KR20210128742A - 글리세롤 생성이 억제된 재조합 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 젖산 생성능을 가지면서, 글리세롤 생성이 억제된 재조합 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 젖산 생성 에 관여하는 유전자가 도입되고, 글리세롤 생성에 관여하는 유전자가 결실 또는 약화된 재조합 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 재조합 내산성 효모를 사용하여 젖산을 생산하는 경우, 젖산 생성능은 유지되면서, 글리세롤 생성이 감소되어, 젖산 정제과정에서 락타이드(lactide) 전환을 위한 올리고머화(oligomerization) 반응에서 글리세롤에 의한 가교를 억제할 수 있어 젖산의 락타이드로의 전환 수율을 높일 수 있다.

Description

글리세롤 생성이 억제된 재조합 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법{Recombinant Acid Resistant Yeast Inhibited Glycerol Production and Method for Preparing Lactic Acid Using The Same}
본 발명은 젖산 생성능을 가지면서, 글리세롤 생성이 억제된 재조합 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 젖산 생성 에 관여하는 유전자가 도입되고, 글리세롤 생성에 관여하는 유전자가 결실 또는 약화된 재조합 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법에 관한 것이다.
PLA(Polylacic Acid)는 젖산(lactic acid)을 락타이드(lactide)로 전환하고 이를 개환중합하여 만드는 생분해성 폴리머이며, 그 원료인 젖산은 발효를 통하여 생산하고 있다. PLA는 일회용 식품용기에 광범위하게 사용될 수 있으며, 단독 혹은 조성물이나 공중합체의 형태로 자동차, 섬유 산업을 포함한 다양한 산업적 플라스틱으로도 사용이 가능한 강도를 갖고 있다. 또한 최근에는 3D 프린팅에서도 사용되는 대표적인 폴리머로 특히 3D 프린터 사용시 유해 가스 발생 및 냄새 발생이 적은 친환경 폴리머이다.
전통적인 젖산 생산 공정은 유산균을 이용하여 생산하며, 유산균에 의해 생성되는 젖산의 축적에 의하여, 산에 의한 균주 사멸 혹은 성장 멈춤을 방지하기 위하여 다양한 형태의 Ca염/Mg염이나 암모니아와 같은 중화제를 이용하여 pH를 중성 pH 인 6~8 로 맞추면서 발효를 진행하게 된다. 발효가 종료되면 미생물을 분리하게 되며 염(salt) 형태로는 물에서의 분리 및 락타이드 전환이 어렵기 때문에 황산을 첨가하여 락테이트를 젖산으로 전환시키면서 Ca염은 CaSO4 형태로 제거를 하게 된다. 이와 같은 과정은 젖산보다도 많은 양의 부산물인 CaSO4가 발생하며, 공정 경제성을 떨어뜨리게 된다.
PLA는 발효를 통하여 젖산을 생산한 후, 생산된 젖산을 정제 공정을 거쳐 락타이드로 전환하는 공정이 일반적이다. 락타이드 전환을 위해서는 젖산을 Hydrogenated form으로 전환하는 공정이 필요하며, 일반적인 중성 발효에의 pH는 6~7이기에 다량의 황산을 이용하여 산성 pH로 전환하게 된다. 이 과정에서 다량의 중화염이 발생하게 되며 이러한 중화염을 제거하기 위한 공정 투자비와 함께 중화염의 낮은 가치로 인하여 경제성이 저하된다.
한편, 젖산은 L형과 D형의 광학 이성질체를 가지고 있다. L형을 주로 생산하는 유산균의 경우에도 약 5~10%의 D형을 같이 생산하는 경우가 많으며, D형을 주로 생산하는 균주의 경우 D형과 L형을 같이 생산하는 형태와 D형과 에탄올을 같이 생산하는 형태로 존재하는 등 많은 다양성을 갖고 있는 미생물군이 있다(Ellen I. Garvie, Microbiological Reviews, 106-139, 1980).
한편, 자연계에서 젖산을 생산하는 Lactobacillus의 경우 젖산을 상업성이 있도록 생산하기 위해서는 많은 양의 고가 영양분(nutrient)을 배지로 사용하여야 하며 이러한 과량의 nutrient 성분은 후단 공정의 중합(polymerization) 공정 혹은 락타이드를 중간체로 하는 경우에는 락타이드 전환 공정에 큰 저해를 주게 되어 고수율, 고순도의 폴리머 또는 그 전구체를 얻기 위해서는 흡착, 증류, 이온교환과 같은 정제 공정 비용을 필요로 하게 되어 역시 높은 생산 비용의 원인이 된다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 제시된 방법으로 효모(Yeast)를 이용한 연구가 제시되었다. 효모의 경우 저가의 nutrient를 사용하여도 원활히 성장/발효를 진행하는 것으로 알려져 있으며 산성에서의 내성도 높은 것으로 알려져 있다.
산성에서 잘 자라는 효모(이하, 내산성 효모)를 이용하여 젖산을 생산할 경우, 발효 시 중화제를 이용하여 배지를 pH 6~7로 유지할 필요가 없기 때문에 발효 공정이 단순해지고, 또한 후단 중화제를 제거하는 정제공정이 필요없어진다. 또한, 효모는 대사에 필요한 많은 성분을 스스로 만들기 때문에 세균 특히 락토바실러스에 대비하여 비교적 영양 수준이 낮은 배지에서도 배양이 가능하기 때문에, 많은 후단 정제 공정을 생략할 수 있어, 생산 단가를 크게 낮출 수 있다.
그러나 효모를 이용하는 젖산 생산 기술에 대하여 전제 조건이 있는데 그것은 상업화에 적용하기 위해서는 균주 발효 성능 지표인 수율, 생산성, 젖산의 농도가 유산균의 성능에 유사한 수준으로 높게 유지되어야 한다는 전제 조건이 있다.
효모를 사용한 내산성 젖산 기술 개발이 시도되고 있으나, 실제적으로는 발효에서 중화반응을 수반하여 pH를 젖산의 pKa value 이상인 3.7 이상으로 유지하여 발효를 해야만 고성능의 발효능을 보이는 경우가 많아서 실제적인 내산성 기술이라고 표현하기에는 어렵고 공정에서의 생산비 절감 효과를 보기도 어렵다(Michael Sauer et al., Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 27:229-256, 2010).
따라서 공정 비용을 절감할 수 있는 내산성 효모는 중화제를 사용하지 않거나 최소량으로 사용하면서 발효액의 pH가 pKa value 이하에서 발효를 마칠 수 있어야 하며, 발효 3대 지표가 유산균과 유사한 수준을 달성해야만 상업적 적용 의미가 있다.
일반적 효모는 글루코오스를 발효하면 에탄올을 주로 생산하고, 주 부산물로는 글리세롤을 생산하며, 젖산을 생산하는 경우는 매우 드물다. 또한 높은 내산성을 갖고 있는 미생물에서 젖산을 생산하는 균주를 선택할 확률이 매우 낮기 때문에, 본 발명자들은 내산성이 우수한 효모 균주를 선별하고, 선별된 균주를 유전공학적인 방법으로 젖산 생산능을 가지면서, 에탄올과 글리세롤 생성능이 억제된 균주를 제조하고자 하였다.
이에, 본 발명자들은 젖산 생산능을 가지면서, 글리세롤 생성능이 억제된 내산성 균주를 제조하고자 예의 노력한 결과, 내산성 효모에서 글리세롤 생성에 관여하는 유전자를 제거하고, 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 추가로 도입한 재조합 균주를 제작하고, 상기 재조합 균주를 이용하여 젖산을 제조하는 경우, 재조합 효모를 이용한 젖산 생산에서 불순물로 작용하는 글리세롤 생성이 감소되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 젖산 생성능을 가지는 재조합 내산성 효모 균주에서 글리세롤 생성능이 감소된 재조합 균주를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 내산성 효모를 이용하여 젖산을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 내산성 효모 유래의 디하이드록시아세톤 인산을 글리세롤-3-인산으로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 내산성 효모 YBC 균주(KCTC13508BP)에서 디하이드록시아세톤 인산을 글리세롤-3-인산으로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자가 결실 또는 약화되어 있고, 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 젖산 생성능을 가지는 재조합 균주를 제공한다.
본 발명은 또한, 내산성 효모 YBC 균주(KCTC13508BP)에서 디하이드록시아세톤 인산을 글리세롤-3-인산으로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자인 GPD1 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자인 CYB2 유전자, 알코올 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자인 ADH 유전자 및 피루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자인 PDC 유전자가 결실되고, 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 젖산 생성능을 가지는 재조합 균주를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 균주를 배양하여 젖산을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 젖산을 수득하는 단계를 포함하는 젖산의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 디하이드록시아세톤 인산을 글리세롤-3-인산으로 전환하는 효소 활성을 가지고, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 단백질과 90% 이상의 상동성을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명은 또한, 디하이드록시아세톤 인산을 글리세롤-3-인산으로 전환하는 효소 활성을 가지고, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 단백질과 90% 이상의 상동성을 가지는 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 4 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 가지는 g1544 유전자의 포로모터를 제공한다.
본 발명에 따른 재조합 내산성 효모를 사용하여 젖산을 생산하는 경우, 젖산생성능은 유지되면서, 글리세롤 생성이 감소되어, 젖산 정제과정에서 락타이드(lactide) 전환을 위한 올리고머화(oligomerization) 반응에서 글리세롤에 의한 가교를 억제할 수 있어 젖산의 락타이드로의 전환 수율을 높일 수 있다.
도 1은 본 발명에서 YBC4 균주의 게놈에서 GPD1(g1544)/GPD2(g5617) 유전자를 삭제하거나 또는 해당 유전자를 삭제하고, LDH 유전자를 삽입하기 위하여 사용한 삭제 카세트의 일예를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 재조합 효모균주인 YBC5 균주의 발효 프로파일을 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
내산성 효모는 산성 pH에서도 당을 빠른 속도로 소모하며 높은 성장률을 나타내고 발효 조건에서는 소모한 당을 산물로 전환하는 특징을 가진다. 본 발명자들의 이전 연구에서는 이러한 특징을 가지는 효모를 여러 효모 라이브러리를 통하여 내산성 효모 YBC 균주(KCTC13508BP)를 선별하였으며, 내산성 효모 YBC 균주(KCTC13508BP)는 젖산 농도가 40g/L~80g/L인 조건에서도 높은 성장성 및 당소모속도를 보이는 균주이다. 상기 내산성 효모 YBC 균주를 대상으로 하여 젖산 생성능을 높이고 에탄올 생성능을 낮추기 위한 대사회로 조절을 실시하여, YBC 균주에서 알코올 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 피루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자가 결실되고 락테이트 디하이드로게나아제 유전자가 도입된 균주에서 락테이트를 피루베이트로 전환하는 시토크롬b2 효소를 코딩하는 유전자를 결실시켜 재조합 균주를 제작하였으며, 상기 제작된 균주에서 글리세롤 생성을 억제하기 위하여 디하이드록시아세톤 인산을 글리세롤 3-인산으로 전환하는 글리세롤 3 포스페이트 디하이드로게나아제 효소를 코딩하는 유전자가 결실된 재조합 균주를 제작하고, 상기 재조합 균주가 높은 젖산 생성능을 가지면서 에탄올 생성능 및 글리세롤 생성능이 억제되는 것을 확인하였다.
또한 저감된 글리세롤에 의한 여분의 탄소는 다른 부산물로 분산되는 경우도 있으나, 이를 젖산으로 전환시킬 수 있을 경우(예를 들어 락테이트 디하이드로게나아제의 강화) 추가 젖산 생성 수율을 증가시킬 수 있는 포텐셜도 있다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 내산성 효모 YBC 균주(KCTC13508BP)에서 디하이드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자가 결실 또는 약화되어 있고, 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 젖산 생성능을 가지는 재조합 균주에 관한 것이다.
일반적으로 글리세롤은 효모 류의 주요 부산물로써 세포내의 역할은, 에탄올이나 락테이트 생산시 발생하는 세포 내부의 NAD/NADH 의 밸런스를 조절하는 산화환원 밸런스(redox balance)의 역할을 하며, 세포 외부의 수분 활성도 감소시 발생하는 삼투압에 의한 세포내 물 손실을 억제하는 역할을 수행하며, 또한 주요 에너지 저장고인 트라이글리세라이드의 전구체인 글리세롤 3 포스페이트의 전구체 역할도 담당하고 있다(Roeland Costenoble et al., Yeast 16: 1483-1495,2000; Elke Nevoigt and Ulf Stahl, FEMS Microbiology Reviews 21:231, 1997)
효모에서 글리세롤 생성 반응을 억제하기 위해서는 글리세롤 생성과 직접적으로 관련된 유전자를 제거하거나 약화하는 방법과 삼투압 등의 조절기작과 관련된 유전자를 변형하는 방법이 알려져 있다. 삼투압 등의 조절기작에 대해서는 HOG (High-osmolarity glycerol) 신호경로가 있으며(Joseph P Dexter et al., BMC Systems Biology, 9:17,2015), 관련 주요 인자인 SSK1(Cytoplasmic phosphorelay intermediate osmosensor and regulator) 등의 제거 또는 변형에 의하여 글리세롤 생성을 억제 할 수 있는 방법도 연구되어 있다(Hubmann et al., Biotechnology for Biofuels, 6:87, 2013, Hubmann et al., Metabolic Engineering, 17:68, 2013).
그러나 이러한 신호경로를 변이를 통하여 조절하는 연구는 매우 많은 연구가 필요하며, 내산성 효모 YBC 균주(KCTC13508BP)와 같이 특수한 균주일 경우에는 각 단계에 대한 검증이 필요하기에, 보다 일반적인 방법인 글리세롤의 생성과 직접적으로 관련된 유전자인 GPD(NAD-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase)와 GPP(DL-glycerol-3-phosphate phosphatase)를 제거하는 방법을 사용하였다. GPD1은 효모의 내삼투성을 조절하기 위한 역할을 주로 하며, GPD2는 GPD1의 Isoform으로 S. cerevisiae에서는 혐기상태에서 세포의 활동을 조절하기 위하여 발현된다. 또한 글리세롤-3-인산을 글리세롤로 전환하기 위한 GPP유전자는 S. cerevisiae에서 2개가 잘 알려져 있는데 GPP1은 혐기조건에서 발현을 하고 GPP2는 삼투압에 의하여 발현한다. GPD과 GPP의 각 Isomer를 각각 제거하는 경우에는 배양 조건과 해당 균주에 따라 글리세롤 생성량에 미치는 영향이 다르기에(Roeland Costenoble et al., Yeast 16:1483, 2000; Jacobus albertyn et al., Molecular and cellular biology, 4135, 1994), 각각의 영향을 실험으로 확인하는 것이 가장 최선의 방법으로 판단하였다.
본 발명에 있어서, 상기 디하이드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-인산으로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자는 GPD1 또는 GPD2 유전자인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 디하이드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-인산으로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자는 GPD1(g1544) 유전자이고, 상기 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는 YBC 균주에서 주 ADH 유전자인 g4423 유전자를 제거하고 상기 g4423 위치에 락토바실러스 플랜타룸 유래의 서열번호 12의 LDH 유전자를 도입하고, CYB2 유전자인 g3002 유전자 (이하, g3002-1 유전자로 칭한다)를 제거하며, 상기 g3002-1 유전자의 위치에 LDH 유전자를 도입한 재조합 균주 YBC2와 재조합 균주 YBC2에서 다시 g2947 유전자를 제거하면서 LDH 유전자를 도입한 재조합 균주 YBC4를 제작하고, GPD1 유전자인 g1544 유전자를 제거한 재조합 균주 YBC5 균주를 제작하였고, 상기 재조합 균주들을 배양하여, 젖산 생성능이 향되고, 에탄올 생산능이 감소하며 글리세롤 생성이 감소하는 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 균주는 알코올 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자(ADH 유전자)가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 알코올 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 g4423 유전자인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 g4423 유전자는 서열번호 6 또는 서열번호 7로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 균주는 상기 ADH 유전자를 대신하여 LDH 유전자가 추가적으로 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 균주는 피루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자(PDC 유전자)가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 피루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자는 g3002 유전자인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 g3002 유전자는 서열번호 8 또는 서열번호 9으로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 균주는 상기 PDC 유전자를 대신하여 LDH 유전자가 추가적으로 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 균주는 락테이트를 피루베이트로 전환하는 시토크롬b2 유전자 (CYB2 유전자)가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 시토크롬b2유전자를 코딩하는 유전자는 g2947 유전자인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 g2947 유전자는 서열번호 10 또는 서열번호 11로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 균주는 상기 CYB2 유전자를 대신하여 LDH 유전자가 추가적으로 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 균주는 상기 GPD1 유전자를 대신하여 LDH 유전자가 추가적으로 도입될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 g1544 유전자의 결실 또는 약화에 의하여 모균주인 YBC 균주(KCTC13508BP) 보다 또한 모균주 유래의 변이 균주인 YBC1, YBC2/YBC3/YBC4 균주 보다 글리세롤 생성능이 감소 또는 차단되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 도입되는 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 L. helveticus 유래 LDH 유전자, R. oryzae 유래 LDH 유전자 또는 L. plantarum 유래 LDH 유전자인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 L. plantarum 유래 LDH 유전자인 것이 바람직하다.
본 발명은 다른 관점에서, 내산성 효모 YBC 균주(KCTC13508BP)에서 디하이드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-인산으로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자인 GPD1 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자인 CYB2 유전자, 알코올 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자인 ADH 유전자 및 피루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자인 PDC 유전자가 결실되고, 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 젖산 생성능을 가지는 재조합 균주에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 결실된 CYB2 유전자, ADH 유전자, PDC 유전자 및 GPD1 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자 위치에 도입되어 상기 결실된 치환된 유전자의 프로모터에 의하여 조절되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일양태에서는, YBC5 균주(Δg4423::ldh/Δg3002-1::ldh/Δg2947::ldh/Δg1544)가 YBC4 균주(Δg4423::ldh/Δg3002-1::ldh/Δg2947::ldh) 에 비하여 글리세롤 생산능이 현저하게 감소한 것을 확인하였다. 그러나 글리세롤이 완전히 제거가 된 것은 아닌데, 이는 오히려 균주의 환경적응 측면에서는 크게 유리한 점이다. 즉, 글리세롤 생산 능력을 완전히 상실한 균주는 글리세롤의 원래 역할인 외부 삼투압 등의 스트레스 환경에서 적용할 수 있는 능력을 상실하여 매우 약해지며, 이러한 균주는 일반적인 상업스케일의 압력과 염농도 및 생산물저해 등의 스트레스 환경을 이기지 못하고 정상적인 발효를 수행할 수 없게 된다. 따라서 당해 발명의 균주는 목적하는 글리세롤 저감은 이룬 반면, 그로 인한 역효과는 나타나지 않은 매우 우수한 성능을 보였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 상기 재조합 균주를 배양하여 젖산을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 젖산을 수득하는 단계를 포함하는 젖산의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명을 통하여 락테이트 생산이 크게 증가하고 에탄올 생산이 크게 감소하였으며 여기에 글리세롤 부산물까지 크게 감소한 우수한 내산성 균주를 확보할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 하이드록시아세톤 인산을 글리세롤-3-인산으로 전환하는 효소 활성을 가지고, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 단백질과 90% 이상의 상동성을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자는 하이드록시아세톤 인산을 글리세롤-3-인산으로 전환하는 효소 활성을 가지고, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 단백질과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상 더더욱 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 디하이드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-인산으로 전환하는 효소로 전환하는 효소 활성을 가지고, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 단백질과 90% 이상의 상동성을 가지는 단백질에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 단백질은 하이드록시아세톤 인산을 글리세롤-3-인산으로 전환하는 효소 활성을 가지고, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 단백질과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상 더더욱 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 가지는 단백질인 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 4 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 가지는 GPD1 유전자 유전자의 포로모터에 관한 것이다.
본 발명에 있어서,'내산성 효모'란 유기산의 pKa 값 미만의 pH에서, 배지에 유기산이 함유되지 않은 경우에 비해, 배지에 1M 이상의 유기산(특히, 젖산)이 함유된 경우, 적어도 10%의 바이오매스 소모율 (당소모율 등) 또는 적어도 10%의 비생장률을 유지할 수 있는 효모로 정의한다. 보다 구체적으로, 본 발명에서,'내산성 효모'란 pH 5 이상인 경우에 비해, pH 2~4에서 적어도 10%의 바이오매스 소모율 (당소모율 등) 또는 적어도 10%의 비생장률을 유지할 수 있는 효모로 정의한다.
본 발명에 따른 재조합 효모는 통상의 방법에 따라 상기 유전자를 숙주 효모의 염색체(chromosome) 상에 삽입시키거나, 상기 유전자를 포함하는 벡터를 숙주 효모에 도입시킴으로써 제조할 수 있다.
상기 숙주효모는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 통상적으로 사용되며, 본 발명의 일 실시예에서는 내산성 효모를 이용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 목적 DNA가 충분히 발현될 수 있는 것이라면 어떠한 종류의 효모라도 무방하다.
상기 재조합 효모는 임의의 형질전환(transformation) 방법에 따라 제조할 수 있다. "형질전환"이란 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미하며, 일반적인 형질전환 방법에는 전기천공법(electroporation), 초산 리튬-PEG법 등이 있다.
또한, 본 발명에서 유전자를 숙주 미생물의 염색체 상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 임의의 유전자 조작방법을 사용할 수 있으며, 일 예로는 레트로바이러스벡터, 아데노바이러스벡터, 아데노-연관 바이러스벡터, 헤르페스심플렉스 바이러스벡터, 폭스바이러스벡터, 렌티바이러스벡터, 비바이러스성벡터 등을 이용하는 방법이 있다. "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이며 또한 Linearized DNA 또한 효모의 게놈 Integration을 위하여 통상적으로 사용하는 형태이다.
전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 또는 영양 요구 마커 유전자 (auxotrophic marker gene) 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있도록 하는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation) 할 수 있으며 (Gibson assembly), 필요에 따라서는 원하는 전체의 Sequence 를 합성하여 사용하는 방법도 통상적으로 이용되고 있다.
아울러, 상기 유전자는 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.
일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션 (연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않고, 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 상태에서, 다른 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택하여 적용할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택하는데 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이고, 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.
본 발명에 있어서, 탄소원은 글루코즈, 자일로즈, 아라비노즈, 수크로즈, 프룩토즈, 셀룰로오즈, 갈락토오스, 글루코즈 올리고머 및 글리세롤로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 배양은 미생물, 예를 들어 대장균 등이 더 이상 작용하지 못하도록 (예를 들어, 대사체 생산 불가능) 하는 조건에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 배양은 pH 1.0 내지 6.5, 바람직하게 pH 1.0 내지 6.0, 보다 바람직하게는 2.6 내지 4.0인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 내산성 효모균주 YBC의 게놈 내의 글리세롤 생산 유전자 분석
본 발명자들은 다양한 효모 균주에 대한 테스트를 통하여 내산성을 갖는 균주를 선별하여, 효모균에 대하여 젖산을 배양 초기에 배지에 첨가하여 미생물의 성장 및 당소모 속도를 확인하면서 내산성이 가장 우수한 균주인 YBC 균주를 선정하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 KCTC13508BP으로 기탁한 바 있다.
계통분석을 통하여 YBC 균주(KCTC13508BP)는 S. cerevisiae와 유사한 균주이며 2배체의 유전자를 갖고 있고 (Diploid), Crab-tree positive 특성이 있는 것을 확인하였다.
YBC 균주의 게놈 전체 서열 data에서 S. cerevisiae 및 Bioinformatics 정보를 이용하여 YBC 균주의 게놈에 존재하는 디하이드록시아세톤 인산을 글리세롤-3-인산으로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자인 GPD1(glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1)으로 annotation된 유전자로 g1544를 확인하였으며, GPD2로 annotation된 유전자로 g5617을 확인하였다. 글리세롤 3-인산을 글리세롤로 전환하는 효소를 코딩하는 GPP 유전자는 YBC 균주의 게놈에서 매우 상동성이 유사한 2개의 유전자로 g4356과 g5443을 확인하였으며, 현재의 정보로는 상기 2개의 유전자 역할을 GPP1과 GPP2로 구분하기 어려워 GPP1 v.1 과 GPP1 v.2 로 명명하여 사용하였다.
표 1에는 YBC과 Saccharomyces cerevisiae의 GPD1과 GPD2의 아미노산 서열간의 유사성을 비교하여 나타내었다.
YBC 와 S. cerevisiae 균주의 GPD1 및 GPD2의 단백질 서열 상동성 비교
YBC GPD1 YBC GPD2 Sc GPD1 Sc GPD2
YBC GPD1 100 69.78 78.06 63.49
YBC GPD2 69.78 100 71.25 63.60
S. cerevisiae GPD1 78.06 71.25 100 65.08
S. cerevisiae GPD2 63.49 63.60 65.08 100
이에 GPD1 유전자(g1544 유전자)(서열번호 1과 서열번호 2) 및 이의 단백질 (서열번호 3)을 대상으로 이를 제거할 수 있는 삭제 카세트(deletion cassette)를 제작하였고, GPD2 유전자(g5617 유전자)(서열번호 13와 서열번호 14) 및 이의 단백질 (서열번호 15)을 대상으로 이를 제거할 수 있는 삭제 카세트(deletion cassette)를 제작하였으며, GPP1 유전자(v.1; g4356 유전자) (서열번호 16와 서열번호 17)과 GPP1 유전자(v.2; g5443 유전자) (서열번호 19과 서열 번호 20) 및 이의 각 단백질 (서열번호 18 및 서열번호 21)에 대해서도 이를 제거할 수 있는 삭제 카세트 (deletion cassette)를 제작하였다.
본 발명에서 사용한 삭제 카세트는 도 1에 나타내었으며, 해당 제한효소 부위나 항생제 내성 유전자의 선택 및 항생제 내성 유전자 제거 방식은 관련 업계에 잘 알려진 방식이며 다양하게 변형하여 사용할 수 있다.
일반적으로 글리세롤을 생산하는 유전자 중 GPD1과 GPD2를 동시에 제거할 경우나 GPP1 및 GPP2를 동시에 제거할 경우에는 균주의 생장 및 외부 환경에 적응할 수 있는 역할이 완전히 차단되어 균주가 삼투압 등에 매우 민감하게 변하여 발효에 부적절 하다는 것은 잘 알려지 사실이다. 따라서 GPD1 이나 GPD2를 제거한 후 글리세롤 저감이 충분하지 않는 경우에는 GPP1 v1 이나 GPP1 v2 를 각각의 GPD1/2 제거 균주에 추가로 제거를 하여 글리세롤을 저감하고자 하는 전략을 수립하였다.
실시예 2: GPD 유전자의 발현량 측정
YBC 균주의 GPD1(g1544)과 GPD2(g5617)의 발현양을 확인하기 위하여 하기 프라이머를 이용하여 ALG9 유전자를 Housekeeping 유전자로 하여 RT-qPCR을 수행하였다. 본 실시예에서 사용한 RT-qPCR 방법을 기술하자면 YBC 균주의 대수증식기에 RNA를 추출한 후 이를 주형으로 하여 cDNA를 제작하였다. 목적유전자(GPD 1 및 GPD2)와 Housekeeping 유전자 (Ref 유전자로 사용) 에 각각 특이적인 프라이머를 합성하고 이를 이용하여 qPCR을 실시하였다. 실험에 사용한 Ref 유전자는 ALG9 이며 사용한 프라이머로 증폭되는 단편의 크기는 147ㅁ3bp 이다.
ALG9 forward primer : CTTTGAGTGCAAGTATCGCC (서열번호 22)
ALG9 reverse primer : TGTGTAATTGTTCACCAAAGCC (서열번호 23)
GPD1(g1544) forward primer : GTCGATTCTCATGTTCGTGC (서열번호 24)
GPD1 reverse primer : CTTAGCGACTTCAGTAGCGA (서열번호 25)
GPD2(g5617) forward primer : CATGTATCGAATCAAGTTCGTG (서열번호 26)
GPD2 reverse primer : CAACTTCTGGTGCTAAATTTGC (서열번호 27)
YBC균주에서 상기의 유전자의 발현량을 살펴볼 때 GPD1은 배양 14시간에 ALG9 대비 약 20배의 발현율을 배양 23시간에는 약 70배의 발현률을 나타내었으며, GPD2는 발현율이 매우 낮아 ALG9과 유사한 발현율을 나타내었다.
상기 결과로부터, YBC 균주에서는 디하이드록시아세톤 인산을 글리세롤-3-인산으로 전환하는 효소로 GPD1이 주된 역할을 할 것이라는 것으로 잠정 결론을 지었으나 실제의 역할을 확인하기 위하여 각각의 유전자가 제거된 균주를 제작하였다.
실시예 3: GPD 유전자가 제거된 재조합 내산성 효모균주 제작
YBC 균주에서 GPD1 유전자, GPD2 유전자, GPP1 v1 유전자 및 GPP1 v2 유전자로 annotation된 g1544 유전자, g5617 유전자, g5443 유전자 및 g4356 유전자를 게놈에서 제거한 균주를 제작하였다.
상기 유전자를 제거하는데 사용한 내산성 효모 균주는 YBC Wild type 균주가 아닌 기존의 YBC균주에서 ADH(alcohol dehydrogenase) 유전자를 제거하면서 LDH 유전자를 도입한 YBC1 균주에, 추가로 g3002-1 유전자(PDC 유전자)가 제거되면서 LDH가 발현된 균주로 Ethanol 생성능이 봉쇄되면서 젖산을 고효율로 생산하는 YBC2 균주에, 락테이트를 소모하는 유전자인 g2947을 제거하면서 LDH 유전자를 도입하여 젖산 소모능이 제거된 YBC4 균주를 사용하였다.
상기 YBC4 균주에서 GPD1(g1544) 유전자를 제거한 (Diploid 균주로 Allele1 및 Allele 2 모두 제거) 균주인 YBC5를 제작하였으며, 당해 균주의 유전형(genotype)을 확인하기 위하여 아래의 표 1의 프라이머를 제작한 뒤 해당 균주의 게놈 DNA에서 확인하였다. 또한 상기 YBC5 균주에서 GPD2(g5617) 유전자를 제거한 균주도 동시에 제작하였으며, 제작한 균주에서 발효시 글리세롤 생성능을 비교하였다.
상기 균주의 제작방법은 다음과 같다:
상기 YBC1 균주는 YBC 균주의 주 ADH 유전자인 g4423 유전자를 제거하고 상기 g4423 위치에 락토바실러스 플랜타룸 유래의 서열번호 12의 LDH 유전자를 도입한 균주로, g4423 및 이들의 UTR의 정보를 바탕으로 하여 각 유전자의 ORF가 제거되고 5' 과 3' UTR를 포함하는 유전자 카세트를 제작하여 Donor DNA로 사용하였다. g4423의 각 allele 에 대하여 상응하는 5' UTR은 서열번호 28 및 서열번호 29에 나타내었고, 3' UTR은 서열번호 30 및 서열번호 31에 나타내었다. Donor DNA의 제작에는 전술한 바와 같이 제한효소를 이용한 클로닝 방법과 Gibson assembly, 유전자 합성을 이용한 방법이 사용되었다. g4423의 ORF 자리에 서열번호 12의 LDH를 합성한 뒤 도입하여 Donor DNA를 제작하고 이를 YBC에 도입하여 재조합 균주 YBC1을 제작하였다.
아울러, g3002-1 유전자는 YBC 균주의 게놈 Sequencing에서 스캐폴드 72 위치에 있는 유전자로 PDC 유전자로 작동하는 유전자이다. YBC 1 균주의 g3002-1 유전자 (스캐폴드 상 72 에 위치한 유전자) 를 제거하며 서열번호 12의 LDH 유전자를 도입한 재조합 균주 YBC2를 제작하였다.
이러한 g3002의 유전자를 치환하기 위한 cassette는 해당 UTR을 Recombination 자리로 이용하여 제작하였다. 상기의 YBC1의 g4423 유전자 (ADH) 의 자리에 LDH를 도입하는 방법과 유사하게 g3002-1의 UTR을 이용하여 제작하였다. 단, 당해 유전자의 치환에서는 과정의 단순화를 위하여 allele variation을 고려하지 않고 하나의 allele를 대상으로 하여 Donor cassette를 제작하였으나, allele 별로 제작도 가능하다. 또한 유전자 치환에 사용하는 프라이머에 대해서도 상기의 결실균주 제작에 사용한 프라이머 이외에 다음과 같이 g3002-1의 UTR과 LDH를 같이 확인할 수 있는 프라이머쌍을 별도로 사용하여 유전자 치환 확인의 정확도를 높였다.
g3002-1 UTR-LDH-fwd : GCAGGATATCAGTTGTTTG(서열번호 32)
g3002-1 UTR-LDH-rev : AATACCTTGTTGAGCCATAG(서열번호 33)
또한, YBC4 균주는 YBC2 균주의 CYB2 유전자인 g2947 유전자를 제거하고 상기 g2947 위치에 락토바실러스 플랜타룸 유래의 서열번호 13의 LDH 유전자를 도입한 균주로, g2947 유전자는 YBC 균주의 게놈 Sequencing 에서 스캐폴드 41 위치에 있는 유전자이다. g2947 및 이들의 UTR의 정보를 바탕으로 하여 각 유전자의 ORF가 제거되고 5' 과 3' UTR을 포함하는 유전자 카세트를 제작하여 Donor DNA로 사용하였다. g2947의 각 allele 에 대하여 상응하는 5' UTR은 서열번호 34 및 서열번호 35에 나타내었고, 3' UTR은 서열번호 36 및 서열번호 37에 나타내었다. Donor DNA의 제작에는 전술한 바와 같이 제한효소를 이용한 클로닝 방법과 깁슨어셈블리(Gibson assembly), 유전자 합성을 이용한 방법이 사용되었다.
단, 당해 유전자의 치환에서는 과정의 단순화를 위하여 allele variation을 고려하지 않고 하나의 allele를 대상으로 하여 Donor cassette를 제작하였으나, allele 별로 제작도 가능하다.
상기 균주의 제작방법은 다음과 같다:
상기 YBC5 균주는 YBC4 균주의 GPD1 유전자인 g1544 유전자를 제거한 균주로, g1544 유전자는 YBC 균주의 게놈 서열분석에서 스캐폴드 19 위치에 있는 유전자이다. g1544 및 이들의 UTR의 정보를 바탕으로 하여 각 유전자의 ORF가 제거되고 5' 과 3' UTR 및 항생제 마커가 있는 유전자 카세트를 제작하여 Donor DNA로 사용하였다. g1544의 각 allele 에 대하여 상응하는 5' UTR은 서열번호 38 및 서열번호 39에 나타내었고, 3' UTR은 서열번호 40 및 서열번호 41에 나타내었다. Donor DNA의 제작에는 전술한 바와 같이 제한효소를 이용한 클로닝 방법과 Gibson assembly, 유전자 합성을 이용한 방법이 사용되었다.
단, 당해 유전자의 치환에서는 과정의 단순화를 위하여 allele variation을 고려하지 않고 하나의 allele를 대상으로 하여 Donor cassette를 제작하였으나, allele 별로 제작도 가능하다. 또한 항생제 마커의 경우도 현재 상용화된 유전공학 기술 (CRISPR)을 적용할 경우 이를 사용하지 않은 형태로 제작 및 적용도 가능하다.
또한 유전자 치환 후 유전형 확인에 사용하는 프라이머에 대해서 다음 표 2와 같이 g1544 및 이후 자세히 기술할 g5617의 유전자 형을 확인할 수 있는 프라이머쌍을 별도로 사용하여 유전자 치환 확인의 정확도를 높였다.
g1544 및 g5617 도입 확인용 프라이머 세트
명칭 서열
G1544 ORF 확인용 primer GGGTACTACTATCGCTAA(서열번호 42)
CACCGGCAACAGAGATAC(서열번호 43)
G1544 ORF 확인용 primer 2nd set CGTACGCAGTGATCCATC(서열번호 44)
CACCGGCAACAGAGATAC(서열번호 45)
G1544 UTR 확인용 primer CGTACGCAGTGATCCATC(서열번호 46)
GCTCGGTCTTAAGCAAAT(서열번호 47)
G5617 ORF 확인용 primer GCATCGTCAACCATTTAAAG(서열번호 48)
CTCAGCTTGAAATGCATC(서열번호 49)
G5617 ORF 확인용 primer 2nd set GCTGCACGTTTACTGTAT(서열번호 50)
CTCAGCTTGAAATGCATC(서열번호 51)
G5617 UTR 확인용 primer GCTGCACGTTTACTGTAT(서열번호 52)
CTTAGATTTCACTGCTGC(서열번호 53)
상기 제작한 재조합 균주의 유전형은 다음과 같다:
YBC2 : Δg4423::ldh/Δg3002-1::ldh
YBC4 : Δg4423::ldh/Δg3002-1::ldh/Δg2947::ldh
YBC5 : Δg4423::ldh/Δg3002-1::ldh/Δg2947::ldh/Δg1544
YBC5a : Δg4423::ldh/Δg3002-1::ldh/Δg2947::ldh/Δg5617
실시예 4: YBC4 균주에서 GPD1 유전자를 결실한 재조합 YBC 균주에서 젖산 생성 및 글리세롤 생성 저해 효과 확인
실시예 3에서 제작한 재조합 균주 YBC5와 YBC5a에 대하여 접종 OD는 0.5, 배지는 m-YP 배지(5g/L Peptone, 4g/L Yeast extract, 5g/L KH2PO4, 2g/L MgSO4ㅇ7H2O, 0.15g/L Uracil)에 글루코오스 10%를 첨가하여 사용하며, 500ml의 플라스크 배양으로 30℃, 150rpm 조건에서 64시간 배양하였다.
YBC4와 YBC5의 배양 결과
Yield (g/g)
Lactic acid Ethanol Glycerol Acetic acid
YBC4 0.79 0.01 0.05 0
YBC5 0.80 0.015 0.01 0.005
YBC5a 0.71 0.047 0.04 0.003
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, YBC5 균주는 YBC4 균주에 비하여 글리세롤 생성능이 80% 억제된 형태를 보였으며, 그럼에도 아직 소량의 글리세롤은 생산하는 것을 알 수 있다. 전술한 바와 같이 글리세롤은 미생물의 환경 적응력 특히 삼투압에 대한 적응력에 매우 중요한 역할을 하기 때문에 GPD1과 GPD2의 동시 제거 혹은 GPP1과 GPP2 의 동시제거에 의한 글리세롤의 완전한 생산력 억제는 균주를 극히 삼투압에 민감하게 하여 정상적인 성장 및 발효를 할 수 없도록 하기에 현 YBC5의 글리세롤 저감율은 매우 적절하다고 할 수 있다. 그러나 본 균주는 글리세롤의 저감이 젖산 생산 증가에 직접적으로 크게 영향을 주지는 못하고 기타 다른 다양한 by-product 로 일부 분산이 되는 효과가 있었으며, 이를 위하여는 추후 젖산 발효 수율을 증가시킬 수 있는 방안의 적용이 필요하다.
글리세롤은 친환경성 고분자인 PLA 제조시 중합에도 영향을 줄 수 있는데, 글리세롤 존재 시 PLA 의 구조가 linear에서 글리세롤의 구조로 인하여 branced 된 구조로 변형이 된다는 것이 보고가 되어 있다.(Wen Shen et al., R. Soc. open sci. 5: 180134, 2018) 이러한 PLA의 구조 변화는 물성에도 영향을 줄 수 있으며, 광학 이성질체 관계인 L-형 PLA 와 D-형 PLA 간의 반데르발스 력으로 만들어지는 stereo complex PLA의 형성 등에도 영향을 주 수 있고, 락타이드(lactide)로의 전환을 위한 젖산 올리고머 생성 시에도 영향을 줄 수 있는 등 많은 후단 공정에서 불순물(impurity)로 작용할 수 있다. 물론 글리세롤을 제거하기 위한 정제 공정을 통하여 이를 감소시키는 방안도 있을 수 있으나 당해 특허와 같이 유전공학을 통하여 글리세롤을 저감하는 것은 원천적으로 이러한 후단 공정에서의 문제를 줄일 수 있는 좋은 방안이다.
GPD1을 제거한 YBC5 균주 대비하여 GPD2를 제거한 YBC5a 균주의 경우에는 글리세롤의 저감에 거의 영향이 없었으며, 젖산의 생산량은 줄고 에탄올의 생산량은 늘어나는 다소 이해하기 어려운 현상을 나타내었다. 전반적인 발효 형태가 젖산 발효에도 저해가 되는 영향을 나타내었기 때문에 GPD2가 제거된 YBC5a 균주는 젖산 생산 균주로 사용하기에 부적합한 것으로 보인다.
상기 YBC5 균주를 제조하기까지 사용된 YBC 1~YBC4 균주의 제작시에는 주요 유전자의 제거 시에는 LDH 유전자를 도입하여, 균주의 젖산 생성능을 높였었다. 그러나 YBC5 균주 제작에서는 GPD1 유전자의 제거 시에 LDH 유전자를 도입하지 않았으며, 이는 이미 동일한 락토바실러스 플랜타룸 유래의 서열번호 12의 LDH 유전자를 3개의 위치에 2개씩 총 6개를 도입한 상태였기에 동종의 유전자의 도입은 내부 Feedback 조절을 고려하여 추가 활성증가에 미치는 영향이 미미할 것이라는 예상을 할 수 있으며, 실시예 2에서 명시하였듯이 일반적인 조건에서의 GPD1/2의 발현율이 Ref 유전자인 ALG9 대비 높기는 하나 다른 ADH나 PDC 등에 비해서는 낮다는 점, 마지막으로 동일한 유전자가 여러 개 게놈 안에 존재할 때 발생할 수 있는 게놈의 불안정성을 고려하여 단순 제거에 대해서만 적용하였다.
실시예 5: YBC5 균주의 발효 성능 평가
본 실시예에서는 YBC5 균주를 플라스크 배양이 아닌 바이오리액터에서 배양하여 젖산발효 성능을 확인하였다.
YBC5 균주를 mYP 배지(5g/L Peptone, 4g/L Yeast extract, 5g/L KH2PO4, 2g/L MgSO4·7H2O, 0.15g/L Uracil) 에 1차 Seed 배양 40ml 2차 Seed 배양 220ml 로 하여 2일에 걸쳐 배양한 후 모든 세포를 수확하여 2L mYP 배지에 접종하였다. 접종 OD는 0.85에 배지는 mYP 배지에 글루코오스 12%로 배양을 시작하였으며, CaCO3 용액를 간헐적으로 주입하여 pH를 pH 3 수준에서 유지할 수 있도록 하였다. 30℃, 500 rpm, Air 0.25vvm 으로 주입하여 배양하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, YBC5 균주는 바이오리액터 내에서 빠른 시간에 모든 글루코오스를 소모하며 젖산을 생산하는 것을 확인할 수 있었으며 최종 pH 3.3에서 젖산 수율이 0.81 (g/g), 생산성 1.6 g/L/hr, 생산 젖산 농도 88.2g/L에 글리세롤 수율 0.01(g/g)을 나타내어 상기 실시예 3의 결과가 바이오리액터에서도 그대로 구현됨을 확인할 수 있었다. 또한 향후 초기 OD 및 배양 조건 개선에 따라 본 성능의 추가 개선도 가능한 것으로 유추된다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> SK Inovation <120> Recombinant Acid Resistant Yeast Inhibited Glycerol Production and Method for Preparing Lactic Acid Using The Same <130> P20-B049 <160> 53 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPD1_g1544 gene allele1_ORF <400> 1 atggttgcta ccgatagatt aaatcaaact tctaatattt tacataaatc aatgaaaaga 60 gcttcaagta tagcgcatct aactgcttta gatcatcctt ttaaaattgc tgttatcggt 120 tccggtaact ggggtactac tatcgctaaa gtagtctctg aaaatgcagc tttaaatcca 180 caattatttg cttccgaagt aagaatgtgg gtctttgaag aaaaaattga tggtaaaaat 240 ttaacagaaa ttataaatac agatcatgaa aatgttaaat atttaccaaa tattaaatta 300 ccagtaaatt taatcgctac tccagatctt ttaaagactg tagaaggcgc agatataatc 360 attttcaata ttcctcatca attcttaact agaattgtac aacaattgaa aggtcatgtc 420 gattctcatg ttcgtgcaat ctcatgtcta aagggtttcg aagtcggtgc tagaggtgta 480 caattactat ccacttatat caccgatgaa ttaggtatcg aatgtggtgc tttatcaggt 540 gccaatatcg ctactgaagt cgctaaggaa aactggtcag aaactaccgt tgcctatcat 600 atcccagaag 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Leu Leu Ser Thr Tyr Ile Thr Asp Glu Leu Gly Ile Glu Cys Gly 165 170 175 Ala Leu Ser Gly Ala Asn Ile Ala Thr Glu Val Ala Lys Glu Asn Trp 180 185 190 Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr His Ile Pro Glu Asp Phe Arg Gly Glu 195 200 205 Gly Tyr Asp Val Asp His Lys Val Leu Lys Ala Leu Phe His Arg Pro 210 215 220 Tyr Phe His Val Ser Val Ile Glu Asp Val Ala Gly Ile Ser Val Ala 225 230 235 240 Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Glu Gly 245 250 255 Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly Leu 260 265 270 Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Gln Met Phe Phe Pro Glu Ser Arg Val 275 280 285 Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr Thr 290 295 300 Cys Ala Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Lys Leu Met Ala Glu Ser 305 310 315 320 Gly Met Ser Ala Leu Asp Ala Glu Lys Lys Leu Leu Asn Gly Gln Ser 325 330 335 Ala Gln Gly Ile Ile Thr Cys Lys Glu Val His Glu Trp Leu Glu Thr 340 345 350 Cys Asn Ser Ile Ser Glu Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln Ile 355 360 365 Ile Tyr Asn Asn Leu Pro Met Glu Asn Ile Pro Asp Met Ile Asp Glu 370 375 380 Leu Glu Val Phe Arg *** 385 390 <210> 4 <211> 1328 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> g1544 gene promoter allele1 <400> 4 agaaaatagt ttctccgatt aaattttttt ttcaaatcaa atctttattt aagaattggt 60 agtgtatagt agtataatat tgcctaagaa attggagtag tccgtaaaaa atgggacaaa 120 attgttgaaa ttgagcaacc tgaaaatttt atgctggtct caagtagaga aacagacgta 180 gaaccaaaat tgacccaatt tcttgttgcc tttaattggg tcattcataa gaattcaaaa 240 tattttcttt tcccactcac gcgagagata tgcgcacacg atatagttaa taccgcttgt 300 aacaatacgt agatggccaa aaatgaacaa aaggggacac tcctcaaaag aaaaaattgc 360 ttgtttggct gtcttctcca attgaaatat acacacacac cgcggtaaaa aaaaaattga 420 aatggaaatc gcggtgggac aaaagtagca accacaacaa gggaattttc cttactgctg 480 cggcagatcc ttactcatct ctcgaatata tatagcctct tgggtccacg ggcaaaaaag 540 aaataaaaaa aagagaagca acagaaccgc acgcaacgta cgcagtgatc catccatttt 600 ccacaaaatt tatctatttt cttgtctata ttttttacgt acaactaact gatcttcttg 660 tccccctccc cccatttacc 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ttgtgactct atggagttta cctattttat ataccactgt atcacaaaaa gtaataacaa 60 cttctcaaat ataatacaat atttaataaa tatatttata tattctaaaa tctacgtttt 120 tctctttctt aaaaaaataa acaaactgac cctttcaatc ttcaatgtga tactttactt 180 attttatttc attacacaga aaggtataaa tatatacata acttaatggt ttattcattt 240 cttcttatta gacagagtgg ttagttgttg tttaacccat tccaataata aatcagtttg 300 taaataacct tcactgttaa atactttatt aatctctaat gaactagtta aagttttctt 360 cttattatct atcaaagtca tattgtaaat tggtttattt tcttcaaatt ctgtctttaa 420 tttaattatt tcagtaccat tcttaccact atatacgata gatttttcaa catatttctt 480 aaagaaccaa aatattacag atagtacaaa atatgtaccg actaaaattt gttgatattt 540 aacgatatta tcatgaacaa attttttatc aatgatgaaa ctgattgctg caacgatggc 600 agttgaataa ccaattaata atttctgatc aactaattca aaggtttctt cataacctaa 660 tcttttcata acatcaggta gactttcatt tatagtttgt gatacttcag agatggaata 720 aacgttaaca ggtttactca ttgtgcttta aaggagaatg cggaattaat gagctcttta 780 ctatgtatca gaactcgaac taatgcaaag aaaaatggaa taaacttgtt acaatatgta 840 tgaattttgt ctattctttt 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ttttttacgt acaactaact gatcttcttg 660 tccccctccc cccatttacc cgttaaaatg aaagctgaac aacagaaaat aataattcgc 720 tctggtggac aaaaaataca agaacaagag agtatcataa ttatgtgggt cacaaatgac 780 cctacaactg tcacctagtt ggtacaaaat ttgaccctca ttctcaaata attactacat 840 ttgggtctgt attaatgcta atatttcaat atatctctat ctatcagtca catacaaatt 900 tatcttcatc ttaaagggac tcacttactc aataatggtc tatctttata tttttttcat 960 acgtatgtat gtacgtagta aagggccatc aatgatccat cttactatta ttattcttta 1020 gttatttcta agcaacaaaa ggtctgtacc acagtttcag tgtcgtcata cctcttcttt 1080 taatttcttt tcggggaggg atgtcttaat gctaacttct gtctcactat taacggtaaa 1140 tcgtattaat ctcaatatat atataaaggg ttgatatttt ccaccgtttt aaaaattatt 1200 cccttgtttc tctattatta attttagact acttatttta attatttttc ccttttttac 1260 ttattatata tatataacta tatattacca ataataatat aagcaatcac atatatttat 1320 cccattaa 1328 <210> 39 <211> 1328 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR of g1544 allele 2 <400> 39 agaaaatagt ttctccgatt aaattttttt ttcaaatcaa atctttattt aagaattggt 60 agtgtatagt agtataatat tgcctaagaa attggagtag tccgtaaaaa atgggacaaa 120 attgttgaaa ttgagcaacc tgaaaatttt atgctggtca caagtagaga aataggcgta 180 gaaccaaaat tgacccaatt tcttgttgcc tttaattggg tcattcataa gaattcaaaa 240 tattttcttt tcccactcac gcgagagata tgcgcacacg atataattaa taccgtttgt 300 aacaatacgt agatggccaa aaatgaacaa aatgggacac tcctcaaaag gaaaaattgc 360 ttgtttggct gtcttctcca attgaaatat acacacacac cgcggtaaaa aaaaaattga 420 aattgaaatc gcggtgggac aaaagtagca accacaacaa gggaattttc cttactgctg 480 cggcagatcc ttactcatct cttgaatata tatagcctct tgggtccacg ggcaaaaaag 540 aaaaaaaaaa aagagaagca acagaaccgc acacaacgta cgcagtgatc catccatttt 600 ccacaaaatt tatttatttt cttgtctgta ttatttacgt acaactaact gatcttcttg 660 tccccccccc cccatttacc cgttaaaatg aaagctgaac aacagaaaat aataattcgc 720 tctgatggac aaaaaataca agaacaagag agtatcatca ctatgtgggt cacaaatgac 780 cctacaactg taatctagtt gatacaaaat ttgaccctca ttctcaaata attactacat 840 ttgggtctgt attaatacta atatctgtat atctctctat ctatcagtca catacaaatt 900 tatcttcatc ttaaagggac tcacttactc aataatggtc tatctttata tttttatcat 960 acgtatgtat gtacgtagta aagggccatc aatgatccat attattatta ttattcttta 1020 gttatttcta agcaacaaaa ggtctgtacc acagtttcag tgtcgtcata tctcttattt 1080 taatttcttt tcggggaggg atgtcttaat gctaacttct gtctcactat taacggtaaa 1140 tcttattaat ctcaatatat atataaaggg ttgatatttt ccaacgtttt aaaacttatt 1200 cccttgtttc tatattacta atttaacatt acttatttta attatttttc ccttttttac 1260 ttattatata tatataagta catattacca ataataatat aagcaatcac atatatttat 1320 cccattaa 1328 <210> 40 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' UTR of g1544 allele 1 <400> 40 tccatcatca agaatatata tatataataa agccatccct tttacgaacc tgcctgcatt 60 tgcttaagac cgagcaaaaa aaataaatta caacataacg aaaaaaacaa acaaacttaa 120 gggggagaaa aaaaaataat atcccataac ttacatacac aacatacata aaattaaaaa 180 aataaacatt ttatcaataa ttttttttta aagtatatag agctactaat attatagaaa 240 tacagacgca acttaaagaa ctttgttcaa tcttttcaat cttctcagtc ttttctagtc 300 ataataaatt atcaaatgcg aatatttaaa tcaaaattat ataaggggta tatcgtatat 360 atataaattt atcaaatgtg tatatgtatt ttattatgtt ta 402 <210> 41 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' UTR of g1544 allele 2 <400> 41 tccatcatca aaaatatata tatataataa agccatccct tttacgaacc tgcctgcatt 60 tgcttaagac cgagcaaaaa aaataaatta caatataacg aaaaaaacaa acaaacttaa 120 gggggagaaa aaaaaataat atcccataac ttacatacac aacatacata aaattaaaaa 180 aataaacatt ttatcaataa ttttttttta aagtatatat agctactaat attatagaaa 240 tacaaatgca acttaaagaa ctttgttcaa tcttttcaat cttctcaatc ttttctagtc 300 ataataaatt atcaaatgcg aatatttaaa ttaaaattat ataaagggta tatcatatat 360 atataaattt atcaattgtg tatatgtatt ttattatgtt ta 402 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 gggtactact atcgctaa 18 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 caccggcaac agagatac 18 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 cgtacgcagt gatccatc 18 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 caccggcaac agagatac 18 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 cgtacgcagt gatccatc 18 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 gctcggtctt aagcaaat 18 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 gcatcgtcaa ccatttaaag 20 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 ctcagcttga aatgcatc 18 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 gctgcacgtt tactgtat 18 <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 ctcagcttga aatgcatc 18 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 gctgcacgtt tactgtat 18 <210> 53 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 cttagatttc actgctgc 18

Claims (17)

  1. 내산성 효모 YBC 균주(KCTC13508BP)에서 디하이드록시아세톤 인산을 글리세롤-3-인산으로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자가 결실 또는 약화되어 있고, 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 젖산 생성능을 가지는 재조합 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 디하이드록시아세톤 인산을 글리세롤-3-인산으로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자는 GPD1 또는 GPD2 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 디하이드록시아세톤 인산을 글리세롤-3-인산으로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자는 GPD1이고, 상기 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
  4. 제1항에 있어서, 알코올 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 추가로 결실 또는 약화되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
  5. 제4항에 있어서, 상기 알코올 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 6 또는 서열번호 7로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
  6. 제1항에 있어서, 피루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자를 코딩하는 유전자가 추가로 결실 또는 약화되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
  7. 제6항에 있어서, 상기 피루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 8 또는 서열번호 9 으로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
  8. 제1항에 있어서, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자가 추가로 결실 또는 약화되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
  9. 제8항에 있어서, 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 10 또는 서열번호 11로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
  10. 제1항에 있어서, 상기 디하이드록시아세톤 인산을 글리세롤-3-인산으로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자의 결실 또는 약화에 의하여 모균주 보다 글리세롤 생성능이 감소되는 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
  11. 내산성 효모 YBC 균주(KCTC13508BP)에서 디하이드록시아세톤 인산을 글리세롤-3-인산으로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자인 GPD1 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자인 CYB2 유전자, 알코올 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자인 ADH 유전자 및 피루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자인 PDC 유전자가 결실되고, 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 젖산 생성능을 가지는 재조합 균주.
  12. 제11항에 있어서, 상기 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 결실된 CYB2 유전자, ADH 유전자, PDC 유전자 및 GPD1 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자 위치에 도입되어 상기 결실된 치환된 유전자의 프로모터에 의하여 조절되는 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
  13. 다음을 단계를 포함하는 젖산의 제조방법;
    (a) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 재조합 균주를 배양하여 젖산을 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 젖산을 수득하는 단계.
  14. 디하이드록시아세톤 인산을 글리세롤-3-인산으로 전환하는 효소 활성을 가지고, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 단백질과 90% 이상의 상동성을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자.
  15. 제14항에 있어서, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 유전자.
  16. 디하이드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-인산으로 전환하는 효소로 전환하는 효소 활성을 가지고, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 단백질과 90% 이상의 상동성을 가지는 단백질.
  17. 서열번호 4 또는 서열번호 5으로 표시되는 염기서열을 가지는 GPD1 유전자 유전자의 포로모터.
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