PT88394B - Processo para a preparacao de novas estripes de levedura para uma taxa melhorada de fermentacao de acucares e processo de fermentacao usando essas estripes - Google Patents

Description

Memória Peseritiva

A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de novas leveduras com capa cidade para melhorar a fermentação de açúcares e a proce£ sos de fermentação que utilizam estas leveduras.

á bem sabido que estirpes de le veduras pertencendo por exemplo ao género Saccharomyces possuem a capacidade de fermentar açúcares dando quantida des aproximadamente equimolares de CO^ e de etanol sob condições anaeróbicas. A actividade de levedar a massa cie pão da levedura é um resultado desta fermentação. 0 produto comercial levedura, de panificação existe em várias formulações que incluem a levedura comprimida ou leve-

vX : '·*’ / -·

.£%·^: .hí-:

ii

dura fresca e a levedura seca. A levedura seca encontra e disponive-l sob a forma de levedura seca activa e de levedura seca instântanea com conteúdos de humidade de cer ca de 6 a S % e de 3 a 6 %, respectivamente.

Uma das primeiras fases no metabolismo dos açúcares pela acção de leveduras consiste no transporte de moléculas de açúcar através da membrana pias mática. Substâncias de transporte específicas para diferentes açúcares são expressas em leveduras. A transforme ção de maltose, por exemplo, encontra-se dependente da pre sença de uma permease de maltose específica. Esta substância de transporte pode existir sob duas fornias que se distinguem por diferenças na velocidade máxima (Vmax) e pela constante de afinidade (Km) (A. Busturia e R. Lagunas, Biochim. Biophys. Acta 820, 324 (1985)). A translocação da maltose através da membrana plasmática da levedura está ligada ao gradiente electroquímico do protão desta membrana. Por cada molécula de maltose transportada, é simportado um protão (R. Serrano, Eur. J. Biochem. 80, 97 (1977)) .

Intracelularmente, a maltose é hidrolisada dando origem a duas moléculas de glucose numa reacção catalisada pela maltase (alfa-glucosidese). A glucose é convertida em seguida em dióxido de carbono e etanol pela via metabólica de Embden-Meyerhof. Em comparação com a fermentação de glucose, são necessárias duas enzimas adicionais para a fermentação da maltose em comparação com a permease de maltose e a maltase. A síntese destas enzimas é induzida pela maltose e reprimida pela glucose, pela frutose e pela manose. Nas massas de panificação não açucaradas (massa sem açúcar) a maltose é o açúcar mais abundante disponível para a levedura. No caso de se adicionar sucrose à massa, este dissacarídeo é hidrolisado extracelularmente pela levedura dando glucose e frutose. Em seguida estas hexoses são transportadas

para, o interior da levedura por acção de diferentes permea ses.

Verifica-se geralmente que a adição de sucrose a tneios contendo maltose, como por exemplo a massa de panificação, inibe o metabolismo da maltose pelas células de levedura. Esta inibição é devida ao facto de a transcrição de genes que codifica para a permease de maltose e para a maltase é reprimida pela glucose (R. B. Needleman, D. B. Kaback, R. A. Bubin, E. L. Perkins, N. G. Rosenberg, K. A. Sutherland, D. B. Forrest e C. A. Michel Proc.Natl. Acad. Sei. USA 81 , 2811 (1984)).

Os genes necessários para o trans porte e para a hidrólise da maltose estão agrupados num local NAL (R. B. Needleman et al. Supra). Algumas estirpes de Saccharomyces podem conter até um máximo de cinco locais MAL (MAL 1 a 4 e MAL 6) que não estão ligados entre si e se encontram localizados nos telómeros de diferentes cromossomas (J. L. Celenza e M. Carlson Genetics 109, 661-664 (1985)). Um local MAL contém genes que codificam para a permease de maltose, para a maltase e para uma ou várias proteínas de regulação (regulador MAL) neces sárias para a indução pela maltose (R. B. Needleman et al. Supra; J. D. Cohen, M J. Goldenthal T. Chow, B. Buchferer e J. Marmur, Mol. Gen. Genet. 200, 1 (1985); R. A. Dubin,

E. L. Perkins, R. E. Needleman e C. A. Michels, Mol. Cell. Boi. 6, 2757 (1986)). Os referidos genes foram isolados e clonados (A.O.J.P. Cohen et al., supra; R. B. Needleman et al., supra; H. J. Feferoff, J, D. Cohen, T. R. Eccleshall, R. B. Needleman, B. A. Buchferf, J. Giacalone e J. Marmur, J. Bacteriol. 149, 1064 (1982)).

Conforme referido anteriormente, a fermentação de leveduras em massa sem açúcar depende da maltose como substrato principal. A maltose é produzida na massa a partir de amido pela acção de amilases, as quais normalmente estão presentes na farinha. Para além

- 3 - - 'i'.·.:

yyyy·

3 3• ··. *···:·/

V.Vi'·

O¹;

disso, a farinha contém uma quantidade variável (de O a

O, 5 %) de açúcares livres como seja glucose, rafinose, etc. (H. Suomalainen, J. Dettwiler e E. Sinda, Process Biochem. 7, 16 (1972)). Estes açúcares são rapidamen te consumidos pela levedura. Foram publicados vários es tudos de investigação da possível correlação entre a fermentação da maltose e a actividade de levedar da levedura de panificação. Em alguns casos verificou-se uma correlação positiva entre a velocidade de fermentação de maltose com actividades de maltase e de permease de maltose. No entanto não foi possível observar uma correlação positiva entre as actividades de maltase e de permease de maltose com a capacidade para levedar em massa sem açú car (P. Hautera e T. Lovgren e P. Hautera, Eur, J. App iiicrobiol. 4, 37 (1977)).

Por transformação de células de levedura com plasmídeos de multicópias contendo genes que codificam para a maltase e para a permease de maltose obteve-se um aumento de quatro vezes na actividade específi. ca da maltase mas a actividade de permease de maltose não foi melhorada. A introdução de genes extra que codificam para a proteína de regulação tem como resultado um au mento moderado na actividade específica da maltase mas no vamente não se observou qualquer efeito sobre a actividade da permease de maltose (J. D. Cohen et al., supra).

Cs transformantes obtidos não foram analisados para deter minar a produção de dióxido de carbono e de etanol por estes investigadores. Com efeito, a técnica anterior de sencorajava a realização destas experiências uma vez que se tinha determinado por várias vezes que não existia qualquer correlação entre as actividades de permease de mal tose e de maltase (actividade de levedar) na massa sem açúcar (H. Suomalainen, J. Dettwiler e E. Sinda, supra I-I. Suomalainen, Eur. J. Appl. Microbiol. 1, 1 (1975);

P, Hautera e T, Lõvgren, supra; T„ Lfívgren e P. Hautera, supra).

mrn» 5

Verificámos agora que'as leveduras transformadas por plasmídeos integrativos, de que se descrevem exemplos seguidamente, apresentam um nível mais ele vado de actividade de perraease de maltose e de maltase, em comparação com a. estirpe· não transformada. Estas actividades mais elevadas de maltase e de permease de malto se coincidem surpreendentemente com um aumento na produção de CC>2 ou na actividade de levedar, tal como se observou também no caso de levedura transformada com vectores epissomais.

Estas leveduras melhoradas apresen tam velocidades mais altas de metabolismo dando como resul tado, por exemplo, produções mais elevadas de dióxicio de carbono e de etanol em meios contendo açúcares, como por exemplo maltose, como fonte de carbono e de energia princi pal. Os métodos proporcionais envolvem a aplicação de té cnicas de ADN recombinante de tal modo que a velocidade de fermentação de meltose por estas leveduras é drasticamente aumentada independentemente da presença de outros açúcares, como por exemplo de glucose.

Para além disso, as estirpes melho radas de levedura apresentam uma excelente actividade de levedar massas de panificação (produção de gás). De modo análogo, a alta velocidade de produção de etanol destas leveduras tem como resultado um período de fermentação reduzido para as leveduras utilizadas na produção de álco ol potável e industrial ou com maior quantidade de álcool produzido num determinado período.

Para além disso se a (acumulação de) maltose está a inibir enzimas, que convertem o açúcar ou o amido, é vantajosa para o dito processo de fermentação a rápida remoção de maltose. Por aplicação da presente invenção pode obter-se uma levedura na qual (um) gene(s) extra é(são) intriduzido(s) codificando para a mal

- 5 tase e/ou a permease de maltose

A presente invenção proporciona uma levedura transformada e um processo para a produção da referida levedura melhorado na velocidade de fermenta ção de açúcares que compreende a introdução na levedura de pelo menos uma construção de ADN, de preferência homóloga, contendo pelo menos um gene na referida levedura que codifica para uma proteína que promove o transporte e/ou a conversão metabólica inicial de um substrato transi, formado, possuindo o gene capacidade de expressão na referida levedura.

A velocidade da fermentação dos açúcares pode ser melhorada durante várias fases da levedura, por exemplo, uma velocidade melhorada causada pela fermentação da maltose ou da sucrose.

Por ADN homólogo entende-se um ADN com origem no mesmo género de levedura. Por exemplo uma levedura Saccharomyces é transformada com ADN com origem em Saccharomyces. Deste modo é possível melhorar propriedades do género de levedura que já existem, sem introduzir novas propriedades que não estavam anteri ormente presentes no género. A melhoria da velocidade ce fermentação dos açúcares pode ser obtida sob condições aerobicas e/ou anaeróbicas. Os genes de interesse inclu em permeases, particularmente a permease de maltose, sacaridases, particularmente maltase, quinases, particularmente hexoquinases e glucoquinase, e outros semelhantes.

A presente invenção pode ser aplicada, por exemplo, a uma proteína de transporte necessária para o transporte para o interior da célula de glucose ou de frutose e a hexoqui nases e glucoquinase que catalisam a conversão metabólica intracelular inicial destas hexoses para dar fosfatos de

A presente invenção proporciona também métodos eficientes para a introdução nas leveduras de pelo menos uma construção de àDH homólogo.

A presente invenção pode ser aplicada com vantagem a uma construção que contém pelo menos um gene que codifica para uma proteína que promove o transporte para o interior da célula de maltose e a conversão metabólica inicial de maltose em glucose. Deste modo é possível obter leveduras que possuem várias vanta gens em comparação com as estirpes (hospedeiras) originais. Os benefícios desta levedura melhorada podem ser encontrados especialmente na produção melhorada de etanol e de CO2. For exemplo, quando a presente Invenção é aplicada a levedura de panificação esta aplicação será de grande vantagem para o padeiro, porque o padeiro necessita de menos tempo ou de menos levedura a fim de leve dar a massa sem açúcar em virtude da actividade de levedar melhorada das novas estirpes.

Tem interesse notar-se que a levedura transformada de acordo com a presente invenção pode ser usada como estirpe inicial nos processos de melhoramento de leveduras além da transformação mediada por ADN, por exemplo, fusão de protoplastos, emparelhamento em massa e mutação. Considera-se que as estirpes resul tantes fazem parte da invenção.

De acordo com um modo de concretização preferido da invenção, as novas estirpes consomem quantidades substanciais de maltose na presença de glucose. Deste modo os padeiros podem também economizar no consumo de açúcar, uma vez que é necessário adicionar menos açúcar a fim de obter massas doces,

É bem conhecido que as leveduras osmotolerantes apresentam um comportamento desfavorável

Por (fraca actividade de levedar) na massa sem açúcar, leveduras osmotolerantes entendem-se as leveduras que têm um comportamento favorável nas massas doces. As massas para os produtos de panificação doces contêm por exemplo 10 a 30 % de açjúcar (com base no peso da farinha) . Por conseguinte, quando se escolhe uma estirpe osmotolerante como hospedeiro para a transformação de acordo com a presente invenção, obtém-se uma levedura osmotolerante que não só se pode aplicar a massas doces mas pode também ser usada em massas sem açúcar uma vez que a sua capacidade para fermentar maltose foi melhorada de acordo com a presente invenção. Como consequência o padeiro apenas nece sita de um tipo de levedura que pode aplicar tanto às ma sas doces como às sem açúcar, o que constitui uma vantagem.

A necessidade de estirpes de levedura. que possuem um bom comportamento tanto em massa sem açúcar, como em massa doce é descrita, por exemplo, na SP-A-128524 e na D2-A-2757778. A fim de obter estirpes que têm um bom comportamento em massas ricas em açúcar e em massas sem açúcar, a ΞΡ-Α-128 525 descreve um método de fusão de protoplastos? a DE-A-2 757 778 descreve, a fim de obter estirpes de leveduras com o mesmo objectivo, um método de selecção de estirpes a partir de uma população de estirpes diplóides preparadas por métodos de hibri dação ou de mutação. Ambos os processos necessitam de muita experimentação e os resultados não são previsíveis nem reproductíveis. Por utilização do processo da presente invenção, é possível obter resultados controlados e reproductíveis com as estirpes de leveduras transformadas. A experimentação das estirpes produzidas de acordo com a presente invenção pode ser mínima porque as proprie dades da estirpe em si não foram substancialmente alteradas excepto no que se refere à melhoria de propriedades referida.

A presente invenção proporciona uma levedura comprimida que apresenta uma produção de gás de pelo menos 340 ml/285 mg de peso seco da levedura em 165 minutos no Ensaio B e uma produção de gás de pelo menos 170 ml/285 mg de peso seco de levedura no Ensaio B‘, respectivamente. De modo vantajoso a levedura seca instantânea ou seca activa é preparada a partir desta levedura comprimida. Durante a secagem da levedura comprimida, perde-se geralmente 15 a 25 % da actividade de levedar com base no peso de matéria seca. A presente invençã proporciona também uma levedura seca (3 a 8 %)(em peso de humidade) que apresenta uma produção de gás dê 310 a 360 ml/2 85 mg cie peso seco de levedura em 165 minutos no Ensaio C* e de preferência pelo menos 330 ml/285 mg de pe so seco de levedura no Ensaio C e pelo menos 155 ml/285 mg de peso seco de levedura no Ensaio C', respectivamente.

Os valores de gás obtidos com levedura preparada de acordo com a presente invenção nunca foram encontrados mesmo quan do se experimentaram nos Ensaios C e C* estirpes disponíveis comercialmente. A invenção pode também ser aplicada a leveduras que apresentam um bom comportamento no que se refere a. actividade de levedar na gama de rnassa com 0 a 6 ou 0 a 10 % de açúcar. Deste modo, é possível preparar leveduras comprimidas que apresentam uma produção de gás de 400 a 5CC ml/285 mg de peso seco de levedura em 165 mi nutos no Ensaio B, de preferência apresentando estas leveduras comprimidas uma produção de gás de pelo menos 440 ml/285 mg de peso seco de levedura. É possível então obter leveduras secas que apresentam uma produção de gás de 32o a 400 ml/285 mg de peso seco de levedura em 165 minutos no Ensaio C, respectivamente apresentando a levedura seca de preferência uma produção de gás de pelo menos 350 ml/285 mg de peso seco de levedura.

Verificam-se vantagens semelhantes destas novas estirpes em fermentações para a produção de álcool notável e industrial.

t

Uma vez que a velocidade metabóli ca global destas novas estirpes foi aumentada quando o su bstrato é maltose, a velocidade de produção global de metabolitos como por exemplo glicerol e compostos que confe rem sabor também será aumentada.

De acordo com o aspecto da presen te invenção, são proporcionados vectores que contêm uma construção de ADN que codifica para uma ou várias proteínas envolvidas na fermentação da maltose. A presente invenção também proporciona um hospedeiro microbiano, de preferência uma levedura, que é, por exemplo, uma espécie de Saccharomyces transformada com vectores descritos na presente invenção. Estes vectores podem ser auto-replicantes e podem conter de modo vantajoso um gene ou uma combinação de genes seleccionados de entre os genes cfue codificam para a permease de maltose, para a maltase e para a proteína de regulação da maltose. Surpreendentemente, verificou-se que a levedura transformada com estes vectores apresenta uma velocidade de fermentação de maltose melhorada, de onde resulta uma maior velo cidade de produção de CO^ na massa. Sstes genes adicionais estão localizados em epissomas, no entanto, e é sabido da literatura que estas moléculas extracromossómicas são facilmente perdidas durante a propagação não selecti va (isto é, crescimento na ausência de G418 neste caso particular) (C. D. Hollenberg (1982) Gene Cloning 12, Organisms other than B, coli. Sás. P.H. Hofscheneider, h, Goebel, Springer Verdag 119; S. A. Parent, C. M. Fenimone e K. A. Bostian (1985), Yeast jL, 83). De um ponto de vista prático, é preferível cultivar uma levedura em meie nao selectivo e portanto é vantajoso construir um conjunto de plasmídeos de integração contendo de preferên cia genes alterados de maltase e/ou de permease de maltose. Por alterado entende-se a permuta do promotor na tural por outro promotor, de preferência homólogo. No caso de serem desenvolvidos processos que permitem a pro

- IC -

liferação estável de plasmídeos na ausência de uma pressão selectiva, a integração do novo ADN introduzido já não é um pré-requisito para se obterem estes transformantes estáveis.

É conhecido da literatura que uma célula contém entre 2o a 100 moléculas destes plasmídeos extra (C. D. Eollenberg (1982), supra; A. Takagi, Ε. N. Chun, C. Boorchird, S. Harashima e Y, Oshima, Appl. Microbiol. Biotechnol, 23, 123; J, Mellor, M. J. Dobson, N.

A. Roberts, N. J, Kingsman e S. M. Kingsman (1985) Gene

nível de expressão dos genes epi ssomais pode ser aumentado ainda mais por permuta dos promotores originais por promotores mais fortes. Parece provável que no futuro seja possível conseguir a replicação estável de plasmídeos na ausência de pressão selectiva .

Os genes da maltase e/ou de permease de maltose são, de acordo com a presente invenção, integrados de modo vantajoso no cromossoma da levedura por meio de. transformação com plasmídeos lineares (ver T, L. Grr-Keaver, J, E. Szostak, R. Rothstein (1981) Proc. Natl. Acad. Sei, U.S.A. 78, 6 354). As leveduras obtidas sãc transformantes estáveis, isto é, os genes alterados da maltase e/ou da permease de maltose podem ser conservados no genoma mesmo na ausência de pressão selectiva.

â conhecido que durante a integração apenas uma ou um número pequeno de cópias dos genes localizado num plasmídeo se integra no cromossoma. Por conseguinte, a fim de obter melhorias semelhantes na produção de. C0₂ como as que se obtêm quando se usam vectores epissomais, o nível de expressão dos genes pode ser alterado de forma vantajosa por aplicação de promotores consti

- 11 AS

tutivos fortes não sensíveis à repressão pela glucose.

Estes promotores são preferidos a fim de compensar a diferença no número cie cópias entre a levedura transformada com vectores epissomados e vectores integrativos e a fim de evitar os efeitos da repressão pela glucose. Observou -se, por exemplo, que durante os primeiros 30 a 40 minutos de fermentação, em meios contendo maltose como princi pel fonte de carbono e de energia e uma concentração de glucose relativamente baixa, os níveis de ARNm da permease de maltose e da maltase reduzem-se até níveis dificilmente detectáveis. Uma vez que a glucose tenha sido consumi da, a indução da expressão dos genes pela maltose tem como resultado um aumento rápido em ambos os níveis dos ARNni.

Conforme indicado, os genes podem ser usados com o seu. promotor natural ou de tipo selvagem ou então o promotor pode ser substituído por um promotor diferente, de preferência por um promotor homólogo. Sspecialmente quando o promotor de tipo selvagem é regulável ou incluctível, pode ser vantajoso proporcionar uma transcrição constitutiva ou um promotor mais forte ou mais fraco. Inversamente, quando o promotor de tipo selvagem é constitutivo, pode haver interesse em proporcionar um pro motor regulável ou inductível ou um promotor mais forte ou mais fraco.

Ê desejável empregar promotores fortes, especialmente quando pode existir um número de cópias da construção no hospedeiro relativamente baixo. Os promotores fortes serão normalmente os envolvidos na produção de proteínas produzidas em alto nível durante o ciclo de vida da levedura ou quando são reguláveis em algum período de interesse no ciclo de vida da levedura, em relação com a presente invenção.

São de particular interesse os promo tores associados com o ciclo glicolítico da levedura, os j

k .ρ

quais incluem de-hidrogenases I e II de álcool, fosfoglu coisomerase, glucose-6-fosfato-de-hidrogenase, isomerase de triose-fosfato, gliceraldeídofosfato-de-hidrogenase, triose-fosfato-isomerase, gliceroldeídofosfato-de-hidroge nase, fosfo-glicerato-quinase, enolase, fosfogliceromutase, quinase de piruvato e de-hidrogenase de lactato. Cutros promotores relacionados com proteínas produzidas em grandes quantidades incluem os promotores associados com a expressão ribossomal, como por exemplo os promotores para a transcrição de factores de início, factores de elongação, etc.. Factores de elongação particulares incluem SP-1 e EP-2, etc..

Apresenta um interesse especial a utilização de promotores em combinação com genes estruturais relacionados com o metabolismo da maltose, especial mente com a maltase, a permease de maltose e o regulador ..;.L. Estes promotores podem ser constitutivos ou regula veis desde que o promotor seja induzido durante a fermentação cio açúcar. por exemplo, muitos dos promotores gli colíticos são activados na presença de um açúcar ou de um metabolito de um açúcar, como por exemplo o etanol.

Deste modo, promotores como a de-hidrogenase de álcool manter-se-ão activos durante o processo de levedar da farinha. De modo semelhante, os promotores associados com a proliferação celular manter-se-ão também activos durante o processo de levedar da massa de panificação.

disso, ao proporcionar promotores que não são pelo regulador HAL, a levedura pode ser utiliPara além regulados cada na presença de glucose sem repressão. Além disso, os genes, não necessitam de maltose para a indução.

Quando se usam promotores de tipo selvagem em conjunção com os genes estruturais de interes se, rode ser desejável proporcionar uma produção aumentada da proteína de regulação. Deste modo, a proteína de regulação pode ser mantida num nível elevado quando o indutor está presente. Por exemplo, na presença de maltose, ί »

a proteína cie regulação MAL será expressa num nível eleve do de forma a proporcionar a expressão de outras proteínas associadas com o metabolismo da maltose e reguladas ps la proteína de regulação MAL.

As alterações de expressão dos genes, conforme descrito em pormenor nos procedimentos experimentais, inclui a permuta dos promotores originais mais (parte de) as sequências guias não traduzidas para os da de-hidrogenas 1 de álcool (ADHI) e o factor de elongação cie tradução SFI°tA de preferência derivado da levedura hospedeira, por exemplo de Saccharomyces. Como consequência, s expressão tornar-se-à insensível à repressão pela glucose e independente da maltose para' a indução.

Verificou-se que as leveduras transformadas por estes plasmídeos integrativos apresentam um nível melhorado cie actividade de permease de maltose e de maltase em comparação com a estirpe não transformada. Estas actividades aumentadas de maltase e de permease de maltose coincidem cie forma surpreendente com um aumento da produção de C0₂ ou cia actividade de levedar, conforme se observa no caso de levedura transformada com vectores epissomais.

A. melhoria obtida na actividade de levedar mantem-se durante a armazenagem mesmo a temperaturas elevadas, por exemplo a temperaturas de 20 a 25°c.

perda relativa de actividade de levedar durante a armazenagem é virrualmente idêntica para as estirpes progenitoras e as estirpes de acordo com a presente invenção. A actividade de levedar em massas de alto conteúdo de açúcai não e afectada pelas modificações introduzidas uma vez que a actividade de levedar das novas estirpes transformadas com plasmídeos integrativos é tão boa como a obtida com a estirpe hospedeira.

A levedura hospedeira deverá conter pelo menos uma. cópia da construção e pode ter duas ou mai$ normalmente não mais do que 200, conforme o gene esteja integrado no genoma, amplificado ou presente num elemento extracromossomai que possua um número de cópias múltiplo. â possível seleccionar a integração ou a não intç gração de acordo com a estabilidade pretendida para a manutenção do elemento extracromossomal preparado, o número de cópias pretendido, o nível de transcrição disponível de acordo com o número de cópias e outros factores semelhantes .

A construção pode incluir um ou vári os genes estruturais com o mesmo promotor ou com promoto res diferentes. A construção pode ser preparada de acor do com os métodos habituais por isolamento dos genes pretendidos a partir de um hospedeiro apropriado, síntese da totalidade ou de uma porção dos genes ou combinação destas técnicas. De modo semelhante, os sinais de regulação e as regiões de início e de terminação da tradução po dera ser isolados a partir de uma fonte natural, podem ser sintetizados ou podem ser preparados por combinações des tas técnicas. Os vários fragmentos podem ser submetidos a digestão por endonucleases (restrição), ligação, sequ enciação, mutagénese in vitro, reparação por iniciadores ou técnicas semelhantes. As várias manipulações são bem conhecidas para a prossecução de fins específicos.

Os vários fragmentos podem ser combi. nados, cionados, isolados e sequenciados de acordo com os métodos habituais. Após cada manipulação de fragmentos podem ser inseridos no vector de clonagem, o vector pode ser utilizado para transformar o hospedeiro, de clonagem, por exemplo Ξ. coli, o hospedeiro de clonagem pode ser cultivado e lisado, o plasmídeo pode ser isolado e os fra gmentos podem ser analisados por análise de restrição, se cuenciação, combinações destas técnicas ou outras semelhan tes.

b _ λ .

ClN

Podem utilizar-se vários vectores durante o decurso do desenvolvimento da construção e a transformação das células do hospedeiro. Estes vectores podem incluir vectores de clonagem, vectores de expressão e vectores que proporcionem a integração no hospedeiro ou ADN simples para transformação e integração.

vector de clonagem é caracteriza do, na sua maior parte, por possuir uma origem de replicação funcional no hospedeiro de clonagem, um marcador para selecção de um hospedeiro que contenha o vector de clonagem, um ou vários poli-adaptadores ou sequências adicionais para inserção, selecção, manipulação, facilidade de sequenciação, excisão ou manipulações semelhantes. Além disso, podem ser utilizados vectores lançadeira, devendo neste caso o vector conter duas ou mais origens de replicação que permitam que o vector se replique em mais do que um hospedeiro, por exemplo num hospedeiro procariótico e num hospedeiro eucariótico.

Os vectores de expressão normalmen te devem proporcionar uma inserção de uma construção que inclua a região de início e a região de terminação de transcrição e de tradução, podendo em alternativa a construção não ter uma ou as duas regiões de regulação, sendo neste caso proporcionadas pelo vector de expressão por in serção da sequência que codifica para o produto proteico. Deste modo, a construção pode ser inserida num gene com regiões de transcrição e de tradução funcionais quando a inserção está na proximidade da extremidade 5’-terminal do gene existente e a construção é regulada pelas regiões de regulação existentes. Normalmente é preferível que o codão de início esteja na posição 5' em relação ao codão de início existente, a menos que seja aceitável um produto de fusão ou cue o codão de início esteja fora de fase em relação ao codão de início existente. Em outros casos, existem vectores de expressão que possuem um ou vários

locais cie restrição entre as regiões de regulação de início e de terminação, de tal modo gue o gene estrutural po de ser inserido no local ou nos locais de restrição e estar sob regulação destas regiões. São de especial interesse para a presente invenção como vectores de expressão para manutenção estável extracromossómica ou para integração as construções e os vectores que na sua forma estável no hospedeiro não possuem ADN livre heterôlogo (não de Saccharomyces).

De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, são proporcionados processos para a produção de leveduras que apresentam todas as vantagens descritas tendo além disso sido eliminadas todas as sequências de ADN procariótico. Ssta eliminação foi conse guida por meio de técnicas de substituição de genes (R. J Rothstein (1983) Methods in Enzymology, 101, 202). De acordo com a presente invenção, estas técnicas são agora aplicadas com vantagem a células de Saccharomyces,° por exemplo, a transformação de células de Saccharomyces com um vector que cc-ntém genes que codifica para rnaltase e/ou permease de maltose alterada localizados num gene específico de esporulação de Saccharomyces (Ξ. Cottlin-Ninga, D, B. Kaback (1986) Mol. Cell. Biol, 6, 2185). Apos introdução deste ADN numa célula hospedeira de Sacoharo rnyces tem lugar uma recombinação homóloga de ADN introduzido com o gene específico de esporulação cromossómico. Como consequência, os genes de rnaltase e/ou de permease de maltose alterados incluídos entre as sequências especi ficas de esporulação ficam integrados no cromossoma. Os transformantes resultantes estão completamente isentos de ADN procariót ico.

Deverá notar-se que é possível obter resultados ainda melhores se a proporção óptima entre as actividades de rnaltase e de permease de maltose for de terminada. Esta determinação pode ser feita por variação dos promotores dos dois genes ou por integração de

‘-'‘AvUMRfSaGC 3

‘WWírr números diferentes de genes (alterados) de maltase e de permease de maltose no genoma da levedura, por exemplo me diante a utilização de vários locais de integração de acor do com os métodos descritos seguidamente.

A proporção óptima entre a actividade da maltase e da permease de maltose pode também ser obtida usando genes de maltose ou de permease de maltose que codificam para outras isoensimas de maltase e de permease de maltose. Para além disso pode ser aplicada qualquer enzima, que tenha pelo menos actividade de maltase ou de permease de maltose.

Para além disso, os genes que codi ficam para a proteína de regulação MAL podem ser integrados no genoma de modo análogo (ver também Exemplo 1) sob a regulação do seu próprio promotor natural ou sob a regulação de outro promotor, de preferência de Saccharomy css, Esta circunstância pode também ser útil a fim de se obter uma proporção óptima entre as actividades de mal tsse e de permease de maltose.

Lista das e st irpes depos i t ad as

As estirpes seguintes foram deposi tadas no Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Países-Baixos:

Baccharomyces cerevisiae 237 Ng (estirpe A), depositada sob o número de acesso CBS 158.86 em 25 de larço de 1986;

Saccharomyces cerevisiae DS 15513 (estirpe C) , depositada sob o número de acesso CBS 406.8^r' em 3 de Setembro de 1987;

Bscherichia coli contendo o plasmídeo p21-4O, depositada sob o número de acesso CBS 400.87

em 2 6 de Agosto de 1987

Escherichia coli contendo o plasmí. deo p73F46, depositada sob o número de acesso CBS 401.87 em 28 de Agosto de 1987;

Escherichia coli contendo o plasmídeo pY6, depositada sob o número de acesso CBS 402.87 em 26 cie Agosto de 1987;

Bscherichia coli contendo o plasmí deo peG418, depositada sob o número de acesso CBS 160.86 ern 2 5 de barço cie 1986;

Escherichia coli contendo o plasmí. deo pTZ-19R, depositada sob o número de acesso CBS 405.87 em 3 de Setembro de 1987;

Escherichia coli contendo o plasmí deo ρ 19.-./ΑΕΗΪ, depositada sob o número de acesso CBS 4C4.2.7 em 3 de Setembro de 1987;

Escherichia coli contendo o plasmí deo p!53-215 AK, depositada sob o número de acesso CBS 403.37 em 3 de Setembro de 1987;

Escherichia coli contendo o plasmí deo pL?24, depositada sob o número de acesso CBS 156.88 em 8 de barço de 1988;

Escherichia coli contendo o plasmí deo ρϋΤ332, depositada sob o número de acesso CBS 158.88 em 8 de barco de 1938;

deo em

Escherichia coli contendo o plasmí pThlGR, depositada sob o número de acesso CBS 480.88 7 de Julho de 1988;

Breve descrição dos_desenhos

A Figura 1 descreve a construção do plasmídeo pGb-eãíal69. As flechas indicam a direcção da. transcrição dos genes indicados. Os plasmídeos estão desenhados de forma esquematizada e sem ser à escala. Abreviaturas: G41S, gene Tn5 (sob regulação'do pro motor ADHI) gue confere resistência a G418; ρ, pvul; X, Abai; Sall; H, HindIII; CIP: fosfatase de intestino de vitela (calf intestine phosphatase).

it Figura 2 descreve a construção de pGb-eAALdl. Os plasmídeos estão desenhados de forma esquematizada e nao estão à escala. Abreviaturas; Δ gene de maltase com supressão parcial da malatase; B, BglII. Ver também descrição da Fig. 1.

A Figura 3 descreve a construção do plasmídeo pGb-eXALõ3. Cs plasmídeos estão desenhados de forma esquemática e não estão à escala. Abreviaturas: (κ), local Kpnl preenchido; (S) local Sall preenchi do; klenow, polimerase de ADN de subunidade grande; H, HindIII. Ver também descrição da Fig. 1.

A Figura 4 descreve a construção de pGfc—H6ç ( Δ-9) . Abreviaturas; K, HindIII; St, Stul; Xlenov;, polimerase I de ADN de subunidade grande; EV, BcoRV; Xh, XhOI; X, Xlul; fl ori, origem de replicação do fago £1; amp, gene de resistência à ampicilina; s.p. iniciador de frequência. As flechas indicam a direcção 5’

3'. A área suprimida está indicada com linhas ponteadas e Δ .

A Figura 5 descreve a sequência do plasmídeo pGb-HSg (Δ-9).

a) Genes de maltase e de permease de maltose. A flecha indica a direcção da transcrição. St (Stul) serviu de ponto de partida, para a construção do mutante de supres- 20 -

são. As partes relevantes da sequência da área intergénica estão apresentadas por baixo deste mapa.

b) Sequência de pGb-m6g (Δ-9). A área suprimida estende-se de -9 até -417. O poliadaptador refere-se aos oligonucleótidos que foram ligados no ADN tratado por Bal 131 (ver também Fig. 4).

A Figura 6 descreve a construção co piasmídeo pgb-lA32/G418, As flechas indicam a direcção da transcrição. Os plasmídeos estão desenhados de forma esquemática e não estão à escala. Abreviaturas:

H, HindIII, 3V, 3LoRV; £1 ori,'origem de replicação do fago gl; amp, gene de resistência à ampicilina; G418, gene Bn5 (promotor A.DHI) que confere resistência a G418; S, Smal; Hc, HincII; pADHI, gene promotor de de-hidrogenase 1 ds álcool ponte do guia 5' (área tracejada).

A Figura 7 descreve a construção do piasmídeo pGb-iRROl.

a) 0 piasmídeo ρϊ4 não está desenhado à escala. Abrevi aturas: 2, EcoRl; B/Bg, ligação BamHI/BglII; H, HindIII.

b) kutagénese em pT4 a fim ce fundir o promotor de EE1<*A + o guia de 5' aos codões dos 5 ácidos aminados N-terminais do gene da maltose de tal modo que se cria também um local BglII. Apresentam-se as sequências relevantes.

iniciador de mutagénese é em parte complementar (indicada com pontos) da sequência 2Plo<A. Na região em que se verificam faltas de correspondência encontram-se os codões de maltase e o local de reconhecimento de BglII - encaixado - (note-se que a orientação apre sentada do iniciador de mutagénese é 3’ 5’, isto é, o local BglII deve ser lido da direita para a esquerr¹ - f Γ I Q t \

V. C. \ -J «J ) e

Na sequência da maltase, indicam-se os codões dos 5 ácidos aminados Π-terminais.

- 21 O local de reconheci-

mento de Bell está indicado por uma caixa.

- Ha sequência de ρϊ4-Σ4, apresenta-se a sequência que cobre a mutação. 0 local BglII está incluido numa caixa. Cs asteriscos indicam o desvio da sequência de nucleótidos da maltase. 0 desvio do quarto codão é uma mutação silenciosa,

c) Os plasmídeos não estão desenhados à escala. Abrevia turas: H, HindIII; Bc, Bell; 13, EcoRI; Bg, BglII; EV, Sco RH; Bg/Bc, ligaçao BglII/Bcll; pEPiPfA; fl ori, origem de replicação do fago Fl; amp, gene de resistência à ampicili n a.

d) Cs plasmídeos não estão desenhados à escala. Abreviaturas: ver c).

A Figura S descreve a construção do plasmídeo pGb-3HSNS. Os plasmídeos estão desenhados de forma esquemática e nao estão à escala-, Abreviaturas E, EcoRI; E, HindIII; sf, sfil; Π, Hotl; fl ori, origem de replicação do fago fl; amp, gene de resistência à ampicilina. A flecha indica a direcção 5' 3'. Oligo 3 e são oligodesoxinucleótidos sintéticos com a sequência de base indicada.

do plasmídeo oGb-B.B2.

A Figura 9 descreve a construção Os plasmídeos estão desenhados de forma esquemática e não estão à escala. Abreviaturas:

E, EcoRI; 3g, BglII; H, HindIII; Hc, HincII; B, Bam HI;

3m, Smal; P, Pst 1; fl ori, origem de replicação fago fl; amp, gene de resistência à ampicilina. As flechas indicam a direcção 5' 3'. Oligo 5 e 6 são oligodesoxinucle ótidos com a sequência de base indicada. Os codões de paragem de tradução TAA estão sublinhados em todos os quadros de leitura.

- 22 ------

A Figura IG descreve a construção do plasmídeo pGb-RBN 3. As flechas indicam a direcção de transcrição. Cs plasmídeos estão desenhados de forma esçuemátics e não estão à escala. Abreviaturas: Sf, Sfil;

Sm, Smal; H, HindIII; fi ori, origem de replicação do fago fl; Am;,, gene de resistência à ampicilina; G 4-18, gene Tn5 (sob regulação do promotor ADHI) que confere resistência a G 418; 2V, EcoRV; Hc HincII.

A Figura 11 descreve a construção do plasmídeo pGb-RBRROl. 0 plasmídeo pGb-iRROl é descrito completamente na Fig. 7 e contém o gene da maltase sob a direcção do promotor de SPle<A (p3Fl©(A) e o gene de perrnease de maltcse sob a direcção do promotor de de-hidrogena.se I de álcool (pADHI) (ambos os promotores estão indica dos com caixas tracejadas). O plasmídeo pGb-RB2 encontra -se descrito na Figura 9. Ro plasmídeo pGb-RBRROl o fragmento gue contém SIT4 encontra-se dividido em duas partes (flancos de SIT4). Os plasmídeos estão desenhados de forma esquemática e não estão à escala. As abreviaturas sao idênticas às das legendas da Figura 10. As flechas indicam a direccão da transcrição.

A Figura 12 descreve a disrupção do gene numa única fase. Na fase 1, digere-se o plasmídeo pGb-RBnS com sfil. Esta operação liberta um fragmento ce ADN cue possui nos dois lados homologia em relação à região do gene SIT4» Esta circunstância dirige a integração para o gene SIT4 (ver também R. J. Rothstein (1983) em Aethods of Enzymology, 101, 202). A região do gene SIV4 encontra-se indicada por uma caixa tracejada. Apresentam-se esquematicamente os dois alelos cromossémicos.

Ha fase 2, a estirpe resultante ApGb-RBN3 é transformada com pUT332 (não digerido) e com pGb-RHRROl digerido com Efil, 0 princípio de cotransformação encontra-se bem documentado (ver A. K. Brand, I. Breeden, J. Abraham, R. Stel glanz e. K. Kasmyth (1985) Cell 41, 41-48 e p. Siliciano

e K. Tatchell (1984) Cell 37, 969-978), Ha primeira selecção usámos a resistência à fleomicina (plasmídeo pUT 332) mas é evidente que também podem ser usados plasmíde os epissomais derivados de 2 p que confirmam resistência a outros antibióticos como o higromicina Β. O plasmídeo pUT 332 e a fleomicina podem ser adquiridos a Cayla, Avenue Larrien, Centre Commercial de Gros, 31094, Toulouse Cedex, França. Ko plasmídeo pUT 332 o gene de resistência à fleomicina é derivado da transposição Tn5 e foi colo cado sob a direcção de urn promotor de levedura. Na fase 3 o plasmídeo epissomal pUT 332 é eliminado dos transforniantes por cultura em meio não-selectivo (cura). Abrevia turas; G413^r, gene de resistência a G418 sob a direcççao do promotor de ADHI; Sf, extremidade de um fragmento de ADN gerado por digestão com Sfil, KAL, um gene alterado de rnaltase e de permease de maltose. Ver também Fig. 9 e 11 para pormenores dos plasmídeos; i· pUT 332, plasmídeo epissomal pUT332.

A Figura 13 descreve a correlação entre o aumento da actividade específica da permease de maltose e da rnaltase com o desaparecimento da glucose do meio k. Os gráficos são representativos das estirpes comerciais de levedura de panificação, como por exemplo a estirpe k.

k Figura 14 descreve as actividades específicas de permease de maltose na estirpe A e os seus derivados de ArNr durante uma simulação de processo de levedar uma massa de pão no meio A.

A Figura 15 descreve as actividades específicas de rnaltase durante urna simulação do proces so de levedar uma massa de pão na estirpe A e nos seus de rivados de ADNr em meio 21 contendo maltose como principal fonte de carbono e de energia.

A Pigura. 16 descreve a fermentação de maltose durante uma simulação do processo de levedar uma massa de pão pela estirpe A e pelos seus derivados de ADBír em meio A contendo maltose como principal fonte de carbono e de energia.

A Figura 17 descreve a fermentação de maltose durante uma simulação do processo de levedar massa de pão pela estirpe A e pelos seus derivados de ADNr em meio B contendo glucose como principal fonte de carbono e de energia.

Os dados experimentais gue se seguem sao apresentados a fim de ilustrar a invenção. Deve rá compreender-se que um especialista na matéria que este ja familiar com os métodos pode usar outras estirpes de levedura e outros vectores que podem igualmente ser usados no processo da presente invenção. Estas alterações estão incluídas no âmbito da presente invenção.

Técnicas de clonagem

Para técnicas gerais de clonagem faz-se referência ao manual de Aaniatis et al. (T. Maniatis, 2. F. Fritsch, J. Sambrook (1982) Molecular Cloning, A. Laboratory Manual). As enzimas de restrição são usadas de acordo com as recomendações do fornecedor e são obtidas de New Bnçland Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Boehringer Mannheim (Boehringer).

£‘m geral são necessárias 1 a 5 unidades de enzima para cin d ir 1 jjg de ADA.

A transformação de E. coli foi efec tuada por meio da técnica d.e CaClg (T. ííaniatis et al., supra)

Construção de plasmídeos recombinantes

1) pGb-eKAL6g

Este plasmídeo é capaz cie auto-replicação em levedura e contém os genes que codificam para a permease de maltose e para a maltase, A construção deste plasmídeo encontra-se esquematizada na Fig. 1.

plasmídeo peG41S é derivado do plasmídeo pE^3LYe23 (Baldari e G. Cesarini (1935), Gene 35, 27) e contém entre os locais Sair e HindUI um fragmento com o gene ϊη5 (Reiss et al. SííBG J. (1984) 3__f 3317) cue confere resistência a G418 sob a direcção do promotor de desidrogenase I de álcool (ADHI) de levedura semelhante à descrita por Bennetzen e Hal (J. C. Bennetzen e B. D. Hall (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018). O plasmídeo peG418 foi cindido com Hind III, desfosforilado com CIP e ligado com um produto da digestão de pY6 com Hind III e Pvul. 0 plasmídeo ρΥβ encontra-se descrito Hl. B. Needleman e C. Hicheis (1983) Mol, Cell, Biol.

736; R. B. Needleman, D. B. Kadack, R. A. Dubin, 3. L. perkins, il. G. Rosenberg X. A. Sutherland, D. B. Forrest, C. Hichels (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81, 2811 e contém um fragmento HindUI de 7,0 kb que compreende o local RALôg. Este dá origem ao plasmídeo pGb-eMAL6g.

2) pGb-eNALõl

Este plasmídeo epissomal derivado de 2 p contém o gene que codifica para a permease de mal tose. A sua construção é esquematizada na Fig. 2.

plasmídeo pGb-elíAL6g contém dois locais BglII, ambos situados no gene da maltase. Es tes locais BglII de 1,4 Kb foram suprimidos do plasmídeo pGb-ehAL6g por digestão com BglII seguida de religação diluída para promover a ligação intramolecular. Verifi- 26 -

cou-se gue esta supressão destrói a função de maltase (J. D. Cohen, H. J. Goldenthal, T. Chow, B. Euchferer e J. Harmwr (1985) Mol. Gen. Genet. 20, 1).

3) pGh-eHAL63

Este plasmídeo epissomal derivado de 2 μ contém ADN cobrindo a função de KALp (gene da proteína de regulação ou regulador MAL). A sua construção encontra-se esquematizada na Fig. 3.

A partir do plasmídeo p21-4O (R. B Needleman e C. Kichels (1983), supra) isolou-se o fragmento Kpnl-Sall contendo o géne da proteína de regulação As extremidades deste fragmento foram alinhadas usando po limerase T4 de ADN e a polimerase de ADN de Klenow e em seguida clonou-se no local HindIII de peG418 preenchido.

4) pGb-?:6g (Δ-9)

Este plasmídeo é um promotor-mutan te de supressão feito na região intergénica dos genes transcritos de forma divergente de permease de maltose e de maltase (ver Fig. 4). Esta região contém os promotores de ambos os genes (S. H. Hong e J. ííartnur (1986) Gene 41, 75). Sste mutante de supressão foi preparado a fim de substituir os promotores originais. A construção compreende as fases seguintes:

a) Clonou-se o fragmento HindIII de aproximadamente 7,0 Kb contendo os genes para a maltase e para a permease de maltose (ver também Fig. 1) no local HindIII do plasmídeo pTS19R. Este plasmídeo encon tra-se disponível comercialmente (Pharmacia). Resulta o plasmídeo pG5-M6g.

b) Linearizou-se o plasmídeo pG6-M6g com StuI que cor27

ta na região intergénica, As extremidades geradas por Stul serviam de ponto de partida para a exonuclease Bal31 a fim de destacar (partes de) a área intergénica contendo os promotores. 0 local Stul situa-se na proximidade do gene da permease de mal tose (s. H. Hong e J. i-íarmur (1986) supra). A incubação com Sal 31 foi levada a efeito conforme des crito por Líaniatis et al. (T. iíaniatis, Ξ. F. Fritsch e J. Sambrook (1982), supra). A momentos apropriados colheram-se amostras da reacção e incubaram-se com polimerase de ADN de Klenow e fim de tomar as extremidades alinhadas. Sm seguida ligaram-se adaptadores sintéticos às extremidades contendo vários locais de restrição.

Utilizaram-se os seguintes oligode soxinucleótidos complementares:

1. 5' GATATC CTCGAG AGGCCT A 3’

2. 3' CTATAG GAGCTC TCCGGA TGCGC 5’

Criaram-se locais de restrição em forma de cadeia dupla para NcoRV (GATATC), Xhol (CTCGAG), Stul (AGGCCT); por ligação à extremidade coesiva cria-se um local J-íluI (ACGCGT) . Após reacçao com quinasa, ligaram-se os adaptadores no ADN tratado com Bal31 de acordo com as condições descritas (T. Maniatis et al., (1982), supra). A mistura de reacção foi em seguida incubada com iílul e cromatografada através de uma coluna C1-2B de Sepharose de 5 ml a fim de separar os oligodesoxinucleótidos não ligados do fragmento de ADN. Reuniram-se as fracçãoes conten do este ADN linear, ligaram-se ao ADN plasmídeo e introduziram-se nas bactérias.

c) G conjunto de mutantes de supressão resultante foi submetido a análise de sequência. Para este fim os plasmídeos de cadeia dupla foram convertidos em ADN de cadeia simples por supèr-infecção com um fa- 28 -

go auxiliar (protocolo de acordo com a recomendação do fornecedor). Os moldes de cadeia simples foram extraídos por meio de procedimentos 1413 nor mais para utilização em sequência de didesoxi (F. Sanger, S. Hicklen e A. R. Conlson (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. 74, 5463). Para iniciador utili zámos o oligodesoxinucleótido (5¹-GAATTCGGTAGCGTTC ACGC-3¹), complementar a uma extensão de ADN perto do codão de partida do gene de perrnease de maltose, A orientação respectiva é de modo a que a sequência seja lida em direcção ao promotor (ver também Fig. 4).

mutante de supressão do qual a maior parte do promotor de perrnease de maltose foi eliminada, foi seleccionado para experiências futu ras. (Parte de) o promotor de maltase encontra-se ainda presente (note-se que o local StuI como ponto de partida para o tratamento com exonuclease se encontra localizado assimetricamente na região intergénica). A Fig. 5 lista a sequência no ponto da supressão do mutante pGb-K6g (Δ-9). Esta sequência é comparada com a sequência recentemente determinada de toda esta área integral (S. H. Hong e J. Aarmur (1986), supra). Na sequência de tipo selvagem foi observada uma clirerença em relação à sequência publicada: a base C em -878 (numeração de acordo com S. H. Kong e J. Piarmur (1986), supra) não se encontra presente na nossa sequência. Em concordância, o ADN não pode ser digerido com Hpal ou com HincII nesta posição.

plasmídeo pGb-M6g (Δ-9) consti tui o plasmídeo de partida para a fusão de outros promoto res tanto ao gene de perrnease de maltose como ao gene de maltase (ver abaixo).

5) pGb-iA32/G418

Este plasmídeo é um plasmídeo integrativo em levedura. Contém o gene da permease de maltose ancorado no promotor de de-hidrogena.se 1 de álcool e parte ds respectiva sequência guia 5'. A sua construção foi efectuada de acordo com o procedimento seguinte (Fig. 6) .

a) o plasmídeo pT£l9R/ADHj. contém o fragmento BamHI de 1,4 Kb com o promotor de ADHI começando na posição

- 15 em relação ao codão AUG (J. L. Sennetzen e B.

D. Hall (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018). A partir deste plasmídeo isolou-se o fragmento EcoRV-HincII de 700 pb e ligou-se com o plasmídeo pGb-M6g (Δ-9) digerido com EcoRV. Os plasmídeos resultantes foram analizados com digestões por enzimas de restrição e confirmou-se a orientação correcta por meio de análise de sequência didesoxi em moldes de cadeis simples (ver Fig. 6). Usou-se o mesmo oligoiniciador do método descrito na ssccão 4c.

Como resultado do procedimento de clonagem do fragmento promotor ADHI, parte do poliadaptador de pTS19R (BamHI-HincII) encontra-se presen te entre o gene de permease de maltose e o promotor ADHI. Ha Fig. òa apresentam-se a estrutura e a se quência de pGb-AB2.

b) Incorporou-se no plasmídeo pGb-A32 o marcador de selecçao dominante G418 . Um fragmento ScoRV/Hinc

II de 1,9 kb contém o gene Tn5 que confere resistência a G418 sob a direcção do promotor de deidrogenase I de álcool. Este fragmento foi isolado por uma digestão dupla com EcoRV/HincII do plasmídeo 153-215 AA. 0 fragmento ScoRV/HincII foi clonado no local Smal do plasmídeo pGb-A32. Obteve-se des te modo o plasmídeo pGb-iA32/G418.

6) pGb-iRRol

Este plasmídeo é um plasmídeo de integração. Contém o gene de permease de maltose sob a direcção do promotor de deidrogenase I de álcool e o gene d maltase sob a direcção do factor de elongação de tradução do promotor EF A via de clonagem é apresentada na

Fig. 7. A abordagem foi a seguinte. 0 gene da maltase contém um local Bell junto ao codão do quinto ácido amina do. por conseguinte a região de codificação de EF1°<A foi submetida a mutagénese de tal modo que os primeiros cinco ácidos arainados foram alterados para ficarem idênticos aos da proteína maltase. Um local BglII foi co-introdusido na posição do local Bell. A conversão do local Bell num local BglII é uma mutação silenciosa no quarto codão.

Por meio de uma ligação BglII/Bcll no promotor de EF1°(A e na sequência guia foi possível fundir estas sequências ao resto do gene da maltase. 0 procedimento compreende as seguintes fases:

a) 0 plasmídeo de partida foi o plasmídeo pYEF46 (S.

Nagata, K. nagashima, Y, Tsunetsugu-Yokoda (1984) BABO J, 3_, 182 5) que contém o gene integral que codifica para EF1CXA. Isolou-se um fragmento BglII de 2,5 kb que cobre este gene e clonou-se no local BamHI do plasmídeo pTSl9R. Tomou-se o clone pT4 (ver Fig. 7a) e utilizou-se para a mutagénese dirigida num oligodesoxinucleótido.

b) Após superinfecção com o fago auxiliar, isolou-se o ADN de cadeia simples (cs) de pT4. Incubaram-se 400 ng de ADN de cs, 400 ng de pTZl9RxBamHI desnaturado pelo calor e 1CG ng de oligodesoxinucleótico de mutagénese (ver Fig. 7b) num volume de 10 pl õe Tris-HCl 7 mM a pH 7,5; NaCl 50 mM e HgClg 7 m.. durante 10 minutos a 56°C. Após 10 minutos à temperatura ambiente, iniciou-se a síntese da segunda cadeia e a ligação por adição de foj

pl de polimerase de A/,í de Klenow (2 U) , 1 pl de licase de ADH T4 (4 ϋ), 1 pl de Tal) (tris.HCl 1OC mb, DTT 100 mM), 4 pl

ZOC b.

c ,~C- 1

I f «b f ' ' / “J ^f de mistura de dNTP

Z, 5 m„·,, 1 pl de ATP 10 mk e 2 pl de tkO. 0 volume final foi de 20 pl. Efectuou-se a incubação durante 16 horas a 17°C, trans formando em seguida 2. coli Jí-UOl com a mistura obtida. Seleccionaram-se os mutantes por hibridação de colónia com um oligodesoxinucleótido tratado com quinase específico para o mutante (ver Pig. 7b). Este oligómero de selecção 5¹-GACTATTI CA.GA‘I‘CTTC-3 ‘ era complementar dos codoes de maltase introduzidos e dos nucleótidos adjacentes.

A hibridação foi levada a efeito durante 16 horas em 6 χ N2T (1 χ M2T = NaCl 0,15 M, Tris.HCl 0,015 i-’ a pH 7,5, 3DTA 0,001 K) a 25°C. Sfectuaram-se vagens apos hibridação na mesma mistura e mesma temperatura. (3 vezes 10 minutos), seguidas per uma lavagem em 3 x Ni£T a 2 5°c, Varias coió nias positivas foram analisadas mais profundamente Por digestão com BglII confirmou-se a presença de um local BglII. Além disso isolou-se ADN de cadeia simples a partir de um mutante contendo um local BglII (pT4-k) e submeteu-se a análise de se quência cidesoxi usando um iniciador sintético de 17 bases complementar dos nucleótidos 87 a 103 do gene de 3blP<A (3. bagata, K. Nagashima, Y. Tsunetsuçu-Yokota, K. Fuyimura, ií. Miyaraki e Y. Kaziro (1984) 2M30 J. 3._z 1825) (5'-CAATACCACCACACTTG-3'). A sequência obtida confirma o êxito da introdução das mutações pretendidas.

c) 7, fase seguinte foi o isolamento do promotor 2F1°<A / segmento terminal-NH₂ do gene da rnaltase de p^rJ.4-k e a fusão deste por meio de ligação de extre midades coesivas BglII/Bcll ao resto do gene da rnaltase. bsta fase restaura a região de codifica ção da rnaltase a jusante do promotor SF1°Ca e da

sequência, guia (ver Fig. 7c). 0 plasmídeo pGb-H6g (Λ-9) foi utilizado para a transformação de GH113, uma estirpe dique de E. coli, a fim de ser capas de utilizar o local Scll (que é sensível a metilação) (GH113 : thr , leuBõ, proA2, tris-4, metBl, lacYl, galK2, ara-14, tsx33, thl-1 thyAll, deoBlõ, supE44, rpsLiõG, dam 3). Isolou -se um fragmento BclI/HindIII de 3,8 kb contendo o gene da maltase excepto no que respeita à parte final da extremidade termiaal-iBj. O plasmídeo ΡΤ4-Π foi digerido com BglIl/HindIII e o fragmento de dimensão 4,1 kb foi isolado (promotor BFl^A, /terminal e gene da maltase). Ligaram-se os dois fragmentos entre si, obtendo-se o plasmídeo pGb-EFHT-3. Por análise de sequência verificou-ss a correcção de todas as mutações introduzidas lor fim, digeriu-se o plasmídeo pGb-EFídí-3 com EcoRV e HindIII para purificar um fragmento EFlPíA, /promotor de rnalt ase/gens de 4,8 kpb. A partir do plasmídeo pGb-iA32/G41S (ver Fig. 6) isolou-se um fragmento HindIII (parcial)/ScoRV de aproximàdamsnte 8,3 kb, Este fragmento é constituído pel inha dorsal de pTSISR, o segmento do promotor ce ADHi/permease de maltose/gene e o segraen r*p o to ADH1/G413 . Ligaram-se os dois, dando origem ao plasmídeo pGb-iRRol (ver Fig. 7d).

oGb-H32

Este plasmídeo serve de veículo de -onaçem a fim de integrar pedaços de ADN no gene SIT4 de charomyces cerevisiae. A sua construção compreende seguintes fases (ver Figuras 8 e 9).

Digeriu-se o plasmídeo pl'Hl9 com EcoRI e HindIII a fim de substituir o seu poliadaptador por um se graento de ADR de 40 nucleótidos preparado por via

sintética. Este pedaço d.e ADN é preparado por ligação dos oligonucleótidos sintéticos 3 e 4 (ver lig. 8). Sste curto fragmento contém extremidades coesivas EcoRI e HindlII. por clona gem deste fragmento de ADR no vector pT2l9R não se restauram os locais EcoRI e HindlII. 0 fra£ mento de ADN sintético contém nas suas extremida des locais de restrição para Kotl e Sfil e no meio um local EcoRI, conforme indicado. 0 pias mídeo resultante é designado pGb-SNEHS.

Isolou-se um fragmento EcoRI contendo o gene SIT (cottlin-Ninga e Kaback, side supra) a partir do plasmídeo pLF24 (que também é conhecido pelo código pLU42c) e clonou-se no local EcoRI do plasmídeo pGb-SJíEHS. Obteve-se deste modo o plasmí deo pGb-5pons31. Devido à ausência de locais de restrição para referência úteis desconhece-se a sua orientação.

plasmídeo pGb-Spons31 contém um local BglII único no meio do gene SIT4. Sste local pode ser usado para possível clonagem de qualquer segmento de RDM a ser transferido para o gene SIT4 por substituição de genes. A fim de facilitar a manipulação de clonagem, o gene SIT4 contém um pedaço c!e ADN sintético contendo vários locais de restrição singulares. A construção do plasmídeo pGb-REL está representada na Fig. 9.

plasmídeo de ADN sintético possui duas extremidades BglII coesivas. A sua orientação no plasmídeo pGb-RB2, conforme indica do na Fig. 9, é baseada em análise do plasmídeo pGb-RBN3 por enzimas de restrição (ver em segui da) .

8) pGb-RBN3

Clonou-se no local Smal do plasmídeo pGb-RB2 um fragmento EcoRV/HincII de l_z9 kb contendo o gene G418 sob a regulação do promotor ADHr (ver também a construção do plasmídeo pGb-iA32/G418). Obteve-se deste modo o plasmídeo pGb-RBN3 (Fig. 10).

9) pGb-EBREGl

Sste pl asmxdeo contem o gene de permease de maltose sob a direcção do promotor de deidrogenase I de álcool e o gene da maltase sob a direcção do promotor EP 1«A. Estão ambos localizados num fragmento HindIII de 3,3 kb que foi clonado no gene SIT4, A sua construção encontra-se esquematizada na Fig. 11. Com esta finalidade, digeriu-se o plasmídeo pGb-iRROl com Hind III e ligou-se no plasmídeo pGb-RB2 x HindIII (tratado com fosfatase de intestino de vitela). Deste modo obteve -se pGb-RRRROl.

IC) pGb-RER3G01

Este plasmídeo contém o gene de regulação ;-al sob a direcção do promotor de deidrogenase de álcool.

I. 0 plasmídeo pGb-RBREGOl pode ser construído como se segue. A partir de p21-40 (R. B. Needleman e C. bechels (1983), supra) isolou-se o fragmento sall contendo o gene da proteína de regulação. Este fragmento é clonado .no local Sall do plasmídeo pTZISR,

Este plasmídeo pode ser obtido comercialmente (Pharmacia). A sua orientação é de tal modo que a área do promotor do gene de regulação HAL fica próxima da sequência do promotor 17 do plasmídeo pT£,18R. Usando o iniciador de sequên cis co plasmídeo pISlSR e outros indicadores oligonucleótí

Qicos preparadc tida, é possível sequenciar a área do promotor do gene ce regulação MAL e a parte de codificação NHL·,-terminal do gene. Beste modo localiza-se a posição do codão de início AUG, Quando estão ausentes locais de restrição fiteis na área do promotor próximo do codão de início AUG, é possível introduzir um destes locais (por exemplo BglII nesta área por meio de mutagénese dirigida com um oligonu cleótiõo de acordo com métodos normais (ver também a construção de plasmídeos recombinantes, secção 5b) .

Depois desta mutagénese o fragmen to BglII-Salã (contendo o gene de regulação MAL sem a área do promotor) e um fragmento ScoRV-BanHI (contendo o promotor ADHI, ver também Fig. 7d, pGh-iRROl) podem ser ligados em entre si no plasmídeo pGb-RB2 (ver Fig. 9), de tal moco gue o gene de regulação MAL se situa sob regulação do promotor ADHI. Deste modo obtém-se o plasmídeo pGb-iRBRZGGl. Por análise de sequência usando os métodos de cadeia de didesoxi com oligonucleótidos de ADNcs como molde é possível confirmar facilmente a correcção das fases de clonagem e a orientação do promotor.

Deverá salientar-se que os plasmí deos anteriormente refericos servem apenas de exemplos pa ra ilustrar a presente invenção. Podem ser usados outro promotores (de preferência de Saccharpmyces, ou outras fracções do mesmo promotor), podem ser seleccionados outros locais de integração e podem ser feitas outras combi nações d.e maltase, permease de maltose e regulador MAL (sob a regulação do seu próprio promotor ou sob a regulação de outro promotor, de preferência de Saccharomyces) utilizando um ou vários locais de integração no genoma da levedura. Deste modo é possível obter uma porção óptima entre as actividades de maltase e de permease de maltose presentes durante todo o período da fermentação anaeróbiC cl ·

A transformação de estirpes de levedura foi levada a efeito de acordo com o método de Ito et al. (H. Ito, Y. Fukuda, K. ífurata, A. Kimura (1983),

J. Bacteriology 153, 163-168). 0 processo compreende a cultura de Saccharomyces num meio nutriente de levedura normal até uma densidade de de 1 a 2 5, de preferência de 4 a 10. Sm seguida as células de levedura são separadas, lavadas e submetidas a um tratamento próprio com iões caotrópicos, em especial iões de um metal alcalino, lítio, césio ou rubídio, em especial sob a forma do respectivo cloreto ou sulfato, de modo especialmente preferido os sais de lítio, a concentrações de cerca õe 2 nt·; até 1,0 M, de preferência a cerca de 0,1 M. Após incubação das células durante um período de 5 a 12o minutos, de preferência de cerca de 60 minutos, com o ião caotrópico (ou com os iões caotrópicos) as células são em seguida incubadas com ADN durante um curto período de tem po a uma temperatura moderada, geralmente de cerca de 5 minutos a 60 minutos. â desejável a adição de polietile no-glicol a uma concentração de cerca de 25 a 50 %, poden do todo o meio ser diluido por adiçao de um volume igual de um concentrado de polietileno-glicol de modo a gue resulte a concentração final pretendida. 0 polietileno-glicol utilizado deverá ser de 2000 a 8000 Daltons, de preferência de 4000 a 7000 Daltons. A incubação será ge ralrr.ente por um período de tempo relativamente curto, geralmente de 5 a 60 minutos. É desejável gue o meio de incubação seja submetido a um tratamento pelo calor durante 1 a 10 minutos a uma temperatura de 35°C a 45°c, de preferência a cerca de 42°c. Para a selecção dos transformantes pode ser usado qualquer marcador util, como por exemplo a resistência a fleomicina (D. Genilloud, M. C. Garrido, F. Aoreno (1984) Gene 32, 225), a higromicina B (Gritz et al. (1983) Gene 25, 178) e ao aminoglicosido G418 (Jiminez et al. (1980), Nature, 287, 869).

Quando as células de levedura foram transformadas com plasmídeos integrativos, a integração foi dirigida ao local MAL usando ADN digerido com BglII. Os plasmídeos de integração utilizados contêm dois locais BglII ambos no gene da maltase a uma distância de 1,4 kb um do outro. Ssta circunstância gera quebras na dupla cadeia, as quais são recombínogénicas e estimulam a inter acção com ADN cromossomal homólogo. 0- lapso é reparado a partir de informação do cromossoma durante o processo da integração (I. L. Orr. Qeaver, J. NQ Szostak, R. Roths tein (1981) proc. Natl. Acad. Sei U.S.A. 78, 6854). O processo de integração dá origem a urna cópia ou a um pequeno número de cópias do vector plasmídico (J. N. Szostak, R. Cou (1979) Plasmid 2_, 536). Não foi determinado o número exacto de cópias destes transformantes usadas em experiências de produção de C0₂·

Foi desenvolvido um esquema a fim de obter transformantes de levedura estáveis que não contenham ADN heterólogo. Exemplos de ADN heterólogo são o ADN do vector pTP19R e os genes de selecção que conferem resistência aos antibióticos G418, fleomicina ou higromicina B. 0 procedimento experimental foi, em resumo, o seguinte (Figura 12)

1) Disrupção numa única fase de um gene SIT4 por meio de transformação da levedura, com o plasmideo pGb-RBN3 digerido com Sfil. Os transformantes foram seleccionados por resistência a G418, O resultado foi a estirpe ApGb-RBN3, na qual um ge ne 5IT4 foi substituido por um gene 81T4 interrompido pelo gene G418 sob a regulação do promotor de ADHI.

2) Utiliziu-se a estirpe ApGb-RBN3 como estirpe hospedeira num protocolo de cotransformação com puT332 e com pGb-RBRROl digerido com Sfil. O

plasmídeo pUT332 é um plasmídeo epissomal derivado de 2 yu contendo um gene que confere resi£ tência à fleomicina. A primeira selecção nesta fase de cotransformação foi levada a efeito em placas contendo fleomicina (30 yig/ml) .

Numa certa percentagem destas células de levedu ra fleomicina¹⁷ (da ordem de 0,1 a 1 %) o gene S1T4 interrompido (com pADHI/G418^r) foi substi, tuído pelo fragmento de SIT4 cotransformado con tencio genes de permease de maltose e de rnaltase alterados. Sste segundo processo de substitui, ção de genes teve como resultado uma levedura que é novamente sensível a G418. A fim de seleccionar as células de levedura em que teve lu gar esta segunda substituição de genes, os transformantes rleomicma foram inoculados por réplica em placas contendo G418 (300 ^g/ml) Nas células que não cresceram o gene G418 incluído entre as sequências do gene SIT4 foi substituído pelos genes HAL alterados incluídos entre as sequências do gene SIT4.

JC S ÔX1S

3) Os transformantes fleomicina G418 foram em seguida curados a partir do plasmídeo episso mal pUT332 por cultura em meio não selectivo (isto é, sem fleomicina) durante 10 a 20 gerações. 0 transformante resultante ApGb-pRBRROl é sensível tanto à fleomicina como a G418 e não contém sequências'procarióticas. Todos os pro cessos de integração foram verificados ao nível do ADN por experiências de mancha de Southern (resultados não apresentados).

A estirpe resultante pode ser usa da como hospedeira em transformações subsequentes por meio da utilização de outro local de in tegração e/ou - no caso das estirpes de levedu

ra serem cliplóides ou poliplóides - no outro alelo (ou nos outros alelos) do gene SIT4, a estir pe A é aneuplóide e diplóide para o cromossoma que contém o gene SIT4. Os dois genes SIT4 da estirpe A foram usadas como local visado para a substituição de genes. Este processo acabou por dar origem ao transformante ApGb-p2RBRROl#l. A utilização de ambos os alelos para a integração aumenta também, com grande probabilidade, a estabilidade genética do transformante, uma vez que o segundo processo de integração eliminou o polimor fismo neste local. Estas regiões polimórficas são sensíveis a conversões de genes que podem ter como resultado a perda das sequências integradas. O transformante obtido deste modo foi analisado por meio de técnicas de mancha de Southern, tende -se verificado um padrão de hibridação conforme previsto a partir dos processos de disrupção genica nos dois genes SIT4.

vector construído pGb-RB2, que serviu de plasmideo de partida para os plasmídeos pGb-RBN3 e pGb-RBRROl, possui várias caracteristicas úteis inspiradas nas seguintes considerações;

1. Muitas vezes torna-se necessário integrar um segmento de ADN que é construído por fusão de um promotor de levedura à região de codificação de outro gene (de levedura). As substituições de genes, evidentemente, só são obtidas facilmente se os fragmentos de trans formação possuem de ambos os lados sequências homólogas cia sequência visada no genoma. Por conseguinte, torna-se necessário ligar um segmento de ADN na extremidade 3¹ da região de codificação (vide supra) que é derivada do mesme gene que os promotores escolhidos. A desvantagem deste método reside em que se tornam necessárias muitas manipulações de clonagem uma vez que nem sempre se usa o mesmo promotor. Para além disso, muitas vezes selecciona-se

um promotor forte derivado de um gene que é funcional nos estágios de interesse (durante o crescimento vegetativo, a fermentação anaeróbica, etc.). Após integração do fragmento manipulado uma cópia deste gene torna-se não funcio nal.

Por conseguinte, desejamos dirigir a substituição de genes para um local que não seja expresso durante o crescimento vegetativo. Escolhemos o ge ne SIT4 (sequência de esporulação induzida transcrita sporulation-induced transcribed) cuja expressão se encontra bem estudada por Gottlin - Ninja e Kaback (supra) mas é evidente que são apropriados outros seres SIT ou em geral segmentos não codificantes. quando a construção de ADI? de interesse é clonada neste gene SIT4 as duas metades do gene SIT4- resultantes servem como extremidades homólogas para recombinação.

Poderá argumentar-se que a área do cromossoma na qual o gene se encontra localizado é inac tiva do ponto de vista de transcrição durante o crescimento vegetativo como resultado de um silenciador análogo ad descrito para o local HiíR (A. H. Brand et al. (1985) Cell 11, 41-48). Este ADH silenciador também reprime a transcrição regulada por promotores independentemente do tipo ce emparelhamento dos promotores e pode actuar sobre os promotores a uma distância de 2600 pb. Gottlin - Ninfa e Kaback (supra) mostraram no entanto que o gene HIS3 possui a capacidade para funcionar durante o crescimento vege tativo quando integrado no gene 3114.

2. k fim de facilitar as manipulaçõe de clonagem, o gene SIT4 possui uma fracção sintética de AI>n contendo vários locais de restrição singulares (polia oaptador com locais de clonagem). Além disso, o poliadag tador contém em ambos os lados codões de paragem para a tradução em tocos os quadros de leitura possíveis (ver Figura 9). msta circunstância constitui uma válvula de se41

gurança para fazer parar a tradução de qualquer transcrição híbrida possível que poderia ser sintetizada através da junção. Estas transcrições híbridas poderiam, de outro modo, codificar para uma proteína com efeito desconhecido.

3. A fim de conseguir uma recombinação homóloga, o segmento de ALI: ao ser integrado contém nas duas extremidades locais de restrição para Notl e Sfil cue podem reconhecer ambas as sequências de 8 pb. A frequência de ocorrência destes locais de restrição é muito baixa e portanto é extremamente improvável que um segmento de ADI: a clonar no poliadaptador no gene SIT4 contenha ambos os locais ce reconhecimento. Deste modo, uma vez que um segmento de ADI; tenha sido clonado no gene SIT4 no pias m i d e ο ρ eo—χ B 2, restrição ccm Notl ou com Sfil liberta um fragmento de ADN que se pode recombinar por interacção com sequências homologas no genoma, isto é, no local SIT4.

3e bem que a parte final das extremidades faça parte do local Notl ou Sfil e portanto não seja homóloga, outros estudos mostraram que - aparentemente por digestão limitada por exonucleases na célula - estas sequências são eliminadas (p. ex. H. Rudolph, «J. Koenig-Ranseo e A. Hinnen (1985) Gene 36, 87-95).

4. Para plasmídeo de partida utiliza-se o plasmídeo ρϊ'Α·19 que se pode obter comercialmente. Este vector tem a vantagem de que tem um alto número de cópias s de que possui uma origem de replicação do fago de cadeia simples £1. Esta circunstância torna muito fácil isolar - após infecção com um fago auxiliar - ADN de cadeia. simples e verificar as sequências de ADN através das junções com o auxílio de iniciadores. Este facto facili ra muito a descrição pormenorizada do ADN manipulado.

Deverá notar-se que é possível aplicar estes melhoramentos não apenas a levedura de panifi cação mas também a outras leveduras.

.'edições da produção de CO.

a) em meio de massa cie panificação sintético (Ensaio A)

Incubaram-se células de levedura em meio YHPíCS (1 % de extrato de levedura; 2 % de bactopeptona; 3,7550 de m&ltcse e 1,25 % de sucrose suplementado com zoC ^.g/ml de G418) . Sfectuou-se o crescimento a 30°C até à fase exponencial tardia. Separaram-se as células de levedura de 6 ml da cultura e ressuspenderam-se em 8,8 ml de meio de massa o.e panificação sintético. Composição deste meio (por litro); sacarose 4,õg; maltose 64,37 çj;

e.H.. PO, 2,0/ cí; i:<;goO. .7H..0 _r /--_TT \ λ m í ‘í 4 z z, /6 g; (nH. )„S0, O,o7 g;

4 ácidos casamínicos 2,07 g; ácido cítrico 4,02 g; citrato trissódico 44,25 g; vitamina Bl 9,2 mg; vitamina B6 9,2 mg; ácido nicotínico 46 mg; D(<)-pantotenato de Ca 18,2 mg

Durante 10 minutos deixou-se a suspen o

Diotma o, 2o pg.

são equilibrar num banho de água a 2 8”c com agitação mo derada, ligando-se em seguida os balões contendo a suspensão ce levedura por meio de um tubo a uma bureta de gás. Psta bureta estava ligada a urna solução contendo por litro 20 ml de uma solução indicadora (1 g de vermelho de metilo; C,5 g de azul de metileno; dissolvidos em 1 1 de etanol a Só A), 40 ml de H_oS0. 1 Π e um traco de CuSO.

4 ^J 4 (dissolvido em ENC^). 0 deslocamento do volume desta solução na bureta constitui uma medição da produção de C0₂' a qual foi medida durante 165 minutos.

Sm cada conjunto de valores experimentais a croducão de CCm obtida foi corricida de acorz do com a temperatura ambiente e com a pressão para as condições padrão de 28°c e de 760 mm de Hg, respectivamente,* rara além disso, foi efectuada uma correcção para a quantidade d.e levedura. As leituras colorimétricas da cultura a 6GC nm foram utilizadas como factor de correcção a fim de normalizar a quantidade de levedura por medição

C^! 3 CG.- 43 b) em massa de

panificação (Ensaios Ben')

Determinaram-se as curvas de produção de CC₂ de levedura comprimida cultivada em melaço pela técnica de adições parciais durante a cultura (fed-batch' em massa de panificação a que não foi adicionado açúcar (massa sem açúcar) (Ensaio B) ou com 30 % de açúcar (Ensaio 53'). A massa sem açúcar foi preparada do modo seguinte; 1 g de levedura comprimida (contendo 26,5 de matéria seca), 34 ml de solução de sal A (1,25 g de NaCl dissolvido em 34 ml de água destilada) e 62,5 ç· de farinha foram misturados num aparelho de Hobart duran te 30 segundos è velocidade 1 e 2 minutos è velocidade 2 de modo a obter uma massa de panificação bem desenvolvida .

À massa com 30 % de açúcar continha 2,0/ g de levedura concentrada (de 28,5 % de matéria seca), 34 ml de solução de sal B (0,938 g de NaCl em 34· mi de água destilada), 62,5 g de farinha e 18,75 g de sucrose (isto é, 30 % de açúcar em relação à farinha, mistura foi efectuada como para a' massa sém açúcar.

A massa foi em seguida transferida para um balão de fundo redondo. A medição da produção de pás foi iniciada 7,5 minutos após a mistura ligando os balões contendo a massa por meio de um tubo a uma bureta de gás (ver secção a) e foi realizada durante 165 minutos a 28°C. No caso de o conteúdo de matéria seca da levedu rei concentrada ser diferente do valor anteriormente indicado, utilizou-se esta levedura; no entanto o valor medido do pocsr de produção de CO₀ foi neste caso corrigido por multiplicação do poder de produção de C0_n pela propor ção entre o conteúdo em matéria seca especificado e o vam cada conjunto de experiencias os obtidos foram corrigidos teno lor medido real.

valores da produção de C0.-, z cc em conta a temperatura e a pressão ambientes para 28^C e 760 nm de Hg respectivamente. Em alguns casos foram

efectuados cálculos adicionais nos quais os valores de gás obtidos foram corrigidos para a percentagem de N da levedura cultivada em culturas com adições parciais (fed -batch”) (% de í: é um indicador do teor de proteína). Encontraram-se percentagens de melhoramentos semelhantes em comparação com valores sem esta última correcção.

c) na massa (Ensaio C e C‘)

Determinaram-se as curvas de produ cão de CG^ em levedura seca, como por exemplo em levedura seca instantânea preparada de acordo com os procedimentos conforme descrito nas Patentes n2s. US 3 843 800 e US 4 341 371 em. massa sem adição de açúcar (Ensaio C) ou com 30 % de açúcar (Ensaio C^!). Sstes ensaios foram le vados a efeito de modo idêntico ao descrito para os Ensai os B e B' excepto em que se utilizaram 300 mg de levedura seca (contendo 96 / de matéria seca) e 600 mg de levedura seca (contendo 96 % de matéria seca) nos ensaios C e C‘, respectivamente. Antes do ensaio a levedura foi mistura da com a farinha e incubada durante 10 minutos a 28 c.

A né 1 i ses enz i mé t i c as

A capacidade para transportar maltose por células de levedura foi determinada usando /*u1ZL —

C -maltose a urna concentração de 15 mH como substracto a 30°C. Os pormenores foram publicados por R. Serrano (supra). A maltase (3. C. 3.2.1.20) foi analisada usando p-nitrofenil-^-D-glucopiranosido como subs. tracto em extractos isentos de células, A análise foi levada a efeito de acordo com K. Halvorson e E. L. Elias, Biochim. Biophys. Acta (1958) 30, 28.

Consumo de substracto e formação de produto em meio líquido desaparecimento da maltose e da glucose a partir do meio líquido foi determinado quantitativamente usando técnicas normais de HPiiC. Um litro de meio continha: 100 g de maltose, 10 g de glucose, 3,0 g de (UH₄)S0₄, 4,0 g de MgSO^.7H₂O, 4 g de KH₂P0 , 4 g de ácidos casamínicos (Difco), 4 g de ácido cítrico.H₂0, 45 g de citrato trissódico. 2^0, 10 g de vitamina Bl, mg de vitamina Bô, 40 mg de ácido nicotínico, 20 mg cíeD (t ) -pantotenato de Ca e 0,02 mg de biotina. 0 pH foi ajustado a 5,7.

Aaicionaram-se ml de meio a uma sus'oensão ce levedura (20 mg de peso seco/2,0 ml de água des. tilada). Esta mistura, a que se chamou meio A, foi incubada a 28°C. 0 meio 3 era semelhante ao meio A mas continha 20 vezes rnais glucose. A experiência foi realizada sob condições anaeróbicas.

Determinação cie proteína

A proteína de extractos isentos de células e de células integrais foi determinada pelo método de microbiureto de J. Goa, Scand, J. Chim. hab. Inves (1953) 5_, 218. Para padrão utilizou-se albumina do Ονο.

Conservação da qualidade

Guardou-se levedura comprida em contentores de plástico fechados a 23°C durante 4 dias.

A conservação da qualidade é definida como a percentagem de poder de produção de gás que se conserva após este período .

Preparação de_levedura comprida

Efectuou-se uma cultura de uma estirpe de levedura numa série de fermentadores. As células foram cultivadas em fermentadores de laboratório de

litros de capacidade com um volume líquido de 6 litros. Durante a fermentação o pH e a temperatura foram mantidos nos valores pretendidos por meio de ajuste automático. O procedimento de fermentação usado é baseado nas técnicas descritas por G. Butscheck e R. Kautzmann, Die Hefen, Band

Technologie der Hefen p. 501-591 (1962), Verlag Hans

Cari, Ntirnfoerg, RF& e nas publicadas por G. Reed e H. J. reppler em Yeast Technology, the AVI Publishing Company Inc., Yestport, Connecticut, BUA (1973). As condições de cultura da fermentação final foram em particular :

- os melaços utilizados eram constituídos por 8o % em peso de melaço de beterraba e 20 % em peso de melaço de cana, calculado numa base de 50 % de açúcar.

- a quantidade de. fosfato necessária foi adicionada sob a forma de fosfato monoamónico antes da inoculação.

- a temperatura aumentou de 26°c até 30°C durante a fermentação de acordo com o quadro 1

- o azoto foi fornecido durante a fermentação sob a for ma de uma solução a 10 % de em água de acordo com

O o quadro 1 o pH foi mantido em 5,0 durante as primeiras 8 horas da fermentação e aumentou a partie desse momento de acordo com o !,.uaâro 1 até 6,2 no fim da fermentação.

- antes na inoculação adicionaram-se 12 mg de vitamina Bl por Kg de melaço contendo 50 % de açúcares fermentescíveis.

A levedura obtida por meio desta fermentação foi concentrada e lavada com água da torneira numa centrífuga de pulverizadores. As massas de leveduras foram comprimidas até um conteúdo em matéria seca va47

riancto entre 26 e 32 %, conteúdo da proteína obtida (% de K x 6,25) variou entre 42 e 55 % de peso seco como con sequência de diferentes quantidades de amónia aplicada durante a fermentação.

Quadro 1

Procedimento de ções parciais (	fermentação fed-batch)	usado para o de levedura	produção por adi- de panificação
Kelacos forne Horas após oiros (% da inoculação quantidade to tal adicionada)	pH	T (°C)	Amónia fornecida. (% da quantidade total adicio nada)
< 0	7	5	28.0	0
G- 1	-	5	28.0	0
1- 2	5	5	28.0	θ
2 - 3	6	5	28.5	1
3- 4	8	5	28.5	7
4- 5	s	5	29.0	11
5- 6	8	5	30.0	11
6- 7	10	5	30.0	12
7- 3	10	5	30.0	15
3- 9	10	5.3	30.0	17
9-10	10	5.6	30.0	17
10-11	10	5.9	30.0	10
11-12	8	6.2	30.0	0

Exemplo 1

Produção de CCk em levedura transformada com plasmídeos derivados de 2ji contendo genes derivados do local MAL6

Transformaram-se as estirpes A e C de levedura de panificação comercial com pGb-eMAL6g (permease de maltose e maltase, ver Fig. 1), pGb-eMAL61 (permease de maltose, ver Fig. 2) e pGb-e MAL63 (regulador de MAL, ver Fig. 3). Os genes MAL contêm ainda os seus nromotores originais, A nomenclatura das estirpes de levedura transformadas é a seguinte: ApeG4l8 represen ta a estirpe A transformada com o plasmídeo peG418.

As outras estirpes transformadas foram indicadas de modo análogo. Gs efeitos destes plasmídeos na produção de C0₂ era meio de massa de pão sintético encontram-se resumi dos no urdro 2. A estirpe hospedeira transformada com o iniciador peG418 (ver Fig. 1) serve para referência, uma vez que verificámos que apenas a presença de um plasmídeo multicópia tem um efeito negativo sobre a produção de gás.

Todos os transformantes apresentam melhorias importantes na produção de C0₂ ^em relação à estirpe de comparação. A combinação de cópias extra dos genes de permease de maltose e de maltase dá a melhoria mais elevada, cerca de 40 % na estirpe A e 18 % na estirpe C.

Os transformantes ApGb-eMALõg e CpGb-enALg também foram ensaiados ern massa sem açúcar adi. clonado. beste caso a levedura foi cultivada era melaços pela técnica de adições parciais (£ed-batch).

Também neste caso se obtiveram importantes melhorias na produção de GO,, (Quadro 3).

ucc.ro 2

Produção de gás da estirpe A e da estirpe C transformadas _ 49 _

com plasmídeos AAL derivados de 2yu em relação às estirpes transformadas com vectores. A produção de C0₂‘foi medida em meio sintético de massa de pão (ver procedimentos ex ;rimentais ) e foi corrigida para 285 mg de matéria seca. Os dados apresentados são valores médios de diversas experiencias.

estirpes	100 minutos	165	minutos
APSG418	100		100
rpGb-eAALõg	157		141
ÀpGb-eEALôl	144		123
ApGb-e;.AL63	119		115
OpeGi13	100		100
CpGb-e?AL6g	121		118
CpGb-ei.ALõl	117		114
Ouadro 3
Produção relativa de gá	s em massa das estirpes	À e C tra
formadas com os plasmídeos peG418 e	pGb-ei'AL6g	derivados
de 2p . A produção cie	C02 foi cor	rígida para	285 mg de
meteria seca.

estirpes	60	100	120	165
	minutos	minutos	minutos	minutos
ApeGilS	100	100	100	1G0
ApGb-eAALóg	125	12 5	125	121
CpeGdlo	100	lOO	100	100
CpGb-eAALôg	151	141	138	129

mo lo 2 produção de C0₂ de estirpes de le veduras transformadas com plasmídeos de integração conten c.o genes recombinantes de maltase e/ou de permease de mal tose,

A estirpe de levedura progenitora foi transformada com pGb-iA32/G418 (característica principal: ABEl/permease de maltose; ver Figura 6) e pGb-iHRol (principal característica = ADHl/permease de maltose e EFl°<A/maltase; ver Figura 7).

A estirpe progenitora A e os dois transformantes de integração foram cultivados pela técnica ce adições parciais (^!lf ed-batch) em melaços de modo semelhante so da fermentação aeróbica comercial (ver Quadro 1) . Após colheita das células, a produção de cO₂ é medida num ensaio de massa padrão sem adição de açúcar.

A produção de gás, de acordo com a análise desta experiência, encontra-se resumida no Quadro 4. A integração do plasmídeo pGb-iA32/G418 no cromossoma da estirpe A melhora a produção de gas na massa de modo significativo.

A melhoria relativa varia ligeiramente de acordo com o mo mento ds. medição (ver Quadro 4). guando além dum gene ete permease de maltose alterado se integra um gene de mal tase alterado no cromossoma da estirpe comercial. A usanco o plasmídeo pGb-iRRol, o pouer de produção de gás é ainda mais melhorado. Nesta experiência típica são produzidos cerca de 30 % mais de CO,, após 165 minutos nu<ó.

ma massa de pão sem açúcar adicionado, o que corresponde a um nível de cerca de 410 ml de CO₂/285 mg de peso seco de levedura.

Numa massa de pão com uma dose de açúcar de 30 / não se verificaram diferenças substanciais na produção de CO,, dos transf ormantes em comparação com a estirpe progenitora (cerca de 190 ml de COp/285 mg de

peso seco de levedura)

A melhoria obtida na actividade de levedar é mantida durante o armazenamento a 23°C. A per da de actividade de levedar é virtualmente idêntica para a estirpe A e para as novas estirpes (ver Quadro 5).

uadro 4

Produção relativa de gás da estirpe A e dos seus derivados cie ADNr contendo genes alterados de maltase e/ou de permease de maltose. Os valores da produção de gás foram corrigidos para 285 mg de matéria seca. Não se adicionou açúcar à massa.

Estirpe	60 minutos	100 minutos	120 minutos	165 minutos
‘Λ TA	100	100	100	100
7-pGD*™ IAS z/G4 13	113	115	115	lll
ApGb-iRRol	131	136	138	133

uadro 5

Conservação da qualidade da estirpe A e dos seus derivados de ADNr com genes alterados de maltase e/ou de permea se de maltose, A actividade de levedar foi medida como no auadro 4 após conservação da levedura comprimida a 23° C durante 4 Pias.

Estirpe Conservação da qualidade (>; da actividade de levedar origi nal)

(cont. do quadro 5)

A

ApGb-iA32/G413

AdGb-iRRol

Exemplo 3

Produção de CG_n de uma estirpe de levedura que contém gec'.<

nes recombinantes de maltase e de permease de maltose e não contém ADN heterólogo.

A estirpe progenitora A foi modifi cada geneticamente de tal modo que um gene de pADHl/permes se de maltose e um gene de pEFl°<A/maltase foram introduzi des no gene SRT4 ern ambos os cromossomas homólogos. Es_ te estirpe, abreviadamente ApGb-p2ítBRRCl#l foi construíd usando os métodos e os plasmídeos de acordo com a descrição anterior (ver secções de transformação e de construção do plasmideo de pGb-RBKS (Fig. 10) e pGb-RBRROl (Fig. 11) e o esquema geral de transformação por meio dum gene de substituição. A estime progenitora A e o transformar te homólogo ApGb-p2R3RR01ttl foram cultivados pela técnica de adições parciais (fed-batch) em melaços de modo senelhante ao da fermentação aeróbica comercial (ver Quadre 1) . Após separação das células, a produção de CO^ é medida num ensaio da massa de pão normal sem adição de acúcar.

C Quadro 6 resume os resultados, ba massa oe pão “sem açúcar o melhoramento é de cerca de IS R depois de 165 minutos, o que corresponde a um nível de cerca, de 367 ml de CO₂/285 mg de peso seco de levedura. Esta estirpe contém duas cópias de cada um dos genes de permease de maltase sob a regulação de um promotor ADHI e ce maltase sob a regulação de um promotor SFl^A. No

nuaâro 4 mostra-se que a estirpe ApGb-iRROl tem um melhora mento de cerca de 30 %. Uma estimativa inicial do número de moléculas de pGb-iRROl integradas num local MAL da estirpe A dá um número de cópias de moléculas de plasmideo integradas de pelo menos 3. Aumentando ainda mais o número ce cópias dos genes da permease de maltose e da malta.se alterados na estirpe ApGb-p2EBRRCl+fcL (p. ex. por integração ern outros genes específicos de esporulação), pode obter-se uma estirpe de levedura transformada homólo ça com pelo menos níveis de produção de gás como a estirpe ApGb-iEEGl.

useiro 6

1redução	relativa	de gás da	estirpe A	e do seu	derivado
de 1DÍ*r	homólogo	com genes	alterados	de maltase e de per
mease de	maltose.	Os valores cio gás	foram corrigidos pa
i c 2 o 5 mc	de prod	uto seco.	Não foi	adicionado	qualquer
açúcar à	massa de	padeiro.
Estirpe		60	ICO	12C	165
	minutos	minutos	minutos	minutos
à -		ICO	ICO	ICO	100
ApGb-p2uE	tíicim	124	128	127	118

t'emolo 4

ÀC tivideid.es ensimáticas e velocidades de consumo' do substrato de estirpes de levedura transformadas com plasmídeos de integração contendo genes recombinantes de maltase e/ου cis permease de maltose.

Conforme descrito anteriormente, a ermease de maltose e de maltase está submede maltose e à regressão de glucose. Esapresentado na Pio. 13 para células de tipo expressão de p tica à indução t e fenómsno é selvagem da estirpe, A

As actividades específicas de

permease de maltose e de rnaltase não aumentam até à maior parte da glucose ter sido utilizada.

A actividade da permease de malto se no início do crescimento da massa é aumentado pela introdução de um gene de permease de maltose alterado no ge no ma cia levedura (estirpe ApGb-iA32/G418) como apresenta do na Fig. 14.

Surpreendentemente, as actividades cia rnaltase foram aumentadas também nesta construção (Fig. 15). Ssta estirpe nova ApGb-12A32/G418 fermentou a maltose mais rapidamente do que a estirpe progenitora A em meio A, o qual contém maltose como principal fonte de carbono e de energia (Fig. 16). Ilo meio B contendo glucose como principal fonte de carbono e de energia este efeito é menos pronunciado (Fig. 17).

Além dum gene de permease de maltose alterado, integrou-se um gene de rnaltase alterado na estirpe cue dá cromossomas ApGb-iARol. Esta estirpe fer montou a maltose a uma velocidade ainda mais alta no meio A (Fig. 16) e também no meio B (Fig. 17). Apesar da con contração extracelular extremamente alta de glucose quantidades consideráveis da maltose foram metabolizados por esta nova estirpe. A estirpe ApGb-iREol apresentou actividades específicas mais altas de rnaltase e de permease de maltose durante o crescimento da massa do que a estirpe A progenitora e a estirpe ApGb-iA32/G418 (Fig. 14 e 15) .

Claims (1)

1. - 1§ processo para a preparação de uma levedura transformada útil para proporcionar uma taxa melhorada de fermentação de açúcar em comparação com a levedura progenitora não transformada caracterizado por comprsender a integração na referida levedura por transformação de pelo menos uma construção de ADN, de preferência de ADN homólogo, contendo a referida construção de ADM pelo menos um gene com expressão na referida levedura que codifica para uma proteína que promove o consumo e/ou conversão metabólica inicial em um substrato constituído por um açúcar transportado, tendo o referido gene a capacidade de expressão na referida levedura, compreendendo a integração referida a transformação mediada por ADM ou outros métodos de melhoria de estirpes,

   - 2s _

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida construção conter pelo menos um gene que codifica para uma enzima com activi oade de permease de maltose, actividade de maltase ou acti vidade de. proteína reguladora de maltose, ou qualquer combinação destas.

   Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por os genes referidos ou as suas combinações serem submetidas a uma regulação do transcrição que não é sensível à repressão por glucose e/ou que n~o sofre indução por maltose.

   processo de acordo com a reivindi. cação 2, caracterizado por a construção de ADN referida conter pelo menos dois dos genes referidos.

   _ 5 a _

   Processo de acordo com a reivindi cação 2, caracterizado por o referido gene estar sob regu lação de transcrição de deidrogenase I de álcool (alcoho dehydrogenase 1” = ADHI) e/ou do promotor do factor de elongação da tradução (SFIPÍA) .

   - 6 a Processo de acordo com a reivindi. cação 5, caracterizado por os referidos promotores serem derivados de uma levedura pertencente ao género Saccharomyces, de preferência de Saccharomyces cerevisiae.

   _ 7â Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado por a referida construção oe ADN ser uma porção de um elemento epissomal.

   - 82 Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por a referi da construção de ADN ser integrada num cromossoma da referida. levedura.

   - 9ã Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por se integrarem pelo menos duas das referidas construções de ADN.

   - los Processo de acordo com qualquer cas reivindicações anteriores, caracterizado por a levedu ra obtida ser isenta de ADN heterólogo e o processo referido compreender uma fase de integração de genes no cromos soma por meio de técnicas se substituição de genes.

   - lis Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por se substituir um gene específico de esporulação cromossomal por um segmento de ADN cue contém o mesmo gene específico de esporulação idêntico no qual foram inseridos genes como os definictos nas reivindicações 1 ou 8.

   - 12 § processo para a preparação de uma levedura transformada com capacidade de melhorar a taxa dc fermentação de maltose em etanol e em dióxido de carbono caracterizado por compreender a integração na referida le vedura de uma construção de ADN substancialmente isenta õe ADN procariótico, contendo a referida construção de ADN pelo menos um dos seguintes genes: um gene que codifi ca para uma. enzima com actividade de maltase, com actividade de permease de maltose ou com actividade de uma proteína ds regulação de maltose.

   - 13 s Processo de acordo com a reivindi. cação 12, caracterizado por a maltase ser submetida a re58 tor do factor de elongação de tradução (EF1<XA).

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 12 ou 13, caracterizado por a perrnease de maltose ser submetida a regulação da expressão do gene por transcrição de um promotor de deidrogenase 0 de álcool (2.DHI) .

   - 15§ Processo de acordo com qualquer das reivindicações 12 a 14, caracterizado por os referidos promotores serem derivados de uma levedura pertencentes ao genero Saccharomyces.

   - 16a processo para a preparação de uma levedura com um grau de humidade de 3 a 8 % caracterizado por compreender uma fase de secagem de uma levedura obtida de acordo com o processo de qualquer das reivindicações 1

   - 17§ processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a referida levedura pertencer ao género 8accharomy ces e ser de preferência Saccharomyces cerevisiae.

   - 18â processo para a preparação de uma levedura caracterizado por se submeter a procedimentos de melhoramento de estirpes, exceptuando a transformação medi.

   sela por ADr, uma levedura obtida de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 17.

   - 19 ã Processo de acordo com qualquer des reivindicações anteriores caracterizado por a estirpe obtida ser escolhida de entre o grupo constituído por Saccharotnyces cerevisiae. estirpe ApGfc-iA32/G418,

   Saccharomyces cerevisiae estirpe ApGb-iRRol,

   Saccharomyces cerevisiae estirpe ApGb-ebALõg,

   Saccharomyces cerevisiae estirpe ApGb-eHAL61,

   Saccharomyces cerevisiae estirpe ApGb-eI-iAL63,

   Saccharomyces cerevisiae estirpe CpGfo-eííALõg e

   Saccharomyces cerevisiae estirpe Ap Gb- eHAL61.

   Saccharomyces cerevisiae estirpe ApGb-p2RBRRO1U1.

   - 2Qâ Processo para a preparação de uma levedura comprimida seca instantânea ou seca activa carac terizado por se utilizar para a sua preparação uma levedu ra obtida de acordo com o processo de qualquer das reivin dicações 1 a 19.

   - 2lã Processo para a preparaçao de uma levedura comprimida caracterizado por se utilizar para a sua pre--ar ação uma levedura obtida de acordo com a reivin dicação 1, apresentando a referida levedura comprimida ob tida uma produção de gás de pelo menos 340 ml/285 mg de oeso seco de levedura em 165 minutos no ensaio B e uma

   produção de gás em de levedura pre ferência uma de peso seco de produção de J. J gás

   produção de gás de 380 a 450 ml/285 mg levedura em 165 minutos no ensaio B' e de um modo especialmente preferido uma produção de gás de pelo menos 400 ml/285 mg de peso seco de levedura em 165 minutos no ensaio E e uma produção de gás de pelo menos 190ml/285 mg de peso seco de levedura em 165 minutos no ensaio B*.

   Processo para a preparação de uma levedura comprimida caracterizado por se utilizar para a sua aracão uma levedura obtida de acordo com a reivin dicação 1, apresentando a referida levedura comprimida obtida uma produção de gás de 400 a 500 ml/285 mg de peso seco de levedura em 165 minutos no ensaio B e de preferên cia uma produção de gás de pelo menos 440 ml/285 mg de pe so de levedura em 165 minutos no ensaio B.

   Processo para a preparação de uma levedura seca instantânea ou de uma levedura seca activa caracterizado por se secar uma levedura obtida de acordo com o processo de qualquer das reivindicações 21 ou 22,

   - 24§Processo para a preparação de uma levedura seca caracterizado por se utilizar para a sua preparação uma levedura obtida de acordo com a reivindica ção 1, apresentando a referida levedura seca obtida uma produção de gás de 310 a 36o ml/285 mg de peso seco de le vedura em 165 minutos no ensaio C e uma produção de gás de 145 a 195 ml/285 mg de peso seco de levedura em 165 mi nutos no ensaio C‘, apresentando de preferência uma produção de gás de pelo menos 330 ml/285 mg de peso seco da levedura em 165 minutos no ensaio C e uma produção de gás de pelo menos 155 ml/285 mg de peso seco de levedura em 155 minutos no ensaio C ou que apresenta uma produção de gás de 320 a 400 ml/285 mg de peso seco de levedura em 165 minutos no ensaio C, de preferência uma produção de gás de pelo menos 350 ml/285 mg de peso seco de levedura em 165 minutos no ensaio C,

   - 25ã processo para a preparação de um vector capaz de se auto-replicar em leveduras e que contém os genes que codificam para permease de maltose e para mal tase designado por pGb-eMALôg caracterizado por a digerir o plasmídeo peG418 com HindlII e se ligar o plasmídeo pY6 digerido com HindlII e Pvul.

   — 2 6 s Processo para a preparação de um vector gue contém o gene que codifica para a permease de maltose designado por pGb-eMAL61 caracterizado por supressão de um fragmento BglII de 1,4 kb do plasmídeo pGb-eHALôg por digestão com BglII seguida de ligação intramolecular.

   - 27§ Processo para a preparação de um vector que contém ADH que cobre a função MALp designado por pG?j-eHAL63 caracterizado por isolamento do fragmento Kpnl-dall do plasmídeo p21-4O, alinhamento das extremidades e clonagem no local HindlII do plasmídeo peG413,

   - 28s Processo para a preparação de um plasmíceo d.e integração em levedura que contém o gene de permease de maltose ligado no promotor da deidrogenase I de álcool e parte da sua sequência guia 5' designado por pGb-iA32/G418 caracterizado por isolamento'do fragmento

   EcoRV-HincIl de 7C0 pb do plasmídeo pT219R/ADHI, ligação em pGb-Kõg digerido com EcoRV e clonagem no local Smal do plasmídeo resultante do fragmento EcoRV/HincXX obtido por dupla, digestão do plasmídeo 153-215 AK.

   - 29 s processo para a preparação de um plasmídeo de integração que contém o gene da permease de maltose sob a direcção do promotor da deidrogenase I de álcool e o gene de maltase sob a. direcção do promotor do factor de elongação da tradução EF1°<A. designado por pGb-iREol caracterizado por isolamento do fragmento BglII de 2,5 kb e clonagem no local BamHI de ρϊ£19Ε, superinfecção com fago auxiliar, isolamento de ADR de cadeia simples, mu tagénese da região de codificação de SF1°<Ã e ligação via BglII/3clI do promotor e da sequência guia de EFlofA.

   - 30§ Processo para a preparação de um plasmídeo mutante de supressão do promotor na região inter genica dos genes divergentes de permease de maltose e da maltase designado por pGb-K6g(Δ-9) caracterizado por clonagem do fragmento HindUI de aproximadamente 7,0 kb no local HindUI de pT219R, linearização com StuI, incubação com Bal31, ligação de adaptadores sintéticos contendo vários locais de restrição e incubação com Klul.

   - 313 Processo para a preparação de um plasmídeo gue contém o gene da permease de maltose sob direcção do promotor da deidrogenase I de álcool e o gene da. maltase sob a direcção do promotor de EF1°<A designado por pGb-RBRROl caracterizado por digestão de pGb-iRROl com HindUI e ligação em pGb-R32 3: KindIII (tratado com fosfatase de intestino de vitela).

   Processo para a preparação de um plasmídeo designado por pGb-RBN3 caracterizado por clonagem no local Srnal de pGb-RB2 de um fragmento ScoRV/HincII cie 1,9 kb contendo o gene G418 sob a regulação do p r o mo t o r de ÃDH1.

   - 33ã Processo para a preparação de um plasmídeo contendo o gene do regulador MAL sob a direcção do promotor de dehidrogenase de álcool designado por pGb-RBRLGC-l caracterizado por isolamento do fragmento Sall ce pll-40, clonagem deste fragmento no local Sall de ρϊΖ13R e ligação do fragmento BglLL-SalX e do fragmento LcoV-_:.anbl em conjunto em pGb-RB2.

   - 34ã processo para a preparação de uma massa para pão ou para bolos caracterizado por se incorpo rar uma levedura preparada de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 24.

   - 35§ Processo para a preparação de produtos de farinha levedados ou de bebidas alcoólicas ou de outros produtos alcoólicos caracterizado por compreender a incorporação de uma levedura preparada de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 24.

   - 36^ Processo para a produção de pão ou de outros produtos relacionados caracterizado por compreender a incorporação de uma levedura preparada de acor do com qualquer das reivindicações 1 a 24.

   - 37ã processo para a preparação de uma enrima com actividade de maltase ou de permease de maltose caracterizado por compreender a incorporação de uma levedura preparada de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 24.