KR102016050B1 - 신규한 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

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KR102016050B1
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Abstract

본 출원은 신규한 프로모터 및 이를 이용한 L-아미노산 생산 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 프로모터 및 이의 용도 {Novel promoter and uses thereof}
본 출원은 신규한 프로모터 및 이를 이용한 목적 산물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
기술의 발전에 따라 세포 내 메커니즘에 대한 이해도가 높아지면서, 세포의 대사작용을 조절하여 다양한 목적 산물을 생산하는 방법이 개발되고 있다. 현재, 에세리키아 속 또는 코리네박테리움 속 등의 미생물이 가장 많이 이용되고 있으며, 아미노산, 폴리페놀, 플라보노이드, 항체, 천연 고무 등 다양한 저분자, 고분자 화합물, 의약품 단백질 등의 생산에 직접 사용되고 있다.
대사작용을 조절하는 다양한 방법 중에서도, 특히 목적 유전자의 과발현을 유도하기 위한 고효율의 유전자 발현 시스템이 주로 연구되고 있다. 예로서, 유전자 발현에 가장 크게 관여하는 요소는 프로모터임이 잘 알려져 있음에 따라, 대장균 유래의 몇몇 프로모터(Ptac, Ptrc, Plac)를 활용한 연구가 활발히 진행되고 있다. 또한, 본 출원인은 선행 연구를 통해 대장균의 tac 프로모터 대비 296%의 강한 활성을 나타내는 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 cj1 프로모터를 발굴한바 있다(대한민국 공개특허공보 제10-2006-0068505호). 그러나, 효율적으로 고수율의 목적 산물을 생산할 수 있는 방법에 대한 연구는 여전히 필요하다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 목적 유전자의 발현을 증가시켜 결국 목적 산물을 효율적으로 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구한 결과, 활성이 높다고 알려진 기존 cj1 프로모터의 서열을 변이시켜 신규의 프로모터(cj2.2)를 제작하였으며, 이는 cj1 프로모터 보다도 약 3배 이상의 높은 활성을 나타냄을 확인하여 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 벡터가 도입된 숙주 세포를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 상기 숙주 세포 또는 이를 배양한 배지에서 목적 물질을 분리하는 단계를 포함하는, 목적 물질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 출원의 하나의 양태는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 출원에서 용어 "프로모터"는 폴리머라제(polymerase)에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 목적 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 코딩 영역의 상위(upstream)의 비 해독된 뉴클레오티드 서열, 즉 폴리머라제가 결합하여 유전자의 전사를 개시하도록 하는 DNA 영역을 의미한다. 상기 프로모터는 mRNA 전사 개시부위의 5' 부위에 위치할 수 있다.
본 출원에서, 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "cj2.2 프로모터"로 혼용되어 명명될 수 있으며, 본 명세서에서는 상기 기술된 용어가 모두 사용될 수 있다.
본 출원의 목적상, 상기 폴리뉴클레오티드는 종래의 프로모터에 비하여 증가된 프로모터 활성을 가질 수 있다. 또한, 목적하는 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 목적 유전자의 발현 증가를 가져올 수 있으며, 상기 목적 유전자의 발현뿐만 아니라 상기 목적 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 및 활성을 증가시킬 수 있다.
또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 범용 프로모터로 사용될 수 있다.
이때, 상기 용어 "목적 유전자"는 발현을 증가시키고자 하는 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 의미하며, 일 예로서 아미노산 생산에 관여하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 유전자는 메치오닌 또는 시스테인 등의 아미노산 생산에 관여하는 단백질을 코딩하는 것일 수 있고, 더욱 구체적으로 메치오닌의 생산에 관여하는 메치오닌 전환 효소 또는 시스테인의 생산에 관여하는 시스테인 전환 효소를 코딩하는 것일 수 있으며, 더욱 더 구체적으로 메치오닌의 생산에 관여하는 O-아세틸호모세린 설피드릴라제(O-acetylhomoserine sulfhydrylase) 또는 시스테인의 생산에 관여하는 O-포스포세린 설피드릴라제(O-phosphoserine sulfhydrylase: OPSS)를 코딩하는 것일 수 있으며, 가장 구체적으로 metZ 유전자 또는 opss 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 각 유전자의 서열은 미국 국립보건원의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스를 통하여 당업자가 용이하게 입수할 수 있다.
본 출원에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
또한, 본 출원의 뉴클레오티드 서열은 종래 알려진 돌연변이 유발법, 예를 들면 방향성 진화법(direct evolution) 및 부위특이적 돌연변이법(site-directed mutagenesis) 등에 의하여 변형될 수 있다.
따라서, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에 대해서 적어도 60% 이상, 구체적으로는 70% 이상, 보다 구체적으로는 80% 이상, 보다 더 구체적으로는 83% 이상, 84% 이상, 88% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 또는 97% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 서열과 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 경우도 역시 본 출원의 범주에 포함됨은 자명하다.
본 출원에서 용어 "상동성"은 주어진 뉴클레오티드 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 상기 뉴클레오티드 서열에 대한 상동성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST(참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993)나 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)를 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
상기 "엄격한 조건"은 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 공지의 문헌에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 60% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다. 혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 상기 용어 "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra,9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
특히, 상기에서 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진다는 표현은 해당 폴리뉴클레오티드를 프로모터로서 목적 유전자에 연결하여 사용할 때, 제한효소 사용과 같이 목적 유전자에 연결하는 과정 중에 발생할 수 있는 뉴클레오티드의 추가, 및/또는 삭제, 및/또는 변이 등의 경우를 배제하지 않는다.
또한, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화되어 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
이때, 상기 "프로모터"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어 "벡터"는 적합한 숙주 세포 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 유전 물질을 보유하는 인위적 DNA 분자로서, 적합한 유전자 발현 조절 서열; 및 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 제조물을 의미한다.
구체적으로, 상기 용어 "유전자 발현 조절 서열"은 상기 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 이에 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 서열을 의미한다.
구체적으로, 상기 유전자 발현 조절 서열은 유전자의 전사를 실시하기 위한 프로모터 외에 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 DNA를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 원핵 생물에 적합한 조절 서열로서 프로모터, 및 리보좀 결합 부위를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드는 통상의 당업자에 의해 필요에 따라 상기한 바와 같은 유전자 발현 조절을 위한 서열을 구성할 수 있다.
또한, 상기 용어 "작동 가능하게 연결된"(operatively linked)은 상기 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 목적 유전자의 전사를 개시 및 매개하도록 상기 목적 유전자의 뉴클레오티드 서열과 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주 세포 내에서 발현 가능한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용하여 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다.
예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λLB3, λBL4, λⅨII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다.
또한, 숙주 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 내재적 프로모터를 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 예를 들면, pECCG117, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pCES208, pXMJ19 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다.
본 출원의 벡터는 상동재조합을 일으켜서 염색체 내로 삽입될 수 있으므로 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 폴리뉴클레오티드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 상기 벡터가 도입된 숙주 세포를 제공한다.
이때, 상기 "벡터"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "숙주 세포"는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 의미한다.
이때, 상기 용어 "형질전환"은 프로모터 활성을 갖는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 상기 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드의 조절을 받는 목적 유전자가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다.
구체적으로, 상기 숙주 세포는, 상기 폴리뉴클레오티드가 도입되고 프로모터로서 작동할 수 있으며, 이에 따라 상기 폴리뉴클레오티드의 조절을 받는 목적 유전자의 발현이 증가하는 것이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 일 예로서, 미생물, 식물 세포, 동물 세포 등이 될 수 있고, 구체적으로 에세리키아 속 또는 코리네박테리움 속 등의 미생물일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 에세리키아 속의 대장균일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 형질전환의 방법은 상기 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 모든 방법을 포함하며, 숙주 세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 상기 숙주 세포 또는 이를 배양한 배지에서 목적 물질을 분리하는 단계를 포함하는, 목적 물질을 생산하는 방법을 제공한다.
이때, 상기 "숙주 세포"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 출원에서, 상기 목적 물질은 아미노산일 수 있다. 구체적으로, 상기 아미노산은 다른 언급이 없는 한 L-형태의 아미노산일 수 있으며, 글리신, 알라닌, 발린, 로이신, 아이소로이신, 트레오닌, 세린, 시스테인, 글루타민, 메치오닌, 아스파라트산, 아스파라긴, 글루탐산, 라이신, 알지닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 프롤린 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 더욱 구체적으로, 상기 아미노산은 메치오닌 또는 시스테인일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "배양"은 숙주 세포를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원에서 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 이용하여 목적 물질을 생산하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정, 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다.
배지 중에서 사용될 수 있는 당원으로는 포도당, 사카로즈, 유당, 과당, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨을 함유하는 염이 포함될 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
상기 숙주 세포의 배양 중 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입할 수 있다.
배양물(배지)의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃일 수 있다. 배양 시간은 원하는 목적 물질의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으나, 구체적으로는 10 내지 160시간일 수 있다.
배양물(배지)로부터의 목적 물질의 회수는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리되어 회수될 수 있다. 이러한 분리 방법에는, 원심분리, 여과, 크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 회수 단계는 정제 공정을 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 신규 프로모터는 미생물에 도입되어 이에 연결되어 있는 유전자의 발현 및 활성을 증가시킬 수 있으므로, 상기 프로모터 및 유전자의 영향을 받는 목적 산물을 효율적으로 생산하는데 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 출원의 일 실시예에 따라 제조한, 재조합 벡터 변이 라이브러리의 개별 클론에서 발현된 녹색형광단백질의 형광 세기를 분석한 결과를 보여주는 그래프이다. cj1은 cj1 프로모터를 포함하는 클론, M1 내지 M20은 상기 변이 라이브러리의 각 개별 클론을 의미한다.
도 2는 본 출원의 일 실시예에서 제조한, cj2.2프로모터 및 metZ 유전자를 포함하는 벡터의 개열지도이다.
도 3은 본 출원의 일 실시예에서 제조한, cj2.2프로모터 및 opss 유전자를 포함하는 벡터의 개열지도이다.
이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
실시예 1: cj1 프로모터 서열을 포함하는 재조합 벡터의 변이 라이브러리 제작
미생물 균주에서 유전자 발현을 강하게 유도할 수 있는 프로모터를 발굴하기 위하여, 강력한 활성을 나타낸다고 알려진 기존의 cj1프로모터(대한민국 공개특허공보 제10-2006-0068505호)를 기반으로 변이 라이브러리를 제작하였다.
구체적으로, cj1 프로모터의 서열을 포함하는 재조합 벡터 pCL-cj1-gfp를 주형으로 하여 변이 라이브러리를 제작하였다. 라이브러리는 error-prone PCR 키트(clontech Diversify® PCR Random Mutagenesis Kit)를 이용하여 제작하였다. 변이가 발생할 수 있는 조건에서, 서열번호 2 및 3의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 1000bp 당 1개의 변이가 발생하는 조건은 다음과 같다: MnSO4(8 mM)를 넣지 않고 dGTP를 40μM(final rxn) 첨가하여 94℃에서 30초 동안 선-열처리(pre-heating) 후, 94℃에서 30초, 68℃에서 1분의 과정을 25회 반복 수행하였다. 이 때 얻어진 PCR 산물을 메가프라이머(500~125 ng)를 이용하여 95℃에서 50초의 변성(denaturation), 60℃에서 50초의 어닐링(annealing), 및 68℃에서 12분의 연장(extension) 과정을 25회 반복 수행한 후 DpnI 처리 과정을 거쳐 대장균 DH5α 균주에 형질 전환하여 라이브러리를 제작하였다.
실시예 2: 재조합 벡터의 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP) 활성 세기 평가
상기 실시예 1에서 제작한 재조합 벡터 변이 라이브러리의 활성을 평가하기 위하여 이의 GFP 활성을 비교하였다.
구체적으로, 약 10,000주 이상의 라이브러리를 M9 배지에 접종하여 약 24시간 동안 37℃, 900rpm에서 배양하였다. 배양한 대장균을 4000rpm으로 10분간 원심분리하여 균체를 수득한 후, PBS(phosphate bufferedsaline)에 현탁하고 형광세포분석기를 통하여 녹색형광단백질의 세기가 강한 변이주를 선별하였다.
1차 스크리닝으로 cj1 프로모터와 비교하여 GFP 활성이 약 1.1배 내지 5배 높은 변이주를 20종 선별하였다(도 1). 이 중에 GFP 활성이 가장 높은 변이 프로모터 M11을 cj2.2 프로모터(서열번호 1)로 명명하고, 서열을 분석하였다.
실시예 3: cj2.2 프로모터의 발현 벡터 제작
상기 실시예 2에서 재조합 벡터 라이브러리 중 cj2.2 프로모터의 활성이 가장 높음을 확인한바, 이를 미생물 균주에 도입하기 위하여 pCL_Pcj1 벡터를 사용하여 위치선택적 돌연변이(Site-directed mutagenesis)를 수행하였다.
구체적으로, 서열번호 4 및 5의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR은 94℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링, 및 68℃에서 12분의 연장 과정을 포함하며, 상기 과정들은 18회 반복 수행하였다.
상기 과정을 통해 얻어진 산물에 DpnI를 처리한 후, DH5α 균주에 형질 전환하여 상기 cj2.2 프로모터를 포함하는 pCL_Pcj2.2 벡터를 제작하였다.
실시예 4: cj2.2 프로모터의 유전자 발현 촉진 활성 측정
실시예 4-1: 메치오닌 전환 효소(O-아세틸호모세린 설피드릴라제)의 발현량 측정
cj2.2 프로모터의 활성 및 이에 따른 유전자 발현 유도능을 확인하기 위하여, cj2.2 프로모터에 메치오닌 전환 효소(O-아세틸호모세린 설피드릴라제)를 연결하고 이의 발현량을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3에서 제작한 pCL_Pcj2.2 벡터에 O-아세틸호모세린 설피드릴라제를 암호화하는 metZ 유전자(대한민국 등록특허공보 제10-1250651호)를 클로닝하였다. PCR은 로도박터 스페로이드의 염색체를 주형으로, 서열번호 6 및 7의 프라이머를 이용하여 수행하였으며, 94℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링, 및 72℃에서 2분의 연장 과정을 30회 반복 수행하였다. 상기 PCR 반응으로 획득한 DNA 절편을 BamHI/SalI으로 절단한 후, 동일한 제한효소로 절단한 pCL_P2.2 벡터에 클로닝하였다. 상기 방법으로 제작된 벡터를 pCL-Pcj2.2-metZ라 명명하였으며, 상기 벡터의 모식도는 도 2에 나타내었다.
상기 pCL-Pcj2.2-metZ 벡터를 대장균 K12 균주에 형질전환 시키고, 50 ㎍/L의 스펙티노마이신이 포함된 LB 평판배지에서 배양한 후 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니를 50 ㎍/L의 스펙티노마이신이 포함된 LB 배지 3 ㎖에 접종하여 37℃, 200rpm 조건으로 16시간 배양하였다. 이를 다시 새로운 25 ㎖ LB 액체배지(250 ㎖ 용량의 플라스크)에 재접종하여 OD600이 0.5~0.6 되도록(2~3시간) 동일 배양 조건에서 키운 직후, 포도당 4%가 첨가된 LB배지 500 ㎖(1L 용기)를 포도당이 고갈되는 시점까지 배양하였다. 배양이 완료된 후, 배양액 1 ㎖을 회수하고 원심분리기로 상등액을 제거하여 세포를 획득하였다. 상기 세포를 0.1M 포타슘포스페이트 완충액(potassium phosphate, pH7.5)으로 세척한 후, 1 ㎖의 포타슘포스페이트 완충액에 현탁하고, 초음파를 이용하여 세포를 파쇄하였다.
이후, 상기 파쇄물 내 메치오닌 전환 효소(O-아세틸호모세린 설피드릴라제)의 활성을 측정하였다. 효소 활성을 측정하기 위하여, 80 g/L의 O-아세틸호모세린 1 ㎖에 소디움메칠머캅탄(15%, w/v) 0.01 ㎖, O-아세틸호모세린 설피드릴라제 0.01 ㎖, 및 피리독살포스페이트(pyridoxal 5'-phosphate) 0.1 mM을 혼합한 기질 용액에, 상기 파쇄물을 5 ㎕ 첨가한 후, 800rpm 교반 하에 33℃에서 효소 반응을 수행하였다. 상기 반응이 완료된 후, 메치오닌 및 O-아세틸호모세린의 농도를 분석하기 위하여 HPLC를 이용하였으며, HPLC에서 분석된 결과를 이용하여 종래의 방법을 통해 단백질 활성을 계산하였다. 그 결과는 하기의 표 1에 나타내었다.
벡터 활성(Unit/㎖) 상대적인 활성
pCL-Pcj1-metZ 9.3 1.0
pCL-Pcj2.2-metZ 29.2 3.1
상기 표 1에서 볼 수 있듯이, 종래에 미생물 균주에서 유전자 발현을 강하게 유도한다고 알려진 cj1 프로모터에 비하여, 본 출원의 cj2.2 프로모터는 그보다 유전자(O-아세틸호모세린 설피드릴라제)의 활성을 약 3.1배 더 증가시키는 것을 확인하였다.
따라서, 상기 cj2.2 프로모터는 종래의 프로모터에 비하여 더 강한 활성을 가지며, 그에 따라 이에 연결된 유전자가 코딩하는 목적 효소의 활성도 더 증가될 수 있음을 확인하였다.
실시예 4-2: 시스테인 전환 효소(O-포스포세린 설피드릴라제)의 발현량 측정
cj2.2 프로모터의 활성 및 이에 따른 유전자 발현 유도능을 확인하기 위하여, cj2.2 프로모터에 시스테인 전환 효소(O-포스포세린 설피드릴라제)를 연결하고 이의 발현량을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3에서 제작한 벡터에 O-포스포세린 설피드릴라제(O-phosphoserine sulfhydrylase; 이하 "OPSS"로 지칭함, 대한민국 등록특허공보 10-1208267)를 클로닝하였다. PCR은 마이코박테리움 스메그마틱스의 염색체를 주형으로, 서열번호 8 및 9의 프라이머를 이용하여 수행하였으며, 상기 실시예 4-1과 유사한 방법으로 벡터를 제작하였다. 제작한 벡터는 pCL-Pcj2.2-opss라 명명하였으며, 상기 벡터의 모식도는 도 3에 나타내었다.
상기 pCL-Pcj2.2-opss 벡터를 대장균 K12 균주에 형질전환 시키고, 50 ㎍/L의 스펙티노마이신이 포함된 LB 평판 배양한 후 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니를 50 ㎍/L 스펙티노마이신이 포함된 LB 배지 5 ㎖에 접종하여 37℃, 200rpm 조건으로 16시간 배양하였다. 이를 다시 새로운 25 ㎖ LB 액체배지(250 ㎖ 용량의 플라스크)에 250 ㎖ 재접종하여 OD600이 0.5~0.6 되도록(2~3시간) 동일 배양 조건에서 키운 직후, 포도당 4%가 첨가된 LB 배지 500 ㎖(1L 용기)를 포도당이 고갈되는 시점까지 배양하였다. 배양액에 자일렌 2%(v/v)를 첨가하여 파쇄하였고, 이를 활성평가에 사용하였다.
이후, 상기 pCL-Pcj2.2-opss 벡터를 이용하여 제조된 OPSS 효소의 활성 평가 조건 및 방법은 기존의 문헌(Mino K 및 Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003; BurnsKE 외, J. Am.Chem. Soc., 127: 11602-11603, 2005; Westrop GD 외, J. Biol.Chem., 281: 25062-25075, 2006)을 인용하였다. 기질의 첨가 단위는 ㎖이며, 효소 활성을 측정하기 위한 조건은 하기 표 2와 같다.
블랭크(Blank) OPSS 반응액
효소 - 파쇄물 40 ㎖
(또는 조단백질 50 ㎎)
1M HEPES (pH7.4) 100 ㎖ 100 ㎖
0.5M Na2S 20 ㎖ 20 ㎖
10mM PLP 20 ㎖ 20 ㎖
100mM OPS 0 50 ㎖
DW 790 ㎖ 750 ㎖
Total 1000 ㎖ 1000 ㎖
상기 표 2에서 효소를 제외한 혼합물을 37℃에서 5분간 선-인큐베이션한 후, OPSS 효소 50 ㎎을 첨가하여 37℃에서 반응시킨 후 상기 반응액에 33.2% TCA 0.1 ㎖를 추가하여 반응을 중지시킨 후, 0.1N HCl에 희석하여 LC 분석을 통해 시스테인과 시스틴을 분석하였다. 측정된 활성 결과는 하기의 표 3에 나타내었다.
벡터 활성 (Unit/㎖) 상대적인 활성
pCL-Pcj1-opss 6.0 1.0
pCL-Pcj2.2-opss 12.0 2.0
상기 표 3에서 볼 수 있듯이, 종래에 미생물 균주에서 유전자 발현을 강하게 유도한다고 알려진 cj1 프로모터에 비하여, 본 출원의 cj2.2 프로모터는 그보다 유전자(O-포스포세린 설피드릴라제)의 활성을 약 2배 더 증가시키는 것을 확인하였다.
따라서, 상기 cj2.2 프로모터는 종래의 프로모터에 비하여 더 강한 활성을 가지며, 그에 따라 이에 연결된 유전자가 코딩하는 목적 효소의 활성도 더 증가될 수 있음을 확인하였다.
실시예 5: cj2.2 프로모터에 의해 생산된, 효소를 이용한 목적 산물의 생산
실시예 5-1: 메치오닌의 생산
상기 실시예 4-1을 통해 cj2.2 프로모터를 이용하면 메치오닌 전환 효소(O-아세틸호모세린 설피드릴라제)의 활성을 증가시킬 수 있음을 확인한바, 상기 효소를 이용하여 목적 산물인 메치오닌을 생산함으로써 이의 활성 및 반응기 시스템에서의 메치오닌 생산 효율을 확인하였다.
한편, O-아세틸호모세린 설피드릴라제는 O-아세틸호모세린을 메치오닌으로 전환한다.
구체적으로, 먼저 효소 반응의 기질인 O-아세틸호모세린은 기존의 특허(대한민국 등록특허 제10-1250651호)에 기재된 미생물 균주를 발효하여 생산한 것을 사용하였으며, 배양한 발효액으로부터 원심분리기를 이용하여 세포를 제거한 후 약 70 g/L 농도의 배양액 500 ㎖을 기질로 사용하였다. 효소인 O-아세틸호모세린 설피드릴라제로는 상기 실시예 4-1에서 생산한 파쇄물(효소액) 50 ㎖를 사용하였다. 효소 반응에는 소디움메칠머캅탄 약 50 ㎖를 사용하였고, 피리독살포스페이트(pyridoxal: 5'-phosphate, 미국 Sigma)는 0.1 mM 농도로 투입하였다. 반응은 pH7.0, 33℃, 교반은 700rpm으로 설정하였다. 반응 시간은 소디움메칠머캅탄을 공급하며 3시간 동안 수행하였다. O-아세틸호모세린과 L-메치오닌의 시간별 농도 분석은 HPLC를 이용하여 수행하였고, 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
시간
[분]		 Cj1 Cj2.2
O-아세틸호모세린
[g/L]		 L-메치오닌
[g/L]		 O-아세틸호모세린
[g/L]		 L-메치오닌
[g/L]
0 66.1 0 66.1 0
30 20.6 24.1 9.2 35.5
90 9.5 42.0 2.8 47.7
120 3.1 47.2 0 49.4
180 0 49.5 - -
표 4에서 볼 수 있듯이, 종래에 미생물 균주에서 유전자 발현을 강하게 유도한다고 알려진 cj1 프로모터에 비하여, 본 출원의 cj2.2 프로모터를 이용하는 경우에는 O-아세틸호모세린이 L-메치오닌으로 전환되는 속도가 더 빠르며, 따라서 L-메치오닌이 보다 더 빠르게 생산되는 것을 확인하였다.
이는, 본 출원의 cj2.2 프로모터로 유전자를 발현시키는 경우, 해당 유전자가 코딩하는 목적 산물, 즉 메치오닌 전환 효소(O-아세틸호모세린 설피드릴라제)의 활성 증가에 의한 것임을 알 수 있었다.
실시예 5-2: 시스테인의 생산
상기 실시예 4-2를 통해 cj2.2 프로모터를 이용하면 시스테인 전환 효소(O-포스포세린 설피드릴라제)의 활성을 증가시킬 수 있음을 확인한바, 상기 효소를 이용하여 목적 산물인 시스테인을 생산함으로써 이의 활성 및 반응기 시스템에서의 시스테인 생산 효율을 확인하였다.
한편, O-포스포세린 설피드릴라제는 OPS를 시스테인(또는 이의 산화물인 시스틴)으로 전환한다.
구체적으로, 전환 반응액의 시스테인 농도는 Gaitonde 방법 및 LC 분석으로 정량하였다. 또한 시스테인이 산화되어 생성된 시스틴은 LC 분석으로 정량하였다. 먼저, 1L 용기 스케일에서의 전환 반응에 앞서, 1L 용기 스케일 발효를 통해 획득한 OPS 발효액에 대하여 원심분리(10000rpm, 10분, 4℃)를 수행하여 상등액을 수득하고 이를 막투과(0.45 ㎛)하여 균체를 제거하였다. 상기 OPS 발효액(19.317 g/L)에 72g Na2S을 투입하고 이로부터 생기는 침전물은 와트만 여과지(6 ㎛)을 이용하여 제거하였다. 이후 10 mM PLP(pyridoxal 5'-phosphate)을 투입하고, 37℃, 200rpm, 5분간 선-인큐베이션하고 최종적으로 50 ㎎ OPS 설피드릴라제를 첨가하여 1L 용기 스케일에서 전환 반응을 수행하였다. 효소 활성을 측정하기 위한 조건은 하기 표 5와 같다.
반응액 구성 반응액 내 농도
(또는 중량)		 혼합된 양 (중량 또는 부피)
OPS 설피드릴라제
(2.59 ㎍/㎕)		 50 ㎎ 19 ㎖
Na2S 300 mM 72g
10 mM PLP 0.1 mM 10 ㎖
균체 제거된 OPS 발효액 (19.317 g/ℓ) 104.42 mM 1000 ㎖
Total - 1029 ㎖
이후, 반응 0, 10, 30, 60, 120분에 각각 시간별로 상기 반응액을 100 ㎕씩 취하여 33.2% TCA 100 ㎕와 섞어서 반응을 중지시켰고, 반응액을 0.1N HCl에 희석하여 LC 분석을 통해 시스테인과 시스틴을 분석하였다. 또한 Gaitonde 방법을 통해서 시스테인과 시스틴을 정량하였다. 분석된 결과는 하기 표 6에 나타내었다.
시간
[분]		 시스테인 및 시스틴 [g/L]
Cj1 Cj2.2
0 1.36 2.5
10 3.58 4.76
30 6.45 7.65
60 8.57 8.98
120 9.07 -
표 6에서 볼 수 있듯이, 종래에 미생물 균주에서 유전자 발현을 강하게 유도한다고 알려진 cj1 프로모터에 비하여, 본 출원의 cj2.2 프로모터를 이용하는 경우에는 시스테인 및 시스틴이 보다 더 빠르게 생산되는 것을 확인하였다.
이는, 본 출원의 cj2.2 프로모터로 유전자를 발현시키는 경우, 해당 유전자가 코딩하는 목적 산물, 즉 시스테인 전환 효소(O-포스포세린 설피드릴라제)의 활성 증가에 의한 것임을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Novel promoter and uses thereof <130> KPA180155-KR <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 307 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cj2.2 promoter <400> 1 caccgcgggc ttattccatt acatggaatg accaggaatg gcagggaatg cgacgaaatt 60 gactgtgtcg ggagcttctg atccgatgct gccaaccagg agagaaaata atgacatgtg 120 caggcacgct ggtgagctgg agatttatga tctcaagtac cttttttctt gcactcgagg 180 gggctgagtg ccagaatggt tgctgacacc aggttgaggt tggtacacac tcaccaatcc 240 tgccgtcgcg ggcgcctgcg tggaacataa accttgagtg aaaccaaatc taggagatta 300 agatatc 307 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> error-prone F_PCR primer <400> 2 ttgcatgcct gcacaccgcg ggctta 26 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> error-prone R_PCR primer <400> 3 agtgaattcg agctcggtac ccgggg 26 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cj2.2 site directed F_primer <400> 4 ataaaccttg agtgaaacca aatctaggag attaa 35 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cj2.2 site directed R_primer <400> 5 ttaatctcct agatttggtt tcactcaagg tttat 35 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> metZ F_primer <400> 6 aattgtcgac atgggtaacg cgtttcgtga ag 32 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> metZ R_primer <400> 7 aattggatcc tcagatcacc gcgagcgc 28 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPSS F_primer <400> 8 aattgtcgac atgacgcgct acgactcc 28 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPSS R_primer <400> 9 aattggatcc ttattccagc gcgtcctc 28

Claims (6)

  1. 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진, 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 상기 벡터는 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터.
  4. 제2항의 벡터가 도입된 숙주 세포.
  5. 제4항에 있어서, 상기 숙주 세포는, 코리네박테리움 속 또는 에세리키아 속에 속하는 박테리아 세포인, 숙주 세포.
  6. 제4항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 상기 숙주 세포 또는 이를 배양한 배지에서 목적 물질을 분리하는 단계를 포함하는, 목적 물질을 생산하는 방법.
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