CN117813388A - 用于生产乳酸盐的遗传修饰的酵母和发酵工艺 - Google Patents

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Abstract

本文公开了能够从蔗糖生产乳酸盐的遗传工程化酵母细胞。该遗传工程化酵母细胞包含编码外源乳酸脱氢酶的多核苷酸；编码外源转化酶的多核苷酸；天然丙酮酸脱羧酶(PDC)基因的缺失或破坏；和导致天然己糖激酶基因过表达的遗传修饰。

Description

用于生产乳酸盐的遗传修饰的酵母和发酵工艺
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年8月18日提交的美国临时申请号63/234,577的优先权，该美国临时申请以全文引用方式并入本文中。
对经由专利中心提交的序列表的参考
在2022年8月1日创建并且经由专利中心与本申请一起电子提交的大小为133kb的名称为“PT-1098-WO-PCR.xml”的序列表的序列表XML文件的内容以全文引用方式并入本文中。
背景技术
商业上大规模使用发酵工艺来生产有机分子，诸如乙醇、柠檬酸和乳酸。在那些工艺中，将碳水化合物喂予到能够将其代谢为期望发酵产物的生物体。同时选择碳水化合物和生物体，使得生物体能够有效地消化碳水化合物来以良好产率形成所期望的产物。在这些工艺中使用遗传工程化生物体变得更加常见，以便优化产率和工艺变量，或使特定碳水化合物能够被代谢。
蔗糖是用于这种商业发酵工艺的可能的碳水化合物进料。然而，许多生物体不能代谢蔗糖和/或不能代谢蔗糖的果糖组分。
发明内容
本公开提供了能够从蔗糖生产乳酸盐的遗传工程化酵母细胞，该工程化酵母细胞包含编码外源乳酸脱氢酶的多核苷酸；编码外源转化酶的多核苷酸；天然丙酮酸脱羧酶(PDC)基因的缺失或破坏；和导致天然己糖激酶基因过表达的遗传修饰。工程化酵母细胞中的己糖激酶活性可以高于缺乏遗传修饰的等同酵母细胞中的己糖激酶活性。当在蔗糖的存在下用于发酵工艺中时，工程化酵母细胞中的峰值乳酸盐生产速率可以高于缺乏遗传修饰的等同酵母细胞的峰值乳酸盐生产速率。遗传修饰可包括用组成型异源或人工启动子置换天然己糖激酶基因启动子。组成型异源或人工启动子可选自由丙酮酸脱羧酶(PDC1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH3)、烯醇化酶(ENO1)和3-磷酸甘油酸激酶(PGK1)组成的组。遗传修饰可包括添加编码天然己糖激酶的外源多核苷酸，使得遗传工程化酵母细胞包含编码天然己糖激酶的序列的至少一个额外拷贝。天然己糖激酶包含与SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25中的至少一者至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一的序列。工程化酵母细胞可包括甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)基因的缺失或破坏。工程化酵母细胞可包括L-乳酸盐：细胞色素c氧化还原酶(CYB2)基因的缺失或破坏。酵母细胞另外包含编码果糖激酶的外源多核苷酸。果糖激酶可包含与SEQ ID NO:26至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一的序列。编码果糖激酶的外源多核苷酸可以与异源或人工启动子可操作地连接。异源或人工启动子可选自由丙酮酸脱羧酶(PDC1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH3)、翻译延伸因子(TEF)、转醛醇酶(TAL)、RPL16B、3-磷酸甘油酸激酶(PGK1)和烯醇化酶(ENO1)组成的组。
乳酸脱氢酶可包含与SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31中的至少一者至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一的序列。编码乳酸脱氢酶的外源多核苷酸可以与异源或人工启动子可操作地连接。异源或人工启动子可选自由丙酮酸脱羧酶(PDC1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH3)、翻译延伸因子(TEF)、转醛醇酶、RPL16B、3-磷酸甘油酸激酶(PGK1)和烯醇化酶(ENO1)组成的组。
外源转化酶可包含与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35中的至少一者至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一的序列。编码外源转化酶的多核苷酸可以与异源或人工启动子可操作地连接。启动子可选自由丙酮酸脱羧酶(PDC1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH3)、翻译延伸因子(TEF)、转醛醇酶(TAL)、RPL16B、3-磷酸甘油酸激酶(PGK1)和烯醇化酶(ENO1)组成的组。
酵母细胞可以是克拉布特里(Crabtree)阴性的。酵母细胞可以是东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)/发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)进化枝的酵母。酵母细胞可以是东方伊萨酵母细胞。酵母细胞可以是东方伊萨酵母细胞，并且天然的、过表达的己糖激酶包含与SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25中的至少一者至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一的序列。
本公开还提供了能够从蔗糖生产乳酸盐的遗传工程化东方伊萨酵母细胞，该工程化酵母细胞包含编码外源乳酸脱氢酶的多核苷酸；编码外源转化酶的多核苷酸；天然丙酮酸脱羧酶(PDC)基因的缺失或破坏；和导致天然己糖激酶基因过表达的遗传修饰，其中工程化东方伊萨酵母细胞能够以至少30g/L、至少80g/L、至少100g/L或至少120g/L的滴度生产乳酸盐。
本公开还提供一种用于从蔗糖生产乳酸盐的方法，该方法包括使包含蔗糖的底物与如本文所述的工程化酵母细胞接触，其中由工程化酵母对底物的发酵来生产乳酸盐。本公开提供了一种从蔗糖生产乳酸盐的方法，该方法包括使包含蔗糖的底物与工程化酵母细胞接触，该工程化酵母细胞包含编码外源乳酸脱氢酶的多核苷酸；编码外源转化酶的多核苷酸；天然丙酮酸脱羧酶(PDC)基因的缺失或破坏；和导致天然己糖激酶基因过表达的遗传修饰，其中由工程化酵母对底物的发酵来生产乳酸盐。体积氧摄取速率(OUR)可以是0.5mmol O2/(L·h)至40mmol O2/(L·h)、1mmol O2/(L·h)至30mmol O2/(L·h)、3mmol O2/(L·h)至25mmol O2/(L·h)、5mmol O2/(L·h)至20mmol O2/(L·h)或10mmol O2/(L·h)至18mmol O2/(L·h)。体积OUR可以是10mmol O2/(L·h)至20mmol O2/(L·h)、10mmol O2/(L·h)至14mmol O2/(L·h)或15mmol O2/(L·h)至18mmol O2/(L·h)。峰值乳酸盐生产速率可以是至少5g L-1h-1、至少6g L-1h-1、至少7g L-1h-1或至少8g L-1h-1。乳酸盐可以以至少1.5g L-1h-1、至少2.0g L-1h-1、至少2.5g L-1h-1、至少3.0g L-1h-1或至少3.5g L-1h-1的速率生产。发酵温度可以在20℃至45℃、25℃至40℃、或30℃至38℃的范围内。乳酸盐滴度可以是至少30g/L、至少80g/L、至少100g/L或至少120g/L。
附图说明
本专利或申请含有至少一张彩色绘制的附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。
附图大体上以举例的方式而非限制的方式示出本文所述的各个方面。
图1显示了如实施例2中概述的在菌株1.3和菌株1.5a的发酵期间乳酸盐的生产。
图2显示了如实施例2中概述的在菌株1.3和菌株1.5a的发酵期间葡萄糖和果糖的消耗以及乳酸盐的生产。
图3显示了如实施例2中概述的在菌株1.3和菌株1.5a的发酵期间乳酸盐生产的平均体积速率。
图4显示了如实施例2中概述的在菌株1.3和菌株1.5a的发酵期间乳酸盐生产的瞬时体积速率。
图5显示了如实施例2中概述的在菌株1.3和菌株1.5a的发酵期间乳酸盐生产的平均体积速率和瞬时体积速率。
图6显示了如实施例3中概述的在菌株1.3和菌株1.5a的发酵期间乳酸盐的生产。
图7显示了如实施例3中概述的在菌株1.3和菌株1.5a的发酵期间葡萄糖和果糖的消耗以及乳酸盐的生产。
图8显示了如实施例3中概述的在菌株1.3和菌株1.5a的发酵期间的平均体积乳酸盐生产速率和瞬时体积乳酸盐生产速率。
图9显示了如实施例4中概述的在菌株1.3、菌株1.6、菌株1.8a、菌株1.8b和菌株1.8c的发酵期间的右旋糖消耗和乳酸盐生产。
图10显示了如实施例4中概述的在菌株1.3、菌株1.6、菌株1.8a、菌株1.8b和菌株1.8c的发酵期间的右旋糖、果糖和蔗糖消耗。
图11显示了如实施例4中概述的在菌株1.3、菌株1.6、菌株1.8a、菌株1.8b和菌株1.8c的发酵期间的乳酸盐生产。
图12显示了如实施例4中概述的在菌株1.3、菌株1.7、菌株1.9a、菌株1.9b和菌株1.9c的发酵期间的右旋糖消耗和乳酸盐生产。
图13显示了如实施例4中概述的在菌株1.3、菌株1.7、菌株1.9a、菌株1.9b和菌株1.9c的发酵期间的蔗糖、右旋糖和果糖消耗。
图14显示了如实施例4中概述的在菌株1.3、菌株1.7、菌株1.9a、菌株1.9b和菌株1.9c的发酵期间的乳酸盐生产。
图15显示了如实施例4中概述的在菌株1.3、菌株1.10a、菌株1.10b和菌株1.10c的发酵期间的右旋糖消耗和乳酸盐生产。
图16显示了如实施例4中概述的在菌株1.3、菌株1.10a、菌株1.10b和菌株1.10c的发酵期间的蔗糖、右旋糖和果糖消耗。
图17显示了如实施例4中概述的在菌株1.3、菌株1.10a、菌株1.10b和菌株1.10c的发酵期间的乳酸盐生产。
图18显示了如实施例4中概述的在菌株1.3、菌株1.11a、菌株1.11b、菌株1.11c、菌株1.11d、菌株1.11e和菌株1.11f的发酵期间的右旋糖消耗和乳酸盐生产。
图19显示了如实施例4中概述的在菌株1.3、菌株1.11a、菌株1.11b、菌株1.11c、菌株1.11d、菌株1.11e和菌株1.11f的发酵期间的蔗糖、右旋糖和果糖消耗。
图20显示了如实施例4中概述的在菌株1.3、菌株1.11a、菌株1.11b、菌株1.11c、菌株1.11d、菌株1.11e和菌株1.11f的发酵期间的乳酸盐生产。
具体实施方式
现在将具体地参考本发明所公开的主题的某些方面，其示例在附图中部分地示出。虽然将结合所列举的权利要求来描述所公开的主题，但是应当理解，例示的主题并不旨在将权利要求限于所公开的主题。
在本文件中，除非上下文另有明确规定，否则术语“一个”、“一种”或“该”用于包括一个或多于一个。除非另外指出，否则术语“或”用于指非排他性的“或”。本文件中所引用的所有出版物、专利和专利文件都以引用的方式全文并入本文，就像以引用的方式单独并入一样。如果本文件与以引用的方式这样并入的那些文件之间用法不一致时，应将并入的参考文献中的用法视为对本文件的用法的补充；对于不可调和的不一致之处，以本文件中的用法为准。
以范围格式表示的值应以灵活的方式解释为不仅包括明确列举为该范围限值的数值，而且包括该范围内所涵盖的所有单个数值或子范围，如同明确列举了每个数值和子范围一样。例如，“约0.1％至约5％”或“约0.1％至5％”的范围应解释为不仅仅包括约0.1％至约5％，而且包括指定范围内的单个值(例如，1％、2％、3％和4％)和子范围(例如，0.1％至0.5％，1.1％至2.2％，3.3％至4.4％)。除非另外指出，否则陈述“约X至Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。同样，除非另外指出，否则陈述“约X、Y或约Z”具有与“约X、约Y或约Z”相同的含义。
除非明确指明，否则ppm(份每一百万份)、百分比和比率是基于重量计的。基于重量的百分比在下文也称为重量％或(重量)％。
本公开涉及经工程化以生产具有改善的蔗糖消耗、特别是改善的果糖消耗的乳酸盐的各种重组细胞。一般而言，本文所述的重组细胞具有天然丙酮酸脱羧酶基因的缺失或破坏，并表达外源乳酸脱氢酶，并且其特征在于以下中的至少一者：外源转化酶的表达、外源果糖转运蛋白的表达、外源己糖激酶基因的表达和导致天然己糖激酶基因过表达的遗传修饰。本公开还提供使用本文所述的遗传工程化细胞从蔗糖生产乳酸盐的发酵方法。
如本文所用，“乳酸盐”是指乳酸的盐(2-羟基丙酸盐)和酸形式(2-羟基丙酸)。乳酸盐测量为游离乳酸和任何乳酸盐(不包括可归因于存在的辅助盐形式的任何阳离子部分的部分)之和。换句话说，“乳酸盐生产速率”、“乳酸盐产率”、“乳酸盐滴度”等分别指游离乳酸和任何乳酸盐之和的速率、产率、滴度。
一般而言，本文所述的重组细胞是酵母细胞。合适的酵母细胞可包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、东方伊萨酵母、盔状毕赤酵母(Pichiagaleiformis)、毕赤酵母种YB-4149(NRRL命名)、嗜酒假丝酵母(Candida ethanolica)、沙漠毕赤酵母(Pichia deserticola)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranifadens)或发酵毕赤酵母。普通技术人员将理解，选择合适的酵母细胞和本公开的重组酵母细胞的要求不限于本文明确列举的那些。
重组酵母细胞可以是克拉布特里阴性酵母细胞。如本文所用，“克拉布特里阴性”是指由于当在高比生长速率(长期效应)下或在高浓度葡萄糖存在下(短期效应)培养时，由于抑制呼吸酶的合成而抑制微生物的氧消耗，在需氧条件下不表现出发酵代谢的克拉布特里效应的酵母细胞。克拉布特里阴性酵母细胞不会表现出这种效应，因此即使在高浓度葡萄糖存在下或在高生长速率下也能够消耗氧。用于确定生物体是克拉布特里阴性还是克拉布特里阳性的方法在本领域中是已知的并且有所描述(例如，参见De Deken R.H.(1965)《普通微生物学杂志》(J.Gen.Microbiol.，44:149-156)。
重组细胞可以是东方伊萨酵母/发酵毕赤酵母进化枝内的物种的酵母细胞。该进化枝是最末端的进化枝，其至少含有物种东方伊萨酵母、盔状毕赤酵母、毕赤酵母种YB-4149(NRRL命名)、乙醇假丝酵母、沙漠毕赤酵母、膜醭毕赤酵母和发酵毕赤酵母。东方伊萨酵母/发酵毕赤酵母进化枝内的物种的鉴定和表征在本领域中是已知的并且有所描述。例如，参见Kurtzman等人(“来自核大亚基(26S)核糖体DNA部分序列分析的子囊菌酵母的鉴定和系统发育(Identification and phylogeny of Ascomycetous yeasts from analysisof nuclear large subunit(26S)ribosomal DNA partial sequences)”，Antonie vanLeeuwanhoek，73:331-371，1998)和WO2007032792A2，该文献各自以引用方式并入本文。对来自数百个子囊菌的26S核糖体DNA的可变D1/D2结构域的分析已显示东方伊萨酵母/发酵毕赤酵母进化枝含有非常密切相关的物种。东方伊萨酵母/发酵毕赤酵母进化枝的成员在26S核糖体DNA的可变D1/D2结构域与该进化枝的其他成员的相似性比与该进化枝之外的酵母物种的相似性更大。因此，东方伊萨酵母/发酵毕赤酵母进化枝的其他成员可使用Kurtzman和Robnett的方法(参见Kurtzman和Fell，《酵母，一项分类学研究》(The Yeasts，aTaxonomy Study)，第35部分，Issatchenkia Kudryavtsev，第222页至第223页(1998)，该文献以引用方式并入本文中)，通过比较它们各自核糖体DNA的D1/D2结构域并与该进化枝的其他成员和该进化枝外的密切相关的物种的D1/D2结构域来鉴定。重组细胞可以是重组东方伊萨酵母、盔状毕赤酵母、毕赤酵母种YB-4149(NRRL命名)、乙醇假丝酵母、沙漠毕赤酵母、膜醭毕赤酵母或发酵毕赤酵母细胞。
当首次表征时，物种东方伊萨酵母被分配名称库德里阿兹威毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)。东方伊萨酵母的无性型(无性形式)已知为克鲁斯假丝酵母(Candidakrusei)。合适的东方伊萨酵母菌株可以包括但不限于东方伊萨酵母菌株ATCC 32196和东方伊萨酵母菌株ATCC PTA-6658。
本文所述的重组细胞包括编码一种或多种外源多肽的一种或多种外源多核苷酸序列，该外源多肽在表达时改善重组细胞将蔗糖发酵成乳酸盐。重组细胞另选地或另外地包括一种或多种增加天然多肽表达的遗传修饰，其中该表达的增加改善重组细胞将蔗糖发酵成乳酸盐。
如本文所用，“外源”是指源自宿主生物体外部的遗传物质或其表达产物。例如，外源遗传物质或其表达产物可以是宿主生物体天然的遗传物质的修饰形式，它可以衍生自另一种生物体，它可以是衍生自另一种生物体的组分的修饰形式，或者它可以是合成衍生的组分。例如，当引入东方伊萨酵母中时，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)转化酶基因是外源的。
如本文所用，“天然”是指除了不影响功能或表达的个体间突变外，在宿主细胞的野生型细胞的基因组内发现的遗传物质或其表达产物。
如本文所用，术语“多肽”和“肽”可互换使用，是指给予所述大分子其功能和性质所必需的总的一级、二级、三级和四级氨基酸序列和结构。如本文所用，“酶”或“生物合成途径酶”是指催化化学反应的蛋白质。任何特定酶(独立地或作为生物合成途径的一部分)的叙述应理解为包括酶适当发挥功能所必需的辅因子、辅酶和金属。如本领域所理解的氨基酸和它们的三个字母和一个字母符号的概述提供于表1中。氨基酸名称、三个字母符号和一个字母符号在本文中可互换使用。
表1：氨基酸三个字母和一个字母符号
与本文所述的多肽具有基本同一性或同源性的变体或序列可用于实施所公开的色素、组合物和方法。此类序列可称为变体或修饰的序列。即，多肽序列可被修饰但仍保留表现出期望的活性的能力。通常，变体或修饰的序列可包括与野生型、天然存在的多肽序列或与如本文所述的变体多肽的为或大于约45％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的序列同一性。
如本文所用，短语“序列同一性％”、“同一性％”和“百分比同一性”可互换使用，并且是指使用标准化算法比对的至少两个氨基酸序列或至少两个核酸序列之间的残基匹配的百分比。氨基酸和核酸序列比对的方法是众所周知的。序列比对和序列同一性的生成包括使用计算方法进行的全局比对和局部比对。可以使用具有默认参数的BLAST(国家生物信息中心(NCBI)基于局部比对的搜索工具)版本2.2.31进行比对。可以使用具有以下默认参数的标准蛋白质BLAST来确定氨基酸序列之间的氨基酸序列同一性％：最大靶序列：100；短查询：自动调整短输入序列的参数；期望阈值：10；字长：6；查询范围内的最大匹配数：0；矩阵：BLOSUM62；空位罚分：(存在：11，扩展：1)；成分调整：条件成分得分矩阵调整；过滤器：未选择；遮罩：未选择。可以使用具有以下默认参数的标准核苷酸BLAST来确定核酸序列之间的核酸序列同一性％：最大靶序列：100；短查询：自动调整短输入序列的参数；期望阈值：10；字长：28；查询范围内的最大匹配数：0；匹配/失配得分：1、-2；空位罚分：线性；过滤器：低复杂度区域；遮罩：仅用于查找表的遮罩。使用具有默认参数的NCBI BLAST版本2.2.31算法相对于参考序列具有XX％(例如，80％)的同一性得分的序列被视为至少XX％相同，或者等效地与参考序列具有XX％的序列同一性。
多肽或多核苷酸序列同一性可以在整个定义的多肽序列(例如，如特定SEQ ID号所定义的)的长度上测量，或者可以在较短的长度上测量，例如，在取自较大的定义的多肽序列的片段(例如，至少15个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少70个或至少150个连续残基的片段)的长度上测量。此类长度仅是示例性的，并且应理解，本文、表、图或序列表中所示序列支持的任何片段长度可用于描述可测量百分比同一性的长度。
本文公开的多肽可包括“变体”多肽、“突变体”和“其衍生物”。如本文所用，术语“野生型”是本领域技术人员所理解的术语，并且意指多肽在自然界中的典型形式，区别于变体或突变形式。如本文所用，“变体”、“突变体”或“衍生物”是指具有与参考蛋白质或多肽分子不同的氨基酸序列的多肽分子。变体或突变体相对于参考分子可具有一个或多个氨基酸残基的插入、缺失或取代。
本文考虑的多肽变体、突变体、衍生物或片段的氨基酸序列可包括相对于参考氨基酸序列的保守氨基酸取代。例如，变体、突变体、衍生物或片段多肽可包括相对于参考分子的保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是氨基酸取代为不同氨基酸的那些取代，其中该取代被预测为对参考多肽的性质的干扰最小。换句话说，保守氨基酸取代基本上保留了参考多肽的结构和功能。保守氨基酸取代通常维持(a)取代区域中多肽主链的结构，例如β片层或α螺旋构象，(b)取代位点处分子的电荷和/或疏水性，和/或(c)侧链的体积。
如本文所用，术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核酸序列”和“核酸”可互换使用并且是指核苷酸序列或其任何片段。这些短语还指天然或合成来源的DNA或RNA，其可以是单链或双链的并且可以表示有义链或反义链。DNA多核苷酸可以是cDNA或基因组DNA序列。
如果处于其天然状态或当通过本领域技术人员已知的方法操作时，多核苷酸可被转录和/或翻译以产生多肽或其片段，则称该多核苷酸编码多肽。这种多核苷酸的反义链也被认为编码该序列。
本领域技术人员理解遗传密码的简并性以及多种多核苷酸可以编码相同的多肽。在一些方面，多核苷酸(即，编码非血红素铁结合蛋白多肽的多核苷酸)可经密码子优化以在特定细胞内表达，该特定细胞包括但不限于植物细胞、细菌细胞、真菌细胞或动物细胞。尽管本文公开了由珊瑚中发现的多核苷酸序列编码的多肽，但可使用编码本文所述的多肽的期望形式的任何多核苷酸序列。因此，可使用非天然存在的序列。这些序列可能是期望的，例如，以增强多肽或蛋白质的异源表达系统中的表达。用于产生简并编码序列的计算机程序是可获得的并且可用于此目的。铅笔、纸、遗传密码和人手也可用于产生简并编码序列。
本文所述的重组细胞可包括一个或多个天然基因中的缺失或破坏。短语“缺失或破坏”是指重组细胞中天然基因的状态，其具有完全消除的编码区(缺失)或基因、其启动子或其终止子的修饰(诸如缺失、插入或突变)，使得基因不再产生活性表达产物、产生严重降低量的表达产物(例如降低至少75％或降低至少90％)或产生活性严重降低的表达产物(例如降低至少75％或降低至少90％)。缺失或破坏可通过遗传工程化方法、强制进化、诱变和/或选择和筛选来实现。待缺失或破坏的天然基因可以用感兴趣的外源核酸置换，用于表达外源基因产物(例如，多肽、酶等)。
本文所述的重组细胞可具有编码参与乙醇发酵或消耗的酶的一种或多种天然基因的缺失或破坏。这些乙醇生物合成途径酶中的一者或多者的缺失或破坏降低细胞产生乙醇的能力，从而增加乳酸盐的发酵生产。
本文所述的重组细胞包括天然丙酮酸脱羧酶(PDC)基因的缺失或破坏。天然PDC基因编码催化丙酮酸转化成乙醛和二氧化碳的酶。当宿主细胞含有多个PDC基因时，优选缺失或破坏它们中的至少一者，更优选破坏它们全部以更完全地消除宿主细胞产生乙醇的能力。当重组细胞是东方伊萨酵母细胞时，重组细胞可包括PDC基因的缺失或破坏，该PDC基因编码与SEQ ID NO:32至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。用于东方伊萨酵母的PDC基因的缺失或破坏的方法在本领域中是已知的并且有所描述。例如，参见WO2007032792A2和WO2017091610A1，该专利以引用方式并入本文中。
本文所述的重组细胞可包括天然甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)基因的缺失或破坏。天然GPD基因的缺失或破坏通过向细胞提供更大的还原当量库来帮助将乙酸氧化还原成乙醇而改善乙酸消耗。当乙醇生物合成途径被破坏时，这种增加的还原当量库可以改善发酵产物(例如乳酸盐)的生产。当宿主细胞含有多个GPD基因时，优选缺失或破坏它们中的至少一者，更优选破坏它们全部。
本文所述的重组细胞可包括天然L-乳酸盐：细胞色素c氧化还原酶基因(CYB2)的缺失或破坏。当宿主细胞含有多个CYB2基因时，优选缺失或破坏它们中的至少一者，更优选破坏它们全部。例如，东方伊萨酵母包括CYB2基因的两个等位基因(CYB2a和CYB2b)，并且当东方伊萨酵母用作宿主细胞时，两者都可以缺失或被破坏。
本文所述的重组细胞可包括一种或多种遗传修饰，其中外源核酸被整合到宿主细胞的基因组中。本领域技术人员知道如何在酵母基因组中选择合适的基因座用于整合外源核酸。例如，在东方伊萨酵母宿主细胞中，合适的相互作用基因座可包括但不限于CYB2B基因座(定义为侧翼为SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的基因座)、ato2基因座(定义为侧翼为SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41的基因座)和adh9091基因座(定义为侧翼为SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43的基因座)。本领域技术人员可以确定其它合适的整合基因座。此外，本领域技术人员将认识到如何使用序列来设计引物以验证在所选基因座处的正确基因整合。
本文所述的重组细胞能够产生乳酸盐，并且包括至少一种功能性外源乳酸脱氢酶(LDH)酶。LDH酶可以从重组细胞中的质粒上的外源核酸表达，或者编码LDH的外源核酸可以整合到重组宿主细胞的基因组中。LDH酶可以是具有乳酸脱氢酶活性的任何合适的酶。如本文所用，“乳酸脱氢酶活性”是指催化丙酮酸向乳酸盐的反应的能力。合适的LDH酶可包括但不限于分类在酶委员会(Enzyme Commission，EC)编号1.1.1.27(L-乳酸脱氢酶)和1.1.1.28(D-乳酸脱氢酶)下的酶。LDH酶可以来自任何合适的生物体，或可以是合成的。合适的LDH酶可以是来自瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、米根霉(Rhizopus oryzae)、家牛(Bos taurus)等的LDH酶。
LDH酶可以是瑞士乳杆菌L-LDH(SEQ ID NO:30)。相关的瑞士乳杆菌LDH以UniProt登录号O32765提供(SEQ ID NO:31)。能够产生乳酸盐的重组细胞可包括具有与SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31中的至少一者至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一的序列的LDH酶。能够产生乳酸盐的重组细胞可包括编码LDH酶的外源核酸，该LDH酶具有与SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31中的至少一者至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一的序列。能够产生乳酸盐并包含编码SEQ ID NO:31的LDH的基因的重组细胞先前描述于WO2007032792中，该专利以全文引用的方式并入本文中。
本文所述的重组细胞可包括编码转化酶的外源核酸。转化酶可以从质粒上的外源核酸或整合到重组宿主细胞的基因组中的外源核酸表达。转化酶可以是具有转化酶活性的任何合适的酶。如本文所用，“转化酶活性”是指催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的能力。合适的转化酶可包括但不限于分类于EC编号3.2.1.26下的酶。转化酶可以来自任何合适的生物体，或可以是合成的。合适的转化酶可以是来自乳酸克鲁维酵母(SEQ ID NO:12)、酿酒酵母(SEQ ID NO:33)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(SEQ ID NO:34)、黑曲霉(Aspergillus niger)(SEQ ID NO:35)等的转化酶。重组细胞可包括具有与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35中的至少一者至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一的序列的转化酶。能够产生乳酸盐的重组细胞可包括编码转化酶的外源核酸，该转化酶具有与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35中的至少一者至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一的序列。
本文所述的重组细胞可包括编码果糖激酶的外源核酸。果糖激酶可以从质粒上的外源核酸或整合到重组宿主细胞的基因组中的外源核酸表达。果糖激酶可以是具有果糖激酶活性的任何合适的酶。如本文所用，“果糖激酶活性”是指催化磷酸基从三磷酸腺苷(ATP)转移至果糖的能力。合适的果糖激酶可包括但不限于分类于EC编号2.7.1.4下的酶。果糖激酶可以来自任何合适的生物体，或可以是合成的。例如，果糖激酶可以是来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的果糖激酶(UniProt Ref.Q9L8G5；SEQ ID NO:26)。重组细胞可包括具有与SEQ ID NO:26至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一的序列的果糖激酶。重组细胞可包括编码果糖激酶的外源核酸，该果糖激酶具有与SEQ ID NO:26至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一的序列。
本文所述的重组细胞可包括编码天然或外源己糖激酶的外源核苷酸，或者可具有导致天然己糖激酶过表达的遗传修饰。己糖激酶可以是具有己糖激酶活性的任何合适的酶。如本文所用，“己糖激酶活性”是指催化己糖被ATP磷酸化为磷酸己糖的能力。例如，己糖激酶可催化磷酸从ATP加成到葡萄糖以形成葡萄糖-6-磷酸。合适的己糖激酶可包括但不限于分类于EC编号2.7.1.1下的酶。己糖激酶可以是己糖激酶I、己糖激酶II或己糖激酶III同工酶。己糖激酶可以是宿主细胞天然的己糖激酶，或己糖激酶可以是外源己糖激酶。例如，当宿主生物体是东方伊萨酵母时，己糖激酶可以是与SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25中的至少一者至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一的序列的酶。重组细胞可包含编码己糖激酶的外源核酸，该己糖激酶与SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25中的至少一者至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一。重组细胞可包括增加己糖激酶的表达的遗传修饰，该己糖激酶与SEQ ID NO:24和SEQID NO:25中的至少一者至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一。遗传修饰可以包括但不限于将编码天然己糖激酶的核苷酸的额外拷贝插入细胞内，在宿主细胞的基因组中天然己糖激酶基因的编码区上游插入组成型启动子，和/或修饰宿主细胞的基因组中天然己糖激酶基因的编码区上游的现有启动子。本领域技术人员将认识到天然己糖激酶基因的表达可以通过本领域已知的多种方法来增加，并且将能够适当地选择和应用这些方法。
本文所述的重组细胞可包括编码果糖转运蛋白的外源核酸。果糖转运蛋白可以从质粒上的外源核酸或整合到重组宿主细胞的基因组中的外源核酸表达。果糖转运蛋白可以是具有果糖转运蛋白活性的任何合适的酶。如本文所用，“果糖转运蛋白活性”是指催化果糖通过质粒膜转移的能力。具有果糖转运蛋白活性的酶在本领域中也可称为转移酶、同向转运体、促进剂等。果糖转运蛋白可以来自任何合适的生物体，或可以是合成的。例如，果糖转运蛋白可以是来自以下的果糖转运蛋白：乳酸克鲁维酵母(UniProt Ref.F2Z6G6，SEQ IDNO:27)拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)(UniProt Ref.Q70WR7，SEQ ID NO:28)卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)(GenBank Ref.EHN03988.1；SEQ ID NO:29)葡萄胞盘菌(Botryotinia fuckeliana)(UniProt Ref.Q5XTQ5；SEQ ID NO:36)或狭长孢灵芝(Ganoderma boninense)(GenBank Ref.VWO95402.1；SEQ IDNO:37)。重组细胞可包括具有与SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37中的一者至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一的序列的果糖转运蛋白。重组细胞可包括编码果糖转运蛋白的外源多核苷酸，该果糖转运蛋白具有与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQID NO:36和SEQ ID NO:37中的至少一者至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一的序列。与缺少该果糖转运蛋白的等同细胞相比，包含如本文所述的果糖转运蛋白的重组细胞将具有增加的果糖消耗速率(例如，由细胞摄取果糖和/或将果糖发酵成一种或多种终产物)。类似地，包含如本文所述的果糖转运蛋白的重组细胞将具有等于或大于缺乏该果糖转运蛋白的等同细胞中的葡萄糖消耗速率的葡萄糖消耗速率。换句话说，尽管果糖转运蛋白的存在增加了果糖消耗速率，但它不会降低葡萄糖消耗速率。
本文所述的重组细胞中的外源核酸可以在启动子的控制下。例如，外源核酸可以与异源或人工启动子可操作地连接。合适的启动子在本领域中是已知的并且有所描述。启动子可以包括但不限于RPL16B(SEQ ID NO:14)、丙酮酸脱羧酶(PDC1；SEQ ID NO:13)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH3；SEQ ID NO:17)、翻译延伸因子(TEF；SEQ ID NO:18)、转醛醇酶(TAL；SEQ ID NO:16)、烯醇化酶(ENO1；SEQ ID NO:19)、3-磷酸甘油酸激酶(PGK1；SEQ IDNO:15)。
本文所述的重组细胞中的外源核酸可以在终止子的控制下。例如，外源核酸可以与异源或人工终止子可操作地连接。合适的终止子在本领域中是已知的并且有所描述。终止子可以包括但不限于PDC(SEQ ID NO:20)和ScGAL10(SEQ ID NO:21)。
如果启动子或终止子在基因组或表达盒中相对于该多核苷酸的位置使得启动子或终止子(视情况而定)执行其转录控制功能，则启动子或终止子“可操作地连接”至给定多核苷酸(例如基因)。
本文所述的多肽可作为构建体的一部分提供。如本文所用，术语“构建体”是指重组多核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，该DNA和RNA可以是单链或双链的并且可以代表有义链或反义链。重组多核苷酸是通过实验室方法形成的多核苷酸，该多核苷酸包括衍生自至少两种不同天然来源的多核苷酸序列，或者它们可以是合成的。因此，构建体可包括通过例如基因组编辑技术引入的对内源基因的新修饰。构建体还可以包括使用例如重组DNA方法产生的重组多核苷酸。构建体可以是包括与编码热不稳定非血红素铁结合多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子的载体。如本文所用，术语“载体”是指能够转运与其连接的另一多核苷酸的多核苷酸。载体可以是质粒，其是指环状双链DNA环，额外的DNA区段可以整合到该环中。
本公开还提供使用本文所述的重组细胞生产乳酸盐的发酵方法。发酵方法包括使用本文所述的遗传工程化酵母发酵底物以生产乳酸盐的步骤。如本领域技术人员所理解的，发酵方法可以包括额外的步骤。额外的工艺步骤的非限制性示例包括将发酵液的温度维持在预定范围内，在发酵期间调节pH，以及从发酵液中分离乳酸盐。发酵工艺可以是微需氧工艺。
作为对本文所述重组细胞的遗传修饰的结果，发酵方法可使用蔗糖作为底物运行。发酵方法的底物还可以包括除蔗糖之外的其它组分。发酵底物还可以包括葡萄糖、木糖、果糖、淀粉的水解物、木质纤维素的水解物或它们的组合。如本文所考虑的，底物的蔗糖组分将经由转化酶和/或蔗糖酶的活性水解成葡萄糖和果糖。因此，发酵底物可以不含任何蔗糖本身，因为所有的蔗糖可以在工艺期间的某一时刻被水解。
发酵工艺可以在各种条件下运行。发酵温度，即加工期间发酵液的温度，可以是环境温度。另选地或另外地，发酵温度可以维持在预定范围内。例如，发酵温度可以维持在25℃至45℃、20℃至40℃、或33℃至38℃的范围内。然而，本领域技术人员将认识到，发酵温度不限于本文所述的任何特定范围，并且可以适当地进行修改。
发酵工艺可以在一定的氧摄取速率(OUR)范围内运行。发酵工艺的体积OUR可以在0.5mmol O2/(L·h)至40mmol O2/(L·h)、1mmol O2/(L·h)至30mmol O2/(L·h)、3mmol O2/(L·h)至25mmol O2/(L·h)、5mmol O2/(L·h)至20mmol O2/(L·h)或10mmol O2/(L·h)至18mmol O2/(L·h)的范围内。在一些实施方案中，比OUR可以在0.2mmol O2/(g细胞干重·h)至13mmol O2/(g细胞干重·h)、0.3mmol O2/(g细胞干重·h)至10mmol O2/(g细胞干重·h)、1mmol O2/(g细胞干重·h)至7mmol O2/(g细胞干重·h)或2mmol O2/(g细胞干重·h)至6mmol O2/(g细胞干重·h)的范围内。然而，发酵工艺的体积或比OUR不限于本文所述的任何特定速率或范围。
发酵工艺可以在各种细胞浓度下运行。在一些实施方案中，发酵结束时的细胞干重可以是1g细胞干重/L至20g细胞干重/L、1g细胞干重/L至10g细胞干重/L、2g细胞干重/L至8g细胞干重/L或2.5g细胞干重/L至6g细胞干重/L。此外，发酵工艺的投入密度(pitchdensity)或投入率(pitching rate)可以变化。在一些实施方案中，投入密度可以是0.05g细胞干重/L至5g细胞干重/L、0.05g细胞干重/L至4g细胞干重/L或0.05g细胞干重/L至2g细胞干重/L。
发酵工艺可与各种特征相关，该特征例如但不限于发酵生产速率、途径发酵产率、最终滴度和峰值发酵速率。这些特征可通过酵母的选择和/或发酵工艺中所用的酵母的遗传修饰来影响。这些特征可通过调节发酵工艺条件来影响。这些特征可以经由酵母选择或修饰与发酵工艺条件的选择的组合来调节。
该工艺的乳酸盐生产速率可以是至少1.0g L-1h-1、至少1.5g L-1h-1、或至少2.0gL-1h-1、至少2.5g L-1h-1、至少3.0g L-1h-1、或至少3.5g L-1h-1。该工艺的乳酸盐产率可以是至少55％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％。该工艺的最终乳酸盐滴度可以是至少30g/升、至少80g/升、至少100g/升或至少120g/升。发酵工艺可具有至少5g L- 1h-1、至少6g L-1h-1、至少7g L-1h-1或至少8g L-1h-1的峰值乳酸盐生产速率。
在一些方面，发酵工艺可包括蔗糖作为仅用于该工艺的一部分的底物。例如，发酵工艺可包括以下步骤：使用蔗糖作为底物产生酵母种子培养物，然后用水解产物、补充有蔗糖的水解产物或其它底物代替蔗糖运行全生产批次。发酵工艺可以作为蔗糖喂料批次运行。此外，发酵工艺可以是分批工艺、连续工艺或半连续工艺，如本领域技术人员所理解的。
实施例
通过参考以下实验性实施例进一步详细描述本发明。除非另有说明，提供这些实施例仅用于说明目的，并不旨在进行限制。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
实施例1：遗传修饰的酵母菌株
菌株1-1
由Brady等人(国际申请公开号WO2015195934A2，2015年12月23日公开)描述的菌株E是在增加浓度的游离乳酸的存在下选择被用于改善乳酸生产率的东方伊萨酵母宿主菌株，从ATCC PTA-6658进化而来，其中丙酮酸脱羧酶(PDC)基因的两个等位基因被敲除并被来自瑞士乳杆菌的乳酸脱氢酶(LDH)置换，并且L-乳酸盐：细胞色素c氧化还原酶基因(CYB2a和CYB2b)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GPD)两者的两个等位基因缺失。如本文所提及的，菌株1-1是指如由Brady等人在2015年12月23日公布的国际申请公布号WO2015195934A2中所描述的菌株E，该国际申请公布以全文引用方式并入本文中。
菌株1-1a
菌株1-1在增加浓度的游离乳酸盐的存在下经受几轮诱变和选择以鉴定具有改善的乳酸盐生产率的菌株。将所得分离物在YPD平板上划线以进行单个菌落分离。选择单个菌落并命名为菌株1-1a。
菌株1-2
将菌株1-1a用SEQ ID NO:2转化。SEQ ID NO:2是SEQ ID NO:1的区段，一种含有来自乳酸克鲁维酵母(KlINV；SEQ ID NO:11)的编码SEQ ID NO:12的氨基酸序列的转化酶基因的质粒。SEQ ID NO:2含有i)在RPL16b启动子SEQ ID NO:14和PDC终止子SEQ ID NO:20的控制下编码氨基酸序列SEQ ID NO:12的KlINV的表达盒；和ii)用于靶向染色体整合到CYB2B基因座中的侧翼DNA。在YNB+蔗糖平板上选择转化体。将所得转化体在YNB+蔗糖平板上划线以进行单个菌落分离。选择单个菌落。通过PCR验证SEQ ID NO:2正确整合到所选菌落中。将经PCR验证的分离物命名为菌株1-2。
菌株1-3
将菌株1-2用SEQ ID NO:3转化。SEQ ID NO:3含有i)来自酿酒酵母(ScMEL5)的可选择标记基因蜜二糖酶的表达盒，该可选择标记基因蜜二糖酶包括PGK启动子(SEQ ID NO:15)和MEL5终止子(SEQ ID NO:22)且侧翼为loxP位点；ii)在RPL16b启动子SEQ ID NO:14和PDC终止子SEQ ID NO:20的控制下编码氨基酸序列SEQ ID NO:12的KlINV的表达盒；和iii)用于靶向染色体整合到CYB2B基因座中的侧翼DNA。在含有2％蜜二糖作为唯一碳源和32μg/mL x-α-gal的YNB平板上选择转化体，该x-α-gal提供ScMEL5标记基因存在的比色指示。将所得转化体在含有32μg/mL x-α-gal的YPD上划线以进行单个菌落分离。选择单个蓝色菌落。通过PCR验证SEQ ID NO:3正确整合到所选蓝色菌落中。将经PCR验证的分离物命名为菌株1-3。
菌株1-4
使用Cre-loxP重组酶系统完成从菌株1-3去除ScMEL5可选择标记。该系统包括两个34bp区域，称为loxP位点，该两个区域由两个13bp反向重复序列构成，该两个反向重复序列由衍生自噬菌体P1的8bp间隔区分开。菌株1-3中的loxP位点直接位于ScMEL5可选择标记的上游和下游。在loxP位点处的重组通过重组酶基因(Cre)的过表达来促进。
将菌株1-3用SEQ ID NO:23转化。SEQ ID NO:23含有：i)来自酿酒酵母(ScSUC2)的可选择标记基因转化酶的表达盒；和ii)用于循环可选择标记ScMEL5的CRE重组酶基因(Cre)的表达盒。在含有2％蔗糖作为唯一碳源和32μg/mL x-α-gal的YNB平板上选择转化体，该x-α-gal提供不存在ScMEL5标记基因的比色指示。将所得转化体在含有32μg/mL x-α-gal的YPD上划线以进行单个菌落分离。选择单个白色菌落。通过PCR验证ScMEL5从所选白色菌落中的损失。将经PCR验证的分离物命名为菌株1-4。
菌株1-5a和菌株1-5b
将菌株1-4用SE ID NO:4转化。SEQ ID NO:4含有i)来自酿酒酵母(ScMEL5)的可选择标记基因蜜二糖酶的表达盒，该可选择标记基因蜜二糖酶包括PGK启动子SEQ ID NO:15和MEL5终止子SEQ ID NO:22且侧翼为loxP位点；ii)在PDC启动子SEQ ID NO:13和酿酒酵母GAL10终止子SEQ ID NO:21的控制下编码氨基酸序列SEQ ID NO:25的来自东方伊萨酵母的己糖激酶基因的表达盒；和iii)用于靶向染色体整合到ato2基因座中的侧翼DNA。在含有2％蜜二糖作为唯一碳源和32μg/mL x-α-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚酚-α-D-吡喃半乳糖苷)的YNB平板上选择转化体，该x-α-gal提供ScMEL5标记基因存在的比色指示。将所得转化体在含有32μg/mL x-α-gal的YPD上划线以进行单个菌落分离。选择两个蓝色单个菌落。通过PCR验证SEQ ID NO:4正确整合到所选蓝色菌落中。将经PCR验证的分离物命名为菌株1-5a和菌株1-5b。
菌株1-6
将菌株1-4用SEQ ID NO:5转化。SEQ ID NO:5含有i)来自酿酒酵母(ScMEL5)的可选择标记基因蜜二糖酶的表达盒，该可选择标记基因蜜二糖酶包括PGK启动子SEQ ID NO:15和MEL5终止子SEQ ID NO:22且侧翼为loxP位点；ii)在PDC启动子SEQ ID NO:13和酿酒酵母GAL10终止子SEQ ID NO:21的控制下编码氨基酸序列SEQ ID NO:26的来自丙酮丁醇梭菌(CaScrK)的果糖激酶基因的表达盒；和iii)用于靶向染色体整合到ato2基因座中的侧翼DNA。在含有2％蜜二糖作为唯一碳源和32μg/mL x-α-gal的YNB平板上选择转化体，该x-α-gal提供ScMEL5标记基因存在的比色指示。将所得转化体在含有32μg/mL x-α-gal的YPD上划线以进行单个菌落分离。选择单个蓝色菌落。通过PCR验证SEQ ID NO:5正确整合到所选蓝色菌落中。将经PCR验证的分离物命名为菌株1-6。
菌株1-7
将菌株1-4用SEQ ID NO:6转化。SEQ ID NO:6含有i)来自酿酒酵母(ScMEL5)的可选择标记基因蜜二糖酶的表达盒，该可选择标记基因蜜二糖酶包括PGK启动子SEQ ID NO:15和MEL5终止子SEQ ID NO:22且侧翼为loxP位点；ii)在PDC启动子SEQ ID NO:13和酿酒酵母GAL10终止子SEQ ID NO:21的控制下编码氨基酸序列SEQ ID NO:27的来自乳酸克鲁维酵母(KlFrt1)的果糖转运蛋白基因的表达盒；和iii)用于靶向染色体整合到ato2基因座中的侧翼DNA。在含有2％蜜二糖作为唯一碳源和32μg/mL x-α-gal的YNB平板上选择转化体，该x-α-gal提供ScMEL5标记基因存在的比色指示。将所得转化体在含有32μg/mL x-α-gal的YPD上划线以进行单个菌落分离。选择单个蓝色菌落。通过PCR验证SEQ ID NO:6正确整合到所选蓝色菌落中。将经PCR验证的分离物命名为菌株1-7。
菌株1-8a、菌株1-8b和菌株1-8c
将菌株1-4用SEQ ID NO:7转化。SEQ ID NO:7含有i)来自酿酒酵母(ScMEL5)的可选择标记基因蜜二糖酶的表达盒，该可选择标记基因蜜二糖酶包括PGK启动子SEQ ID NO:15和MEL5终止子SEQ ID NO:22且侧翼为loxP位点；ii)在PDC启动子SEQ ID NO:13和酿酒酵母GAL10终止子SEQ ID NO:21的控制下编码氨基酸序列SEQ ID NO:26的来自丙酮丁醇梭菌(CaScrK)的果糖激酶基因的表达盒；和iii)用于靶向染色体整合到adh9091基因座中的侧翼DNA。在含有2％蜜二糖作为唯一碳源和32μg/mL x-α-gal的YNB平板上选择转化体，该x-α-gal提供ScMEL5标记基因存在的比色指示。将所得转化体在含有32μg/mL x-α-gal的YPD上划线以进行单个菌落分离。选择三个蓝色单个菌落。通过PCR验证SEQ ID NO:7正确整合到所选蓝色菌落中。将经PCR验证的分离物命名为菌株1-8a、菌株1-8b和菌株1-8c。
菌株1-9a、菌株1-9b和菌株1-9c
将菌株1-4用SEQ ID NO:8转化。SEQ ID NO:8含有i)来自酿酒酵母(ScMEL5)的可选择标记基因蜜二糖酶的表达盒，该可选择标记基因蜜二糖酶包括PGK启动子SEQ ID NO:15和MEL5终止子SEQ ID NO:22且侧翼为loxP位点；ii)在PDC启动子SEQ ID NO:13和酿酒酵母GAL10终止子SEQ ID NO:21的控制下编码氨基酸序列SEQ ID NO:27的来自乳酸克鲁维酵母(KlFrt1)的果糖转运蛋白基因的表达盒；和iii)用于靶向染色体整合到adh9091基因座中的侧翼DNA。在含有2％蜜二糖作为唯一碳源和32μg/mL x-α-gal的YNB平板上选择转化体，该x-α-gal提供ScMEL5标记基因存在的比色指示。将所得转化体在含有32μg/mL x-α-gal的YPD上划线以进行单菌落分离。选择三个蓝色单个菌落。通过PCR验证SEQ ID NO:8正确整合到所选蓝色菌落中。将经PCR验证的分离物命名为菌株1-9a、菌株1-9b和菌株1-9c。
菌株1-10a、菌株1-10b和菌株1-10c
将菌株1至菌株4用SEQ ID NO:9转化。SEQ ID NO:9含有i)来自酿酒酵母(ScMEL5)的可选择标记基因蜜二糖酶的表达盒，该可选择标记基因蜜二糖酶包括PGK启动子SEQ IDNO:15和MEL5终止子SEQ ID NO:22且侧翼为loxP位点；ii)在PDC启动子SEQ ID NO:13和酿酒酵母GAL10终止子SEQ ID NO:21的控制下编码氨基酸序列SEQ ID NO:28的来自拜耳接合酵母(ZbFfz1)的果糖转运蛋白基因的表达盒；和iii)用于靶向染色体整合到adh9091基因座中的侧翼DNA。在含有2％蜜二糖作为唯一碳源和32μg/mL x-α-gal的YNB平板上选择转化体，该x-α-gal提供ScMEL5标记基因存在的比色指示。将所得转化体在含有32μg/mL x-α-gal的YPD上划线以进行单菌落分离。选择三个蓝色单个菌落。通过PCR验证SEQ ID NO:9正确整合到所选蓝色菌落中。将经PCR验证的分离物命名为菌株1-10a、菌株1-10b和菌株1-10c。
菌株1-11a、菌株1-11b、菌株1-11c、菌株1-11d、菌株1-11e和菌株1-11f
将菌株1至菌株4用SEQ ID NO:10转化。SEQ ID NO:10含有i)来自酿酒酵母(ScMEL5)的可选择标记基因蜜二糖酶的表达盒，该可选择标记基因蜜二糖酶包括PGK启动子SEQ ID NO:15和MEL5终止子SEQ ID NO:22且侧翼为loxP位点；ii)在PDC启动子SEQ IDNO:13和酿酒酵母GAL10终止子SEQ ID NO:21的控制下编码氨基酸序列SEQ ID NO:29的来自卡氏酵母(ScarlFsy1)的果糖转运蛋白基因的表达盒；和iii)用于靶向染色体整合到adh9091基因座中的侧翼DNA。在含有2％蜜二糖作为唯一碳源和32μg/mL x-α-gal的YNB平板上选择转化体，该x-α-gal提供ScMEL5标记基因存在的比色指示。将所得转化体在含有32μg/mL x-α-gal的YPD上划线以进行单个菌落分离。选择六个蓝色单个菌落。通过PCR验证SEQ ID NO:9正确整合到所选蓝色菌落中。将经PCR验证的分离物命名为菌株1-11a、菌株1-11b、菌株1-11c、菌株1-11d、菌株1-11e和菌株1-11f。
实施例2：使用产乳酸盐菌株1.3和菌株1.5a的发酵
产乳酸盐酵母菌株1.3和菌株1.5a在发酵罐中运行以评估葡萄糖和果糖消耗以及乳酸盐生产。将菌株1.3和菌株1.5a在YPD平板(细菌蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、葡萄糖20g/L和琼脂15g/L)上进行单个菌落划线，并孵育直至单个菌落可见。在室温下孵育导致单个菌落在约72小时内生长，并且在30℃下孵育导致单个菌落在约18小时内生长。将来自平板的细胞刮入无菌种子培养基(表2)中并测量光学密度(OD600)。使用型号Genesys20的分光光度计(Thermo Scientific)在600nm波长和1cm光程比色皿(path length cuvette)下测量光学密度。种子培养物在含有50mL种子培养基的500mL摇瓶中在34℃和250RPM下运行，直至它们达到4-8的OD600。
用种子培养物接种2L容量的发酵罐以达到0.2的初始OD600。用每种菌株的种子培养物接种分开的发酵罐。在即将接种之前，将1.45L发酵培养基添加到发酵罐中。将发酵培养基灭菌，pH至5.5，并且该发酵培养基含有表4中概述的组分。
发酵罐中的pH从5.5开始并且自由下降到4.45，其中通过控制添加30％的石灰(氢氧化钙)悬浮液来维持该pH，直到已经添加了84g的石灰悬浮液，此后不再进行pH控制。通过在容器底部处的喷射环用0.25SLPM(标准升/分钟)空气喷射发酵罐。通过选择适当的搅拌速度(约600RPM±25)，实现12mmol O2/(L*h)至13mmol O2/(L*h)的氧摄取速率。操作这些发酵使得在细胞实现足够的密度后，实现氧限制并且随后在发酵的整个剩余部分中维持氧限制(例如，溶解氧小于约10)。使用在接种前校准的Mettler Toledo6800传感器(瑞士乌尔多夫梅特勒托利多公司(Mettler-Toledo GmbH，Urdorf，Switzerland))测量溶解氧。通过拔出探针并测量空信号来校准0％，根据如上详述的容器中的运行条件使用空气喷射来校准100％(在接种之前)。如上所述，使用本领域技术人员已知的方法计算氧摄取速率(“OUR”)。对于该实施例，通过质谱仪测量氧、N2和CO2值。
在接种后立即取样，在批次结束时取样，并在整个发酵过程中定期取样。通过具有折射率检测器的高效液相色谱分析样品的乳酸盐、葡萄糖、果糖、蔗糖和阿拉伯糖醇浓度。发酵结果报告于表6和图1至图5中。
总之，菌株1.5a(其中东方伊萨酵母己糖激酶2-1(HXK2-1)是过表达的)具有比对照菌株1.3更高的乳酸盐生产速率和更高的峰值乳酸生产速率。
表2：种子培养基
组分 在1000mL最终体积中的量
无水右旋糖 100g
MES水合物 19.5g
DMu盐25x(表3) 40mL
D-生物素储液(1000x，1.04g/mL) 1mL
痕量组成(表5) 1mL
Lubrizol 1:100 1mL
甘油10％ 1mL
表3：DMu盐25x
化学 分子量 g/L
尿素 60.06 57.0
磷酸一钾 136.09 75.0
七水合硫酸镁 246.47 12.5
表4：发酵培养基
表5：痕量组成
化学 制剂 分子量 g/L
EDTA(二水合二钠盐) C10H14N2Na2O8.2H2O 372.24 15.0
七水合硫酸锌 ZnSO4.7H2O 287.54 4.5
二水合氯化锰 MnCl2.2H2O 161.88 1.0
五水合硫酸铜(II) CuSO4.5H2O 249.68 0.3
七水合硫酸铁(II) FeSO4.7H2O 278.02 3.0
表6.
实施例3：在较高OUR下使用产乳酸盐菌株1.3和菌株1.5a发酵
产乳酸盐酵母菌株1.3和菌株1.5a在发酵罐中运行以评估葡萄糖和果糖消耗以及乳酸盐生产。将菌株1.3和菌株1.5a在YPD平板(细菌蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、葡萄糖20g/L和琼脂15g/L)上进行单个菌落划线，并孵育直至单个菌落可见。在室温下孵育导致单个菌落在约72小时内生长，并且在30℃下孵育导致单个菌落在约18小时内生长。将来自平板的细胞刮入无菌种子培养基(表2.1)中并测量光学密度(OD600)。使用型号Genesys20的分光光度计(Thermo Scientific)在600nm波长和1cm光程比色皿下测量光学密度。种子培养物在含有50mL种子培养基的500mL摇瓶中在34℃和250RPM下运行，直至它们达到4-8的OD600。
用细胞浆液接种250mL容量的发酵罐，使初始OD600达到0.1。用每种菌株的细胞浆液接种分开的发酵罐，一式三份。在即将接种之前，将0.2L发酵培养基添加到发酵罐中。将发酵培养基灭菌，pH至5.5，并且该发酵培养基含有表7中概述的组分。
使用MES缓冲液和30％碳酸钙(CaCO3)控制发酵罐中的pH。在接种前和在第2小时添加30％CaCO3溶液以达到3.0的目标pH。在第2小时添加CaCO3后，允许pH自由下落且不发生进一步的pH控制。通过在容器底部处的喷射环用1SLPM(标准升/分钟)空气喷射发酵罐。通过选择适当的搅拌速度(分别为600RPM±25RPM或625RPM±25RPM)，实现12mmol O2/(L*h)至13mmol O2/(L*h)或15mmol2/(L*h)至17mmol O2/(L*h)的氧摄取速率。操作这些发酵使得在细胞实现足够的密度后，实现氧限制并且随后在发酵的整个剩余部分中维持氧限制(例如，溶解氧小于约10)。使用在接种前校准的Mettler Toledo6800传感器(瑞士乌尔多夫梅特勒托利多公司)测量溶解氧。通过拔出探针并测量空信号来校准0％，根据如上详述的容器中的运行条件使用空气喷射来校准100％(在接种之前)。如上所述，使用本领域技术人员已知的方法计算氧摄取速率(“OUR”)。对于该实施例，通过质谱仪测量氧、N2和CO2值。
在接种后立即取样，在批次结束时取样，并在整个发酵过程中定期取样。通过具有折射率检测器的高效液相色谱分析样品的乳酸盐、果糖、蔗糖、阿拉伯糖醇和葡萄糖浓度。发酵结果报告于表8和图6至图8中。
总之，与在12-13的OUR下运行的相同菌株相比，在菌株1.5a和菌株1.3中将OUR增加至15-17导致更高的乳酸盐生产速率、总生产时间的减少和峰值乳酸盐生产速率的增加。
表7：发酵培养基
表8.
实施例4：菌株1.3、菌株1.6、菌株1.7、菌株1.8a至菌株1.8c、菌株1.9a至菌株1.9c 和菌株1.10a至菌株1.10c的摇瓶培养物
产乳酸盐酵母菌株1.3、菌株1.6、菌株1.7、菌株1.8a至菌株1.8c、菌株1.9a至菌株1.9c和菌株1.10a至菌株1.10c在摇瓶中运行以评估葡萄糖和果糖消耗以及乳酸盐生产。将菌株1.3、菌株1.6、菌株1.7、菌株1.8a至菌株1.8c、菌株1.9a至菌株1.9c和菌株1.10a至菌株1.10c在YPD平板(细菌蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、葡萄糖20g/L和琼脂15g/L)上进行单个菌落划线，并孵育直至单个菌落可见。在室温下孵育导致单个菌落在约72小时内生长，并且在30℃下孵育导致单个菌落在约18小时内生长。将细胞从平板上刮入生产培养基(表9)中并测量光学密度(OD600)。使用型号Genesys20的分光光度计(Thermo Scientific)在600nm波长和1cm光程比色皿下测量光学密度。
用生产培养基培养物接种含有0.26g CaCO3的250mL无挡板摇瓶以达到0.2的初始OD600。在即将接种之前，将18mL生产培养基添加到250mL摇瓶中。将生产培养基灭菌，pH至5.5，并且该生产培养基含有表9中概述的组分。接种后，将摇瓶在34℃下、以70％的相对湿度并以150rpm振荡进行孵育约67小时。
在接种后立即取样，在批次结束时取样，并在整个发酵过程中定期取样。通过具有折射率检测器的高效液相色谱分析样品的乳酸盐、葡萄糖、果糖、蔗糖和阿拉伯糖醇浓度。发酵结果报告于图9至图20中。
总之，菌株1.6、菌株1.8a、菌株1.8b、菌株1.8c、菌株1.9a、菌株1.10a、菌株1.10b、菌株1.10c、菌株1.11b、菌株1.11c、菌株1.11d、菌株1.11e和菌株1.11f相对于对照菌株1.3显示出改善的果糖消耗速率。类似地，与对照菌株1.3相比，菌株1.6、菌株1.7、菌株1.8a、菌株1.8b、菌株1.8c、菌株1.9a、菌株1.9b、菌株1.10a、菌株1.10b、菌株1.11b、菌株1.11c、菌株1.11d和菌株1.11e特别是在发酵早期具有更高的右旋糖消耗和乳酸盐生产速率。
表9：生产培养基
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Claims (38)

1.一种能够从蔗糖生产乳酸盐的遗传工程化酵母细胞，所述工程化酵母细胞包含
编码外源乳酸脱氢酶的多核苷酸；
编码外源转化酶的多核苷酸；
天然丙酮酸脱羧酶(PDC)基因的缺失或破坏；和
导致天然己糖激酶基因过表达的遗传修饰。
2.根据权利要求1所述的工程化酵母细胞，其中所述工程化酵母细胞中的己糖激酶活性高于缺乏所述遗传修饰的等同酵母细胞中的己糖激酶活性。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的工程化酵母细胞，其中当在蔗糖的存在下用于发酵工艺时，所述工程化酵母细胞中的峰值乳酸盐生产速率高于缺少所述遗传修饰的等同酵母细胞的峰值乳酸盐生产速率。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的工程化酵母细胞，其中所述遗传修饰包括用组成型异源或人工启动子置换天然己糖激酶基因启动子。
5.根据权利要求4所述的工程化酵母细胞，其中所述组成型异源或人工启动子选自由丙酮酸脱羧酶(PDC1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH3)、烯醇化酶(ENO1)和3-磷酸甘油酸激酶(PGK1)组成的组。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的工程化酵母细胞，其中所述遗传修饰包括添加编码所述天然己糖激酶的外源多核苷酸，使得所述遗传工程化酵母细胞包含编码所述天然己糖激酶的序列的至少一个额外拷贝。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的工程化酵母细胞，其中所述天然己糖激酶包含与SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25中的至少一者至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一的序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的工程化酵母细胞，其中所述工程化酵母细胞包括甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)基因的缺失或破坏。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的工程化酵母细胞，其中所述工程化酵母细胞包括L-乳酸盐：细胞色素c氧化还原酶(CYB2)基因的缺失或破坏。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的工程化酵母细胞，其中所述外源转化酶包含与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ
ID NO:35中的至少一者至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一的序列。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的工程化酵母细胞，其中编码所述外源转化酶的所述多核苷酸与异源或人工启动子可操作地连接。
12.根据权利要求11所述的工程化酵母细胞，其中所述启动子选自由丙酮酸脱羧酶(PDC1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH3)、翻译延伸因子(TEF)、转醛醇酶(TAL)、RPL16B、3-磷酸甘油酸激酶(PGK1)和烯醇化酶(ENO1)组成的组。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的工程化酵母细胞，其中所述酵母细胞是克拉布特里阴性的。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的工程化酵母细胞，其中所述酵母细胞是东方伊萨酵母/发酵毕赤酵母进化枝的酵母。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的工程化酵母细胞，其中所述酵母细胞是东方伊萨酵母细胞。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的工程化酵母细胞，其中所述酵母细胞是东方伊萨酵母细胞，并且所述天然的、过表达的己糖激酶包含与SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25中的至少一者至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一的序列。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的工程化酵母细胞，其中所述酵母细胞另外包含编码果糖激酶的外源多核苷酸。
18.根据权利要求17所述的工程化酵母细胞，其中所述果糖激酶包含与SEQ ID NO:26至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一的序列。
19.根据权利要求17或18所述的工程化细胞，其中编码所述果糖激酶的所述外源多核苷酸与异源或人工启动子可操作地连接。
20.根据权利要求19所述的工程化细胞，其中所述异源或人工启动子选自由丙酮酸脱羧酶(PDC1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH3)、翻译延伸因子(TEF)、转醛醇酶(TAL)、RPL16B、3-磷酸甘油酸激酶(PGK1)和烯醇化酶(ENO1)组成的组。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的工程化细胞，其中所述乳酸脱氢酶包含与SEQID NO:30和SEQ ID NO:31中的至少一者至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一的序列。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的工程化细胞，其中编码所述乳酸脱氢酶的所述外源多核苷酸与异源或人工启动子可操作地连接。
23.根据权利要求22所述的工程化细胞，其中所述异源或人工启动子选自由丙酮酸脱羧酶(PDC1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH3)、翻译延伸因子(TEF)、转醛醇酶、RPL16B、3-磷酸甘油酸激酶(PGK1)和烯醇化酶(ENO1)组成的组。
24.一种从蔗糖生产乳酸盐的方法，所述方法包括：
使包含蔗糖的底物与根据权利要求1至23中任一项所述的工程化酵母细胞接触，其中由所述工程化酵母对所述底物的发酵来生产乳酸盐。
25.根据权利要求24所述的方法，其中体积氧摄取速率(OUR)为0.5mmol O2/(L·h)至40mmol O2/(L·h)、1mmol O2/(L·h)至30mmol O2/(L·h)、3mmol O2/(L·h)至25mmol O2/(L·h)、
5mmol O2/(L·h)至20mmol O2/(L·h)或10mmol O2/(L·h)至18mmol O2/(L·h)。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述体积OUR为10mmolO2/(L·h)至20mmolO2/(L·h)、10mmol O2/(L·h)至14mmolO2/(L·h)或15mmol O2/(L·h)至18mmol O2/(L·h)。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中峰值乳酸盐生产速率为至少5g L- 1h-1、至少6g L-1h-1、至少7g L-1h-1或至少8g L-1h-1。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的方法，其中乳酸盐以至少1.5gL-1h-1、至少2.0gL-1h-1、至少2.5g L-1h-1、至少3.0g L-1h-1或至少3.5g L-1h-1的速率生产。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的方法，其中发酵温度在20℃至45℃、25℃至40℃或30℃至38℃的范围内。
30.根据权利要求24至29中任一项所述的方法，其中乳酸盐滴度为至少30g/L、至少80g/L、至少100g/L或至少120g/L。
31.一种从蔗糖生产乳酸盐的方法，所述方法包括：
使包含蔗糖的底物与工程化酵母细胞接触，所述工程化酵母细胞包含
编码外源乳酸脱氢酶的多核苷酸；
编码外源转化酶的多核苷酸；
天然丙酮酸脱羧酶(PDC)基因的缺失或破坏；和
导致天然己糖激酶基因过表达的遗传修饰，
其中由所述工程化酵母对所述底物的发酵来生产乳酸盐。
32.根据权利要求31所述的方法，其中体积氧摄取速率(OUR)为0.5mmol O2/(L·h)至40mmol O2/(L·h)、1mmol O2/(L·h)至30mmol O2/(L·h)、3mmol O2/(L·h)至25mmol O2/(L·h)、5mmol O2/(L·h)至20mmol O2/(L·h)或10mmol O2/(L·h)至18mmol O2/(L·h)。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述体积OUR为10mmolO2/(L·h)至20mmolO2/(L·h)、10mmol O2/(L·h)至14mmolO2/(L·h)或15mmol O2/(L·h)至18mmol O2/(L·h)。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中峰值乳酸盐生产速率为至少5g L- 1h-1、至少6g L-1h-1、至少7g L-1h-1或至少8g L-1h-1。
35.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中乳酸盐以至少1.5gL-1h-1、至少2.0gL-1h-1、至少2.5g L-1h-1、至少3.0g L-1h-1或至少3.5g L-1h-1的速率生产。
36.根据权利要求31至35中任一项所述的方法，其中发酵温度在20℃至45℃、25℃至40℃或30℃至38℃的范围内。
37.根据权利要求31至36中任一项所述的方法，其中乳酸盐滴度为至少30g/L、至少80g/L、至少100g/L或至少120g/L。
38.一种能够从蔗糖生产乳酸盐的遗传工程化东方伊萨酵母细胞，所述工程化酵母细胞包含
编码外源乳酸脱氢酶的多核苷酸；
编码外源转化酶的多核苷酸；
天然丙酮酸脱羧酶(PDC)基因的缺失或破坏；和
导致天然己糖激酶基因过表达的遗传修饰，
其中所述工程化东方伊萨酵母细胞能够以至少30g/L、至少80g/L、至少100g/L或至少120g/L的滴度生产乳酸盐。
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US11268112B2 (en) * 2018-04-13 2022-03-08 Lygos, Inc. Recombinant host cells and methods for the production of L-lactic acid
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