CN113528362A - 甘油产生受到抑制的重组耐酸酵母和使用其生产乳酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有乳酸产生能力并且甘油产生受到抑制的重组耐酸酵母及使用其制备乳酸的方法。更具体地，公开了其中引入了参与乳酸产生的基因并且缺失或减弱了参与甘油产生的基因的重组耐酸酵母，以及使用其制备乳酸的方法。当使用该重组耐酸酵母生产乳酸时，在减少甘油的产生的同时维持乳酸的产生，因此在转化为丙交酯的低聚反应中可以抑制甘油造成的交联，因此可以提高乳酸转化为丙交酯的转化率。

Description

甘油产生受到抑制的重组耐酸酵母和使用其生产乳酸的方法

技术领域

本发明涉及一种具有乳酸产生能力并且甘油产生受到抑制的重组耐酸酵母及使用其制备乳酸的方法。更具体地，本发明涉及其中引入了参与乳酸产生的基因并且缺失或减弱了参与甘油产生的基因的重组耐酸酵母，以及使用该重组耐酸酵母制备乳酸的方法。

背景技术

聚乳酸(PLA)是可生物降解的聚合物，其通过将乳酸转化成丙交酯并在使其进行开环聚合反应而制备。其原料乳酸通过发酵生产。PLA广泛用于一次性食品容器中，其优点在于，它可以单独使用或以塑料中的组合物或共聚物的形式用于各种行业，包括汽车行业和纤维行业。另外，它是近年来已在3D打印中使用的代表性聚合物，并且是一种环保聚合物，当用于3D打印机时，它会产生较少量的有害气体和异味。

传统的乳酸生产过程是使用乳酸菌进行的，并且包括在使用各种形式的钙盐/Ma盐或中和剂(例如氨)保持6至8的中性pH的同时进行发酵，以防止因乳酸菌产生并累积的乳酸而导致细菌死亡或其生长减慢。当发酵完成时，分离微生物，并添加硫酸以将乳酸盐(lactate)转化为乳酸，同时由于难以从水中分离盐并将其转化为丙交酯而将钙盐以CaSO₄的形式除去。在该方法中，产生的副产物CaSO₄的量大于乳酸的量，因此降低了工艺效率。

通常，PLA通过发酵产生乳酸，然后通过纯化工艺将产生的乳酸转化为丙交酯。为了转化为丙交酯，需要将乳酸转化为氢化形式的工艺，而中性发酵的pH通常为6至7，因此使用大量的硫酸将中性pH改变为酸性pH。在该过程中，产生大量的中和盐，并且由于中和盐的价值低以及去除该中和盐的工艺的投资成本，经济可行性降低。

同时，乳酸具有L型光学异构体和D型光学异构体。存在各种各样的微生物种群。例如，主要产生L型光学异构体的乳酸菌通常也产生约5-10％的D型光学异构体，主要产生D型光学异构体的菌株包括产生D型光学异构体和L型光学异构体的菌株，产生D型光学异构体和乙醇的菌株等(Ellen I.Garvie,Microbiological Reviews,106-139,1980)。

同时，就天然产生乳酸的乳酸菌(Lactobacillus)而言，为了商业化地生产乳酸，必须使用大量昂贵的营养物作为培养基。这些过多的营养成分极大地阻碍了下游聚合工艺或当丙交酯用作中间体时进行的丙交酯转化工艺，为了获得高收率和高纯度的聚合物或其前体，产生了诸如吸附、蒸馏和离子交换的纯化工艺的成本，从而进一步增加了生产成本。为了解决这些问题，已经提出了使用酵母的研究。众所周知，即使使用廉价的营养物，酵母也可以进行生长/发酵，并且还具有高的耐酸性。

当使用在酸中生长良好的酵母(以下称为“耐酸酵母”)生产乳酸时，在发酵过程中无需使用中和剂将培养基的pH维持在6至7，因此简化了发酵工艺，并且不需要用于去除中和剂的下游纯化工艺。此外，酵母本身会产生代谢所需的许多成分，因此与细菌(尤其是乳酸菌)相比，可以在营养水平相对较低的培养基中进行培养，从而避免了下游的纯化工艺，并明显降低了生产成本。

然而，使用酵母生产乳酸的技术是有要求的。要求是，作为菌株发酵性能指标的乳酸的产量(yield)、产率(productivity)和浓度必须保持在与乳酸菌的性能相似的高水平，才能使该技术能够被商业化应用。

尽管已开发出使用耐酸酵母生产乳酸的技术，但在实践中，由于该技术在很多情况下在发酵中伴有中和反应，只有当在pH值保持在至少为3.7(不低于乳酸的pKa值)的情况下进行发酵，才能表现出较高的发酵性能，因此将该技术确定为实现耐酸性的实用方法是不合理的，并且很难预期降低工艺中的生产成本的效果(Michael Sauer et al.,Biotechnology and Genetic Engineering Reviews,27:229-256,2010)。

因此，能够降低工艺成本的耐酸酵母只有在其能够在发酵溶液的pH值不超过pKa值的情况下完成发酵而不使用中和剂或以最小量使用中和剂，并且三个主要发酵指标达到了与乳酸菌相似的水平时，才能被商业应用。

通常，酵母以乙醇为主要产物代谢，副产物为葡萄糖，几乎不产生乳酸。另外，由于从具有高耐酸性的微生物中选择产生乳酸的菌株的可能性非常低，因此，本发明人选择了具有优异的耐酸性的酵母菌株，并试图通过基因工程方法构建一种具有乳酸产生能力并具有乙醇和甘油产生能力受到抑制的菌株。

因此，作为努力产生具有乳酸产生能力和甘油产生能力受到抑制的耐酸菌株的结果，本发明人通过从耐酸酵母中去除参与甘油产生的基因并进一步将编码乳酸脱氢酶的基因引入该酵母中而构建了一种重组菌株，并且发现当使用该重组菌株生产乳酸时，作为使用该重组酵母的乳酸生产中的杂质的甘油的量减少。基于这一发现，完成了本发明。

发明内容

因此，鉴于上述问题提出了本发明，本发明的一个目的是提供一种具有乳酸产生能力和甘油产生能力受到抑制的重组耐酸酵母菌株。

本发明的另一个目的是提供一种使用重组耐酸酵母菌株制备乳酸的方法。

本发明的另一个目的是提供一种源自耐酸酵母的编码酶的基因，该酶将磷酸二羟丙酮转化为甘油-3-磷酸(glycerol-3-phosphate)。

根据本发明的一个方面，上述和其他目的可以通过提供一种具有乳酸产生能力的重组菌株来实现，其中从耐酸酵母YBC菌株(KCTC13508BP)中缺失或减弱编码将磷酸二羟丙酮转化为甘油-3-磷酸的酶的基因，并将编码乳酸脱氢酶的基因引入到该耐酸酵母YBC菌株。

根据本发明的另一个方面，提供了一种具有乳酸产生能力的重组菌株，其中从耐酸酵母YBC菌株(KCTC13508BP)中缺失编码将磷酸二羟丙酮转化为甘油-3-磷酸的酶的GPD1基因、编码将乳酸盐(lactate)转化为丙酮酸盐(pyruvate)的酶的CYB2基因、编码乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)的ADH基因，以及编码丙酮酸脱羧酶的PDC基因；并且

其中将编码乳酸脱氢酶的基因引入耐酸酵母YBC菌株。

根据本发明的另一方面，提供了一种生产乳酸的方法，该方法包括：(a)培养重组菌株以产生乳酸；和(b)收集产生的乳酸。

根据本发明的另一方面，提供了一种具有将磷酸羟基丙酮(hydroxyacetonephosphate)转化为甘油-3-磷酸的酶活性的基因，该基因编码与包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白具有90％以上的同源性的蛋白。

根据本发明的另一方面，提供了一种具有将磷酸二羟丙酮转化为甘油-3-磷酸的酶活性的蛋白，该蛋白与包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白具有90％以上的同源性。

根据本发明的另一方面，提供了一种GPD1基因的启动子，其包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的核苷酸序列。

本发明的效果

当使用根据本发明的重组耐酸酵母生产乳酸时，维持乳酸的产生的同时减少甘油的产生，从而在转化为丙交酯的低聚反应中可以抑制甘油造成的交联，因此可以提高乳酸转化为丙交酯的转化率(conversion yield)。

附图说明

从以下结合附图的详细描述中，将更清楚地理解本发明的上述和其他目的、特征和其他优点，其中：

图1示出了用于从本发明的YBC4菌株的基因组中缺失GPD1(g1544)/GPD2(g5617)基因或缺失所述基因并插入代替其的LDH基因的缺失盒(deletion cassette)的实例。

图2示出了根据本发明的重组酵母菌株YBC5菌株的发酵图曲线。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所理解的相同的含义。通常，本文使用的术语在本领域中是众所周知的并且是通常使用的。

耐酸酵母的特征在于即使在酸性pH下也以高速率消耗糖，表现出高生长速率，并且在发酵条件下将消耗的糖转化为所需的产物。在本发明人的先前研究中，在几个酵母文库中从具有这些特征的酵母中选择了耐酸酵母菌株(KCTC13508BP)，并且该耐酸酵母菌株(KCTC13508BP)即使在乳酸浓度为40g/L至80g/L的情况下也具有高生长速率和高糖消耗率。通过控制代谢回路(metabolic circuit)以提高耐酸酵母YBC菌株的乳酸产生能力并抑制乙醇产生能力，通过从菌株(其通过从YBC菌株中缺失编码乙醇脱氢酶的基因和编码丙酮酸脱羧酶的基因并将乳酸脱氢酶基因引入YBC菌株而获得)中缺失编码将乳酸盐转化为丙酮酸盐的细胞色素b2酶的基因来生产重组菌株。另外，为了抑制所构建的菌株中甘油的产生，通过缺失编码将磷酸羟基丙酮转化为甘油-3-磷酸的甘油-3-磷酸脱氢酶的基因来构建重组菌株，并且发现该重组菌株具有提高的乳酸产生能力和被抑制的乙醇产生能力和甘油产生能力。

另外，由于甘油减少而造成的过量碳可分配给其他副产物。然而，当转化为乳酸时，有可能进一步提高乳酸产生的产率(例如，增强乳酸脱氢酶)。

因此，一方面，本发明涉及一种具有乳酸产生能力的重组菌株，其中从耐酸酵母YBC菌株(KCTC13508BP)中缺失或减弱了编码将磷酸二羟丙酮转化为甘油-3-磷酸的酶的基因，并将编码乳酸脱氢酶的基因引入所述耐酸酵母YBC菌株。

通常，甘油是酵母的主要副产物，其功能是平衡细胞中的氧化还原反应(redox)，特别是调节乙醇或乳酸盐生产过程中发生的细胞内NAD/NADH的平衡，其在抑制由渗透压导致的细胞内水流失中起重要作用，所述渗透压因细胞外水活性的降低而产生，并且甘油还充当甘油-3-磷酸的前体，甘油-3-磷酸是主要的能量储存物(major energy storage)甘油三酯的前体(Roeland Costenoble et al.,Yeast 16:1483-1495,2000；Elke Nevoigt andUlf Stahl,FEMS Microbiology Reviews 21:231,1997)。

抑制酵母中甘油产生反应的已知方法包括去除或减弱与甘油产生直接相关的基因，以及修饰与调节机制(如渗透压)有关的基因。对于诸如渗透压之类的调节机制，存在一个HOG(高渗透压甘油)信号传导途径(Joseph P Dexter et al.,BMC Systems Biology,9:17,2015)，并且通过去除或修饰相关的主要因子SSK1(细胞质磷脂接力转移中间渗透感应器和调节器，cytoplasmic phosphorelay intermediate osmosensor and regulator)等抑制甘油产生(Hubmann et al.,Biotechnology for Biofuels,6:87,2013；Hubmann etal.,Metabolic Engineering,17:68,2013)。

然而，通过突变调节这些信号传导途径需要大量的研究，并且对于某些菌株，例如耐酸酵母YBC菌株(KCTC13508BP)，需要对每个步骤进行验证。因此，使用了更通用的方法，即，去除与GPD(NAD依赖性甘油-3-磷酸甘油脱氢酶)和GPP(DL-甘油-3-磷酸磷酸酶)直接相关的基因的方法。GPD1主要起调节酵母的抗渗透性(osmotic resistance)的作用，GPD2是GPD1的同种型，在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达以调节厌氧条件下的细胞活性。另外，在酿酒酵母中用于将甘油-3-磷酸转化为甘油的两个GPP基因是众所周知的。GPP1在厌氧条件下表达，而GPP2在渗透压胁迫下表达。去除GPD和GPP的每种异构体后，每种情况对甘油生成的影响会因培养条件和相应菌株而异(Roeland Costenoble et al.,Yeast 16:1483,2000；Jacobus Albertyn et al.,Molecular and cellular biology,4135,1994)。因此，认为最好的方法是使用实验来检测每种情况的效果。

根据本发明，编码将磷酸二羟丙酮转化为甘油-3-磷酸的酶的基因可以是GPD1或GPD2基因，并且优选地，编码将磷酸二羟丙酮转化为甘油-3-磷酸的酶的基因是GPD1(g1544)基因，其中该基因可以包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

在本发明的一个实施方案中，从YBC菌株中去除了作为主要ADH基因的g4423基因，将源自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的、SEQ ID NO：12的LDH基因引入到g4423基因的位置处，从中去除作为CYB2基因的g3002基因(以下称为“g3002-1基因”)，并在g3002-1基因的位置处引入LDH基因，以构建重组菌株YBC2。从重组菌株YBC2中除去g2947基因，并将LDH基因导入其中，以构建重组菌株YBC4。从重组菌株YBC4中除去作为GPD1基因的g1544基因，以构建重组菌株YBC5。培养重组菌株，并证实检测到了菌株的乳酸产生能力提高，乙醇产生能力和甘油产生能力受到抑制。

根据本发明，重组菌株的特征在于，可以进一步缺失编码乙醇脱氢酶的基因(ADH基因)，该编码乙醇脱氢酶的基因是g4423基因，并且该g4423基因包含SEQ ID NO：6或SEQID NO：7的序列。

根据本发明，重组菌株的特征在于，可以进一步引入LDH基因代替ADH基因。

根据本发明，重组菌株的特征在于，可以进一步缺失编码丙酮酸脱羧酶的基因(PDC基因)，该编码丙酮酸脱羧酶的基因是g3002基因，并且该g3002基因包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的序列。

根据本发明，重组菌株的特征在于，可以进一步引入LDH基因代替PDC基因。

根据本发明，该重组菌株的特征在于，可以进一步缺失将乳酸盐转化为丙酮酸盐的细胞色素b2基因(CYB2基因)，该细胞色素b2基因是g2947基因，并且该g2947基因包含SEQID NO：10或SEQ ID NO：11的序列。

根据本发明，重组菌株的特征在于，可以进一步引入LDH基因代替CYB2基因。

根据本发明，重组菌株的特征在于，可以进一步引入LDH基因代替GPD1基因。

根据本发明，与亲本菌株，即YBC菌株(KCTC13508BP)，以及突变菌株YBC1/YBC2/YBC4菌株相比，通过g1544基因的缺失或减弱衍生自亲本菌株的YBC5菌株具有降低的或被抑制的甘油产生能力。

根据本发明，引入的编码乳酸脱氢酶的基因优选为源自瑞士乳杆菌(L.helveticus)的LDH基因，源自米根霉(R.oryzae)的LDH基因或源自植物乳杆菌(L.plantarum)的LDH基因，更优选为源自植物乳杆菌的LDH基因。

在另一方面，本发明是具有乳酸产生能力的重组菌株，其中，从耐酸酵母YBC菌株(KCTC13508BP)中缺失编码将磷酸二羟丙酮转化为甘油-3-磷酸的酶GPD1基因、编码将乳酸盐转化为丙酮酸盐的酶的CYB2基因、编码乙醇脱氢酶的ADH基因以及编码丙酮酸脱羧酶的PDC基因，并且其中将编码乳酸脱氢酶的基因引入该耐酸酵母YBC菌株中。

根据本发明，编码乳酸脱氢酶的基因在缺失的CYB2基因、ADH基因、PDC基因和GPD1基因中的至少一个的位置处引入，并由被缺失和替换的基因的启动子调节。

在本发明的一个实施方案中，与YBC4菌株(Δg4423：：ldh/Δg3002-1：：ldh/Δg2947：：ldh)相比，YBC5菌株(Δg4423：：ldh/Δg3002-1：：ldh/Δg2947：：ldh/Δg1544)表现出大大降低的甘油产生能力。尽管甘油没有被完全除去，但是就菌株的环境适应性而言，这是相当有利的。换句话说，完全丧失甘油产生能力的菌株丧失了作为其原始功能的对诸如外部渗透压的胁迫环境(stress environment)的适应能力，并且变得很弱。这些菌株不能承受诸如一般商业规模的压力、盐浓度和产物抑制之类的胁迫(stress)，因此不能正常进行发酵。因此，本发明的菌株表现出非常优异的性能，以实现所需的甘油减少(glycerolreduction)而不会引起不利影响。

因此，另一方面，本发明涉及一种生产乳酸的方法，其包括(a)培养重组菌株以产生乳酸，和(b)收集产生的乳酸。

根据本发明，可以预期具有大幅度增加的乳酸盐产生(lactate production)、大幅度减少的乙醇产生和大幅度减少的甘油副产物的优异的耐酸菌株。

另一方面，本发明涉及一种具有将磷酸羟基丙酮转化为甘油-3-磷酸的酶活性的基因，该基因编码与包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白具有90％以上的同源性的蛋白。

根据本发明，该基因具有将磷酸羟基丙酮转化为甘油-3-磷酸的酶活性，并且编码与包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白具有90％以上，优选95％以上，甚至更优选98％以上，并且还更优选99％以上的同源性的蛋白。

在本发明中，该基因可以包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

在另一方面，本发明涉及一种具有将磷酸二羟丙酮转化为甘油-3-磷酸的酶活性的蛋白，该蛋白与包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白具有90％以上的同源性。

在本发明中，该蛋白具有将磷酸二羟丙酮转化为甘油-3-磷酸的酶活性，并且与包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白具有90％以上，优选95％以上，甚至更优选98％以上，并且还更优选99％以上的同源性。

在另一方面，本发明涉及一种GPD1基因的启动子，其包含SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：5的核苷酸序列。

如本文所用，术语“耐酸酵母”定义为当培养基含有浓度为至少1M的有机酸(特别是乳酸)时，与培养基不含有机酸时相比，能够在小于有机酸的pKa值的pH下保持至少10％的生物质消耗率(例如糖消耗率)或至少10％的比生长速率的酵母。更具体地，术语“耐酸酵母”定义为与5以上的pH相比，在2至4的pH下能够保持至少10％的生物质消耗率(例如糖消耗率)或至少10％的比生长速率的酵母。

根据本发明的重组酵母可以通过按照常规方法将基因插入宿主酵母的染色体中或通过将包括该基因的载体引入宿主酵母中来产生。

作为宿主酵母，通常使用具有高的DNA引入效率和被引入的DNA的表达效率高的宿主细胞。在本发明的一个实施方案中，使用耐酸酵母，但是本发明不限于此，并且可以使用任何类型的酵母，只要其能够充分表达靶DNA即可。

重组酵母可以根据任何转化方法来制备。术语“转化”是指将DNA引入宿主以使DNA以染色体的系数复制或通过染色体整合引入DNA的现象，并且是指通过将外部DNA引入细胞来人工诱导遗传变化的现象。一般的转化方法包括电穿孔、乙酸锂-PEG等。

另外，在本发明中，可以使用任何通常已知的基因工程方法作为将基因插入宿主微生物的染色体中的方法。例如，存在使用逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘病毒载体、慢病毒载体、非病毒载体等的方法。“载体”是指DNA产物，其包含与可在合适的宿主中表达DNA的合适调控序列可操作地连接的DNA序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或仅仅是潜在的基因组插入物。当转化到合适的宿主中时，载体可以独立于宿主基因组复制或执行功能，或者其中一些可以与基因组整合。质粒是目前最常用的载体形式，但是线性DNA也是酵母基因组整合的常用形式。

典型的质粒载体包括(a)有效地进行复制以便在每个宿主细胞中包括预定量的质粒载体的复制起点，(b)抗生素抗性基因或营养缺陷型标记基因，以筛选用质粒载体转化的宿主细胞，和(c)插入外源DNA片段的限制酶切割位点。即使不存在适当的限制酶切割位点，也可以按照常规方法(吉布森组装)使用合成的寡核苷酸衔接子或接头容易地连接载体和外源DNA。如果需要，也通常使用合成和使用整个所需序列的方法。

此外，当一核酸序列与另一核酸序列基于彼此之间的功能关系对齐(aligned)时，称为与之“可操作地连接”。可以是以这样的方式连接的基因和控制序列，以便当合适的分子(例如转录激活蛋白)与控制序列连接时能够进行基因表达。例如，当作为参与多肽分泌的前蛋白表达时，前序列(pre-sequence)或分泌前导序列(secretory leader)的DNA可操作地连接至多肽的DNA；当启动子或增强子影响序列的转录时，启动子或增强子可操作地与编码序列连接；当核糖体结合位点影响序列的转录时，核糖体结合位点可操作地与编码序列连接；或当放置核糖体结合位点以促进翻译时，核糖体结合位点可操作地与编码序列连接。

通常，术语“可操作地连接”是指连接的DNA序列与其接触，或分泌前导序列与其接触并存在于阅读框中。但是，增强子不必与其接触。这些序列的连接是通过在方便的限制性酶切位点处进行连接(结合)来进行的。当不存在这样的位点时，使用根据常规方法的合成寡核苷酸衔接子或接头。

应当理解，就表达本发明的DNA序列而言，并不是所有的载体都具有相同的功能。同样，对于相同的表达系统，并非所有宿主都具有相同的功能。但是，本领域技术人员将能够从多种载体、表达控制序列和宿主中进行适当的选择，而没有过多的实验负担，也不会脱离本发明的范围。例如，载体的选择应考虑宿主来进行，因为载体应在宿主中复制。还应考虑载体复制的次数、控制载体复制的次数的能力以及由相应载体编码的其他蛋白的表达，例如抗生素标记(antibiotic marker)的表达。

在本发明中，碳源可包括但不限于选自葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、果糖、纤维素、半乳糖、葡萄糖低聚物和甘油中的一种或多种。

在本发明中，可以在使得诸如大肠杆菌(E.coli)等微生物不再起作用(例如，不能产生代谢产物)的条件下进行培养。例如，可以在1.0至6.5的pH，优选1.0至6.0的pH，更优选2.6至4.0的pH下进行培养，但不限于此。

在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，对于本领域技术人员而言显而易见的是，提供这些实施例仅用于举例说明本发明，而不应解释为限制本发明的范围。

实施例1：耐酸菌株YBC的基因组中产生甘油的基因的分析

本发明人通过对各种酵母菌株进行测试来选择具有耐酸性的菌株，并且通过在酵母菌株的培养开始时向培养基中添加乳酸并且监测微生物的生长和糖消耗率来确定具有最佳耐酸性的菌株，即YBC菌株，并将该菌株以保藏号为KCTC13508BP保藏在韩国生物科学与生物技术研究所的生物资源中心。

系统发育分析(Phylogenetic analysis)表明，YBC菌株(KCTC13508BP)是与酿酒酵母(S.cerevisiae)相似的菌株，是二倍体，并且为Crabtree阳性。

利用酿酒酵母和来自该YBC菌株的全基因组序列数据的生物信息学信息，鉴定g1544和g5617为分别用GPD1(甘油-3-磷酸脱氢酶1)和GPD2注释的基因，它们是存在于YBC菌株的基因组中的编码将磷酸二羟丙酮转化为甘油-3-磷酸的酶的基因。鉴定出了两个GPP基因，即g4356和g5443，它们编码将甘油-3-磷酸转化为甘油的酶，它们在YBC菌株的基因组中具有非常相似的同源性，并且根据目前的信息，很难辨别基于GPP1和GPP2的两个基因的功能。因此，这些基因被称为“GPP1 v.1”和“GPP1 v.2”。

表1比较了YBC和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的GPD1和GPD2的氨基酸序列的相似性。

[表1]

YBC和酿酒酵母菌株的GPD1和GPD2的蛋白序列同源性的比较

	YBC GPD1	YBC GPD2	Sc GPD1	Sc GPD2
					YBC GPD1	100	69.78	78.06	63.49
YBC GPD2	69.78	100	71.25	63.60
					酿酒酵母GPD1	78.06	71.25	100	65.08
酿酒酵母GPD2	63.49	63.60	65.08	100

因此，构建了能够去除GPD1基因(g1544基因)(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)及其蛋白(SEQ ID NO：3)的缺失盒，构建了能够去除GPD2基因(g5617基因)(SEQ ID NO：13和SEQID NO：14)及其蛋白(SEQ ID NO：15)的缺失盒，并构建了能够去除GPP1基因(v.1；g4356基因)(SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17)、GPP1基因(v.2；g5443基因)(SEQ ID NO：19和SEQ IDNO：20)及其蛋白(SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：21)的缺失盒。

本文中使用的缺失盒如图1所示，选择相应的限制酶位点(restriction enzymesite)或抗生素抗性基因并去除抗生素抗性基因的方法在相关技术中是众所周知的，并且可以进行各种修改来使用。

通常，当同时去除产生甘油的基因中的GPD1和GPD2或GPP1和GPP2时，菌株的生长和适应外部环境的能力被完全阻断，因此菌株对渗透压等非常敏感并且不适用于发酵，这在本领域中是众所周知的。因此，当在去除GPD1或GPD2后发现甘油减少不够充分时，从每个GPD1/2被去除的菌株中进一步去除GPP1 v1或GPP1 v2作为增强甘油减少的策略。

实施例2：GPD基因表达水平的测定

为了确认该YBC菌株的GPD1(g1544)和GPD2(g5617)的表达水平，使用以下引物和作为管家基因的ALG9基因进行RT-qPCR。本实施例中使用的RT-qPCR方法将描述如下。将对数生长期间的YBC菌株提取RNA，并使用RNA为模板生成cDNA。合成了针对靶基因(GPD1和GPD2)和管家基因(用作Ref基因)中的每一个的特异性引物，并将其用于qPCR。实验中使用的Ref基因为ALG9，用所用引物扩增的片段大小为147±3bp。

ALG9正向引物：CTTTGAGTGCAAGTATCGCC(SEQ ID NO：22)

ALG9反向引物：TGTGTAATTGTTCACCAAAGCC(SEQ ID NO：23)

GPD1(g1544)正向引物：GTCGATTCTCATGTTCGTGC(SEQ ID NO：24)

GPD1反向引物：CTTAGCGACTTCAGTAGCGA(SEQ ID NO：25)

GPD2(g5617)正向引物：CATGTATCGAATCAAGTTCGTG(SEQ ID NO：26)

GPD2反向引物：CAACTTCTGGTGCTAAATTTGC(SEQ ID NO：27)

关于该基因在该YBC菌株中的表达水平，在培养14小时后，该YBC菌株表现出的GPD1表达率是ALG9的表达率的约20倍，在培养23小时后，该YBC菌株表现出的GPD1表达率是ALG9的表达率的约70倍，并且该YBC菌株表现出非常低的GPD2表达率，与ALG9的表达率相似。

上述结果初步表明，GPD1在该YBC菌株中作为将磷酸二羟丙酮转化为甘油-3-磷酸的酶起着主要作用。为了验证其实际作用，构建了已去除每个基因的菌株。

实施例3：去除了GPD基因的重组耐酸酵母菌株的构建

从该YBC菌株的基因组中去除分别用GPD1基因、GPD2基因、GPP1v1基因和GPP1 v2基因注释的g1544基因、g5617基因、g5443基因和g4356基因以构建菌株。

用于去除基因的耐酸酵母菌株是YBC1菌株，YBC1菌株通过将LDH基因引入该常规YBC菌株(而不是YBC野生型菌株)并从中缺失ADH(乙醇脱氢酶)而构建，由此，通过从YBC1菌株中去除g3002-1基因(PDC基因)并将LDH引入其中而构建能够高效产生乳酸并且抑制乙醇产生的YBC2菌株，乳酸消耗能力被去除的YBC4菌株通过将LDH基因引入该菌株并去除消耗乳酸盐的基因g2947而构建。

通过从YBC4菌株中去除GPD1(g1544)基因(作为二倍体菌株，去除等位基因1和等位基因2,)来构建YBC5，制备下表1中的引物以鉴定该菌株的基因型，根据该菌株的基因组DNA确定该菌株的基因型。另外，同时，通过从YBC5菌株中去除GPD2(g5617)基因来构建菌株，并且比较了制备的菌株之间在发酵期间的甘油产生能力。

菌株的构建方法如下：

YBC1菌株是通过从该YBC菌株中除去作为YBC菌株的主要ADH基因的g4423基因并将源自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的SEQ ID NO：12的LDH基因引入g4423的位置而获得的菌株。基于g4423及其UTR的信息，构建去除了每个基因的ORF并包含5'UTR和3'UTR的基因盒，并将其用作供体DNA。对于g4423的每个等位基因，相应的5'UTR包含SEQ IDNO：28和SEQ ID NO：29的序列，而3'UTR包含SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31的序列。采用如上所述的使用限制性酶的克隆方法、吉布森组装和使用基因合成的方法制备供体DNA。合成SEQ ID NO：12的LDH，然后将其引入g4423的ORF位点以制备供体DNA，并且将供体DNA引入YBC以构建重组菌株YBC1。

另外，在YBC菌株的基因组测序中g3002-1基因是位于骨架72处的基因，并作为PDC基因。从YBC1菌株中去除g3002-1基因(位于骨架(scaffold)72处的基因)，并将SEQ ID NO：12的LDH基因引入其中，以构建重组菌株YBC2。

使用相应的UTR作为重组位点构建用于替换g3002基因的盒。与上述将LDH引入YBC1的g4423基因(ADH)的位点的方法类似，使用g3002-1的UTR构建盒。然而，为了简化基因替换过程，在不考虑等位基因变异的情况下制备了针对一个等位基因的供体盒，但是也可以为每个等位基因制备一个供体盒。另外，对于用于基因替换的引物，除了用于制备缺失菌株(deletion strain)的引物之外，分别使用如下能够检测LDH和g3002-1的UTR的一对引物，以提高基因替换的准确性。

g3002-1 UTR-LDH-正向：GCAGGATATCAGTTGTTTG(SEQ ID NO：32)

g3002-1 UTR-LDH-反向：AATACCTTGTTGAGCCATAG(SEQ ID NO：33)

另外，YBC4菌株是通过从YBC菌株中缺失作为YBC2菌株的主要CYB2基因的g2947基因，并在g2947的位置处引入源自植物乳杆菌的SEQ ID NO：13的LDH基因而构建的菌株。在YBC菌株的基因组测序中g2947基因是位于骨架41处的基因。基于g2947及其UTR的信息，构建去除了每个基因的ORF并包含5'UTR和3'UTR的基因盒，并将其用作供体DNA。对于g2947的每个等位基因，相应的5'UTR包含SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35的序列，而3'UTR包含SEQID NO：36和SEQ ID NO：37的序列。采用如上所述的使用限制性酶的克隆方法、吉布森组装和使用基因合成的方法制备供体DNA。

然而，为了简化基因替换过程，在不考虑等位基因变异的情况下制备针对一个等位基因的供体盒，但是也可以为每个等位基因制备一个供体盒。

菌株的构建方法如下：

YBC5菌株是通过从YBC4菌株中缺失作为YBC4菌株的GPD1基因的g1544基因而构建的菌株。在YBC菌株的基因组测序中g1544基因是位于骨架19处的基因。基于g1544及其UTR的信息，构建去除了每个基因的ORF并包含5'UTR和3'UTR的基因盒，并将其用作供体DNA。对于g1544的每个等位基因，相应的5'UTR包含SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39的序列，而3'UTR包含SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41的序列。采用如上所述的使用限制性酶的克隆方法、吉布森组装和使用基因合成的方法制备供体DNA。

为了简化基因替换过程，在不考虑等位基因变异的情况下制备了针对一个等位基因的供体盒，但是也可以为每个等位基因制备一个供体盒。另外，当使用目前商业化的基因工程技术(CRISPR)时，可以在不使用抗生素标记的情况下制备和应用供体盒。

另外，对于基因替换后用于基因分型的引物，如下表2所示，可用于鉴定g1544和g5617的基因型以增加基因替换鉴定的准确性的引物对将在后面详细描述，如表2所示。

[表2]

用于鉴定g1544和g5617的引入的引物组

制备的重组菌株的基因型如下：

YBC2：Δg4423：：ldh/Δg3002-1：：ldh，

YBC4：Δg4423：：ldh/Δg3002-1：：ldh/Δg2947：：ldh，

YBC5：Δg4423：：ldh/Δg3002-1：：ldh/Δg2947：：ldh/Δg1544，

YBC5a：Δg4423：：ldh/Δg3002-1：：ldh/Δg2947：：ldh/Δg5617。

实施例4：在通过从YBC4菌株中缺失GPD1基因而构建的重组YBC菌株中确认乳酸产生作用和甘油产生抑制作用

对于实施例3中构建的重组菌株YBC5和重组菌株YBC5a，接种OD为0.5，此处使用的培养基为补充有10％葡萄糖的m-YP培养基(5g/L蛋白胨，4g/L酵母提取物，5g/L KH₂PO₄，2g/L MgSO₄·7H₂O，0.15g/L尿嘧啶)，在500ml烧瓶中于30℃和150rpm下培养64小时。

[表3]

YBC4、YBC5和YBC5a的培养结果

结果，从表3可以看出，与YBC4菌株相比，YBC5菌株表现出80％的甘油产生抑制(glycerol-producing inhibition)，但是产生了少量的甘油。如上所述，甘油在微生物对环境的适应中，特别是对渗透压的适应中起关键作用，通过同时去除GPD1和GPD2或同时去除GPP1和GPP2来完全抑制甘油产生会使菌株对渗透压极为敏感，并使菌株无法正常生长和发酵。因此，认为YBC5当前的甘油减少率(glycerol reduction rate)是合适的。然而，在该菌株中，甘油的减少并没有直接极大地影响乳酸产生的增加，但是甘油分布在各种其他副产物中。因此，需要使用一种方法来提高未来乳酸发酵的产率。

甘油还可能影响环保聚合物PLA的产生过程中的聚合反应，据报道，在甘油的存在下，由于甘油的结构，PLA的结构从线性形式变为支链形式(Wen Shen et al.,R.Soc.opensci.5:180134,2018)。PLA结构的这种变化可能会在许多后续过程中起到杂质的作用，例如，可能会通过L型PLA和D型PLA(两者之间互为光学异构体)之间的范德华力影响立体复合PLA的物理性质和形成，以及用于转化为丙交酯的乳酸低聚物的形成。当然，可能存在通过用于去除甘油的纯化过程来减少甘油的方法，但是通过本发明中的基因工程来减少甘油是减少后续工艺中此类问题发生率的有效策略。

与去除了GPD1的YBC5菌株相比，去除了GPD2的YBC5a菌株表现出有些难以理解的结果，包括几乎没有减少甘油的作用，减少乳酸生成和增加乙醇生成。已确定从中去除了GPD2的YBC5a菌株不适合用作乳酸产生菌株，因为它抑制了整体的乳酸发酵。

在用于构建YBC5菌株的YBC1菌株至YBC4菌株的制备中，当去除主基因时引入了LDH基因，以提高菌株的乳酸产生能力。然而，在YBC5菌株的制备中，当去除GPD1基因时没有引入LDH基因。其原因是，在三个位置处引入了源自植物乳杆菌的SEQ ID NO：12的两个LDH基因(总共6个基因)，因此可以预测，考虑到内部反馈调节，引入上述相同的基因对额外增加活性的影响可以忽略不计，并且如实施例2所述，GPD1/2在一般条件下的表达率高于Ref基因ALG9的表达率，但低于ADH或PDC的表达率，并且当基因组中存在彼此类型相同的多个基因时，基因组可能不稳定。

实施例5：YBC5菌株的发酵性能的评估

在该实施例中，在生物反应器中而不是在烧瓶培养物中培养YBC5菌株，以确认其乳酸发酵性能。

将YBC5菌株在mYP培养基(5g/L蛋白胨、4g/L酵母提取物、5g/LKH₂PO₄、2g/LMgSO₄·7H₂O和0.15g/L尿嘧啶)中培养，在2天内，在40ml mYP培养基中进行第一次种子培养(seed culture)，并在220ml mYP培养基中进行第二次种子培养，然后收获所有细胞并接种在2L mYP培养基中。接种OD为0.85，在补充有12％葡萄糖的mYP培养基中开始培养，并将CaCO₃溶液间歇地注入培养基中以保持pH为3。在30℃和500rpm，空气流量为0.25vvm的条件下进行培养。

结果，从图2可以看出，YBC5菌株在短时间内在生物反应器中消耗了所有葡萄糖并产生乳酸，并且在最终pH为3.3时，乳酸产率为0.81(g/g)，生产率为1.6g/L/小时，所产生的乳酸的浓度为88.2g/L，甘油的产率为0.01(g/g)。这表明在生物反应器中获得了与实施例3相同的结果。另外，基于未来的初始OD和培养条件的改善，期望该性能的进一步改善是可能的。

尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但是本领域技术人员将理解，提供该描述出于说明性目的提出了优选的实施方案，并不应解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> SK 新技术株式会社(SK INNOVATION CO., LTD.)

<120> 甘油产生受到抑制的重组耐酸酵母和使用其生产乳酸的方法

<130> KHP212110301.1

<150> 10-2020-0046779

<151> 2020-04-17

<160> 53

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1170

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GPD1_g1544 基因 等位基因1_ORF

<400> 1

atggttgcta ccgatagatt aaatcaaact tctaatattt tacataaatc aatgaaaaga 60

gcttcaagta tagcgcatct aactgcttta gatcatcctt ttaaaattgc tgttatcggt 120

tccggtaact ggggtactac tatcgctaaa gtagtctctg aaaatgcagc tttaaatcca 180

caattatttg cttccgaagt aagaatgtgg gtctttgaag aaaaaattga tggtaaaaat 240

ttaacagaaa ttataaatac agatcatgaa aatgttaaat atttaccaaa tattaaatta 300

ccagtaaatt taatcgctac tccagatctt ttaaagactg tagaaggcgc agatataatc 360

attttcaata ttcctcatca attcttaact agaattgtac aacaattgaa aggtcatgtc 420

gattctcatg ttcgtgcaat ctcatgtcta aagggtttcg aagtcggtgc tagaggtgta 480

caattactat ccacttatat caccgatgaa ttaggtatcg aatgtggtgc tttatcaggt 540

gccaatatcg ctactgaagt cgctaaggaa aactggtcag aaactaccgt tgcctatcat 600

atcccagaag atttcagagg tgaaggttac gatgtagatc ataaagtatt aaaggcttta 660

ttccacagac cttatttcca cgtctctgtc attgaagatg tcgcaggtat ctctgttgcc 720

ggtgctttga aaaacgttgt cgctttaggt tgtggtttcg tcgaaggttt aggctggggt 780

aataatgctt ctgcagctat tcaaagagtc ggtcttggtg aaatcatcaa gtttggtcaa 840

atgttcttcc cagaatctcg tgtcgaaact tattatcaag aatccgcagg tgtcgcagat 900

ttaattacta cttgtgcagg tggtagaaac gttaaagttg ctaaattaat ggctgaaagt 960

ggtatgagtg ccttagatgc tgaaaagaaa ttattaaatg gtcaatctgc tcaaggtatt 1020

attacttgta aagaagttca tgaatggtta gaaacttgta attcaatttc tgaattccca 1080

ttatttgaag ccgtttatca aattatttac aataatttac caatggaaaa tatacctgat 1140

atgatcgatg aattagaagt tttccgttaa 1170

<210> 2

<211> 1170

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GPD1_g1544 基因 等位基因2_ORF

<400> 2

atggttgcta ccgatagatt aaatcaaact tctaatattt tacataaatc aatgaaaaga 60

gcttcaagta tagcgcatct aactgcttta gatcatcctt ttaaaatcgc tgttatcggt 120

tccggtaact ggggtactac tatcgctaaa gtagtctctg aaaatgcagc tttaaatcca 180

caattatttg cttccgaagt aagaatgtgg gtctttgaag aaaaaattga tggtaaaaat 240

ttaacagaaa ttataaatac agatcatgaa aatgttaaat atttaccaaa tatcaaatta 300

ccagtaaatt taatcgctac tccagatctt ttaaagactg tcgagggtgc agatataatc 360

attttcaata ttcctcatca attcttaact agaattgtac aacaattgaa aggtcatgtc 420

gattctcatg ttcgtgcaat ctcatgtcta aagggtttcg aagtcggtgc tagaggtgta 480

caattactat ccacttatat caccgatgaa ttaggtatcg aatgtggtgc tttatcaggt 540

gctaatatcg ctactgaagt cgctaaggaa aactggtccg aaactaccgt tgcttatcat 600

atcccagaag atttcagagg tgaaggttac gatgtagatc ataaagtatt aaaggcttta 660

ttccatagac cttatttcca cgtctccgtg attgaagatg tcgcaggtat ctctgttgcc 720

ggtgctttga aaaacgttgt cgctttaggt tgtggtttcg tcgaaggttt aggctggggt 780

aataatgctt ctgcagctat tcaaagagtc ggtcttggtg aaattatcaa gtttggtcaa 840

atgttcttcc cagaatctcg tgtcgaaact tattatcaag aatccgcagg tgtcgcagat 900

ttaattacta cttgtgcagg tggtagaaac gttaaagttg ctaaattaat ggctgaaagt 960

ggtatgagtg ccttagatgc tgaaaagaaa ttattaaatg gtcaatctgc tcaaggtatt 1020

attacttgta aagaagttca tgaatggtta gaaacttgta attcaatttc tgaattccca 1080

ttatttgaag ccgtttatca aattatttac aataatttac caatggaaaa tatacctgat 1140

atgatcgatg aattagaagt tttccgttaa 1170

<210> 3

<211> 389

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GPD1(g1544)等位基因1/2_ORF

<400> 3

Met Val Ala Thr Asp Arg Leu Asn Gln Thr Ser Asn Ile Leu His Lys

1 5 10 15

Ser Met Lys Arg Ala Ser Ser Ile Ala His Leu Thr Ala Leu Asp His

20 25 30

Pro Phe Lys Ile Ala Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr Ile

35 40 45

Ala Lys Val Val Ser Glu Asn Ala Ala Leu Asn Pro Gln Leu Phe Ala

50 55 60

Ser Glu Val Arg Met Trp Val Phe Glu Glu Lys Ile Asp Gly Lys Asn

65 70 75 80

Leu Thr Glu Ile Ile Asn Thr Asp His Glu Asn Val Lys Tyr Leu Pro

85 90 95

Asn Ile Lys Leu Pro Val Asn Leu Ile Ala Thr Pro Asp Leu Leu Lys

100 105 110

Thr Val Glu Gly Ala Asp Ile Ile Ile Phe Asn Ile Pro His Gln Phe

115 120 125

Leu Thr Arg Ile Val Gln Gln Leu Lys Gly His Val Asp Ser His Val

130 135 140

Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Ala Arg Gly Val

145 150 155 160

Gln Leu Leu Ser Thr Tyr Ile Thr Asp Glu Leu Gly Ile Glu Cys Gly

165 170 175

Ala Leu Ser Gly Ala Asn Ile Ala Thr Glu Val Ala Lys Glu Asn Trp

180 185 190

Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr His Ile Pro Glu Asp Phe Arg Gly Glu

195 200 205

Gly Tyr Asp Val Asp His Lys Val Leu Lys Ala Leu Phe His Arg Pro

210 215 220

Tyr Phe His Val Ser Val Ile Glu Asp Val Ala Gly Ile Ser Val Ala

225 230 235 240

Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Glu Gly

245 250 255

Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly Leu

260 265 270

Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Gln Met Phe Phe Pro Glu Ser Arg Val

275 280 285

Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr Thr

290 295 300

Cys Ala Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Lys Leu Met Ala Glu Ser

305 310 315 320

Gly Met Ser Ala Leu Asp Ala Glu Lys Lys Leu Leu Asn Gly Gln Ser

325 330 335

Ala Gln Gly Ile Ile Thr Cys Lys Glu Val His Glu Trp Leu Glu Thr

340 345 350

Cys Asn Ser Ile Ser Glu Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln Ile

355 360 365

Ile Tyr Asn Asn Leu Pro Met Glu Asn Ile Pro Asp Met Ile Asp Glu

370 375 380

Leu Glu Val Phe Arg

385

<210> 4

<211> 1328

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> g1544 基因 启动子 等位基因1

<400> 4

agaaaatagt ttctccgatt aaattttttt ttcaaatcaa atctttattt aagaattggt 60

agtgtatagt agtataatat tgcctaagaa attggagtag tccgtaaaaa atgggacaaa 120

attgttgaaa ttgagcaacc tgaaaatttt atgctggtct caagtagaga aacagacgta 180

gaaccaaaat tgacccaatt tcttgttgcc tttaattggg tcattcataa gaattcaaaa 240

tattttcttt tcccactcac gcgagagata tgcgcacacg atatagttaa taccgcttgt 300

aacaatacgt agatggccaa aaatgaacaa aaggggacac tcctcaaaag aaaaaattgc 360

ttgtttggct gtcttctcca attgaaatat acacacacac cgcggtaaaa aaaaaattga 420

aatggaaatc gcggtgggac aaaagtagca accacaacaa gggaattttc cttactgctg 480

cggcagatcc ttactcatct ctcgaatata tatagcctct tgggtccacg ggcaaaaaag 540

aaataaaaaa aagagaagca acagaaccgc acgcaacgta cgcagtgatc catccatttt 600

ccacaaaatt tatctatttt cttgtctata ttttttacgt acaactaact gatcttcttg 660

tccccctccc cccatttacc cgttaaaatg aaagctgaac aacagaaaat aataattcgc 720

tctggtggac aaaaaataca agaacaagag agtatcataa ttatgtgggt cacaaatgac 780

cctacaactg tcacctagtt ggtacaaaat ttgaccctca ttctcaaata attactacat 840

ttgggtctgt attaatgcta atatttcaat atatctctat ctatcagtca catacaaatt 900

tatcttcatc ttaaagggac tcacttactc aataatggtc tatctttata tttttttcat 960

acgtatgtat gtacgtagta aagggccatc aatgatccat cttactatta ttattcttta 1020

gttatttcta agcaacaaaa ggtctgtacc acagtttcag tgtcgtcata cctcttcttt 1080

taatttcttt tcggggaggg atgtcttaat gctaacttct gtctcactat taacggtaaa 1140

tcgtattaat ctcaatatat atataaaggg ttgatatttt ccaccgtttt aaaaattatt 1200

cccttgtttc tctattatta attttagact acttatttta attatttttc ccttttttac 1260

ttattatata tatataacta tatattacca ataataatat aagcaatcac atatatttat 1320

cccattaa 1328

<210> 5

<211> 1328

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> g1544 基因 启动子 等位基因2

<400> 5

agaaaatagt ttctccgatt aaattttttt ttcaaatcaa atctttattt aagaattggt 60

agtgtatagt agtataatat tgcctaagaa attggagtag tccgtaaaaa atgggacaaa 120

attgttgaaa ttgagcaacc tgaaaatttt atgctggtca caagtagaga aataggcgta 180

gaaccaaaat tgacccaatt tcttgttgcc tttaattggg tcattcataa gaattcaaaa 240

tattttcttt tcccactcac gcgagagata tgcgcacacg atataattaa taccgtttgt 300

aacaatacgt agatggccaa aaatgaacaa aatgggacac tcctcaaaag gaaaaattgc 360

ttgtttggct gtcttctcca attgaaatat acacacacac cgcggtaaaa aaaaaattga 420

aattgaaatc gcggtgggac aaaagtagca accacaacaa gggaattttc cttactgctg 480

cggcagatcc ttactcatct cttgaatata tatagcctct tgggtccacg ggcaaaaaag 540

aaaaaaaaaa aagagaagca acagaaccgc acacaacgta cgcagtgatc catccatttt 600

ccacaaaatt tatttatttt cttgtctgta ttatttacgt acaactaact gatcttcttg 660

tccccccccc cccatttacc cgttaaaatg aaagctgaac aacagaaaat aataattcgc 720

tctgatggac aaaaaataca agaacaagag agtatcatca ctatgtgggt cacaaatgac 780

cctacaactg taatctagtt gatacaaaat ttgaccctca ttctcaaata attactacat 840

ttgggtctgt attaatacta atatctgtat atctctctat ctatcagtca catacaaatt 900

tatcttcatc ttaaagggac tcacttactc aataatggtc tatctttata tttttatcat 960

acgtatgtat gtacgtagta aagggccatc aatgatccat attattatta ttattcttta 1020

gttatttcta agcaacaaaa ggtctgtacc acagtttcag tgtcgtcata tctcttattt 1080

taatttcttt tcggggaggg atgtcttaat gctaacttct gtctcactat taacggtaaa 1140

tcttattaat ctcaatatat atataaaggg ttgatatttt ccaacgtttt aaaacttatt 1200

cccttgtttc tatattacta atttaacatt acttatttta attatttttc ccttttttac 1260

ttattatata tatataagta catattacca ataataatat aagcaatcac atatatttat 1320

cccattaa 1328

<210> 6

<211> 1047

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ADH 基因(g4423) 等位基因1_ORF

<400> 6

atgtctattc caactactca aaagggtgtt atcttctacg aatctagagg taagctagaa 60

tacaaggaca ttccagtccc aactccaaag gctaacgaat tattaatcaa cgttaagtac 120

tctggtgttt gtcacactga tttacacgct tggcacggtg actggccatt gccagttaag 180

ctacctttag tcggtggtca cgaaggtgcc ggtgttgtcg tcgccattgg tgaatccgtt 240

aagggctgga agatcggtga ttacgccggt attaaatggt taaacggttc ttgtatgaac 300

tgtgaatact gtgaattagg taacgaatct aactgtccag aagctgattt atctggttac 360

actcacgatg gttctttcca acaatacgct accgctgatg ctatccaagc tgctaagatc 420

ccagccggta ccgatctagc cgaagttgct ccaatcttat gtgctggtgt taccgtctac 480

aaggctctaa agtccgctaa cctaagagct ggtgaatggt gtgctatctc cggtgctgct 540

ggtggtctag gttctctagc tgtccaatac gctaaggcta tgggttacag agtcgtcggt 600

attgacggtg gtgaagaaaa ggaaaagcta ttcaagtcta ttggtggtga agttttcgtc 660

gatttcacta aggaaaagga tatcattggt actattgtca aggccactaa cggtggtgct 720

cacggtgtta tcaacgtctc cgtctctgaa gccgctatcg aagcttctac caagtacgtt 780

agagctaacg gtacctccgt tttagtcggt atgccagctg gtgccgtctg tagatccgat 840

gtctttgacc acgtcgtcaa gtccatctct attgtcggtt cttacgtcgg taacagagct 900

gataccagag aagctctaga cttcttcgcc agaggtttag tcaagtctcc aatcaagatt 960

gctccattat ctgacttacc agaaattttc gaaaagatgg aaaagggtca aatcgttggt 1020

agatacgttg ttgacacttc taactaa 1047

<210> 7

<211> 1047

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ADH 基因(g4423) 等位基因2_ORF

<400> 7

atgtctattc caactactca aaagggtgtt atcttctacg aatctagagg taagctagaa 60

tacaaggaca ttccagtccc aactccaaag gctaacgaat tattaatcaa cgttaagtac 120

tctggtgttt gtcacactga tttacacgct tggcacggtg actggccatt gccagttaag 180

ctacctttag tcggtggtca cgaaggtgcc ggtgttgtcg tcgccatggg tgaatccgtt 240

aagggctgga agatcggtga ttacgccggt attaaatggt taaacggttc ttgtatgaac 300

tgtgaatact gtgaattagg taacgaatct aactgtccag aagctgattt atctggttac 360

actcacgatg gttctttcca acaatacgct accgctgatg ctatccaagc tgctaagatc 420

ccagccggta ccgatctagc cgaagttgcc ccaatcttat gtgctggtgt taccgtctac 480

aaggctctaa agtccgctaa cctaagagct ggtgaatggt gtgctatctc cggtgctgct 540

ggtggtctag gttctctagc tgtccaatac gctaaggcta tgggttacag agtcgtcggt 600

attgacggtg gtgatgaaaa ggaaaagcta ttcaagtcca ttggtggtga agttttcgtc 660

gatttcacta aggaaaagga tatcattggt actattgtta aggccactaa cggtggtgct 720

cacggtgtta tcaacgtctc cgtctctgaa gccgctatcg aagcttctac caagtacgtt 780

agagctaacg gtacctccgt tttagtcggt atgccagctg gtgctgtctg tagatccgat 840

gtctttgacc acgtcgtcaa gtccatctct attgtcggtt cttacgtcgg taacagagct 900

gataccagag aagctctaga cttcttcgcc agaggtttag tcaagtctcc aatcaagatt 960

gctccattat ctgacttacc agaaattttc gaaaagatgg aaaagggtca aatcattggt 1020

agatacgttg ttgacacttc taactaa 1047

<210> 8

<211> 1690

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PDC 基因(g3002) 等位基因1_ORF

<400> 8

atggctgaaa ttcaattagg tcgttactta ttcgaaagat taaagcaagt taaatgtact 60

accgttttcg gtttaccagg tgatttcaac ttggtcttat tagacaagtt atacgaagtc 120

gaaggtatga gatggtccgg tgacactaac gaattaaacg ctgcttacgc tgctgatggt 180

tacgctagag ttaagggtat ggccgctatg atcaccactt tcggtgtcgg tgaattatcc 240

gctttaaacg gtattgccgg ttcttactct gaacacgtcg gtgttttaca cattgtcggt 300

tgtccatcta ctttactaca agctaagggt ctattattac accacacctt agctgatggt 360

gacttcgatg tcttccacag aatgtctgct aacatctctt gtactacctc tatgatcact 420

gacattgcca ctgctccaag tgaaattgac agatgtatca gagctactta catcaaccaa 480

agaccagtct acttaggttt cccatctgac tactttgaaa agactgttcc agcttctcta 540

ttacaaactc caattgactt atctctaaag gctaacgatg ctgcttctga agatgaagtt 600

attgaagaaa tcttaaccat ggttaaggct gctaagaacc caatcatcat tgctgatgct 660

tgttcttcca gacacaacgt taaggctgaa accaagaagt tagtcgatgt taccaacttc 720

ccagccttcg ctactcctct aggtaaggcc gtcattgacg aaactcaccc aagattcggt 780

ggtatctacg ttggttctct atccagacca gctgtcaagg aagccgttga atccgctgat 840

ttaatcttat ctgtcggtgc tctattatcc gattacaaca ctgcttcttt cacttacggt 900

tacaacacca agaacattgt tgaattccac tccgaccaca tgaagatcag aaacgctacc 960

ttcccaggtg tccaaatgaa attcgttcta caaagattac taaaggtcat cggtgaagct 1020

aacaagggtt acaaggccgt tgctacccca gctaaggctc cagctaacgc tgaagtccca 1080

gcttctactc cattgaagca agaatggtta tggaacgaag tttccaactt cttccaagaa 1140

ggtgatgtta tcatcactga aaccggtact tcttccttcg gtatcaactc ctctgtcttc 1200

ccagccaaca ctattggtat ctctcaagtc ttatggggtt ccattggtta cgctggtggt 1260

gctgttgccg gtgctgcttt cgccgctgaa gaaattgacc cagctaagag agtcattcta 1320

ttcattggtg acggttctct acaattaacc gttcaagaaa tctccaccat tgttagatgg 1380

ggtctaaagc catacttatt cgtcttaaac aacgatggtt acaccattga aagattaatt 1440

cacggtccaa aggctcaata caacgaaatt caaaactggg ataacttaaa gattctacca 1500

accttcggtg ctaaggacta cgaaactcac agagttgcta ccactggtga atggaagaag 1560

ttgatcgctg acaaggcttt caacgttcca tctaagatca gaatgatcga agttatgtta 1620

ccagttatgg atggtccagc tgctttgatc gctcaaggta agctatccga agaaatgaac 1680

gctgctatgt 1690

<210> 9

<211> 1689

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PDC 基因(g3002) 等位基因2_ORF

<400> 9

atggctgaag ttcaattagg tcgttactta ttcgaaagat taaagcaagt taactgtact 60

accgttttcg gtttaccagg tgatttcaac ttggtcttat tagacaagtt atacgaagtc 120

gaaggtatga gatggtccgg tgacactaac gaattaaacg ctgcttacgc tgctgatggt 180

tacgctagag ttaagggtat ggccgctatg atcaccactt tcggtgtcgg tgaattatcc 240

gctttaaacg gtattgccgg ttcttactct gaacacgtcg gtgttttaca cattgtcggt 300

tgtccatcta ctttactaca agctaagggt ctattattac accacacctt agctgatggt 360

gacttcgatg tcttccacag aatgtctgct aacatctctt gtactacctc tatgatcact 420

gacattgcca ctgctccaag tgaaattgac agatgtatca gagctactta catcaaccaa 480

agaccagtct acttaggttt cccatctgac tactttgaaa agactgttcc agcttctcta 540

ttacaaactc caattgactt atctctaaag gctaacgatg ctgcttctga agatgaagtt 600

attgaagaaa tcttaaccat ggttaaggct gctaagaacc caatcatcat tgctgatgct 660

tgttcttcca gacacaacgt taaggctgaa accaagaagt tagtcgatgt taccaacttc 720

ccagccttcg ctactcctct aggtaaggcc gtcattgacg aaactcaccc aagattcggt 780

ggtatctacg ttggttctct atccagacca gctgtcaagg aagccgttga atccgctgat 840

ttaatcttat ctgtcggtgc tctattatcc gattacaaca ctgcttcttt cacttacggt 900

tacaacacca agaacattgt tgaattccac tccgaccaca tgaagatcag aaacgctacc 960

ttcccaggtg tccaaatgaa attcgttcta caaagattac taaaggtcat cggtgaagct 1020

aacaagggtt acaaggccgt tgctacccca gctaaggctc cagctaacgc tgaagtccca 1080

gcttctactc cattgaagca agaatggtta tggaacgaag tttccaactt cttccaagaa 1140

ggtgatgtta tcatcactga aaccggtact tcttccttcg gtatcaactc ctctgtcttc 1200

ccagccaaca ctattggtat ctctcaagtc ttatggggtt ccattggtta cgctggtggt 1260

gctgttgccg gtgctgcttt cgccgctgaa gaaattgacc cagctaagag agtcattcta 1320

ttcattggtg acggttctct acaattaacc gttcaagaaa tctccaccat tgttagatgg 1380

ggtctaaagc catacttatt cgtcttaaac aacgatggtt acaccattga aagattaatt 1440

cacggtccaa aggctcaata caacgaaatt caaaactggg ataacttagc tctattacca 1500

ttattcggtg ctaaggacta cgaaactcac agagttgcta ctaccggtga atggaagaga 1560

ttagttgctg acaaggcctt caacgttcca tctaagatta gaatgattga aatcatgtta 1620

ccagttatgg acggtccagc tgctttgatt gctcaaggta agctatccga agaaatgaac 1680

gctgctatg 1689

<210> 10

<211> 1851

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CYB2 基因(g2947) 等位基因1_ORF

<400> 10

atgcaagcaa tttcaaaaaa ttcaacattt ttacgtaatt gtaaaaattt gaaatttatt 60

tcaaagaaca ttaataatag gaagttatct tcttcatcta taactttatc acaattacaa 120

tcaattaaaa ctaataccaa ttataagaat tattcttcca aaaatttacg taattcatta 180

attttattat cgtctgtatc atttttagct tattacgcta atgatcaatt acaacataat 240

actaattcat taatatctaa tgataatggt aagaatccag ctgctaataa gaaaccaatc 300

tctccagcag aagttgctaa acataacaaa ccagatgatt gttgggtagt tattgacggt 360

tacgtttacg atgtctcttt ctttattcca aatcatccag gtggtgaaga tgtcattaga 420

gctaatgcag gtaaggatgt taccgctatc ttcatgccat tacatgctaa gggtaccctt 480

gaaaagaata ttccaattga aaatcaatta ggtccattaa gtaaaccaat gcctaaaaaa 540

ttagtttgtc caccttatgc tcctggtgag acaccttatg aaattatgac taaacaaaaa 600

ttaagagata atatgccacc attaggcaca attttaaatc tttatgattt tgagagatta 660

gcttcaaaaa ttttaactaa tcaagcttgg gcttattatt cttctggtgc agatgatgaa 720

attacatata gagaaaacca taacgcttat catagaatct ttttcaaacc acatatttta 780

gtcgatgtta aggatgtcga tttgaagact actatgttag gtaataagac cgatgttcca 840

ttctatgtta gtgctactgc tttatgtaaa ttaggtaatc cagaaggtgg tgaagttgat 900

atcgctaaag gttgtggttc aacttcttat atggttcctc aaatgatttc tactttagct 960

tcttgttcat tagatgaagt cgcccagggg aaagctaacg ataaacaatt acaatggttt 1020

caattatatg ttaattccga tagaaagatt actagaaatt taattaaaca tgctgaagat 1080

ttaggtatga aggctatctt cgtcacagtt gatgctcctt ctttaggtaa tagagaaaag 1140

gatcaaaaga ttaaatttac tactcaaggt tctgagggtc caaagatttt acaaaagaaa 1200

ggtgattcct ccaatgctgc tgctgaagca aagaagaaag aaaataaatc cgatggtgcc 1260

tctaaagctt tatctaaatt tatcgatcct tctttgtcct gggaagatat cgcaaagatg 1320

agaaaattga ctaaattacc aatcgttatt aagggtgttc aaagagctga agatgctgta 1380

agagcagctc aaatgggttg tcaaggtgtt gttctttcaa atcatggtgg tagacaatta 1440

gatttctcaa gagccccaat tgaagttctt gcagagacta tgccaatttt gaaacatcat 1500

ggtctagata agaatttcga tgtctttgtc gatggtggta ttcgccgtgg tactgatatc 1560

ttaaaggcat tgtgtcttgg tgctacaggt gttggtttag gtagaccttt cttatatgct 1620

aattcttgtt atggtagaga tggtgttgct catgctattg atatcattac caaagaatta 1680

gaaatgtcta tgagattatt aggtgttagc aaaattgagg atttgaatcc aggtttctta 1740

gatttacaat ctttacatgc cagatctgtt cttgttgcta aggatgcatt atatgaaaat 1800

tcatacaagg aaccacaact agctaaattc ttaattgacg acgatgatta g 1851

<210> 11

<211> 1827

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CYB2 基因(g2947) 等位基因2_ORF

<400> 11

atgcaagcaa ttaattttaa aaatttgaaa tttatttcaa agaacattaa taataggaag 60

ttatcttctt catctataac tttatcacaa ttacaatcaa ttaaaacaaa taccaattac 120

aagaattatt cttccaaaaa tttacgtaat tcattaattt tattatcttc tgtatcattt 180

ttagcttatt acgctaatga tcagttacaa cagaatacta attcattaat atctaatgaa 240

aatggtaaga atccagctgc taataagaaa ccaatctctc cagcagaagt tgctaaacat 300

aacaaaccag atgattgttg ggtagttatt gacggttacg tttacgatgt ctctttcttt 360

attccaaatc atccaggtgg tgaagatgtc attagagcta atgcaggtaa ggatgttacc 420

gctatcttca tgccattgca tgctaagggt acccttgaaa agaatattcc aattgaaaat 480

caattaggtc cattaagtaa accaatgcct aaaaaattag tttgtccacc ttatgctcct 540

ggtgagacac cttatgaaat tatgactaaa caaaaattga gagataatat gccaccatta 600

ggtacaattt taaatcttta tgattttgaa agattagctt caaaaatttt aactaatcaa 660

gcttgggctt attattcttc tggtgcagat gatgaaatta catatagaga aaaccataac 720

gcttatcata gaatcttttt caaaccacat attttagtcg atgttaagga tgtcgatttg 780

aagactacta tgttaggtaa taagaccgat gttccattct atgttagtgc tactgcttta 840

tgtaaattag gtaatccaga aggtggtgaa gttgatatcg ctaaaggttg tggttcaact 900

tcttatatgg ttcctcaaat gatttctaca ttagcttctt gttcattaga tgaagtcgcc 960

caagggaaaa ctaacgataa acaattacaa tggtttcaat tatatgttaa ttccgataga 1020

aagattacta gaaatttaat taaacatgct gaagatttag gtatgaaggc tatcttcgtc 1080

acagttgatg ctccttcttt aggtaataga gaaaaggatc aaaagattaa atttactact 1140

caaggttctg agggtccaaa gattttacaa aagaaaggtg attcctccaa tgctgctgct 1200

gaagcaaaga agaaagaaaa taaatccgat ggtgcctcta aagctttatc taaatttatc 1260

gatccttctt tgtcttggga agatatcgca aagatgagaa aattgactaa attaccaatc 1320

gttattaagg gtgttcaaag agctgaagat gctgtcagag cagctcaaat gggttgtcaa 1380

ggtgttgttc tttcaaatca tggtggtaga caattagatt tctcaagagc cccaattgaa 1440

gttcttgcag agactatgcc aattttgaaa catcatggtc tagataagaa tttcgatgtc 1500

tttgtcgatg gtggtattcg tcgtggtact gatatcttaa aggcattatg tcttggtgct 1560

acaggtgttg gtttaggtag acctttctta tatgctaatt cttgttatgg tagagatggt 1620

gttgctcatg ctattgatat cattaccaaa gaattagaaa tgtctatgag actattaggt 1680

gttagtaaaa ttgaggattt gaatccaggt ttcttagatt tacaatcttt acatgccaga 1740

tctgttcttg ttgctaagga tgcattatat gaaaattcat acaaggaacc acaactagct 1800

aaattcttaa ttgacgacga tgattag 1827

<210> 12

<211> 963

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 源自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的ldh 基因

<400> 12

atgtcttcta tgccaaatca tcaaaaagtt gttttggttg gtgatggtgc tgttggttct 60

tcttatgctt ttgctatggc tcaacaaggt attgctgaag aatttgttat tgttgatgtt 120

gttaaagata gaactaaagg tgatgctttg gatttggaag atgctcaagc ttttactgct 180

ccaaaaaaaa tttattctgg tgaatattct gattgtaaag atgctgattt ggttgttatt 240

actgctggtg ctccacaaaa accaggtgaa tctagattgg atttggttaa taaaaatttg 300

aatattttgt cttctattgt taaaccagtt gttgattctg gttttgatgg tatttttttg 360

gttgctgcta atccagttga tattttgact tatgctactt ggaaattttc tggttttcca 420

aaagaaagag ttattggttc tggtacttct ttggattctt ctagattgag agttgctttg 480

ggtaaacaat ttaatgttga tccaagatct gttgatgctt atattatggg tgaacatggt 540

gattctgaat ttgctgctta ttctactgct actattggta ctagaccagt tagagatgtt 600

gctaaagaac aaggtgtttc tgatgatgat ttggctaaat tggaagatgg tgttagaaat 660

aaagcttatg atattattaa tttgaaaggt gctacttttt atggtattgg tactgctttg 720

atgagaattt ctaaagctat tttgagagat gaaaatgctg ttttgccagt tggtgcttat 780

atggatggtc aatatggttt gaatgatatt tatattggta ctccagctat tattggtggt 840

actggtttga aacaaattat tgaatctcca ttgtctgctg atgaattgaa aaaaatgcaa 900

gattctgctg ctactttgaa aaaagttttg aatgatggtt tggctgaatt ggaaaataaa 960

taa 963

<210> 13

<211> 1134

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GPD2(g5617) 基因 等位基因1_ORF

<400> 13

atgcatcgtc aaccatttaa agtcacagtt attggttcag gtaattgggg tacaactatt 60

gcaaaagttg ttgcggagaa tacagttcaa aatcctcatt tatttaataa agatgttaat 120

atgtgggtat ttgaagaaat gattgatgga gaaaaattaa cagaaattat aaatacaaga 180

catcaaaatg ttaaatattt acctggaatt gatttaccac ataatttaat tgcaaatcca 240

tcattattag atagtgttaa aggtgcagat attcttgtat ttaatgtacc acatcaattt 300

ttacctaaaa ttgtatcaca attaaaggga catgtatcga atcaagttcg tgcaatttca 360

tgtttaaaag ggtttgaagt tggtgctaaa ggggtacaat tattatcatc atatattaaa 420

gatgaattag atattcaatg tggtgcatta tcaggtgcaa atttagcacc agaagttgca 480

aaagagcatt ggtcagagac aactgttgca tatcaattac catctgattt taaaggtgaa 540

ggatttgatg tagatcataa agtattaaag atgttatttc atagaccata tttccatgtt 600

aatgtaattg atgatgttgc aggtatttca attgcaggtg cattgaaaaa tgttgttgca 660

ttagcatgtg gttttgttga aggtttagga tggggtaata atgcagcagc agctatacaa 720

agagttggac ttggtgaaat tattaaattt ggtcaaatgt ttttcccaga gagtcgtgtt 780

gaaacatatt atcaagaatc tgcaggtgtt gcagatttaa ttactacatg ttcaggtggt 840

agaaatgtta aagttgcaaa atatatgtca aagaatcatg ttgatgcatt tcaagctgag 900

aaagaattat taaatggtca atctgcacaa ggtgtaatta cttgtaaaga agttcatgaa 960

tggttatcaa catgtgaatt aacagaagat ttcccattat ttgaagcagt ttatcaaatt 1020

gtttataata atatgccaat ggaacaaatt cctgatatga ttgatgaatt agaaccattt 1080

gaagttgaag aagatgatga accgcaacaa gaacaacaac cagttactaa ctag 1134

<210> 14

<211> 1134

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GPD2(g5617) 基因 等位基因2_ORF

<400> 14

atgcatcgtc aaccatttaa agttacagtt attggttcag gtaattgggg tacaactatt 60

gcaaaagttg ttgcagagaa tacagttcaa aatcctcatt tatttaataa agatgttaat 120

atgtgggtat ttgaagaaat gattgatgga gaaaaattaa cagaaattat aaatacaaga 180

catcaaaatg ttaaatattt acctggaatt gatttaccac ataatttaat tgcaaatcca 240

tcattattag atagtgttaa aggtgcagat attcttgtat ttaatgtacc acatcaattt 300

ttacctaaaa ttgtatcaca attaaaggga catgtatcga atcaagttcg tgcaatttca 360

tgtttaaaag gttttgaagt tggtgctaaa ggggtacaat tattgtcatc atatattaaa 420

gatgaattag atattcaatg tggtgcatta tcaggtgcaa atttagcacc agaagttgca 480

aaagaacatt ggtcagagac aactgttgca tatcaattac catctgattt taaaggtgaa 540

ggatttgatg tagatcataa agtattaaaa atgttatttc atagaccata ttttcatgtt 600

aatgtaattg atgatgttgc aggtatttca attgcgggtg cattgaaaaa tgttgttgca 660

ttagcatgtg gttttgttga aggtttagga tggggtaata atgctgctgc agctatacaa 720

agagttggac ttggtgaaat tattaaattt ggtcaaatgt ttttcccaga gagtcgtgtt 780

gaaacatatt atcaagaatc tgcaggtgtt gcagatttaa ttactacatg ttcaggtggt 840

agaaatgtta aagttgcaaa atatatgtca aagaatcatg ttgatgcatt tcaagctgag 900

aaagaattat taaatggtca atctgcacaa ggtgtaatta cttgtaaaga agttcatgaa 960

tggttatcaa catgtgaatt aacagaagat ttcccattat ttgaagcagt ttatcaaatt 1020

gtttataata atatgccaat ggaacaaatt cctgatatga ttgatgaatt agaaccattt 1080

gaagttgaag aagatgatga accgcaacaa gaacaacaac cagttactaa ctag 1134

<210> 15

<211> 377

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GPD2(g5617) 基因 等位基因1/2_ORF

<400> 15

Met His Arg Gln Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp

1 5 10 15

Gly Thr Thr Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Thr Val Gln Asn Pro

20 25 30

His Leu Phe Asn Lys Asp Val Asn Met Trp Val Phe Glu Glu Met Ile

35 40 45

Asp Gly Glu Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val

50 55 60

Lys Tyr Leu Pro Gly Ile Asp Leu Pro His Asn Leu Ile Ala Asn Pro

65 70 75 80

Ser Leu Leu Asp Ser Val Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Phe Asn Val

85 90 95

Pro His Gln Phe Leu Pro Lys Ile Val Ser Gln Leu Lys Gly His Val

100 105 110

Ser Asn Gln Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly

115 120 125

Ala Lys Gly Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Ile Lys Asp Glu Leu Asp

130 135 140

Ile Gln Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala

145 150 155 160

Lys Glu His Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr Gln Leu Pro Ser Asp

165 170 175

Phe Lys Gly Glu Gly Phe Asp Val Asp His Lys Val Leu Lys Met Leu

180 185 190

Phe His Arg Pro Tyr Phe His Val Asn Val Ile Asp Asp Val Ala Gly

195 200 205

Ile Ser Ile Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Ala Cys Gly

210 215 220

Phe Val Glu Gly Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ala Ala Ala Ile Gln

225 230 235 240

Arg Val Gly Leu Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Gln Met Phe Phe Pro

245 250 255

Glu Ser Arg Val Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp

260 265 270

Leu Ile Thr Thr Cys Ser Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Lys Tyr

275 280 285

Met Ser Lys Asn His Val Asp Ala Phe Gln Ala Glu Lys Glu Leu Leu

290 295 300

Asn Gly Gln Ser Ala Gln Gly Val Ile Thr Cys Lys Glu Val His Glu

305 310 315 320

Trp Leu Ser Thr Cys Glu Leu Thr Glu Asp Phe Pro Leu Phe Glu Ala

325 330 335

Val Tyr Gln Ile Val Tyr Asn Asn Met Pro Met Glu Gln Ile Pro Asp

340 345 350

Met Ile Asp Glu Leu Glu Pro Phe Glu Val Glu Glu Asp Asp Glu Pro

355 360 365

Gln Gln Glu Gln Gln Pro Val Thr Asn

370 375

<210> 16

<211> 753

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GPP1(g4356) 基因 等位基因1_ORF

<400> 16

atgccactaa ctgaaaaacc actatctgtt aaagttaacg catgtctact agatgtagat 60

ggtacaatta ttatatcaca acctgcaatt gcagaaatgt ggagagattt tggtaaggat 120

aaaccttatt ttgattcaga acatgtaatt aaaatttctc atggttggag aacttatgat 180

gcaattgcaa aatttgctcc agattttgct actcatgaat ttgttgctaa attagaaggt 240

gcaattcctg aaaaatatgg gaaatttgct gttcaagtcc ctggtgctgt taaattttgt 300

aatgatatga attctttacc aaaggaaaaa tgggctgtag ctacttctgg tacatttgaa 360

atggcttctc aatggtttaa attcttaaat attaagagac ctgaaaattt tattactgct 420

tcaagtgtta aggaagggaa acccgctcct gaatgttatt taaagggtag aaatggttta 480

ggtttcccaa taaataaaca agatccaagt aaatcaaaag tatttgtatt tgaagatgct 540

cctgctggta tcgctgcagg taaagctgca ggttgtaaaa tcgtcggtat tgcaactact 600

tttgacgctg ataccttaaa ggagaaaggt tgtgatatta tcattaaaaa cttcgaatct 660

gttaaacttg gtaactacga cccagcaacc gatgaagttg aattgatttt caatgattat 720

ctttacgcta aggacgattt attgaaatgg taa 753

<210> 17

<211> 753

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GPP1(g4356) 基因 等位基因2_ORF

<400> 17

atgccactaa ctgaaaaacc actatctgtt aaagttaatg catgtctact agatgtagat 60

ggtacaatta ttatatcaca acctgcaatt gcagaaatgt ggagagattt tggtaaggat 120

aaaccttatt ttgattcaga gcatgtaatt aaaatttctc atggttggag aacttatgat 180

gcaattgcaa aatttgctcc agattttgct actcatgaat ttgttgctaa attagaaggt 240

gcaattcctg aaaaatatgg gaaatttgct gttcaagtcc ctggtgctgt taaattttgt 300

aatgatatga attctttacc aaaggaaaaa tgggctgttg ctacttctgg tacatttgaa 360

atggcttctc aatggtttaa attcttaaat attaaaagac ctgaaaattt tattactgct 420

tcaagtgtta aggaagggaa accagctcct gaatgttatt taaagggtag aaatggttta 480

ggtttcccaa taaataaaca agatccaagt aaatcaaaag ttttcgtatt tgaagatgct 540

cctgctggta tcgctgcagg taaagctgca ggttgtaaaa tcgtcggtat tgcaactact 600

tttgacgctg atactttaaa ggagaaaggt tgtgatatta tcattaaaaa cttcgaatct 660

gttaaacttg gtaactacga tccagcaact gatgaagttg aattgatttt caatgattat 720

ctttacgcta aggacgattt attgaaatgg taa 753

<210> 18

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GPP1(g4356) 基因 等位基因1/2_ORF

<400> 18

Met Pro Leu Thr Glu Lys Pro Leu Ser Val Lys Val Asn Ala Cys Leu

1 5 10 15

Leu Asp Val Asp Gly Thr Ile Ile Ile Ser Gln Pro Ala Ile Ala Glu

20 25 30

Met Trp Arg Asp Phe Gly Lys Asp Lys Pro Tyr Phe Asp Ser Glu His

35 40 45

Val Ile Lys Ile Ser His Gly Trp Arg Thr Tyr Asp Ala Ile Ala Lys

50 55 60

Phe Ala Pro Asp Phe Ala Thr His Glu Phe Val Ala Lys Leu Glu Gly

65 70 75 80

Ala Ile Pro Glu Lys Tyr Gly Lys Phe Ala Val Gln Val Pro Gly Ala

85 90 95

Val Lys Phe Cys Asn Asp Met Asn Ser Leu Pro Lys Glu Lys Trp Ala

100 105 110

Val Ala Thr Ser Gly Thr Phe Glu Met Ala Ser Gln Trp Phe Lys Phe

115 120 125

Leu Asn Ile Lys Arg Pro Glu Asn Phe Ile Thr Ala Ser Ser Val Lys

130 135 140

Glu Gly Lys Pro Ala Pro Glu Cys Tyr Leu Lys Gly Arg Asn Gly Leu

145 150 155 160

Gly Phe Pro Ile Asn Lys Gln Asp Pro Ser Lys Ser Lys Val Phe Val

165 170 175

Phe Glu Asp Ala Pro Ala Gly Ile Ala Ala Gly Lys Ala Ala Gly Cys

180 185 190

Lys Ile Val Gly Ile Ala Thr Thr Phe Asp Ala Asp Thr Leu Lys Glu

195 200 205

Lys Gly Cys Asp Ile Ile Ile Lys Asn Phe Glu Ser Val Lys Leu Gly

210 215 220

Asn Tyr Asp Pro Ala Thr Asp Glu Val Glu Leu Ile Phe Asn Asp Tyr

225 230 235 240

Leu Tyr Ala Lys Asp Asp Leu Leu Lys Trp

245 250

<210> 19

<211> 753

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GPP1(g5443) 基因 等位基因1_ORF

<400> 19

atgcctctaa ctgaaaaacc tctatctcta aaaatcaacg ccgctttatt cgatgttgat 60

ggtaccatta tcatctctca accagctatt gctgctatgt ggagagattt cggtaaggac 120

aagccatact tcgatgctga acatgttatt cacatctctc acggttggag aaccttcgat 180

gccatcgcta aatttgctcc agatttcgct gatgaaaaat tcgttgctga attagaaggt 240

tccattccag ataaattcgg tgaacattcc atcgaagttc caggtgccgt caagttatgc 300

ggtgatctaa acaagctacc aaaggaaaag tgggctgttg ccacttctgg tacttgggaa 360

atggctcaca aatggttcga tatcctaggt attaaaagac catctaactt cattaccgcc 420

ggtgatgtta agaacggtaa gccacatcca gaaccataca ccaagggtag aaacggtcta 480

ggttacccag ttaacgaaca agacccatct aaatccaagg ttgttgtctt tgaagatgct 540

ccagctggta ttgctgccgg taaggctgct ggttgtaaga ttgttggtat tgctaccact 600

ttcgatctag atttcttaat tgaaaagggt tgtgatatca ttgtcaagaa ccacgaatct 660

attaaggttg gtggttacga tccagttact gatgaagtcg aattaatctt caccgattac 720

ttatatgcta aggatgattt actaaaatgg taa 753

<210> 20

<211> 753

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GPP1(g5443) 基因 等位基因2_ORF

<400> 20

atgcctctaa ctgaaaaacc tctatctcta aaaatcaacg ccgctttatt cgatgttgat 60

ggtaccatta tcatctctca accagctatt gctgctatgt ggagagattt cggtaaggac 120

aagccatact tcgatgctga acatgttatt cacatctctc acggttggag aaccttcgat 180

gccatcgcta aatttgctcc agatttcgct gatgaaaaat tcgttgctga attagaaggt 240

tccattccag ataaattcgg tgaacattcc atcgaagttc caggtgccgt caagttatgc 300

ggtgatctaa acaagctacc aaaggaaaag tgggctgttg ccacttctgg tacttgggaa 360

atggctcaca aatggttcga tatcctaggt attaaaagac catctaactt cattaccgcc 420

ggtgatgtta agaacggtaa gccacatcca gaaccataca ccaagggtag aaacggtcta 480

ggttacccag ttaacgaaca agacccatct aaatccaagg ttgttgtctt tgaagatgct 540

ccagctggta ttgctgccgg taaggctgct ggttgtaaga ttgttggtat tgctaccact 600

ttcgatctag atttcttaat tgaaaagggt tgtgatatca ttgtcaagaa ccacgaatct 660

attaaggttg gtggttacga tccagttact gatgaagtcg aattaatctt caccgattac 720

ttatatgcta aggatgattt actaaaatgg taa 753

<210> 21

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GPP1(g5443) 基因 等位基因1/2_ORF

<400> 21

Met Pro Leu Thr Glu Lys Pro Leu Ser Leu Lys Ile Asn Ala Ala Leu

1 5 10 15

Phe Asp Val Asp Gly Thr Ile Ile Ile Ser Gln Pro Ala Ile Ala Ala

20 25 30

Met Trp Arg Asp Phe Gly Lys Asp Lys Pro Tyr Phe Asp Ala Glu His

35 40 45

Val Ile His Ile Ser His Gly Trp Arg Thr Phe Asp Ala Ile Ala Lys

50 55 60

Phe Ala Pro Asp Phe Ala Asp Glu Lys Phe Val Ala Glu Leu Glu Gly

65 70 75 80

Ser Ile Pro Asp Lys Phe Gly Glu His Ser Ile Glu Val Pro Gly Ala

85 90 95

Val Lys Leu Cys Gly Asp Leu Asn Lys Leu Pro Lys Glu Lys Trp Ala

100 105 110

Val Ala Thr Ser Gly Thr Trp Glu Met Ala His Lys Trp Phe Asp Ile

115 120 125

Leu Gly Ile Lys Arg Pro Ser Asn Phe Ile Thr Ala Gly Asp Val Lys

130 135 140

Asn Gly Lys Pro His Pro Glu Pro Tyr Thr Lys Gly Arg Asn Gly Leu

145 150 155 160

Gly Tyr Pro Val Asn Glu Gln Asp Pro Ser Lys Ser Lys Val Val Val

165 170 175

Phe Glu Asp Ala Pro Ala Gly Ile Ala Ala Gly Lys Ala Ala Gly Cys

180 185 190

Lys Ile Val Gly Ile Ala Thr Thr Phe Asp Leu Asp Phe Leu Ile Glu

195 200 205

Lys Gly Cys Asp Ile Ile Val Lys Asn His Glu Ser Ile Lys Val Gly

210 215 220

Gly Tyr Asp Pro Val Thr Asp Glu Val Glu Leu Ile Phe Thr Asp Tyr

225 230 235 240

Leu Tyr Ala Lys Asp Asp Leu Leu Lys Trp

245 250

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 22

ctttgagtgc aagtatcgcc 20

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 23

tgtgtaattg ttcaccaaag cc 22

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 24

gtcgattctc atgttcgtgc 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 25

cttagcgact tcagtagcga 20

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 26

catgtatcga atcaagttcg tg 22

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 27

caacttctgg tgctaaattt gc 22

<210> 28

<211> 988

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> g4423 等位基因 1的5' UTR

<400> 28

gttaactcag ttttctctct ttccctccac cccacgttac tctgcgaaca aaaatacgca 60

cagaatgaac atctgattga ttaatattta tatattactt agtggcaccc ctacaaacaa 120

accaattttg aatatttctc accatcatga tatttattta gggcaagaat ttcatgtaca 180

tacgtgcgtg tactgcatag ttttgttata tgtaaataac cagcaatata tcaccaatga 240

taaatgctca gtaatttatt tggaaccaaa atagtttcag taatcaaata atacaataac 300

taacaagtgc tgattataca acagctgtta acaacacaaa cacgctctct tctattctct 360

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tgttattctg ttcaattctc tctctctttt taaggtatct ttacattaca ttacatatcc 600

caaattacaa caagagcaag aaatgaagca caacaacacg ccatctttcg tgattatttt 660

atcatttcta tatcgtaact aaattaacaa atgctatgtt tcttaatttt taatgataaa 720

tctaactgct accttaattt ctcatggaaa gtggcaaata cagaaattat atattcttat 780

tcattttctt ataattttta tcaattacca aatatatata aatgcaatta attgattgtt 840

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atatctttct tttctatttc tctttttcgt ttaatctcac cgtacacata tatatccata 960

tatcaataca aataaaaatc atttaaaa 988

<210> 29

<211> 961

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> g4423 等位基因 2的5' UTR

<400> 29

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ttgttcgtgt ggtatattca cgaatttgca atttagaaat tatatttttt aaaagaattg 420

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tcgactgcta acaccagaca acaccgaacg aaaacaagaa aaaataatta ttctctctct 540

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aatgttaagt ttattaattt ttaatgataa atctagttgc taccttaatt tctcatggaa 720

agtggcaaat actgaaatta tttaattcta ctttcatttt cttataattt ttatcaatta 780

ccaaatatat ataaatgcaa ttaattgatt gttcctgtca cataattttt tttgtttgtt 840

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tgtttaatct caccgtacac atatatatcc atatatcaat acaaataaaa atcatttaaa 960

a 961

<210> 30

<211> 256

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> g4423 等位基因 1的3' UTR

<400> 30

taagtcattt aatttattct tttagaatat atttattttg tctttatttt tgaaatgtta 60

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cttttaaaca ttaaactcgt taacgaatta tataatgatt ttatcgaact actttatgtt 180

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ccattcgaaa ctcgag 256

<210> 31

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> g4423 等位基因 2的 3' UTR

<400> 31

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ttttaaacat taaactcgtt aacgaattat ataatgattt tatcgaacta ctttatgttt 180

ttttaataga ataatcttct ttattaatat aacttactac ttcttaatct tgttgtcctc 240

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<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 32

gcaggatatc agttgtttg 19

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 33

aataccttgt tgagccatag 20

<210> 34

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> g2947 等位基因 1的5' UTR

<400> 34

atatattttg gctgacattg taattagatg agatccacaa tttttctttt gtttgactgt 60

tcgatatgga gaaggtggga tgcactatta ttatattcag aagtttattt gtacagttta 120

aagaacaaat agtggctaat cctatcctcg gactaaaaaa aatcgttcac ttctatccta 180

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caattttctg taaag 375

<210> 35

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> g2947 等位基因 2的5' UTR

<400> 35

atatattttg gctgacattg taattagatg agatccacaa tttttctttt gtttgactgt 60

tcgatatgga gaaggtggga tgcactatta ttatattcag aagtttattt gtacagcttg 120

aagaacaaat agtggctaat cctatcctcg gactaaaaaa aattgttcac ttttatccta 180

ctgtaaatct tatgaaaatg atgtaattca tatagttact atattttctt tcttttagaa 240

acttcatgat atatatatat atataaaagg actaatcacc caactctcaa atttattaaa 300

aagaaatatg tttctatcat cttcttttct tattatacct tctctaataa taaaaataaa 360

caactttctg taaag 375

<210> 36

<211> 997

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> g2947 等位基因 1的3' UTR

<400> 36

ttgtgactct atggagttta cctattttat ataccactat atcacaaaaa gtaataacaa 60

cttttcaaat ataatacaat attcaataaa tatatttata tattctaaaa tctacgtttt 120

tctctttctt aaaaaaataa acaaactgac cctttcaatc ttcaatgtga tactttactt 180

attttatttc attacacaga aaggtataaa tatatacata acttaatggt ttattcattt 240

cttcttatta gacaacgtgg ttagttgttg tttaacccat tccaataata aatcagtttg 300

taaataacct tcactgttaa atactttatt aatctctaat gaactagtta aagttttctt 360

cttattatct atcaaagtca tattgtaaat tggtttattt tcttcaaatt ctgtctttaa 420

tttaattatt tcagtaccat tcttaccact atatacgata gatttttcaa catatttctt 480

aaagaaccaa aatattacag atagtacaaa atatgtaccg actaaaattt gttgatattt 540

aacgatatta tcatgaacaa attttttatc aatgatgaaa ctgattgctg caacgatggc 600

agttgaataa ccaattaata atttctgatc aactaattca aaggtttctt catagcctaa 660

tcttttcatg acatcaggta gactttcatt tatagtttgt gatacttcag agatggaata 720

aacgttaacg ggcttactca ttgtgcttta aaggagaatg cggaattaat gagctcttta 780

ctatgtatca gaactcgaac taatgcaaag acaaatggaa taaactagtt acaatatata 840

tgaattttgt ctgttctttt ataatatatt ataatggatt tcccaaattg atgattattg 900

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<210> 37

<211> 997

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> g2947 等位基因 2的3' UTR

<400> 37

ttgtgactct atggagttta cctattttat ataccactgt atcacaaaaa gtaataacaa 60

cttctcaaat ataatacaat atttaataaa tatatttata tattctaaaa tctacgtttt 120

tctctttctt aaaaaaataa acaaactgac cctttcaatc ttcaatgtga tactttactt 180

attttatttc attacacaga aaggtataaa tatatacata acttaatggt ttattcattt 240

cttcttatta gacagagtgg ttagttgttg tttaacccat tccaataata aatcagtttg 300

taaataacct tcactgttaa atactttatt aatctctaat gaactagtta aagttttctt 360

cttattatct atcaaagtca tattgtaaat tggtttattt tcttcaaatt ctgtctttaa 420

tttaattatt tcagtaccat tcttaccact atatacgata gatttttcaa catatttctt 480

aaagaaccaa aatattacag atagtacaaa atatgtaccg actaaaattt gttgatattt 540

aacgatatta tcatgaacaa attttttatc aatgatgaaa ctgattgctg caacgatggc 600

agttgaataa ccaattaata atttctgatc aactaattca aaggtttctt cataacctaa 660

tcttttcata acatcaggta gactttcatt tatagtttgt gatacttcag agatggaata 720

aacgttaaca ggtttactca ttgtgcttta aaggagaatg cggaattaat gagctcttta 780

ctatgtatca gaactcgaac taatgcaaag aaaaatggaa taaacttgtt acaatatgta 840

tgaattttgt ctattctttt ataataaatt ataatagatt tcccaaattg atgattattg 900

gttcactaag aaagctagaa agaagatgag atttctcgaa tagtaaaata ttaccttaac 960

atatctgaga ttaaaccgat agtcaatttg tacgtta 997

<210> 38

<211> 1328

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> g1544 等位基因 1的 5' UTR

<400> 38

agaaaatagt ttctccgatt aaattttttt ttcaaatcaa atctttattt aagaattggt 60

agtgtatagt agtataatat tgcctaagaa attggagtag tccgtaaaaa atgggacaaa 120

attgttgaaa ttgagcaacc tgaaaatttt atgctggtct caagtagaga aacagacgta 180

gaaccaaaat tgacccaatt tcttgttgcc tttaattggg tcattcataa gaattcaaaa 240

tattttcttt tcccactcac gcgagagata tgcgcacacg atatagttaa taccgcttgt 300

aacaatacgt agatggccaa aaatgaacaa aaggggacac tcctcaaaag aaaaaattgc 360

ttgtttggct gtcttctcca attgaaatat acacacacac cgcggtaaaa aaaaaattga 420

aatggaaatc gcggtgggac aaaagtagca accacaacaa gggaattttc cttactgctg 480

cggcagatcc ttactcatct ctcgaatata tatagcctct tgggtccacg ggcaaaaaag 540

aaataaaaaa aagagaagca acagaaccgc acgcaacgta cgcagtgatc catccatttt 600

ccacaaaatt tatctatttt cttgtctata ttttttacgt acaactaact gatcttcttg 660

tccccctccc cccatttacc cgttaaaatg aaagctgaac aacagaaaat aataattcgc 720

tctggtggac aaaaaataca agaacaagag agtatcataa ttatgtgggt cacaaatgac 780

cctacaactg tcacctagtt ggtacaaaat ttgaccctca ttctcaaata attactacat 840

ttgggtctgt attaatgcta atatttcaat atatctctat ctatcagtca catacaaatt 900

tatcttcatc ttaaagggac tcacttactc aataatggtc tatctttata tttttttcat 960

acgtatgtat gtacgtagta aagggccatc aatgatccat cttactatta ttattcttta 1020

gttatttcta agcaacaaaa ggtctgtacc acagtttcag tgtcgtcata cctcttcttt 1080

taatttcttt tcggggaggg atgtcttaat gctaacttct gtctcactat taacggtaaa 1140

tcgtattaat ctcaatatat atataaaggg ttgatatttt ccaccgtttt aaaaattatt 1200

cccttgtttc tctattatta attttagact acttatttta attatttttc ccttttttac 1260

ttattatata tatataacta tatattacca ataataatat aagcaatcac atatatttat 1320

cccattaa 1328

<210> 39

<211> 1328

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> g1544 等位基因 2的5' UTR

<400> 39

agaaaatagt ttctccgatt aaattttttt ttcaaatcaa atctttattt aagaattggt 60

agtgtatagt agtataatat tgcctaagaa attggagtag tccgtaaaaa atgggacaaa 120

attgttgaaa ttgagcaacc tgaaaatttt atgctggtca caagtagaga aataggcgta 180

gaaccaaaat tgacccaatt tcttgttgcc tttaattggg tcattcataa gaattcaaaa 240

tattttcttt tcccactcac gcgagagata tgcgcacacg atataattaa taccgtttgt 300

aacaatacgt agatggccaa aaatgaacaa aatgggacac tcctcaaaag gaaaaattgc 360

ttgtttggct gtcttctcca attgaaatat acacacacac cgcggtaaaa aaaaaattga 420

aattgaaatc gcggtgggac aaaagtagca accacaacaa gggaattttc cttactgctg 480

cggcagatcc ttactcatct cttgaatata tatagcctct tgggtccacg ggcaaaaaag 540

aaaaaaaaaa aagagaagca acagaaccgc acacaacgta cgcagtgatc catccatttt 600

ccacaaaatt tatttatttt cttgtctgta ttatttacgt acaactaact gatcttcttg 660

tccccccccc cccatttacc cgttaaaatg aaagctgaac aacagaaaat aataattcgc 720

tctgatggac aaaaaataca agaacaagag agtatcatca ctatgtgggt cacaaatgac 780

cctacaactg taatctagtt gatacaaaat ttgaccctca ttctcaaata attactacat 840

ttgggtctgt attaatacta atatctgtat atctctctat ctatcagtca catacaaatt 900

tatcttcatc ttaaagggac tcacttactc aataatggtc tatctttata tttttatcat 960

acgtatgtat gtacgtagta aagggccatc aatgatccat attattatta ttattcttta 1020

gttatttcta agcaacaaaa ggtctgtacc acagtttcag tgtcgtcata tctcttattt 1080

taatttcttt tcggggaggg atgtcttaat gctaacttct gtctcactat taacggtaaa 1140

tcttattaat ctcaatatat atataaaggg ttgatatttt ccaacgtttt aaaacttatt 1200

cccttgtttc tatattacta atttaacatt acttatttta attatttttc ccttttttac 1260

ttattatata tatataagta catattacca ataataatat aagcaatcac atatatttat 1320

cccattaa 1328

<210> 40

<211> 402

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> g1544 等位基因 1的3' UTR

<400> 40

tccatcatca agaatatata tatataataa agccatccct tttacgaacc tgcctgcatt 60

tgcttaagac cgagcaaaaa aaataaatta caacataacg aaaaaaacaa acaaacttaa 120

gggggagaaa aaaaaataat atcccataac ttacatacac aacatacata aaattaaaaa 180

aataaacatt ttatcaataa ttttttttta aagtatatag agctactaat attatagaaa 240

tacagacgca acttaaagaa ctttgttcaa tcttttcaat cttctcagtc ttttctagtc 300

ataataaatt atcaaatgcg aatatttaaa tcaaaattat ataaggggta tatcgtatat 360

atataaattt atcaaatgtg tatatgtatt ttattatgtt ta 402

<210> 41

<211> 402

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> g1544 等位基因 2的3' UTR

<400> 41

tccatcatca aaaatatata tatataataa agccatccct tttacgaacc tgcctgcatt 60

tgcttaagac cgagcaaaaa aaataaatta caatataacg aaaaaaacaa acaaacttaa 120

gggggagaaa aaaaaataat atcccataac ttacatacac aacatacata aaattaaaaa 180

aataaacatt ttatcaataa ttttttttta aagtatatat agctactaat attatagaaa 240

tacaaatgca acttaaagaa ctttgttcaa tcttttcaat cttctcaatc ttttctagtc 300

ataataaatt atcaaatgcg aatatttaaa ttaaaattat ataaagggta tatcatatat 360

atataaattt atcaattgtg tatatgtatt ttattatgtt ta 402

<210> 42

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 42

gggtactact atcgctaa 18

<210> 43

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 43

caccggcaac agagatac 18

<210> 44

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 44

cgtacgcagt gatccatc 18

<210> 45

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 45

caccggcaac agagatac 18

<210> 46

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 46

cgtacgcagt gatccatc 18

<210> 47

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 47

gctcggtctt aagcaaat 18

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 48

gcatcgtcaa ccatttaaag 20

<210> 49

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 49

ctcagcttga aatgcatc 18

<210> 50

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 50

gctgcacgtt tactgtat 18

<210> 51

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 51

ctcagcttga aatgcatc 18

<210> 52

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 52

gctgcacgtt tactgtat 18

<210> 53

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 53

cttagatttc actgctgc 18

Claims (17)

1.一种具有乳酸产生能力的重组菌株，其中从耐酸酵母YBC菌株(KCTC13508BP)缺失或减弱了编码将磷酸二羟丙酮转化为甘油-3-磷酸的酶的基因，并将编码乳酸脱氢酶的基因引入所述耐酸酵母YBC菌株。

2.根据权利要求1所述的重组菌株，其中所述编码将磷酸二羟丙酮转化为甘油-3-磷酸的酶的基因是GPD1或GPD2基因。

3.根据权利要求1所述的重组菌株，其中所述编码将磷酸二羟丙酮转化为甘油-3-磷酸的酶的基因是GPD1基因，

其中所述基因包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的重组菌株，其中所述重组菌株的特征在于，编码乙醇脱氢酶的基因被进一步缺失或减弱。

5.根据权利要求4所述的重组菌株，其中所述编码乙醇脱氢酶的基因包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的序列。

6.根据权利要求1所述的重组菌株，其中所述重组菌株的特征在于，编码丙酮酸脱羧酶的基因被进一步缺失或减弱。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其中所述编码丙酮酸脱羧酶的基因包含SEQ IDNO：8或SEQ ID NO：9的序列。

8.根据权利要求1所述的重组菌株，其中，所述重组菌株的特征在于，编码将乳酸盐转化为丙酮酸盐的酶的基因被进一步缺失或减弱。

9.根据权利要求8所述的重组菌株，其中所述编码将乳酸盐转化为丙酮酸盐的酶的基因包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的序列。

10.根据权利要求1所述的重组菌株，其中，由于所述编码将磷酸二羟丙酮转化为甘油-3-磷酸的酶的基因的缺失或减弱，与所述重组菌株的亲本菌株相比，所述重组菌株具有降低的甘油产生能力。

11.一种具有乳酸产生能力的重组菌株，其中，从耐酸酵母YBC菌株(KCTC13508BP)中缺失编码将磷酸二羟丙酮转化为甘油-3-磷酸的酶的GPD1基因、编码将乳酸盐转化为丙酮酸盐的酶的CYB2基因、编码乙醇脱氢酶的ADH基因以及编码丙酮酸脱羧酶的PDC基因；并且

其中将编码乳酸脱氢酶的基因引入所述耐酸酵母YBC菌株。

12.根据权利要求11所述的重组菌株，其中所述编码乳酸脱氢酶的基因引入至被缺失的CYB2基因、ADH基因、PDC基因和GPD1基因中的至少一个的位置处，并由被缺失或替换的基因的启动子调控。

13.一种生产乳酸的方法，其包括：

(a)培养根据权利要求1至12中任一项所述的重组菌株以产生乳酸；和

(b)收集产生的乳酸。

14.一种具有将磷酸羟基丙酮转化为甘油-3-磷酸的酶活性的基因，所述基因编码与包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白具有90％以上的同源性的蛋白。

15.根据权利要求14所述的基因，其中所述基因包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

16.一种具有将磷酸二羟丙酮转化为甘油-3-磷酸的酶活性的蛋白，所述蛋白与包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白具有90％以上的同源性。

17.一种GPD1基因的启动子，其包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的核苷酸序列。

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