ala Val Gly

275 280 285

Ile Phe Leu Ala Pro Glu Ser Pro Trp Trp Leu Val Lys Lys Gly Arg

290 295 300

Ile Asp Gln Ala Arg Arg Ser Leu Glu Arg Ile Leu Ser Gly Lys Gly

305 310 315 320

Pro Glu Lys Glu Leu Leu Val Ser Met Glu Leu Asp Lys Ile Lys Thr

325 330 335

Thr Ile Glu Lys Glu Gln Lys Met Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Trp Asp

340 345 350

Cys Val Lys Asp Gly Ile Asn Arg Arg Arg Thr Arg Ile Ala Cys Leu

355 360 365

Cys Trp Ile Gly Gln Cys Ser Cys Gly Ala Ser Leu Ile Gly Tyr Ser

370 375 380

Thr Tyr Phe Tyr Glu Lys Ala Gly Val Ser Thr Asp Thr Ala Phe Thr

385 390 395 400

Phe Ser Ile Ile Gln Tyr Cys Leu Gly Ile Ala Ala Thr Phe Val Ser

405 410 415

Trp Trp Ala Ser Lys Tyr Cys Gly Arg Phe Asp Leu Tyr Ala Phe Gly

420 425 430

Leu Ala Phe Gln Ala Ile Met Phe Phe Ile Ile Gly Gly Leu Gly Cys

435 440 445

Ser Asp Thr His Gly Ala Lys Met Gly Ser Gly Ala Leu Leu Met Val

450 455 460

Val Ala Phe Phe Tyr Asn Leu Gly Ile Ala Pro Val Val Phe Cys Leu

465 470 475 480

Val Ser Glu Met Pro Ser Ser Arg Leu Arg Thr Lys Thr Ile Ile Leu

485 490 495

Ala Arg Asn Ala Tyr Asn Val Ile Gln Val Val Val Thr Val Leu Ile

500 505 510

Met Tyr Gln Leu Asn Ser Glu Lys Trp Asn Trp Gly Ala Lys Ser Gly

515 520 525

Phe Phe Trp Gly Gly Phe Cys Leu Ala Thr Leu Ala Trp Ala Val Val

530 535 540

Asp Leu Pro Glu Thr Ala Gly Arg Thr Phe Ile Glu Ile Asn Glu Leu

545 550 555 560

Phe Arg Leu Gly Val Pro Ala Arg Lys Phe Lys Ser Thr Lys Val Asp

565 570 575

Pro Phe Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala Glu Ile Asn Val Lys Asp

580 585 590

Pro Lys Glu Asp Leu Glu Thr Ser Val Val Asp Glu Gly Arg Ser Thr

595 600 605

Pro Ser Val Val Asn Lys

610

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>7

agagctcagc atataaagag aca 23

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>8

tggatccgta tctacctact gg 22

Claims

1.多核苷酸，其是编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，其是由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸。

3.如权利要求1或2所述的多核苷酸，其特征在于，其是DNA。

4.蛋白质，其特征在于，其是被权利要求1～3中任一项所述的多核苷酸编码的蛋白质。

5.载体，其特征在于，含有权利要求1～3中任一项所述的多核苷酸。

6.转化酵母，其特征在于，其中导入了权利要求5所述的载体。

7.如权利要求6所述的酵母，其特征在于，通过导入权利要求5所述的载体，低聚糖分解能力提高。

8.如权利要求7所述的酵母，其特征在于，通过增加权利要求4所述的蛋白质的表达量，低聚糖分解能力提高。

9.酒类的制造方法，其特征在于，使用权利要求6～8中任一项所述的酵母。

10.如权利要求9所述的酒类的制造方法，其特征在于，酿造的酒类是麦芽饮料。

11.如权利要求9所述的酒类的制造方法，其特征在于，酿造的酒类是葡萄酒。