KR20060068505A - 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법 - Google Patents

코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 7로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 프로모터, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는 방법을 제공한다.
프로모터, 코리넥박테리움, 대장균

Description

코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터 서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는 방법{Novel promoter nucleic acid derived from corynebacterium genus bacteria, expression cassette comprising the promoter and vector comprising the cassette, host cell comprising the vector and method for expressing a gene using the cell}
도 1은 코리네박테리움 암모니아게네스 세포 추출물 시료를 2차원전기영동 분석하고 실버 염색을 수행한 다음 현상한 결과를 나타내는 도면이다
도 2는 탐색벡터 p117-gfp의 제조과정을 나타내는 도면이다.
도 3은 탐색벡터 p117-gfp로부터 본 발명의 프로모터 서열 pcj1 내지 pcj7를 포함하는 재조합 벡터의 제조과정을 나타내는 도면이다.
본 발명은 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터 서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는 방법에 관한 것이다.
코리네형 세균은 L-라이신, L-쓰레오닌 및 각종 핵산을 포함한 사료, 의약품 및 식품 등의 분야에서 다양한 용도를 갖는 화학물질을 생산하는 산업용 미생물이다. 이러한 코리네형 세균을 유전공학적 및 대사공학적 기술을 이용하여 고역가 균주로 개발하기 위해서는, 코리네형 세균내에서 여러 가지 대사과정에 관련된 유전자의 발현을 가능하게 하여야 하는데, 이를 위해서는 유용한 프로모터 개발이 필수적이라 할 수 있다.
코리네형 세균에서 유전자를 발현시키기 위해서는, 일차적으로 자체 유전자들이 원래 갖고 있던 프로모터를 사용하는 것이 일반적이었다 (Journal of Bacteriology, 181(19), 6188-6191, 1999 등). 한편, 코리네형 세균에서의 유전자 발현을 위한 프로모터 서열은 대장균이나 고초균 등과 같은 다른 산업용 미생물과는 달리 일반적인 구조가 알려지지 않았다. 그러므로, 클로람페니콜과 같은 항생제 내성 유전자의 프로모터 부분을 제거하고, 여기에 코리네형 세균으로부터 분리한 염색체 DNA를 적절한 제한효소로 절단하여 도입한 후, 이것으로 코리네형 세균을 형질전환시켜 얻은 균주의 항생제 내성을 측정함으로써, 프로모터를 개발해왔다 (Gene, 102, 93-98, 1991; Microbiology, 142, 1297-1309, 1996). 특히, 핵산 생산 미생물로 잘 알려진 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenesis)에 이용되는 프로모터의 경우, 개발이 매우 미약한 실정이며, 공지기술로는 기존에 대장균에서 보고된 tac 프로모터와 비교해서 약 10% 향상된 것이 공지되어 있다 (Biotechnol. Lett. 25, 1311-1316, 2003). 그러나, 유전자의 대량발현을 위한 측면에서는, 매우 만족스럽지 못한 유전자 발현효율을 보이는 단점이 있다. 또한, 미국특허 제5,593,781호에는 브레비박테리움 플라붐 스트레인 MJ-233 (FERM BP-1497)로부터 분리되고 tac 프로모터 보다 강력한 활성을 갖는 프로모터 DNA가 개시되어 있다. 그러나, 이 프로모터는 브레비박테리움 속으로부터 분리된 것으로 다른 세포에서 작용가능하지 않을 수 있고, 따라서 산업적으로 많이 이용되는 코리네박테리움 암모니아게네스로부터 유래되고, 강력하면서도 다른 세포에서도 활성을 가질 수 있는 프로모터 서열이 여전히 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 코리네박테리움 암모니아게네스로부터 강력한 프로모터 서열을 갖는 영역을 탐색하던 중 본 발명의 프로모터가 코리네박테리움 암모니아게네스 및 대장균에서 발현가능하고, 강력한 프로모터 활성을 갖는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 코리네박테리움 속에서 강력한 프로모터 활성을 갖는 프로모터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프로모터를 포함하는 발현 카세트 및 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 숙주 세포를 이용하여 유전자를 발현하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 서열번호 1 내지 7로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 프로모터를 제공한다.
본 발명의 프로모터는 분리된 핵산으로서 프로모터 활성을 갖는다. 본 발명에 있어서 "프로모터"란 RNA 폴리머라제가 결합하여 유전자의 전사를 개시하도록 하는 DNA 영역을 말한다. "tac 프로모터"란 대장균의 트립토판 오페론 프로모터의 -35 영역으로부터 얻어진 서열과 대장균의 유당 오페론 프로모터의 -10 영역으로부터 얻어진 서열을 융합하여 얻어진 프로모터를 의미한다. tac 프로모터는 종래 가장 강력한 프로모터 활성을 갖는 것 중의 하나로 널리 알려져 있었다. 본 발명의 프로모터 중 서열번호 1,4,5,6 및 7로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산을 포함하는 프로모터는 코리네박테리움 속 박테리아 세포에서 tac 프로모터에 비하여 더 강력한 프로모터 활성을 갖는다. 특히, 서열번호 1 및 4로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산을 포함하는 프로모터는 코리네박테리움 속 박테리아 세포에서 tac 프로모터에 비하여 10 배 이상 강력한 프로모터 활성을 갖는다.
본 발명의 프로모터는 코리네박테리움 속 박테리아 세포에서 뿐만 아니라 에세리키아 속 박테리아 세포에서도 프로모터 활성을 갖는다. 특히, 서열번호 1을 포함하는 프로모터는 에세리키아 속 박테리아 세포에서도 tac 프로모터에 비하여 2 배 이상 더 강력한 프로모터 활성을 갖는다.
본 발명의 프로모터가 기능할 수 있는 세포는 코리네박테리움 속 박테리아 세포이면 어느 것이나 포함된다. 코리네박테리움 속 박테리아의 예에는 코리네박테 리움 암모니아게네스 CJHB100 (KCCM-10330) 및 ATCC 6871, 및 코리네박테리움 글루타미큠 ATCC 13032 및 ATCC 13060 등이 포함될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 프로모터가 기능할 수 있는 에세리키아 속 박테리아 세포의 예는 대장균이 포함된다.
본 발명의 프로모터 서열은 종래 알려진 돌연변이 유발법, 예를 들면 방향성 진화법 (directed evolution) 및 부위특이적 돌연변이법 등에 의하여 당업자에 의하여 용이하게 변형될 수 있다. 따라서, 서열번호 1 내지 7로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산을 포함하는 분리된 프로모터 서열과 일정한 정도 예를 들면 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상의 상동성을 가지고 있고, 코리네박테리움 속 박테리아 세포에서 프로모터로서 기능할 수 있는 핵산은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명은 또한, 코딩서열과 작동가능하게 연결된 본 발명의 상기 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 상기 코딩 서열은 예를 들면, 전체 유전자, 또는 그의 일정한 영역을 코딩하는 서열일 수 있다. 본 발명에 있어서 "작동가능하게 연결된"이란 프로모터 서열이 상기 코딩 서열의 전사를 개시 및 매개하도록, 상기 코딩 서열과 프로모터가 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 본 발명의 카세트는 상기 서열과 작동가능하게 연결된 5′및 3′조절서열을 더 포함할 수 있다. 코딩 서열의 예는 IMP, GMP, L-라이신 및 L-쓰레오닌과 같은 대사 산물에 연관되어 있는 유전자일 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 발현 카세트가 포함되어 있는 벡터를 제공한다. 본 발명에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으나, 당업계에 알려진 임의의 벡터가 될 수 있다. 사용될 수 있는 벡터는 예를 들면, pCR2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen 사, 미국) 및 pECCG117 (KFCC-10673)가 될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 발현 카세트가 포함되어 있는 벡터의 예는 p117-cj1-gfp, p117-cj2-gfp, p117-cj3-gfp, p117-cj4-gfp, p117-cj5-gfp, p117-cj6-gfp 및 p117-cj7-gfp일 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명에 사용되는 숙주 세포는 바람직하게는, 코리네박테리움 속 또는 에세리키아 속에 속하는 박테리아 세포일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 숙주 세포는 더욱 바람직하게는, 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (KCCM-10330) 또는 대장균이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 숙주 세포를 배양하여 외래 유전자를 발현하는 방법을 제공한다. 숙주 세포의 배양은 선택되는 숙주 세포에 따라 종래 알려진 임의의 배양 배지 및 배양 조건을 사용하여 이루어질 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
본 발명의 실시예에서는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (KCCM-10330)을 배양하여 배양 단계에 따라 세포 추출물을 준비하고, 2차원전기영동을 수 행하여 각 배양 시기에서 과발현되는 단백질을 선발하고, 선발된 단백질을 절단하여 펩티드 서열을 분석하였고, 얻어진 펩티드 서열 데이터를 이용하여 상기 단백질의 유전자를 확인하고 그로부터 상기 유전자의 프로모터 영역을 분리하였다. 다음으로, 얻어진 프로모터 영역을 포함하는 벡터를 제조하고 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (KCCM-10330) 및 대장균에서 프로모터 활성을 조사하였다.
실시예 1 : 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (KCCM-10330) 배양 및 배양 시기에 따른 과발현 단백질의 선발
(1) 세포의 배양
원당가수분해물 (포도당 50 % + 과당 50 %의 혼합물)를 함유하는 배지에서 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (KCCM-10330)을 배양하였다. 배양 중 세포의 농도를 측정하고, 초기 정체기 및 정체기 (stationary phase)에서 배양물 시료를 채취하여 원심분리하여 상등액을 제거하고, 얻어진 세포를 파쇄 버퍼 중에서 파쇄하여 약 100 ㎕의 세포 추출물을 얻었다.
(2) 2차원전기영동 분석
(1)에서 얻은 세포 추출물로부터 세포 추출물을 포함해서 총 부피가 350㎕가 되도록 6M 요소, 2M 티오우레아, 4% CHAPS, 0.4% DTT로 희석한 후, 7 ㎕의 IPG 버퍼, 3 ㎕의 1% 브로모페놀 블루 (BPB)를 가하였으며, 이들을 Immobiline pH gradient Drystrip으로 재수화 트레이 (rehydration tray) 위에서 시료를 얹은 후, 시료의 증기화와 요소의 결정화를 방지하기 위하여 2 ml 덮개 액체를 가하고, 대략 24 시간 정도 실온에서 재수화(rehydration)시켰다
재수화된 스트립 겔을 0-100 V에서 1 시간, 300 V에서 1 시간, 600 V에서 1 시간, 및 약 43-97 kVhr가 되도록 8000V의 시간을 조정하면서 (pH 4-7: 43.4 kVhr, pH 4.5-5.5, pH 5.5-6.7: 97 kVhr), Multiphor II 등전점 포커싱 장치 (Amersham Bioscience, 미국)를 이용하여 20?에서 등전점 포커싱을 수행하였다.
IEF가 완료되면, 각 스트립 겔을 pH 8.8의 20 mM Tris-HCl, 6M 요소, 2% SDS, 20% 글리세롤, 2.5 % 아크릴아미드 및 5 mM TBP를 포함하는 용액에서 15분 동안 평형화시켰다. 평형화된 각 스트립을 2차원 겔 (9-16 % 농도 구배) 위에 얹고 0.5 % 저비점 아가로즈와 0.001% BPB가 들어있는 SDS 용액으로 봉합하고, 100 V에서 약 19 시간 동안 전기영동을 수행하였다.
전기영동 후 겔을 45 % 메탄올 및 5% 아세트산 용액으로 고정시킨 다음, 증류수로 1 시간 동안 아세트산을 세척하였다. 0.02% 소듐 티오설페이트로 2 분 동안 민감화 (sensitization)시키고 증류수를 이용하여 세척하였다. 다음으로, 겔을 0.1% 실버 나이트레이트와 20 분 동안 반응시킨 다음 다시 증류수로 세척했다. 이후 2% (w/v) 소듐 카르보네이트 및 0.04% (v/v) 포름알데히드를 함유하는 용액으로 현상하여 원하는 세기의 스팟이 나타나면 1% 아세트산으로 반응을 정지시켰다. 마지막으로 겔을 증류수로 세척하고, 밀봉된 플라스틱 백 속에 저장한 후 4 ℃에서 보관하였다.
쿠마시 염색을 하는 경우에는 겔을 꺼낸 후 30% 메탄올 및 10% 아세트산 용액으로 1 시간 동안 고정하고 증류수로 간단히 세척한 후 콜로이드성 쿠마시 브릴리언트 G-250으로 24 시간 동안 염색하였으며 10% 메탄올 및 7% 아세트산 용액으로 4 시간 동안 탈염색했다.
(3) 스팟으로부터 질량분석 (mass spectrometry)을 위한 펩티드 시료의 준비
스팟으로부터 펩티드의 분리는 공지된 방법을 변형하여 사용하였다 (Shevchenko et al. Anal. Chem., 68(5), 850-8, 1996).
먼저, 단백질 스팟을 겔로부터 잘라 내고, 30 mM 포타슘 페리시아니드 및 100 mM 소듐 티오설페이트의 1:1 혼합액 120 ㎕ 중에서 탈염색하고, 증류수로 세척한 후 다시 120 ㎕의 50% 아세토니트릴/25 mM 암모늄 비카르보네이트, pH 7.8로 10 분 동안 세척하였다. 50 ㎕의 100% 아세토니트릴과 하얀색이 될 때까지 약 5 분 동안 반응시킨 후 진공건조하였다.
건조된 각 스팟에 0.02 ㎍/㎕ 2차원전기영동급 트립신 10 ㎕를 가해 얼음 속에서 45 분 동안 반응시킨 다음, 50 mM 암모늄 비카르보네이트 버퍼, pH 7.8을 첨가하고 37 ℃에서 12 내지 14 시간 반응시켰다. 10 ㎕ 0.5% TFA, 50% 아세토니트릴 중에서 10 분 동안 3회 초음파 처리 방법으로 펩티드를 추출하였다.
(4) 질량 분석
상기와 같이 추출된 펩티드를 HPLC-MS/MS에 의하여 분석하였다. HPLC-MS/MS는 1100 series HPLC 시스템 (Agilient 사, 미국)을 나노 스프레이 이온화소스가 장착된 Finnigan LCQ DECA ion-trap mass spectrometery (ThermoQuest, 미국) 장치를 이용하였다. HPLC는 C18 마이크로프로브 역상 칼럼을 사용하고, 0.1% 포름산 (용매 A) 및 90% (v/v) 아세토니트릴 및 0.1% 포름산 용액 (용매 B)을 직선 구배 (유속 1 ㎕/min)로 흘려 주어 펩티드를 분리하였다.
펩티드의 검출은 다음과 같은 NSI (nano spray ionization) 기준으로 이루어졌다. 스프레이 전압: 1.8 kV; 모세관 온도: 200 ℃; 모세관 전압: 34 V; 관 렌즈 오프셋: 40 V; 전자 증폭기 (electron multiplier): -60 V. 모든 측정결과는 3회 측정 후 센트로이드 모드 (centroid mode)에서 수집되었으며 400-2000 Da의 전 MS 스캔을 얻은 후, 임계값 (threshold) 값을 1x105 카운트로 고정하여 가장 강력한 이온들을 고해성 줌 스캔으로 분리하고 다시 충돌유도해리 (collision-induced dissociation) (CID) MS/MS를 실시하였다. 해석되지 않은 CID 스펙트럼들의 서열을 TurboQuest software (Thermo Finnigan 사, 미국)을 사용하여 확인하였으며, SEQUEST 검색 결과는 교차 상관 및 △Cn (델타 노말라즈된 상관)으로 확인하였다.
이러한 방법으로 분석된 펩티드의 아미노산 서열의 확인 및 동정은 Q-star Pulsar LC MS/MS (Applied Biosystems사, 미국)를 이용하여 아미노산 서열분석하였다.
그 결과, 50 개의 단백질을 확인하고, 이들 중 과발현되는 7 종류의 단백질을 선별하였다. 도 1은 본 실시예의 시료를 2차원전기영동 분석하고 실버 염색을 수행한 다음 현상한 결과를 나타내는 도면이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 7종류의 과발현된 스팟을 확인할 수 있다 (CJ1 내지 7 스팟). 이들 7 종류의 단백질의 기능은 표 1에 나타내었다. 이들 단백질의 기능은 얻어진 펩티드 서열을 공지된 NCBI 젠 뱅크 데이터베이스의 아미노산 서열과 비교하여 확인하였다.
표 1.
스팟명 단백질 젠뱅크 accession No.
CJ1 열충격단백질 hsp60 AE008903.1
CJ2 5-카르복시메틸-2-히드록뮤코네이트 세미알데히드 디히드로게나제 NC-006461.1
CJ3 호모프로토카테쿨레이트 2,3-디옥시게나제 NC-005835.1
CJ4 잠정적 번역 신장 인자 EF-Tu YP-145957
CJ5 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 AAA69094
CJ6 시스틴 신타제 AAV89445
CJ7 망간 수퍼옥사이드 디스뮤타제 NP-940564
상기와 같이 선별된 7 종류의 과발현 단백질의 아미노산 서열로부터 추정되는 유전자 서열을 얻고, 이들 유전자 서열을 분석하여 프로모터 부위를 선별하였다. 그 결과, CJ1 내지 CJ7 단백질에 대응되는 유전자 서열로부터 분리된 서열번호 1~7의 올리고뉴클레오티드가 프로모터 활성을 갖는 것으로 추정하였다.
실시예 2 : 프로모터 서열을 함유하는 재조합 벡터 p117-cj1~7-gfp 제작 및 코리네박테리움 암모니아게네스에서의 프로모터 활성의 확인
(1) 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100의 게놈으로부터 프로모터 서열의 증폭
Eikmann 등 (Gene, 102, 93-98, 1991)의 방법에 따라, 1 일간 배양한 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 25 ㎖로부터 염색체 DNA 500 ㎍을 분리하였다. 분리된 염색체를 주형으로 사용하고 CJ1 내지 CJ7의 각 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트 (각각 서열번호 10 및 11, 12 및 13, 14 및 15, 16 및 17, 18 및 19, 20 및 21, 22 및 23)를 이용하여 PCR을 수행 (94 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 30 초간의 반응을 30 회)하여, 각 프로모터 서열 (pcj1 내지 pcj7)을 증폭하였다.
(2) 탐색 벡터의 제작
먼저, pGFuv vector (clontech 사, 미국)를 주형으로 하고, 서열번호 8 및 9를 프라이머로 하여 PCR을 수행 (94 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 1 분간의 반응을 30 회)하여, 프로모터 부분이 제거된 녹색형광단백질 (GFP) 유전자를 증폭하였다. 다음으로, 얻어진 프로모터 부분이 제거된 GFP 유전자를 pCR2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen, 미국)에 클로닝한 후, 다시 PstI과 EcoRI으로 절단하여 대장균과 코리네형 세균에서 발현 가능한 셔틀벡터인 pECCG117 (KFCC-10673/KFCC-10674)의 PstI과 EcoRI 위치에 도입한 후, 이를 프로모터 분리를 위한 탐색벡터 (p117-gfp)로 사용하였다. 도 2는 탐색벡터 p117-gfp의 제조과정을 나타내는 도면이다.
(3) 탐색 벡터에 프로모터 서열의 도입 및 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100에서의 프로모터 활성의 확인
(2)에서 얻은 상기 탐색벡터를 제한효소 KpnI/EcoRV로 절단하고, 동일한 효소로 절단된 프로모터 서열 (pcj1 내지 pcj7)과 연결하여, 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100로부터 분리된 프로모터 활성을 가질 것으로 추정되는 pcj1 내지 pcj7의 각 올리고뉴클레오티드가 GFP와 연결되어 있는 재조합 벡터 (p117-cj1~7-gfp)를 제조하였다. 도 3은 탐색벡터 p117-gfp로부터 본 발명의 프로모터 서열 pcj1 내지 pcj7를 포함하는 재조합 벡터의 제조과정을 나타내는 도면이다.
얻어진 재조합 벡터를 van der Rest 등의 방법 (Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 541-545, 1999)으로 형질전환이 가능하게 만든 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (KCCM-10330)에 도입하였다. 형질전환된 균주를 카나마이 신 10 ㎍/㎖이 포함된 CM 배지(펩톤 1%, 육즙 1%, 염화나트륨 0.25%, 효모 추출물 1%, 아데닌 100mg/ml, 구아닌 100mg/ml, 한천 2% (pH 7.2))에 도말하여 32 ℃에서 3 일간 배양하면서 성장하는 균주를 1차로 선별하였다, 다음으로, 선별된 균주에 자외선을 비추어서 형광을 발하는 균주를 2차로 선별하였다.
이는 프로모터 pcj 1 내지 pcj7가 실제적으로 코리네형 세균에서 프로모터 활성을 가지고 있다는 것을 나타내는 것이다.
다음으로, 프로모터 활성을 정량적으로 측정하였다. 상기 재조합 벡터 p117-cj1~7-gfp가 도입된 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (KCCM-10330)를 동일한 방법으로 배양하고, 원심분리하여 세포를 얻었다. 다음으로, 회수된 세포를 단백질 추출 버퍼 (PBS 중의 EDTA 1mM, 글리세롤 3%, triton-X-100 1% 용액, pH-7.5)에 현탁시키고, 초음파 처리하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물을 원심분리하고, 세포 추출물이 포함되어 있는 상등액을 취하였다. 얻어진 세포 추출물에 대하여 브레드포드 분석법에 의하여 단백질량을 측정하였다. 다음으로, 동일양의 세포 추출물에 대하여 Laure Gory 등의 방법 (FEMS Microbiology Letters 194, 127-133, 2001)을 이용하여 488 nm에서 여기광을 조사하고, 511 nm 발출광을 LS-50B spectrophotometer (Perkin-Elmer) 기기를 이용하여 측정함으로써, GFP 유전자의 발현정도를 측정하였다.
그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프로모터는 GFP 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있으며, 특히 pcj1 및 pcj4 프로모터는 다른 프로모터에 비해 상대적으로 매우 강력한 프로모터임을 확인할 수 있다.
표 2.
프로모터 pcj1 pcj2 pcj3 pcj4 pcj5 pcj6 pcj7
형광강도 12309 437 479 11790 1363 5651 2493
실시예 3: tac 프로모터와 본 발명의 프로모터의 코리네박테리움 암모니아게네스에서의 프로모터 활성의 비교
본 실시예에서는 본 발명의 프로모터와 종래 일반적으로 사용되던 tac 프로모터의 프로모터 활성을 코리네박테리움 암모니아게네스에서 비교하였다.
(1) tac 프로모터와 GFP 유전자가 융합된 서열을 포함하는 벡터의 제조
먼저, pKK223-2 vector (Pharmacia Biotech, 미국)를 주형으로 하고, 서열번호 24 및 25를 프라이머로 하여 실시예 1과 동일한 조건으로 PCR을 수행하여 tac 프로모터 서열을 증폭하고, pCR2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen, 미국)에 도입시켜 클로닝하였다. 다음으로, 얻어진 tac 프로모터 서열을 제한효소 KpnI 및 EcoRV으로 절단하여 분리하고, 동일한 효소로 절단된 p117-gfp에 연결하여 재조합 발현벡터 (p117-tac-gfp)를 제작하였다.
이 재조합 벡터로 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100을 실시예 1과 동일한 방법을 이용하여 형질전환시켜 형질전환체를 얻었으며 GFP 유전자의 활성을 측정함으로써 tac 프로모터에 의한 GFP 유전자의 활성을 실시예 2에서 선별한 프로모터에서의 GFP 활성과 비교하였다. 그 결과를 표 3 에 나타내었다.
표 3.
프로모터 pcj1 pcj2 pcj3 pcj4 pcj5 pcj6 pcj7 Ptac
상대적 형광강도 1140% 40% 44% 1092% 126% 523% 231% 100%
표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 프로모터가 GFP 유전자를 효율적으로 발현시킨다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 코리네박테리움 암모니아게네스에서 tac 프로모터의 프로모터 활성과 비교한 결과, pcj2 및 pcj3를 제외한 pcj1, pcj4, pcj5, pcj6 및 pcj7 프로모터는 tac 프로모터 보다 상대적으로 강력한 프로모터임을 확인 할 수 있었다. 특히, pcj1 및 pcj4 프로모터는 tac 프로모터에 비하여 10배 이상 강력한 활성을 보였다.
실시예 4: 대장균에서 본 발명의 프로모터의 프로모터 활성의 확인
본 발명의 프로모터가 코리네형 세균뿐만 아니라 대장균에서도 프로머터 활성을 가지고 있는지를 확인하였다. 실시예 1과 2에서 사용한 재조합 발현벡터를 대장균에 형질전환시켜 형질전환체를 얻었으며, 실시예 1에서와 동일한 방법으로 GFP 유전자의 활성을 측정함으로써 본 발명의 프로모터가 대장균에서 GFP 유전자의 발현에 효과적으로 사용될 수 있는지를 조사하였다. 비교군으로 tac 프로모터를 포함하는 재조합 벡터 p117-tac-gfp를 사용하였다. 표 4는 대장균에서의 본 발명의 프로모터의 프로모터 활성을 나타낸 것이다.
표 4.
프로모터 pcj1 pcj2 pcj3 pcj4 pcj5 pcj6 pcj7 ptac
상대적 형광강도 296% 15% 20% 17% 19% 24% 24% 100%
표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 프로모터가 대장균에서도 GFP 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 특히, pcj1 프로모터는 본 발명의 다른 프로모터에 비하여 코리네형 세균뿐 만 아니라 대장균에서도 매우 강력할 프로모터임을 확인할 수 있다.
실시예 5 : IPTG가 본 발명의 프로모터의 활성에 미치는 영향
tac 프로모터의 경우 대장균 내에서 IPTG (isopropylthio-β-D-galactoside)에 의하여 발현이 유도되는 대표적인 프로모터로 알려져 있다. 즉, 대장균에 있어서 IPTG의 유무에 따라서 tac 프로모터로부터 발현되는 유전자의 발현량이 현저하게 차이가 난다.
본 실시예에서는 IPTG가 본 발명의 프로모터로부터 GFP 유전자의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 이를 위하여 본 발명의 프로모터 중 활성이 가장 좋은 pcj1 프로모터를 포함하는 재조합 벡터 (p117-cj1-gfp)를 대장균과 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (KCCM-10330)에 실시예 1 및 2와 동일한 방법으로 도입하고, 그로부터 발현되는 GFP의 발현량을 측정하였다. 비교군으로 tac 프로모터를 포함하는 재조합 벡터 p117-tac-gfp를 사용하였다.
그 결과를 표 4에 나타내었다.
표 4.
숙주세포 코리네박테리움 아모니아게네스 CJHB100 대장균
유도여부 IPTG 유도 유도 없음 IPTG 유도 유도 없음
프로모터 ptac pcj1 ptac pcj1 ptac pcj1 ptac pcj1
형광강도 2089 5530 1959 5048 6480 7165 2314 7199
표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프로모터가 대장균 및 코리네박테리움 암모니아게네스에서 IPTG의 유무에 상관없이 tac 프로모터 보다 효율적으로 GFP 유전자를 발현시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
이상과 같은 실시예의 결과로부터 얻어진 프로모터 pCJ1, pCJ2,pCJ3,pCJ4,pCJ5,pCJ6 및 pCJ7을 pECCG117에 삽입하고 얻어진 벡터를 대장균 DH5α에 형질전환하고 이를 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 2004년 11월 6일자로 기탁하였다 (각 수탁번호 KCCM-10611, KCCM-10612,KCCM-10613,KCCM-10614,KCCM-10615,KCCM-10616,및 KCCM-10617).
본 발명의 프로모터에 따르면, 대장균 및 코리네박테리움 암모니아게네스에서 그와 작동가능하게 연결되어 있는 유전자를 효율적으로 발현되게 할 수 있다. 본 발명의 프로모터는 코리네박테리움 속 박테리아를 이용한 균주 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 발현 카세트 및 그를 포함하는 벡터에 의하면, 외래 유전자를 대장균 및 코리네박테리움 암모니아게네스에서 효율적으로 발현시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 숙주 세포에 의하면, 외래 유전자를 효율적으로 발현할 수 있다.
본 발명의 유전자 발현 방법에 의하면 외래 유전자를 효과적으로 발현시킬 수 있다.
<110> CJ Corporation <120> Novel promoter nucleic acid derived from Corynebacterium genus bacteria, expression cassette comprising the promoter and vector comprising the cassette, host cell comprising the vector and method for expressing a gene using the cell <130> PN05941 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 301 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 1 caccgcgggc ttattccatt acatggaatg accaggaatg gcagggaatg cgacgaaatt 60 gactgtgtcg ggagcttctg atccgatgct gccaaccagg agagaaaata atgacatgtg 120 caggcacgct ggtgagctgg agatttatga tctcaagtac cttttttctt gcactcgagg 180 gggctgagtg ccagaatggt tgctgacacc aggttgaggt tggtacacac tcaccaatcc 240 tgccgtcgcg ggcgcctgcg tggaacataa accttgagtg aaacccaatc taggagatta 300 a 301 <210> 2 <211> 285 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 2 aattccacca gacgttgttt agtaagtgcc cgaattctcg gttggtgcag ttgcttttcg 60 atgaatggga gaacctcgaa tacttccgcg tctctacttt ccggtacgtg ccacacagag 120 cagagcaatc ggtggaagag cacgacagat tagtagcgct tatcgaagcc caggcagaag 180 atttctacat cgaatcccaa gcccgcaacc accgcctgac aaccgcaacg acctaccgcc 240 aacgtttaaa ttccgaaaat catcacgaag aacaaggagt gcaca 285 <210> 3 <211> 291 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 3 gctgcctaca tctggacttc tgacctgaag cgctcccaca acttcgcgca aaacgttgaa 60 gccggcatgg tctggttgaa ctccaacaac gtccgtgacc tgcgcacccc attcggtggc 120 gtcaaggcat ccggtctggg gcatgagggc ggctaccgct ccattgactt ctacaccgac 180 caacaggccg tacacatcaa cttaggcgaa gtccacaacc cagtcttcgg caagcaaacc 240 aactaattct ccctcatcca cactcccctt ttaacctcac taggagtcat c 291 <210> 4 <211> 312 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 4 actgggaggg taggggtcac gctgaattag caggtcacat cctgttgctt gagctggccg 60 ttaccctcct aggatccgag atgattcttg tagaggacta acgtccgcac aaatcttccg 120 cgggatgctc aaatcaccct tagctggttt gaaaaatccg tggcataaat ctaggatcgt 180 gtaactggca cgaaaagaaa gcgtcatcgg cgcttgggaa catcttttta agatattcct 240 caagtgccgt gacatctgtc aaccccgtgg ctgcgagagt cgtagtcaca atgaagtcca 300 ggaggacata ca 312 <210> 5 <211> 249 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 5 tcggacatat acggatttac ctgctgcaat cgcgccggcc cttgctcgaa attgcgtgaa 60 ttttagtctg attgtgttgg aatatccgca gaatgtgtgg gtttgctttt ataaatctgc 120 gcagtgtagg gaacctcggt actatcggca gtgtcggaga aacttcctcg atataaatct 180 ttgaagtaat tctcccaggc aatagctttt gacgtactcc gcttcccaac tttttaggag 240 acaactacc 249 <210> 6 <211> 332 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 6 ggcttcatcg tcgtctttga tccgatgcga gtccattaac ccaaactcct taaagcccgt 60 aaaacggggg tattccaaca cggttatcca cagtttaacc gttattcggg ggtaatccta 120 acccaaatca ttacggaaac tccaatctgg ctcacaatat cctccatgat tctagggaca 180 cccaatcagg tgcacccgct tcctgcgaca acgagtcaaa ctcggcaaag ccctcaacct 240 gtcggtctag aatatatata ccgcccggtc tagtgttgtg gtgtacacta acgataaacc 300 aacaaagttg tctattaaga ggaggccatt tc 332 <210> 7 <211> 318 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 7 agaaacatcc cagcgctact aatagggagc gttgaccttc cttccacgga ccggtaatcg 60 gagtgcctaa aaccgcatgc ggcttaggct ccaagatagg ttctgcgcgg ccgggtaatg 120 catcttcttt agcaacaagt tgaggggtag gtgcaaataa gaacgacata gaaatcgtct 180 cctttctgtt tttaatcaac atacaccacc acctaaaaat tccccgacca gcaagttcac 240 agtattcggg cacaatatcg ttgccaaaat attgtttcgg aatatcatgg gatacgtacc 300 caacgaaagg aaacactc 318 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 acgcgatatc atgagtaaag gagaagatct t 31 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aaaactgcag ttatttgtag agctcatcca t 31 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cggggtacca ccgcgggctt attccattac at 32 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 acgcgatatc ttaatctcct agattgggtt tc 32 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 cggggtacca attccaccag acgttgttta gta 33 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 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<211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 cggggtacca gaaacatccc agcgctacta ata 33 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 acgcgatatc agtgtttcct ttcgttggg 29 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 cggggyaccc ggagcttatc gactgcacg 29

Claims (6)

  1. 서열번호 1 내지 7로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 프로모터.
  2. 코딩서열과 작동가능하게 연결된 제1항에 따른 프로모터를 포함하는 발현 카 세트.
  3. 제2항에 따른 발현 카세트를 포함하는 벡터.
  4. 제3항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  5. 제4항에 있어서, 코리네박테리움 속 또는 에세리키아 속에 속하는 박테리아 세포인 숙주 세포.
  6. 제4항 또는 제5항에 따른 숙주 세포를 배양하여 외래 유전자를 발현하는 방법.
KR1020040107215A 2004-12-16 2004-12-16 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법 KR100620092B1 (ko)

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KR1020040107215A KR100620092B1 (ko) 2004-12-16 2004-12-16 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
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