KR102003911B1 - 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 마이코스포린 유사 아미노산의 생산방법 - Google Patents

마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 마이코스포린 유사 아미노산의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본원은 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물 및 상기 미생물을 이용한 마이코스포린 유사 아미노산의 생산방법에 관한 것이다.
본원의 미생물은 마이코스포린 유사 아미노산의 생산능이 향상되어, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 데 효율적으로 사용될 수 있다.

Description

마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 마이코스포린 유사 아미노산의 생산방법 {A microorganism for producing a Mycosporine-like amino acid and a method for preparing a Mycosporine-like amino acid using the same}
본원은 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물 및 상기 미생물을 이용한 마이코스포린 유사 아미노산의 생산방법에 관한 것이다.
태양으로부터 방출되는 자외선은 UV A(자외선 A, 약 320-400nm의 영역), UV B(자외선 B, 약 290-320nm의 영역) 및 UV C(자외선 C, 약 100~280 nm의 영역)으로 구성되어 있다. 자외선 A는 진피층까지 침투하여 주로 색소 침착 및 피부노화를 유발하고, 광 과민성 피부병 발생에 관여하며, 자외선 B는 고 에너지 광선으로 표피와 진피 상부에 침투하여 일광화상, 색소침착 및 피부암 발생에 관여한다고 알려져 있다.
이러한 부작용을 막기 위해 자외선을 차단하려는 시도가 있어왔다. 자외선 차단제의 종류로는 화학적 자외선 차단제(Chemical sunscreen agent)와 물리적 자외선차단제(Physical sunscreen agent)가 있는데, 화학적 자외선 차단제는 주로 자외선의 흡수를 통해서, 물리적 자외선 차단제는 반사 및 산란을 통해 자외선의 침투를 막는다.
화학적 자외선 차단제에 포함되는 성분으로는, 자외선 B를 주로 흡수하는 PABA, PABA 에스테르s(Amyl dimethyl PABA, octyl dimethyl PABA), 시나메이트(Cinnamates: Cinoxate), 살리실레이트 (Salicylate: Homomenthyl salicylate), 캄퍼(Camphor) 등과, 자외선 A를 주로 흡수하는 벤조페논(Benzophenone: Oxybenzone, Dioxybenzone, Suliso benzene), 디벤조일 메탄(Dibenzoyl methane), 안트라닐레이트(Anthranilate) 등이 알려져 있다. 이러한 화학적 자외선 차단제들은 자외선을 흡수하여 차단하는 효과를 얻을 수 있으나, 이들 중 일부는 피부나 눈에 자극을 줄 수 있고, 특히, PABA, PABA 에스테르, 벤조페논, 시나메이트 등은 접촉성 피부염을 초래할 수 있다고 알려져있다. 또한, 다른 일부는 피부의 광 과민성 반응을 유발할 수 있는 등의 문제점이 보고되어 있는 바, 일부 국가들에서는 화학적 자외선 차단제들의 사용을 제한하거나, 그 사용량을 제한하고 있다.
물리적 자외선 차단제에 포함되는 성분으로는, 이산화티탄 (Titanium dioxide), 탈크 (Talc; Magnesium silicate), 산화 마그네슘 (Magnesium oxide), 산화 아연 (Zinc oxide), 카올린 (Kaolin) 등이 알려져 있다. 이들은 접촉성 피부염과 같은 부작용이 없고, 물에 잘 지워지지 않는 장점이 있는 반면, 원하는 제형을 실현하면서 유효한 함유량을 유지하기 어렵고, 피부에 도포 시 백탁 현상 등이 나타나는 단점이 있다.
마이코스포린 유사 아미노산 (Mycosporine-like amino acids: MAAs)은 자연 생물체에 존재하는 물질로, UVA, UVB를 효과적으로 흡수하는 것으로 알려져 있다. MAAs는 자연계에 35종 이상이 존재한다고 알려져 있다(Mar. Biol., 1991, 108: 157-166; Planta Med., 2015, 81: 813-820). 최근에는 다양한 당이 붙은 형태의 MAAs가 미세조류에 존재하며, 항산화 기능이 탁월하다고 보고되었다 (Journal of Photochemistry and Photobiology, 2015, 142: 154-168). 또한, MAAs는 자외선 차단능뿐만 아니라, 산화, 삼투 및 열 스트레스에 대한 저항성 등을 부여한다고 알려져 있다 (Comp. Biochem. Physiol.C Toxicol. Pharmacol., 2007, 146: 60-78; J. Photochem. Photobiol. B., 2007, 89: 29-35).
하지만, 미세조류 내에서 생산되는 MAAs의 양은 수 ㎍ 수준으로 매우 낮고, 미세조류를 배양하여 MAAs를 분리, 추출, 정제하는 조건들이 복잡하여 MAAs 소재를 대량생산하기 어려운 문제가 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 미생물에서 MAAs의 생산을 증가시키기 위해 예의 노력한 결과, MAAs를 생산하는 미생물에서 2-dehydro-3-deoxyphosphoheptonate aldolase, phosphoenolpyruvate synthetase 및 transketolase 단백질의 활성을 강화시키는 다방면의 연구를 통하여 MAAs의 생산이 증가됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
Comp. Biochem. Physiol. B 1995, 112: 105-114. FEMS Microbiol Lett. 2007, 269: 1-10. Ann. Rev. Physiol. 2002, 64: 223-262. Mar. Biol. 1991, 108: 157-166. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 2015, 142: 154-168 Biol. Rev. 1999, 74: 311-345. Mol. Biol. Evol. 2006, 23: 1437-1443. Science, 2010, 329: 1653-1656. Genomics 2010, 95: 120-128. Geomicrobiol. J. 1997. 14: 231-241. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 2007. 146: 60-78. Can. J. Bot. 2003. 81: 131-138. J. Photochem. Photobiol. B. 2007, 89: 29-35. J. Bacteriol. 2011. 193(21): 5923-5928. Planta Med. 2015. 81: 813-820 ACS Appl. Mater. Interfaces. 2015. 7: 16558-16564 Appl Environ Microbiol. 2016, 82(20): 6167-6173 ChemBioChem. 2015, 16: 320-327 Methods Mol Biol. 2013, 1073: 43-7 Nature Review, 2011, 9: 791-802
본원의 하나의 목적은 2-디하이드로-3-데옥시포스포헵토네이트 알돌라제 (2-dehydro-3-deoxyphosphoheptonate aldolase), 포스포에놀피루베이트 신테타제 (phosphoenolpyruvate synthetase), 트랜스케톨라제 (transketolase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 활성이 강화된, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.
본원의 다른 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 마이코스포린 유사 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, 마이코스포린 유사 아미노산의 생산방법을 제공하는 것이다.
이하에서는, 본원을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는, 2-디하이드로-3-데옥시포스포헵토네이트 알돌라제 (2-dehydro-3-deoxyphosphoheptonate aldolase), 포스포에놀피루베이트 신테타제 (phosphoenolpyruvate synthetase) 및 트랜스케톨라제 (transketolase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 활성이 강화된, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물을 제공한다.
본원에서 용어, “2-디하이드로-3-데옥시포스포헵토네이트 알돌라제(2-dehydro-3-deoxyphosphoheptonate aldolase)”는 하기 반응식의 가역 반응을 촉매하는 효소를 의미하며, 구체적으로, 3-디옥시-아라비노-헵툴로소네이트-7-포스페이트(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate, DAHP)를 합성하는 효소를 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
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Figure 112018019301625-pat00001
본원에서, 2-디하이드로-3-데옥시포스포헵토네이트 알돌라제는 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-포스페이트(DAHP) 신타제와 혼용된다.
본원에서 용어, "포스포에놀피루베이트 신테타제(phosphoenolpyruvate synthetase)"는 하기 반응식의 가역 반응을 촉매하는 효소를 의미하며, 구체적으로, 포스포에놀피루베이트를 합성하는 효소를 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
[반응식]
Figure 112018019301625-pat00002
본원에서 용어, "트랜스케톨라제(transketolase)"는 하기 반응식의 가역 반응을 촉매하는 효소를 의미한다.
[반응식]
Figure 112018019301625-pat00003
또는
Figure 112018019301625-pat00004
상기 2-디하이드로-3-데옥시포스포헵토네이트 알돌라제, 포스포에놀피루베이트 신테타제, 트랜스케톨라제의 유전적 정보는 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 미국 국립생물정보센터 (National Center for Biotechnology Information; NCBI)의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 2-디하이드로-3-데옥시포스포헵토네이트 알돌라제, 포스포에놀피루베이트 신테타제, 트랜스케톨라제는 미생물의 종 또는 미생물에 따라 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하는 경우가 있기 때문에, 그 유래나 서열에 한정되지 않는다.
구체적으로, 상기 2-디하이드로-3-데옥시포스포헵토네이트 알돌라제는 서열번호 2, 37 또는 124의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있고, 상기 포스포에놀피루베이트 신테타제는 서열번호 19 또는 98의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있고, 트랜스케톨라제는 서열번호 24, 96 또는 123의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에서 "아미노산 서열을 포함하는 단백질"은 "아미노산 서열을 가지는 단백질", 또는 "아미노산 서열로 구성되는 단백질"이라는 표현과 혼용되어 사용될 수 있다.
또한, 본원에서 상기 효소들은 각각의 효소와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 한, 기재된 서열번호뿐만 아니라, 상기 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 단백질을 포함할 수 있다.
또한 상기 서열과 상동성을 가지는 서열로서 실질적으로 기재된 서열번호의 효소 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 경우도 역시 본 출원의 범주에 포함됨은 자명하다.
본원에 사용된 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건(stringent condition)하에서 썼던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor,New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다. 상기에서 용어 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 예를 들어, 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다.
본원의 2-디하이드로-3-데옥시포스포헵토네이트 알돌라제, 포스포에놀피루베이트 신테타제, 트랜스케톨라제는 상기 각각의 효소와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 한, 기재된 서열번호의 아미노산 서열 또는 상기 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 상기 효소들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드는 각 효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이면 제한 없이 포함될 수 있다.
또한, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 상기 2-디하이드로-3-데옥시포스포헵토네이트 알돌라제, 포스포에놀피루베이트 신테타제, 트랜스케톨라제 효소 단백질의 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
상기 “엄격한 조건”이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1XSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, “상보적”은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).본원에서 용어, “활성의 강화”는 효소 단백질의 활성이 도입되거나, 미생물이 가진 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 활성이 향상된 것을 의미한다. 상기 활성의 “도입”은, 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 특정 단백질의 활성이 자연적 혹은 인위적으로 나타나게 되는 것을 의미한다. 구체적으로 효소 단백질의 활성이 강화된 미생물은, 천연의 야생형 미생물 또는 비변형 미생물에 비해서 효소단백질의 활성이 향상된 미생물을 의미한다. 상기 활성 강화는 예를 들어, 외래의 2-디하이드로-3-데옥시포스포헵토네이트 알돌라제, 포스포에놀피루베이트 신테타제, 및/또는 트랜스케톨라제를 도입하여 강화하는 것; 또는 내재적 2-디하이드로-3-데옥시포스포헵토네이트 알돌라제, 포스포에놀피루베이트 신테타제 및/또는 트랜스케톨라제의 활성을 강화하는 것을 모두 포함할 수 있다. 구체적으로, 본원에서 활성 강화의 방법으로는,
1) 상기 효소들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가,
2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형,
3) 상기 효소들의 활성이 강화되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 형, 또는
4) 이의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 1) 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 또한 카피수 증가의 한 양태로, 효소의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 효소와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 효소가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
다음으로, 2) 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.
구체적으로, 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 강력한 프로모터의 예로는 CJ7 프로모터, lysCP1 프로모터, EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 혹은 aceB 프로모터 등이 있다. 더욱 구체적으로는 코리네박테리움 속 유래 프로모터인 lysCP1 프로모터(WO2009/096689), CJ7 프로모터(WO2006/065095), SPL프로모터(KR 10-1783170 B), 혹은 o2 프로모터(KR 10-1632642 B)와 작동 가능하게 연결되어, 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현율을 향상시킬 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 3) 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.
마지막으로, 4) 상기 1) 내지 3)의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법은, 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 이의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 및 상기 효소의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 변형 중 1 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 기능을 할 수 있는 폴리뉴클레오티드 집합체인 경우 유전자로 기재될 수 있다. 본원에서 폴리뉴클레오티드와 유전자는 혼용될 수 있으며, 폴리뉴클레오티드 서열과 뉴클레오티드 서열은 혼용될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 “벡터”는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질 전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pSKH, pRS-413, pRS-414, pRS-415 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질 전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질 전환된 세포를 선별할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "형질 전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질 전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지않는다. 상기 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, EAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원의 미생물은 추가적으로 3-디하이드로퀴네이트 디히드라타제(3-dehydroquinate dehydratase) 단백질 활성이 불활성화될 수 있다.
본원에서 용어, "3-디하이드로퀴네이트 디히드라타제(3-dehydroquinate dehydratase)"는 하기 반응식의 가역 반응을 촉매하는 효소를 의미하며, 구체적으로, 3-디하이드로퀴네이트(3-dehydroquinate)를 3-디하이드로시키메이트(3-dehydroshikimate)로 전환할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
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Figure 112018019301625-pat00005
3-디하이드로퀴네이트 디히드라타제는 미생물의 종 또는 미생물에 따라 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하는 경우가 있기 때문에, 그 유래나 서열에 한정되지않는다. 구체적으로 상기 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 서열번호 90의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 가지며 상기 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 경우도 역시 본원의 범주에 포함됨은 자명하다.
본원의 용어 "불활성화"는 본래 미생물이 가진 효소 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 그 활성이 약화되는 경우; 단백질이 전혀 발현이 되지않는 경우; 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없는 경우를 의미한다. 상기 불활성화는 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이 등으로 효소 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 효소의 활성에 비해 약화하거나 제거된 경우; 효소를 코딩하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 천연형 미생물에 비하여 낮거나 제거된 경우; 효소를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체가 결실된 경우; 및 이들의 조합 역시 포함하는 개념으로, 이에 한정되지는 않는다. 즉 효소 단백질의 활성이 불활성화된 미생물은, 천연의 야생형 미생물 또는 비변형 미생물에 비해서 효소단백질의 활성이 낮거나 또는 제거된 미생물을 의미한다.
상기 효소 활성의 불활성화는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 1) 상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 2) 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절 서열의 변형, 3) 상기 단백질의 활성이 제거 또는 약화되도록 단백질을 코딩하는 염색체 상의 유전자 서열의 변형, 4) 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입; 5) 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열을 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착을 불가능하게 만드는 방법; 6) 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터를 부가하는 방법(Reverse transcription engineering, RTE) 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 일부 뉴클레오티드 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법의 일례로 상동 재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 결실시키는 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 발현 조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 효소의 활성을 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기에서 "일부"란, 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 1 내지 300개, 더욱 구체적으로는 1 내지 100개, 보다 더욱 구체적으로는 1 내지 50개일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 미생물은 추가적으로 3-디하이드로퀴네이트 신타제(3-dehydroquinate synthase) 단백질의 활성이 비변형 미생물에 비해 강화될 수 있다.
상기 3-디하이드로퀴네이트 신타제(3-dehydroquinate synthase)는 하기 반응식의 가역 반응을 촉매하는 효소를 의미하며, 구체적으로 3-디하이드로퀴네이트(3-dehydroquinate, 3-DHQ)를 합성할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
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Figure 112018019301625-pat00006
본원에서 용어, "마이코스포린 유사 아미노산(mycosporine-like amino acids; MAAs)"은 자외선을 흡수하는 고리형 화합물을 의미한다. 본원에서 마이코스포린 유사 아미노산은 자외선을 흡수할 수 있는 한 제한이 없으나, 구체적으로, 사이클로헥세논(cyclohexanone) 또는 사이클로헥센이민(cyclohexenimine)의 중심 링을 가지는 화합물; 또는 상기 중심 링에 아미노산 등의 다양한 물질이 결합된 화합물일 수 있으며, 더욱 구체적으로, 마이코스포린-2-글라이신 (Mycosporine-2-glycine), 팰라이티놀 (Palythinol), 팰라이텐산 (Palythenic acid), 데옥시가두솔(deoxygadusol), 마이코스포린-메틸아민-트레오닌 (Mycosporine-methylaminethreonine), 마이코스포린-글라이신-발린 (Mycosporine-glycine-valine), 팰라이틴(Palythine), 아스테리나-330 (Asterina-330), 시노린 (Shinorine), 포르피라-334(Porphyra-334), 유하로테스-362(Euhalothece-362), 마이코스포린-글라이신(Mycosporine-glycine), 마이코스포린-오르니틴 (Mycosporine-ornithine), 마이코스포린-라이신 (Mycosporine-lysine), 마이코스포린-글루탐산-글라이신(Mycosporine-glutamic acid-glycine), 마이코스포린-메틸아민-세린(Mycosporine-methylamine-serine), 마이코스포린-타우린(Mycosporine-taurine), 팰라이텐(Palythene), 팰라이텐-세린(Palythine-serine), 팰라이텐-세린-설페이트(Palythine-serine-sulfate), 팰라이티놀(Palythinol), 우수지렌(Usujirene) 또는 이들의 조합일 수 있다.
본원에서 마이코스포린 유사 아미노산은 MAA 및 MAAs와 혼용될 수 있다.
본원에서 용어, "마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물"은 마이코스포린 유사 아미노산의 생합성에 관여하는 효소의 유전자 또는 상기 유전자들의 클러스터를 포함하는 미생물을 의미할 수 있고 또는 상기 클러스터가 도입 또는 강화된 미생물을 의미할 수 있다. 또한, 본원에서 용어, "마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자 클러스터"는 마이코스포린 유사 아미노산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 그룹을 의미하는 것일 수 있다. 구체적으로는 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자, 마이코스포린 유사 아미노산에 추가적인 아미노산 잔기를 부착하는 활성을 가진 효소의 유전자, 또는 상기 유전자들의 클러스터를 포함할 수 있다. 상기 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자는 이를 포함하는 미생물이 마이코스포린 유사 아미노산을 생산할 수 있는 한, 미생물의 외래 및/또는 내재적인 유전자를 모두 포함한다. 상기 외래 유전자는 동종 및/또는 이종일 수 있다.
상기 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자는, 이를 포함하는 미생물이 마이코스포린 유사 아미노산 생합성에 관여하는 효소를 생산하고 결과적으로 마이코스포린 유사 아미노산을 생산할 수 있는 한, 상기 유전자들의 유래 미생물 종에는 제한이 없으나, 구체적으로, 남세균(cyanobacteria)인 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노스톡 펀티포르메(Nostoc punctiforme), 노두라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 시아노테스 속 PCC 7424(Cyanothece sp. PCC 7424), 라인비아 속 PCC 8106(Lyngbya sp . PCC 8106), 마이크로카이스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 마이크로코레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 시아노테스 속 ATCC 51142(Cyanothece sp . ATCC 51142), 크로코스파에라 와트소니(Crocosphaera watsonii), 시아노테스 속 CCY 0110(Cyanothece sp . CCY 0110), 시린드로스페르멈 스태그날 속 PCC 7417 (cylindrospermum stagnale sp,PCC 7417), 아파노테스 할로피티카 (Aphanothece halophytica) 또는 트리코데스미운 에리트라에움(Trichodesmium erythraeum)이거나, 또는 균류(fungi)인 마그나포르테 오르지아에(Magnaporthe orzyae), 피레노포라 트리티씨-레펜티스(Pyrenophora tritici-repentis), 아스퍼질러스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 넥트리아 헤마토코카(Nectria haematococca), 아스퍼질러스 니두란스(Aspergillus nidulans), 지베렐라 제아에(Gibberella zeae), 베르티씰리움 알보-아트룸(Verticillium albo-atrum), 보트리오티니아 푸케리아나(Botryotinia fuckeliana), 파에오스파에리아 노도룸(Phaeosphaeria nodorum)이거나, 또는 네마토르텔라 벡텐시스(Nematostella vectensis), 헤테로카프사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra), 옥시리스 마리나(Oxyrrhis marina), 칼로디니움 미크룸(Karlodinium micrum), 악티노신네마 미룸(Actinosynnema mirum) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에 따르면, 본 출원의 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물은, 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자 또는 이의 클러스터를 포함한다. 구체적으로, 상기 미생물은 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자 클러스터가 도입되거나 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성이 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자는 미생물이 마이코스포린 유사 아미노산을 생산할 수 있는 한 효소 명칭이나 유래 미생물에 제한 되지 않으나, 2-디메틸 4-데옥시가두솔 신타제(2-demetyl 4-deoxygadusol synthase), O-메틸트랜스퍼라제(O-methyltransferase), 및 C-N 리가제(C-N ligase)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상, 구체적으로, 1이상, 2이상, 3이상, 또는 모든 효소 단백질; 또는 이와 동일 및/또는 유사한 활성을 가진 효소 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.
예를 들면, 상기 2-디메틸 4-데옥시가두솔 신타제(2-demetyl 4-deoxygadusol synthase)는 세도헵툴로스-7-포스파이트 (sedoheptulose-7-phosphate)를 2-디메틸-4-데옥시가두솔 (2-demethyl-4-deoxygadusol)로 변환하는 효소이다. 상기 O-메틸트랜스퍼라제(O-methyltransferase)는, 2-디메틸-4-데옥시가두솔 (2-demethyl-4-deoxygadusol)을 4-데옥시가두솔 (4-deoxygadusol)로 변환하는 효소이고, 상기 4-데옥시가두솔 (4-deoxygadusol)의 글라이실레이션(glycylation)은 상기 C-N 리가제(C-N ligase)에 의해 촉매된다.
또한, 상기 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물은, 마이코스포린 유사 아미노산에 추가적인 아미노산 잔기를 부착하는 활성을 가진 효소의 유전자 또는 상기 유전자들의 클러스터를 포함할 수 있다. 상기 유전자 또는 상기 유전자들의 클러스터는, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물이 두 개 이상의 아미노산 잔기가 부착된 마이코스포린 유사 아미노산을 생산할 수 있는 한 효소 명칭이나 유래 미생물에 제한되지 않으나, 구체적으로 논-리보좀 펩티드 신테타제 (nonribosomal peptide synthetase: NRPS), 논-리보좀 펩티드 신테타제 유사 효소(non-ribosomal peptide synthetase-like enzyme: NRPS-like enzyme) 및 D-알라닌 D-알라닌 리가제 (D-Ala D-Ala ligase: DDL) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상, 구체적으로, 1이상, 2이상, 3이상, 또는 모든 효소 단백질; 또는 이와 동일 및/또는 유사한 활성을 가진 효소 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.
일부 마이코스포린 유사 아미노산은, 마이코스포린-글라이신에 두 번째 아미노산 잔기를 포함한다. 상기 논-리보좀 펩티드 신테타제, 논-리보좀 펩티드 신테타제 유사 효소 및 D-알라닌 D-알라닌 리가제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소는, 마이코스포린-글라이신에 두 번째 아미노산 잔기를 부착시킬 수 있다.
일 실시예에 따르면, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물은, 논-리보좀 펩티드 신테타제, 논-리보좀 펩티드 신테타제 유사 효소 및 D-알라닌 D-알라닌 리가제와 같이, 마이코스포린-글라이신에 두 번째 아미노산을 부착시킬 수 있는 활성을 가진 효소라면, 효소 명칭이나 유래 미생물 종에 제한 없이 포함할 수 있다.
예를 들면, 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis) 내 논-리보좀 펩티드 신테타제 유사 효소 (Ava_3855) 또는 노스톡 펀티포르메(Nostoc punctiforme) 내 D-알라닌 D-알라닌 리가제 (NpF5597)은 마이코스포린-글라이신에 세린 잔기를 부착시켜 시노린을 형성시킬 수 있다. 또 다른 예시로, 마이코스포린-2-글라이신은, 아파노테스 할로피티카 (Aphanothece halophytica) 내 D-알라닌 D-알라닌 리가제 호몰로그 (Ap_3855)에 의한 두 번째 글라이신 잔기의 부착으로 형성될 수 있다. 유사하게, 악티노신네마 미룸(Actinosynnema mirum)에서는, D-알라닌 D-알라닌 리가제에 의하여 세린 또는 알라닌이 부착되어 시노린 또는 마이코스포린-글라이신-알라닌이 형성될 수 있다. 본 출원의 일 실시예에 따른 미생물은, 전술된 효소 또는 이와 동일 및/또는 유사한 활성을 가진 효소들 중에서 목적하는 마이코스포린 유사 아미노산 생산에 적합한 것들을 선택하여 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는, 상기 2-디메틸 4-데옥시가두솔 신타제, O-메틸트랜스퍼라제, C-N 리가제, 논-리보좀 펩티드 신테타제, 논-리보좀 펩티드 신테타제 유사 효소 및/또는 D-알라닌 D-알라닌 리가제는, 유래되는 미생물 종에 한정되지 않고, 동일 및/또는 유사한 기능과 역할을 수행하는 효소로 알려진 것이면 제한 되지 않으며, 이들 간의 상동성 수치 범위 또한 제한되지 않는다. 예를 들면, 시린드로스페르멈 스태그날 PCC 7417 (C. stagnale PCC 7417)의 MylA, MylB, MylD, MylE 및 MylC는, 아나바에나 바리아빌리스 (Anabaena variabilis) 및 노스톡 펀티포르메 (Nostoc punctiforme) 유래의 2-디메틸 4-데옥시가두솔 신타제, O-메틸트랜스퍼라제, C-N 리가제, 및 D-알라닌 D-알라닌 리가제에 상응하고 (homologous), 이들 사이의 유사도는 약 61 내지 88% 이다(Appl Environ Microbiol, 2016, 82(20), 6167-6173; J Bacteriol, 2011, 193(21), 5923-5928). 즉, 본 발명에서 사용될 수 있는 효소는, 동일 및/또는 유사한 기능 및 효과를 나타내는 것으로 알려진 것이라면 유래되는 미생물 종이나 서열 상동성에 크게 제한되지 않는다. 또한, 상기 선행 기술문헌에 기재된 비특허문헌은 전체로써 본원의 참조로 포함된다.
또한, 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자는 서열번호 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 또는 122의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자는 서열번호 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 또는 122의 아미노산 서열과 50%, 60%, 또는 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 더더욱 구체적으로는 95%이상, 보다 더욱 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 미생물이 마이코스포린 유사 아미노산을 생산할 수 있는 한 상기 상동성을 벗어난 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열도 제한 없이 포함할 수 있다. 구체적으로, 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자는 서열번호 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 109의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 서열과 상동성을 가지는 서열로서 실질적으로 기재된 서열번호의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 경우도 역시 본원의 범주에 포함됨은 자명하다.
또한, 상기 뉴클레오티드 서열은 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 상기 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자는 마이코스포린 유사 아미노산 생합성에 관여하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이면 본원에 제한없이 포함될 수 있다.
또는, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 마이코스포린 유사 아미노산 생합성에 관여하는 단백질을 암호화하는 서열이라면 본원에 제한 없이 포함될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물은, 서로 유래가 다른 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자들을 포함할 수 있다.
본원에서 단백질의 활성 강화 및/또는 유전자의 도입은 순서에 상관없이 동시, 순차, 역순으로 수행될 수 있다.
상기 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물은 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자 클러스터를 포함하여 마이코스포린 유사 아미노산을 생산할 수 있고, 추가적으로, 2-디하이드로-3-데옥시포스포헵토네이트 알돌라제, 포스포에놀피루베이트 신테타제 및 트랜스케톨라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 활성을 강화시킴으로써, 마이코스포린 유사 아미노산의 생산능을 증가시킨 미생물일 수 있다. 또한, 본원의 미생물은 2-디하이드로-3-데옥시포스포헵토네이트 알돌라제, 포스포에놀피루베이트 신테타제 및 트랜스케톨라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 활성을 강화시킴으로써, 마이코스포린 유사 아미노산의 생산능을 증가시킨 미생물인 한 제한이 없으나, 구체적으로, 코리네박테리움 속 미생물, 에스케리키아 속 미생물, 또는 효모일 수 있다.
상기 코리네박테리움 속 미생물은 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범(Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스(Corynebacterium efficiens) 등일 수 있으며, 더욱 구체적으로는, 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 에스케리키아 속 미생물은 구체적으로, 에스케리키아 알베르티(Escherichia albertii), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 에스케리키아 페르구소니(Escherichia fergusonii), 에스케리키아 헤르마니(Escherichia hermannii), 에스케리키아 불네리스(Escherichia vulneris)등일 수 있으며, 더욱 구체적으로는, 에스케리키아 콜라이일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 효모는 상기 효모는 구체적으로, 자낭균문(Ascomycota)인 사카로미케스아문(Saccharomycotina), 외자낭균아문(Taphrinomycotina), 또는 담자균문(Basidiomycota)인 담자균아문(Agaricomycotina), 녹균아문(Pucciniomycotina)등에 속하는 미생물일 수 있으며, 더욱 구체적으로 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 미생물, 쉬조사카로미세스(Schizosaccharomyces) 속 미생물, 파피아(Phaffia) 속 미생물, 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 속 미생물, 피키아(Pichia) 속 미생물, 칸디다(Candida) 속 미생물일 수 있다. 보다 더욱 구체적으로는, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원의 다른 하나의 양태는 본원의 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 마이코스포린 유사 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, 마이코스포린 유사 아미노산의 생산방법을 제공한다.
상기 "미생물"및 "마이코스포린 유사 아미노산"은 전술한 바와 같다.
본원에서 "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미생물에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 본원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 구체적으로는 본원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다. 구체적으로, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나, 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 또한, 배양온도는 20 내지 45, 구체적으로는 25 내지 40 를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글
루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
상기 배양에 의하여 생산된 MAAs는 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
본원에서 용어, "배지"는 본원의 미생물을 배양할 배양배지 및/또는 배양한 다음 수득한 산물을 의미한다. 상기 배지는 미생물을 포함하는 형태 및 상기 미생물을 포함하는 배양액에서 원심분리, 여과 등으로 미생물을 제거한 형태도 모두 포함하는 개념이다.
본원의 상기 배양 단계에서 생산된 MAAs를 회수하는 단계는 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 MAAs를 수집할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양된 미생물 또는 배지로부터 목적하는 MAAs를 회수할 수 있다. 상기 MAAs를 회수하는 단계는 분리 공정 및/또는 정제 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본원의 미생물은 마이코스포린 유사 아미노산의 생산능이 향상되어, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 데 효율적으로 사용될 수 있다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<대장균 기반 MAAs 생산 재조합 미생물 제작 및 이를 이용한 MAAs 생산>
실시예 1: 2 - 디하이드로 -3- 데옥시포스포헵토네이트 알돌라제(2-dehydro-3-deoxyphosphoheptonate aldolase ) 활성 강화 균주 제작
미생물의 MAAs 생산능을 증가시키기 위하여, 2-디하이드로-3-데옥시포스포헵토네이트 알돌라제의 활성이 강화된 대장균을 제작하였다. 구체적으로, 대장균 W3110을 기반균주로 하여 aroG(2-디하이드로-3-데옥시포스포헵토네이트 알돌라제; 서열번호 1 및 2) 유전자를 추가로 도입하였다. 플라스미드의 제작에 사용된 주형 및 프라이머는 하기 [표 1]과 같다.
Figure 112018019301625-pat00007
상기 주형 및 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 유전자 단편을 증폭한 후, fhuA arm 1과 fhuA arm 2 유전자 단편을 BamH1-Spe1 제한효소로 절단한 pSKH 벡터 (PCT/KR2007/006933)에 상기 증폭된 단편을 In-FusionR HD cloning kit(clontech)를 이용하여 결합(ligation) 하였고, 제조된 벡터는 pSKH-ㅿfhuA로 명명하였다. 상기 fhuA 유전자 결손으로 인해 대장균의 파지감염이 억제된다.
Pn_aroG 유전자 단편은 Spe1-EcoRV 제한효소로 절단한 pSKH-ㅿfhuA 벡터에 In-FusionR HD cloning kit(clontech)를 이용하여 결합(ligation)하였고, 강화된 프로모터로 알려진 Ptrc와 Pcj1 유전자 단편은 Spe1-Nde1 제한효소로 절단하고 aroG 유전자 단편은 Nde1-EcoRV 제한효소로 절단한 다음, Ptrc와 aroG 유전자 단편 또는 Pcj1(대한민국 등록특허 제10-620092호)와 aroG 유전자 단편을 각각 Spe1-EcoRV 제한효소로 절단한 pSKH-ㅿfhuA 벡터에 In-FusionR HD cloning kit(clontech)를 이용하여 결합(ligation) 하였다. 제조된 벡터는 각각 pSKH-ㅿfhuA-Pn-aroG , pSKH-ㅿfhuA-Ptrc-aroG, pSKH-ㅿfhuA-Pcj1-aroG로 명명하였다.
상기 벡터는 시퀀싱을 통하여 클로닝 여부와 벡터의 유전자 서열을 확인한 후, 야생형 대장균 W3110 균주에 전기천공법으로 형질전환 시켰다. 형질 전환된 유전자는 1차 재조합(교차)에 의해 염색체에 도입된 후, 2차 재조합(교차)을 통해 염색체로부터 플라스미드 부위의 절제(excision)가 일어났다. 상기 2차 재조합이 완료된 대장균 형질전환 주들을 대상으로 서열번호 14(정방향) 및 8(역방향)의 프라이머를 사용한 PCR을 통해 aroG 유전자 도입을 확인하였다.
실시예 2: 미세조류 유래 시노린 생합성 유전자를 과발현하는 벡터 제작
A. variabilis 기반 시노린 생합성 유전자 클러스터는 2-디메틸 4-데옥시가두솔 신테이즈(2-demetyl 4-deoxygadusol synthase), O-메틸트랜스퍼라제(O-methyltransferase), C-N 라이게이즈(C-N ligase), 및 논-리보좀 펩티드 신테이즈(non-ribosomal peptide synthetase)를 암호화 하는 4개의 유전자(Ava_ABCD)로 이루어져 있으며, A. variabilis ATCC29413 게놈 DNA를 이용하여 시노린 생합성 유전자 클러스터를 동정하였다. pECCG117_Pcj1_GFP_terminator 벡터를 이용하여, A. variabilis ATCC29413 로부터 유래한 시노린 생합성 유전자를 포함하는 벡터를 제작하였다. 시노린 생합성 유전자 발현 벡터의 명칭과 벡터를 제작하기 위해 사용한 각각의 주형 및 프라이머는 하기 [표 2]와 같다.
Figure 112018019301625-pat00008
상기 주형과 프라이머를 이용하여 유전자 단편을 수득한 후, 각각의 유전자 단편은 EcoRV-XbaI 제한효소를 처리한 pECCG 117_Pcj1_GFP_terminator 벡터에 In-FusionR HD cloning kit(clontech)를 이용하여 결합(ligation)되었다. 제조된 벡터는 pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD으로 명명하였고, 시퀀싱을 통하여 클로닝 여부와 벡터의 유전자 서열을 확인되었다. Ava_ABCD의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 17에 명시하였다.
실시예 3: 2 - 디하이드로 -3- 데옥시포스포헵토네이트 알돌라제 활성 강화 균주의 시노린 생산능 평가
실시예 1에서 제작된 aroG 유전자 강화 균주 및 야생형 W3110 균주에 실시예 2에서 제작된 pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD 플라스미드를 각각 전기천공법을 통해 도입한 후, LB 고체 배지에 도말하였다. 상기 균주를 37℃ 배양기에서 밤새 배양한 후, 25 mL 역가 배지[배지 조성: 포도당 40 g/L, KH2PO4 0.3 g/L, K2HPO4 0.6 g/L, (NH4)2SO4 15 g/L, MgSO47H2O 1 g/L, NaCl 2.5 g/L, Sodium citrate 1.2 g/L, 효모 추출물 2.5 g/L, 탄산칼슘 40 g/L: pH7.0]에 한 백금이 씩 접종한 다음, 이를 37℃, 200 rpm의 배양기에서 48시간 배양하였으며, HPLC(waters社)를 이용한 이의 분석 결과를 [표 3]에 나타내었다.　
Figure 112018019301625-pat00009
상기 [표 3]에 나타낸 바와 같이, 유전자 aroG가 강화된 균주(W3110ㅿfhuA::Pn-aroG/pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD)에서 생산된 시노린 농도는 대조군 대비 약 20% 증가하였다. 특히, 프로모터를 강화하여 유전자 aroG가 강화된 균주(W3110ㅿfhuA::Ptrc-aroG/pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD,W3110ㅿfhuA::Pcj1-aroG/ pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD)의 경우는 69%, 94% 증가하였다.
실시예 4: 포스포에놀피루베이트 신테타제 ( phosphoenolpyruvate synthetase )의 활성 강화 균주 제작
미생물의 MAAs 생산능을 증가시키기 위하여, 포스포에놀피루베이트 신테타제 의 활성이 강화된 대장균을 제작하였다. 구체적으로, 대장균 W3110을 기반균주로하여 pps(포스포에놀피루베이트 신테타제; 서열번호 18 및 19)유전자를 추가로 도입하였다. 플라스미드의 제작에 사용된 주형 및 프라이머는 하기 [표 4]과 같다.
Figure 112018019301625-pat00010
상기 주형 및 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 유전자 단편을 증폭한 후, Pn_pps 유전자 단편은 Spe1-EcoRV 제한효소로 절단한 pSKH-ㅿfhuA 벡터에 In-FusionR HD cloning kit(clontech)를 이용하여 결합(ligation) 하였고, 실시예 1에서 제작된 Ptrc와 Pcj1 유전자 단편은 Spe1-Nde1 제한효소로 절단하고 pps 유전자 단편은 Nde1-EcoRV 제한효소로 절단한 다음, Ptrc와 pps 유전자 단편 또는 Pcj1와 pps 유전자 단편을 각각 Spe1-EcoRV 제한효소로 절단한 pSKH-ㅿfhuA 벡터에 In-FusionR HD cloning kit(clontech)를 이용하여 결합(ligation)하였다. 제조된 벡터는 각각 pSKH-ㅿfhuA-Pn-pps, pSKH-ㅿfhuA-Ptrc-pps, pSKH-ㅿfhuA-Pcj1-pps로 명명하였다.
상기 벡터는 시퀀싱을 통하여 클로닝 여부와 벡터의 유전자 서열을 확인한 후, 야생형 대장균 W3110 균주에 전기천공법으로 형질전환시켰다. 형질전환된 유전자는 1차 재조합(교차)에 의해 염색체에 도입된 후, 2차 재조합(교차)을 통해 염색체로부터 플라스미드 부위의 절제(excision)가 일어났다. 상기 2차 재조합이 완료된 대장균 형질전환 주들을 대상으로 서열번호 14(정방향) 및 21(역방향)의 프라이머를 사용한 PCR을 통해 pps 유전자 도입을 확인하였다.
실시예 5: 포스포에놀피루베이트 신테타제 활성 강화 균주의 시노린 생산능 평가
실시예 4에서 제작된 pps 유전자 도입 균주 및 야생형 W3110 균주에 실시예 2에서 제작된 pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD 플라스미드를 각각 전기천공법을 통해 도입한 후, LB 고체 배지에 도말하였다. 상기 균주를 37℃ 배양기에서 밤새 배양한 후, 상기 실시예 3의 25mL 역가 배지에 한 백금이 씩 접종한 다음, 이를 37℃, 200 rpm의 배양기에서 48시간 배양하였으며, 이의 결과를 [표 5]에 나타내었다.
Figure 112018019301625-pat00011
상기 [표 5]에 나타낸 바와 같이, 유전자 pps가 강화된 균주에서 생산된 시노린 농도는 41% 증가하였으며, 강한 프로모터로 치환함으로써 이의 활성을 강화시킨 경우는 대조군 대비 최대 60% 증가하였다.
실시예 6: 트랜스케톨라제 ( transketolase I/II)의 활성 강화 균주 제작
미생물의 MAAs 생산능을 증가시키기 위하여, 트랜스케톨라제의 활성이 강화된 대장균을 제작하였다. 구체적으로, 대장균 W3110을 기반균주로하여 tktA (트랜스케톨라제; 서열번호 23 및 24) 유전자를 추가로 도입하였다. 플라스미드의 제작에 사용된 주형 및 프라이머는 하기 [표 6]과 같다.
Figure 112018019301625-pat00012
상기 주형 및 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 유전자 단편을 증폭한 후, Pn_tktA 유전자 단편은 Spe1-EcoRV 제한효소로 절단한 pSKH-ㅿfhuA 벡터에 In-FusionR HD cloning kit(clontech)를 이용하여 결합(ligation) 하였고, 실시예 1에서 제작된 Ptrc와 Pcj1 유전자 단편은 Spe1, Nde1 제한효소로 절단하고 tktA 유전자 단편은 Nde1-EcoRV 제한효소로 절단한 다음, Ptrc와 tktA 유전자 단편 또는 Pcj1와 tktA 유전자 단편을 각각 Spe1-EcoRV 제한효소로 절단한 pSKH-ㅿfhuA 벡터에 In-FusionR HD cloning kit(clontech)를 이용하여 결합(ligation)하였다. 제조된 벡터는 각각 pSKH-ㅿfhuA-Pn-tktA , pSKH-ㅿfhuA-Ptrc-tktA , pSKH-ㅿfhuA-Pcj1-tktA 로 명명하였다.
상기 벡터는 시퀀싱을 통하여 클로닝 여부와 벡터의 유전자 서열을 확인한 후, 야생형 대장균 W3110 균주에 전기천공법으로 형질전환 시켰다. 형질 전환된 유전자는 1차 재조합(교차)에 의해 염색체에 도입된 후, 2차 재조합(교차)을 통해 염색체로부터 플라스미드 부위의 절제(excision)가 일어났다. 상기 2차 재조합이 완료된 대장균 형질전환 주들을 대상으로 서열번호 14(정방향) 및 26(역방향)의 프라이머를 사용한 PCR을 통해 tktA 유전자 도입을 확인하였다.
실시예 7: 트랜스케톨라제의 활성 강화 균주의 시노린 생산능 평가
실시예 6에서 제작된 tktA 유전자 도입 균주 및 야생형 W3110 균주에 실시예 2에서 제작된 pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD 플라스미드를 각각 전기천공법을 통해 도입한 후, LB 고체 배지에 도말하였다. 상기 균주를 37℃ 배양기에서 밤새 배양한 후, 상기 실시예 3의 25mL 역가 배지에 한 백금이 씩 접종한 다음, 이를 37℃, 200 rpm의 배양기에서 48시간 배양하였으며, 이의 결과를 [표 7]에 나타내었다.　
Figure 112018019301625-pat00013
상기 [표 7]에 나타낸 바와 같이, 유전자 tktA가 강화된 균주에서 생산된 시노린 농도는 4.5% 증가하였으며, 강한 프로모터로 치환하여 이의 활성을 강화한 경우는 대조군 대비 최대 32% 증가하였다.
실시예 8: 2 - 디하이드로 -3- 데옥시포스포헵토네이트 알돌라제 / 포스포에놀피루베이트 신테타제 / 트랜스케톨라제의 활성 강화 균주 제작
미생물의 MAAs 생산능을 증가시키기 위하여, 2-디하이드로-3-데옥시포스포헵토네이트 알돌라제/ 포스포에놀피루베이트 신테타제/트랜스케톨라제 의 활성이 강화된 대장균을 제작하였다. 구체적으로, 대장균 W3110을 기반균주로하여 aroG, pps, tktA 유전자를 추가로 도입하였다. 플라스미드의 제작에 사용된 주형 및 프라이머는 하기 [표 8]과 같다.
Figure 112018019301625-pat00014
상기 주형 및 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 유전자 단편을 증폭한 후, Spe1-EcoRV 제한효소로 절단한 pSKH-ㅿfhuA 벡터에 In-FusionR HD cloning kit(clontech)를 이용하여 결합(ligation) 하였다. 제조된 벡터는 pSKH-ㅿfhuA-Pcj1-aroG-Pcj1-ppsA-Pcj1-tktA로 명명하였다.
상기 벡터는 시퀀싱을 통하여 클로닝 여부와 벡터의 유전자 서열을 확인한 후, 야생형 대장균 W3110 균주에 전기천공법으로 형질전환 시켰다. 형질전환된 유전자는 1차 재조합(교차)에 의해 염색체에 도입된 후, 2차 재조합(교차)을 통해 염색체로부터 플라스미드 부위의 절제(excision)가 일어났다. 상기 2차 재조합이 완료된 대장균 형질전환 주들을 대상으로 서열번호 14(정방향) 및 26(역방향)의 프라이머를 사용한 PCR을 통해 aroG, pps, tktA 유전자 도입을 확인하였다.
실시예 9: 2 - 디하이드로 -3- 데옥시포스포헵토네이트 알돌라제 / 포스포에놀피루 베이트 신테타제 / 트랜스케톨라제의 활성 강화 균주의 시노린 생산능 평가
실시예 8에서 제작된 aroG, pps, tktA 유전자 도입 균주 및 야생형 W3110 균주에 실시예 2에서 제작된 pECCG117 Pcj1_Ava_ABCD 플라스미드를 전기천공법을 통해 도입한 후, LB 고체 배지에 도말하였다. 상기 균주를 37℃ 배양기에서 밤새 배양한 후, 상기 실시예 3의 25mL 역가 배지에 한 백금이 씩 접종한 다음, 이를 37℃, 200rpm의 배양기에서 48시간 배양하였으며, 이의 결과를 [표 9]에 나타내었다.
Figure 112018019301625-pat00015
상기 [표 9]에 나타낸 바와 같이, 유전자 3종(aroG, pps, tktA)이 조합되어 강화된 균주에서 생산된 시노린 농도는 대조군 대비 267% 증가하였다. 이는 각 유전자의 프로모터를 강한 프로모터로 치환하여 얻은 최대 증가량의 합보다 예상치 못한 수준으로 향상된 결과이다. 즉, 상기 aroG, pps, tktA 3종의 유전자가 조합되는 경우, 보다 높은 농도의 시노린 생산이 가능함을 확인하였다.
실시예 10: 3 - 디하이드로퀴네이트 디히드라타제 (3- dehydroquinate dehydratase)가 불활성된 균주 제작
미생물의 MMAs 생산능을 증가시키기 위하여, 3-디하이드로퀴네이트 디히드라타제(aroD)가 불활성된 균주를 제작하였다.
구체적으로, 유전자 삽입 마커로 pKD3의 클로람페니콜(chloramphenicol) 내성 유전자가 사용되었으며, aroD 유전자 일부분과 pKD3 플라스미드의 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하는 aroD 결손 카세트는 서열번호 32(정방향) 및 33(역방향)의 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 제작되었다. 야생형 대장균 W3110 및 실시예 8에서 제작한 aroG, pps 및 tktA 유전자 도입 균주에 람다 레드 재조합효소 유전자를 포함하는 pKD46 플라스미드를 형질전환하고, 아라비노스(arabinose)를 이용하여 해당 유전자의 발현을 유도하여 컴피턴트 세포를 제작하였다. 상기 컴피턴트 세포에 aroD 결손 카세트를 전기천공법을 이용하여 도입한 후, 클로람페니콜이 30mg/L 포함된 LB 고체 배지에 도말하였다. 이렇게 얻어진 균주를 서열번호 34(정방향) 및 35(역방향)의 프라이머를 이용하여 PCR하였고, 1300bp 증폭된 단편의 관찰을 통해 aroD 유전자 결손을 확인하였다.
실시예 11: 3 - 디하이드로퀴네이트 디히드라타제가 불활성된 균주의 시노린 생산능 평가
실시예 10에서 제작된 aroD 유전자가 결손된 균주에 실시예 2에서 제작된 pECCG117 Pcj1_Ava_ABCD 플라스미드를 전기천공법을 통해 도입한 후, LB 고체 배지에 도말하였다. 상기 균주를 37℃ 배양기에서 밤새 배양한 후, 상기 실시예 3의 25mL 역가 배지에 한 백금이 씩 접종한 다음, 이를 37℃, 200rpm의 배양기에서 48시간 배양하였으며, 이의 결과를 [표 10]에 나타내었다.　
Figure 112018019301625-pat00016
상기 [표 10]에 나타낸 것과 같이, aroG, pps, tktA가 강화된 시노린 생산균주 대비, 추가적으로 aroD가 결손된 균주는 시노린의 농도가 66% 증가하였다. 상기 aroG, pps, tktA가 강화된 균주 W3110ㅿfhuA::Pcj1-aroG-Pcj1-pps-Pcj1-tktA / pECCG117_PCJ1_Ava_ABCD 균주를 CB06-0020으로 명명하였고, 부다페스트 조약하에 2018년 2월 14일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM12224P를 부여받았다.
< 코리네박테리움 글루타미쿰 기반 MAAs 생산 재조합 미생물 제작 및 이를 이용한 MAAs 생산>
실시예 12: 2 - 디하이드로 -3- 데옥시포스포헵토네이트 알돌라제 활성 강화 벡터 제작 및 시노린 생산능 평가
미생물의 MAAs 생산능을 증가시키기 위하여, 2-디하이드로-3-데옥시포스포헵토네이트 알돌라제의 활성이 강화된 코리네박테리움속 미생물을 제작하였다. 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 기반균주로하여, aroG (2-디하이드로-3-데옥시포스포헵토네이트 알돌라제; 서열번호 36 및 37)유전자를 추가로 도입하였다. 플라스미드의 제작에 사용된 주형 및 프라이머는 하기 [표 11]과 같다.
Figure 112018019301625-pat00017
상기 주형과 프라이머를 이용하여 유전자 단편을 수득한 후, 각각의 유전자 단편은 EcoRV/ XbaI 제한효소로 처리한 pECCG 117, pECCG 117_Pcj7_GFP_terminator(대한민국 등록특허 제10-620092호, p117-cj7-gfp) 벡터에 In-FusionR HD cloning kit (clontech)을 이용하여 결합(ligation)되었다. 제조된 벡터는 각각 pECCG117_Pn_cgl aroG, pECCG117_Pcj7_cgl aroG 로 명명하였다. 상기 벡터들은 시퀀싱을 통하여 클로닝 여부와 벡터의 유전자 서열을 확인하였다.
먼저, 코리네박테리움 속 미생물은 시노린을 생산하지 못하므로, 시노린 생합성경로를 도입한 균주를 제작하였다. 구체적으로, pECCG117_Ptrc_Ava_ABCD를 주형으로 하고 서열번호 42(정방향)과 43(역방향)의 프라이머 쌍을 이용하여 Ava_ABCD를 PCR하였다. 약 7kb의 PCR 단편을, NdeI 제한효소 처리한 pDZTn 벡터(국제공개특허 WO 2009-125992A)에 In-FusionR HD cloning kit(clontech)를 이용하여 결합(ligation)하여 pDZTn_Ava_ABCD를 제작하였다. 그 뒤 서열번호 44(정방향)과 45(역방향)의 프라이머 쌍으로 O2 프로모터(대한민국 등록특허 제10-1632642호) 단편을 PCR 하였고, pDZTn_Ava_ABCD를 NdeI 제한효소 처리한 벡터에 In-FusionR HD cloning kit(clontech)를 이용하여 결합(ligation)하여 pDZTn_PO2_Ava_ABCD를 제작하였다.
상기의 재조합 플라스미드를 야생의 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 전기천공법으로 형질전환시켜(van der Rest et al. 1999), 상기 플라스미드를 1차 재조합(교차)에 의해 염색체에 도입한 후, 2차 재조합(교차)을 통해 염색체로부터 플라스미드를 절제(excision)하였다.
상기 2차 재조합이 완료된 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환주들을 대상으로 각 유전자 특이적 프라이머 (gene-specific primer) 쌍인 서열번호 42 및 43을 사용한 PCR을 통해 Ava_ABCD 유전자의 도입을 확인하였다. 제조된 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 13032 △N1021_PO2_Ava_ABCD로 명명하였다.
상기 코리네박테리움 글루타미쿰 13032 △N1021_PO2_Ava_ABCD 균주에 각각 pECCG117_Pn_cgl aroG, pECCG117_Pcj7_cgl aroG 벡터를 전기천공법으로 형질 전환시켰다.
상기 제작된 균주 및 대조군이 되는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032(c.gl 13032)을 카나마이신(Kanamycin) 포함 BHIS 고체 배지에서 밤새 배양하였으며, 상기 균주들을 25 mL 역가 배지 [배지 조성: 포도당 40 g/L, KH2PO4 1 g/L, (NH4)2SO4 10 g/L, MgSO47H2O 5g/L, NaCl 5 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 탄산칼슘 30 g/L: pH7.0]에 한 백금이 씩 접종한 다음, 이를 37℃, 200 rpm의 배양기에서 48 시간 배양하였으며, 이의 결과를 [표 12]에 나타내었다.　
Figure 112018019301625-pat00018
위의 [표 12]에서 보는 것처럼 시노린 생합성 유전자를 포함하는 균주에 aroG 발현양을 증가시켰을 경우, 시노린의 농도가 39% 증가 되었다. 특히 프로모터를 강화한 경우 시노린의 농도는 80%까지 향상될 수 있음을 확인하였다.
실시예 13: 포스포에놀피루베이트 신테타제 / 트랜스케톨라제 활성 강화 벡터 제작 및 시노린 생산능 평가
미생물의 MAAs 생산능을 증가시키기 위하여, tkt 또는 pps의 활성이 강화된 코리네박테리움 글루타미쿰을 제작하였다. 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 기반균주로 하여 tkt(트랜스케톨라제; 서열번호 95 및 96) 또는 pps(포스포에놀피루베이트 신테타제; 서열번호 97 및 98) 유전자를 추가로 도입하였다. 플라스미드의 제작에 사용된 주형 및 프라이머는 하기 [표 13]과 같다.
Figure 112018019301625-pat00019
주형과 프라이머 조합을 맞추어 PCR기법을 통해 얻은 유전자 단편과 EcoRV/ XbaI 제한효소 처리한 pECCG117, pECCG117_Ptrc_GFP_terminator 및 pECCG 117_Pcj7_GFP_terminator 벡터를 In-FusionR HD cloning kit(clontech)를 이용하여 결합(ligation)하여 제작 하였다. 제조된 벡터는 각각 pECCG117- Pn-tkt/pECCG117-Pcj7-tkt 및 pECCG117- Ptrc-pps/pECCG117-Pcj7-pps 로 명명하였다. 상기 벡터들은 시퀀싱을 통하여 클로닝 여부와 벡터의 유전자 서열을 확인한 후, 코리네박테리움 글루타미쿰 13032 △N1021_PO2_Ava_ABCD 균주에 전기 천공법으로 형질 전환 시켰다. 제작된 Kanamycin 포함 BHIS 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 상기 실시예 12의 25 mL 역가 배지에 한 백금이 씩 접종한 다음, 이를 37℃, 200 rpm의 배양기에서 48시간 배양하였으며, 이의 결과를 [표 14]에 나타내었다.
Figure 112018019301625-pat00020
상기 [표 14]에 나타낸 바와 같이, 유전자 tkt, pps를 강화시킬 경우 시노린 생산이 각각 최대 57% 또는 72% 향상되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 14: 2 - 디하이드로 -3- 데옥시포스포헵토네이트 알돌라제 / 포스포에놀피루베이트 신테타제/트랜스케톨라제의 활성 강화 균주 제작 및 평가
미생물의 MAAs 생산능을 증가시키기 위하여 aroG, pps 및 tkt의 활성이 강화된 코리네박테리움 글루타미쿰을 제작하였으며, 보다 높은 MAAs 생산량을 확인하기 위하여, 추가적으로 3-디하이드로퀴네이트 디히드라타제(aroD)도 불활성화 시켰다. 구체적으로는, aroG, pps, tktA 유전자의 강화를 위해 pDZ-ㅿaroD-Pcj7-aroG-Pcj7-pps-Pcj7-tktA 플라스미드를 제작하였다. 상기 pDZ-ㅿaroD-Pcj7-aroG-Pcj7-pps-Pcj7-tktA 플라스미드의 제작에 사용된 주형 및 프라이머는 하기 [표 15]와 같다.
Figure 112018019301625-pat00021
우선, 코리네박테리움 글루타미쿰의 aroD 유전자(서열번호 89 및 90) 결실 균주를 제작하기 위하여 aroD의 개방 해독틀(open reading frame)이 내부적으로 결실된 pDZ-ΔaroD 플라스미드를 제작하였다. 상기 pDZ-ΔaroD의 내부적 유전자 소실은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 91과 92 및 서열번호 93과 94의 정방향과 역방향 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 유전자 단편을 pDZ 벡터에 도입하여 제작하였다.
다음으로, 상기 표 15의 주형 및 프라이머를 사용하여 aroG, pps, 그리고 tkt 각각의 유전자 단편을 PCR을 통해 증폭한 후, SpeI 제한효소로 절단한 pDZ-ㅿaroD 벡터에 각각 도입하였다. 상기 벡터 2종은 시퀀싱을 통하여 클로닝 여부와 벡터의 유전자 서열을 확인한 후, 코리네박테리움 글루타미쿰 13032 △N1021_PO2_Ava_ABCD 균주에 전기 천공법으로 형질 전환 시켰다. 제작된 Kanamycin 포함 BHIS 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 상기 실시예 12의 25 mL 역가 배지에 한 백금이 씩 접종한 다음, 이를 37℃, 200rpm의 배양기에서 48시간 배양하였으며, 이의 결과를 [표 16]에 나타내었다.
Figure 112018019301625-pat00022
상기 [표 16]에 나타낸 바와 같이, 유전자 3종 (aroG, pps, tktA)이 강화된 균주에서 생산된 시노린 농도는 대조군 대비 약 25% 증가하였다. 이로부터 aroD 결손을 통해 시노린 생산능을 높인 균주에서도, 상기 3종의 유전자 조합시에는 높은 농도로 시노린을 생산할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 3종의 유전자의 강화가 조합된 균주에 추가로 aroD 유전자를 불활성화 하는 경우, 보다 높은 농도로 시노린을 생산할 수 있음을 해석할 수 있다.
<Yeast 기반 MAAs 생산 재조합 미생물 제작 및 이를 이용한 MAAs 생산>
실시예 15: 시노린을 생산하는 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) 균 주 제작
사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae)를 시노린 생산 균주로 사용하기 위하여 A. variabilis ATCC29413 유래의 시노린 생합성 유전자를 yeast 발현용 벡터에 도입하였다. pRS-413 벡터에 GPD 프로모터를 사용하여 Ava_A와 Ava_B 유전자를 삽입하였다. 구체적으로, pGPD-Ava_A, pGPD-Ava_B 부위를 overlapping PCR을 사용하여 연결한 후, 벡터와 PCR product를 제한효소 BamH I, Sal I으로 처리한 후, T4 리가아제를 사용하여 연결하여, pRS-413-pGPD-Ava_A-pGPD-Ava_B 벡터를 제작하였다.
다음으로 pRS-414 벡터에 GPD 프로모터를 사용하여 Ava_C와 Ava_D 유전자를 삽입하였다. 구체적으로, pGPD-Ava_C, pGPD-Ava_D 부위를 overlapping PCR을 사용하여 연결한 후, 벡터와 PCR product를 제한효소 BamH I, Sal I으로 처리한 후, T4 리가아제를 사용하여 연결하여, pRS-414-pGPD-Ava_C-pGPD-Ava_D 벡터를 제작하였다. 벡터 제작에 사용한 프라이머와 주형 DNA는 하기 [표 17]에 나타내었다.
Figure 112018019301625-pat00023
pRS-413-pGPD-Ava_A-pGPD-Ava_B 벡터와 pRS-414-pGPD-Ava_C-pGPD-Ava_D 벡터를 사카로마이세스 세레비지에 CEN.PK-1D(S. cerevisiae CEN.PK-1D)에 리튬 아세테이트 형질전환법을 통하여 도입한 후, 시노린 생산 여부를 확인하였다. auxotrophic marker인 Trp, His가 제외된 SC (synthetic complete) 고체 배지에 도말한 후 30℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. Trp, His가 제외된 SC (synthetic complete) 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 하기 [표 18]의 25 mL 역가 배지에 한 백금이 씩 접종한 다음, 이를 30℃, 150rpm의 배양기에서 24시간 배양하였으며, 이의 결과를 [표 19]에 나타내었다.
Figure 112018019301625-pat00024
Figure 112018019301625-pat00025
실험 결과, 시노린을 생산하지 않는 야생형 사카로마이세스 세레비지에균주에 시노린 생합성 유전자를 도입한 결과, 331mg/l의 시노린을 생산함을 확인하였다.
실시예 16: 사카로마이세스 세레비지에 의 TKL1 ( 트랜스케톨라제 ) 강화를 통한 시노린 생산량 증대
MAAs 생산능을 증가시키기 위하여 TKL1의 활성이 강화된 사카로마이세스 세레비지에 균주를 제작하였다. 이를 위해, pRS-415-pGPD, pRS-415-pADH, pRS-415-pTEF 벡터에 TKL1 유전자를(서열번호 110 및 123) 클로닝하여 TKL1 유전자의 발현을 강화하였다.
상기 pRS-415-pGPD 벡터에 포함된 GPD 프로모터는 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로제나제(GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), isozyme 3(TDH3) 유전자의 프로모터로, THD3 유전자 ORF의 개시 코돈으로부터 -674bp 내지 -1bp 서열을 포함한다.
상기 pRS-415-pADH 벡터에 포함된 ADH 프로모터는 알코올 디하이드로제나제(ADH1: Alcohol dehydrogenase) 유전자의 프로모터로, ADH1 유전자 ORF의 개시 코돈으로부터 -1500bp 내지 -1bp 서열을 포함한다.
상기 pRS-415-pTEF 벡터에 포함된 TEF 프로모터는 번역 신장 인자(TEF1: Translational elongation factor EF-1 alpha) 유전자의 프로모터로, TEF1 유전자 ORF의 개시 코돈으로부터 -500bp 내지 -1bp 서열을 포함한다.
구체적으로, 하기 [표 20]의 프라이머를 사용하여 TKL1 유전자를 PCR 한 후, PCR product와 pRS-415-pGPD, pRS-415-pADH, pRS-415-pTEF 벡터를 제한효소 BamH I과 Sal I으로 처리한 후, T4 리가아제를 사용하여 연결하여, pRS-415-pGPD-TKL1, pRS-415-pADH-TKL1, pRS-415-pTEF-TKL1 벡터를 제작하였다.
Figure 112018019301625-pat00026
다음으로 실시예 15에서 제작한 시노린 생합성 플라스미드를 pRS-415-pGPD-TKL1, pRS-415-pADH-TKL1, pRS-415-pTEF-TKL1 와 함께 사카로마이세스 세레비지에 CEN.PK-1D 균주에 도입하여, Trp, Ura, His가 제외된 SC (synthetic complete) 고체 배지에 도말한 후 30℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. Trp, Ura, His가 제외된 SC (synthetic complete) 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 25 mL 역가 배지에 한 백금이 씩 접종한 다음, 이를 30℃, 150rpm의 배양기에서 24시간 배양하였으며, 이의 결과를 하기의 [표 21]에 나타내었다.
Figure 112018019301625-pat00027
상기 [표 21]에 나타낸 바와 같이, GPD 프로모터를 사용하여 TKL1 유전자의 발현을 강화한 균주에서 WT 대비 시노린 생산량이 증가함을 확인 하였다. 또한 프로모터의 세기가 증가할 수록(pGPD>pTEF>pADH) 시노린 생산량이 증가함을 추가적으로 확인 하였다.
실시예 17: 사카로마이세스 세레비지에 의 ARO4 (3- 데옥시 -D- 아라비노 - 헵툴로 소네이트-7-포스페이트(DAHP)신타제) 강화를 통한 시노린 생산량 증대
MAAs 생산능을 증가시키기 위하여 ARO4의 활성이 강화된 사카로마이세스 세레비지에 균주를 제작하였다. 이를 위해, pRS-415-pGPD, pRS-415-pADH, pRS-415-pTEF 벡터에 ARO4 유전자를(서열번호 111 및 124) 클로닝하여 ARO4 유전자의 발현을 강화하는 전략을 사용하였다. 구체적으로, [표 22]의 프라이머를 사용하여 ARO4 유전자를 PCR 한 후, ARO4 PCR product와 pRS-415-pGPD, pRS-415-pADH, pRS-415-pTEF 벡터를 제한효소 BamH I과 Sal I으로 처리한 후, T4 리가아제를 사용하여 연결하여, pRS-415-pGPD-ARO4, pRS-415-pADH-ARO4, pRS-415-pTEF-ARO4 벡터를 제작하였다.
Figure 112018019301625-pat00028
다음으로 실시예 15에서 제작한 시노린 생합성 플라스미드를 pRS-415-pGPD-ARO4, pRS-415-pADH-ARO4, pRS-415-pTEF-ARO4 와 함께 사카로마이세스 세레비지 CEN.PK-1D균주에 도입하여, Trp, Ura, His가 제외된 SC (synthetic complete) 고체 배지에 도말한 후 30℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. Trp, Ura, His가 제외된 SC(synthetic complete) 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 25mL 역가 배지에 한 백금이 씩 접종한 다음, 이를 30℃, 150 rpm의 배양기에서 24시간 배양하였으며, 이의 결과를 [표 23]에 나타내었다.
Figure 112018019301625-pat00029
상기 [표 23]에 나타낸 바와 같이, GPD 프로모터를 사용하여 ARO4 유전자의 발현을 강화한 균주에서 WT 대비 시노린 생산량이 187% 증가함을 확인 하였다.
실시예 18: 사카로마이세스 세레비지에 에 pps ( 포스포에놀피루베이트 신테타 제) 강화를 통한 시노린 생산량 증대
MAAs 생산능을 향상 시키기 위해 pps의 활성이 강화된 사카로마이세스 세레비지에 균주를 제작하였다. 이를 위해, pRS-415-pGPD, pRS-415-pADH, pRS-415-pTEF 벡터에 대장균의 pps 유전자를 클로닝하여 pps 유전자의 발현을 강화하는 전략을 사용하였다.
구체적으로, [표 24]의 프라이머를 사용하여 pps 유전자를 PCR 한 후, pps PCR product와 pRS-415-pGPD, pRS-415-pADH, pRS-415-pTEF 벡터를 제한효소 BamH I과 Sal I으로 처리한 후, T4 리가아제를 사용하여 연결하여, pRS-415-pGPD-pps, pRS-415-pADH-pps, pRS-415-pTEF-pps 벡터를 제작하였다.
Figure 112018019301625-pat00030
다음으로 실시예 15에서 제작한 시노린 생합성 플라스미드를 pRS-415-pGPD- pps, pRS-415-pADH-pps, pRS-415-pTEF-pps 와 함께 사카로마이세스 세레비지에 CEN.PK-1D 균주에 도입하여, Trp, Ura, His가 제외된 SC (synthetic complete) 고체 배지에 도말한 후 30℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. Trp, Ura, His가 제외된 SC(synthetic complete) 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 25 mL 역가 배지에 한 백금이 씩 접종한 다음, 이를 30℃, 150rpm의 배양기에서 24시간 배양하였으며, 이의 결과를 [표 25]에 나타내었다.
Figure 112018019301625-pat00031
상기 [표 25]에 나타낸 바와 같이 pps 유전자를 과발현한 균주에서 WT 대비 시노린 생산량이 70% 증가함을 확인 하였다. 또한 프로모터의 세기가 증가할 수록(pGPD>pTEF>pADH) 시노린 생산량이 증가함을 추가적으로 확인하였다.
실시예 19: 사카로마이세스 세레비지에 균주에서 TKL1 강화, ARO4 강화, pps 유전자 도입을 통한 시노린 생산량 증대
실시예 16, 17 및 18의 결과를 토대로 사카로마이세스 세레비지에 에서 시노린 생합성에 영향을 주는 유효 인자로 TKL1 , ARO4 , pps(E. coli ) 유전자를 선정하고, 이 3가지 유전자의 동시 강화를 통하여 시노린 생합성을 증대시키고자 하였다. 유효 유전자 3종을 도입하기 위하여 pRS-415-pGPD-TKL1-pGPD-ARO4, pRS-416-pGPD-pps 벡터를 제작하였다. 구체적으로, pGPD-TKL1, pGPD-ARO4 부위를 overlapping PCR을 사용하여 연결한 후, 벡터와 PCR product를 제한 효소 BamH I, Sal I으로 처리한 후, T4 리가아제를 사용하여 연결하여, pRS-415-pGPD-TKL1-pGPD-ARO4 벡터를 제작하였다.
다음으로 대장균 유래의 pps 유전자를 PCR 한 후, pps PCR product와 pRS-416-pGPD 벡터를 제한 효소 BamH I과 Sal I으로 처리한 후, T4 리가아제를 사용하여 연결하여, pRS-416-pGPD-pps 벡터를 제작하였다. 벡터 제작에 사용한 프라이머와 주형 DNA는 [표 26]에 나타내었다.
Figure 112018019301625-pat00032
다음으로 실시예 15에서 제작한 시노린 생합성 플라스미드를 pRS-415-pGPD-TKL1-pGPD-ARO4, pRS-416-pGPD-pps 벡터와 함께 사카로마이세스 세레비지에 CEN.PK-1D 균주에 도입하여, Leu, Trp, Ura, His가 제외된 SC (synthetic complete) 고체 배지에 도말한 후 30℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. Leu, Trp, Ura, His가 제외된 SC (synthetic complete) 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 25 mL 역가 배지에 한 백금이 씩 접종한 다음, 이를 30℃, 150 rpm의 배양기에서 24시간 배양하였으며, 이의 결과를 [표 27]에 나타내었다.　
Figure 112018019301625-pat00033
상기 [표 27]에 나타낸 바와 같이, 유효 유전자 3종(pps, TKL1, ARO4 )이 과발현된 균주에서 WT 대비 시노린 생산량이 230% 로 획기적으로 증가함을 확인하였다.
본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위 내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.
한국미생물보존센터 KCCM12224P 20180214
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A microorganism for producing a Mycosporine-like amino acid and a method for preparing a Mycosporine-like amino acid using the same <130> KPA171169-KR <160> 124 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1053 <212> DNA <213> Escherichia coli W3110 <400> 1 atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60 gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120 aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180 tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240 gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300 acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360 gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420 gcaggtgagt ttctcgatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480 gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct 540 tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600 aatgccgccg 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Arg Val Tyr Phe Glu 85 90 95 Lys Pro Arg Thr Thr Val Gly Trp Lys Gly Leu Ile Asn Asp Pro His 100 105 110 Met Asp Asn Ser Phe Gln Ile Asn Asp Gly Leu Arg Ile Ala Arg Lys 115 120 125 Leu Leu Leu Asp Ile Asn Asp Ser Gly Leu Pro Ala Ala Gly Glu Phe 130 135 140 Leu Asp Met Ile Thr Pro Gln Tyr Leu Ala Asp Leu Met Ser Trp Gly 145 150 155 160 Ala Ile Gly Ala Arg Thr Thr Glu Ser Gln Val His Arg Glu Leu Ala 165 170 175 Ser Gly Leu Ser Cys Pro Val Gly Phe Lys Asn Gly Thr Asp Gly Thr 180 185 190 Ile Lys Val Ala Ile Asp Ala Ile Asn Ala Ala Gly Ala Pro His Cys 195 200 205 Phe Leu Ser Val Thr Lys Trp Gly His Ser Ala Ile Val Asn Thr Ser 210 215 220 Gly Asn Gly Asp Cys His Ile Ile Leu Arg Gly Gly Lys Glu Pro Asn 225 230 235 240 Tyr Ser Ala Lys His Val Ala Glu Val Lys Glu Gly Leu Asn Lys Ala 245 250 255 Gly Leu Pro Ala Gln Val Met Ile Asp Phe Ser His Ala Asn Ser Ser 260 265 270 Lys Gln Phe Lys Lys Gln Met Asp Val Cys Ala Asp Val Cys Gln Gln 275 280 285 Ile Ala Gly Gly Glu Lys Ala Ile Ile Gly Val Met Val Glu Ser His 290 295 300 Leu Val Glu Gly Asn Gln Ser Leu Glu Ser Gly Glu Pro Leu Ala Tyr 305 310 315 320 Gly Lys Ser Ile Thr Asp Ala Cys Ile Gly Trp Glu Asp Thr Asp Ala 325 330 335 Leu Leu Arg Gln Leu Ala Asn Ala Val Lys Ala Arg Arg Gly 340 345 350 <210> 3 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fhuA arm 1_F <400> 3 ccaagcgacg cccaacctgc catcatggcg cgttccaaaa ctgctcagc 49 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fhuA arm 1_R <400> 4 tatcctcgag actagtgagc tcctttcagc ggttcggtgg 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fhuA arm 2_F <400> 5 ctagtctcga ggatatcgac cacaccctgc tgaccggtgt 40 <210> 6 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fhuA arm 2_R <400> 6 atagaatacc aattggcatg ctttttagaa acggaaggtt gcggttgc 48 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pn_aroG_F <400> 7 aaaggagctc actagtagga tgctcctgtt atgg 34 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pn_aroG_R 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tgtaatcctc gcacccattc ggcgatcaca atgttctaca atcacccagg tgttgcagaa 780 gcctatcttg gtaaaactcc tctagctgca cctttggaac ctcttgcaga tagcaagccc 840 acttactgga tatatcacga aatctggcga ttgactggga ttcgctctgg acaacaatta 900 caaacttggt ttgggagatt agtcagaggt acagatgcca tttatcgcct ggacgatccg 960 ataccatttt taactttgca ccattggcag attactttac ttttgctaca aaatttgcaa 1020 cgactcaaag gttgggtaaa gatcgatttt aatatcggta aactcgtgga attagggggc 1080 gactaa 1086 <210> 109 <211> 1047 <212> DNA <213> Nostoc punctiforme ATCC29133 <400> 109 atgccagtac ttaatatcct tcatttagtt gggtctgcac acgataagtt ttactgtgat 60 ttatcacgtc tttatgccca agactgttta gctgcaacag cagatccatc gctttataac 120 tttcaaattg catatatcac acccgatcgg cagtggcgat ttcctgactc tctcagtcga 180 gaagatattg ctcttaccaa accgattcct gtgtttgatg ccatacaatt tctaacaggc 240 caaaacattg acatgatgtt accacaaatg ttttgtattc ctggaatgac tcagtaccgt 300 gccctattcg atctgctcaa gatcccttat ataggaaata ccccagatat tatggcgatc 360 gcggcccaca aagccagagc caaagcaatt gtcgaagcag caggggtaaa agtgcctcgt 420 ggagaattgc ttcgccaagg agatattcca acaattacac ctccagcagt cgtcaaacct 480 gtaagttctg acaactcttt aggagtagtc ttagttaaag atgtgactga atatgatgct 540 gccttaaaga aagcatttga atatgcttcg gaggtcatcg tagaagcatt catcgaactt 600 ggtcgagaag tcagatgcgg catcattgta aaagacggtg agctaatagg tttacccctt 660 gaagagtatc tggtagaccc acacgataaa cctatccgta actatgctga taaactccaa 720 caaactgacg atggcgactt gcatttgact gctaaagata atatcaaggc ttggatttta 780 gaccctaacg acccaatcac ccaaaaggtt cagcaagtgg ctaaaaggtg tcatcaggct 840 ttgggttgtc gccactacag tttatttgac ttccgaatcg atccaaaggg acaaccttgg 900 ttcttagaag ctggattata ttgttctttt gcccccaaaa gtgtgatttc ttctatggcg 960 aaagcagccg gaatccctct aaatgattta ttaataaccg ctattaatga aacattgggt 1020 agtaataaaa aggtgttaca aaattga 1047 <210> 110 <211> 1626 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae CEN.PK-1D <400> 110 aacaagccgg gctttacctt gtctgacaac tacacctatg ttttcttggg tgacggttgt 60 ttgcaagaag gtatttcttc agaagcttcc tccttggctg gtcatttgaa attgggtaac 120 ttgattgcca tctacgatga caacaagatc actatcgatg gtgctaccag tatctcattc 180 gatgaagatg ttgctaagag atacgaagcc tacggttggg aagttttgta cgtagaaaat 240 ggtaacgaag atctagccgg tattgccaag gctattgctc aagctaagtt atccaaggac 300 aaaccaactt tgatcaaaat gaccacaacc attggttacg gttccttgca tgccggctct 360 cactctgtgc acggtgcccc attgaaagca gatgatgtta aacaactaaa gagcaaattc 420 ggtttcaacc cagacaagtc ctttgttgtt ccacaagaag tttacgacca ctaccaaaag 480 acaattttaa agccaggtgt cgaagccaac aacaagtgga acaagttgtt cagcgaatac 540 caaaagaaat tcccagaatt aggtgctgaa ttggctagaa gattgagcgg ccaactaccc 600 gcaaattggg aatctaagtt gccaacttac accgccaagg actctgccgt ggccactaga 660 aaattatcag aaactgttct tgaggatgtt tacaatcaat tgccagagtt gattggtggt 720 tctgccgatt taacaccttc taacttgacc agatggaagg aagcccttga cttccaacct 780 ccttcttccg gttcaggtaa ctactctggt agatacatta ggtacggtat tagagaacac 840 gctatgggtg ccataatgaa cggtatttca gctttcggtg ccaactacaa accatacggt 900 ggtactttct tgaacttcgt ttcttatgct gctggtgccg ttagattgtc cgctttgtct 960 ggccacccag ttatttgggt tgctacacat gactctatcg gtgtcggtga agatggtcca 1020 acacatcaac ctattgaaac tttagcacac ttcagatccc taccaaacat tcaagtttgg 1080 agaccagctg atggtaacga agtttctgcc gcctacaaga actctttaga atccaagcat 1140 actccaagta tcattgcttt gtccagacaa aacttgccac aattggaagg tagctctatt 1200 gaaagcgctt ctaagggtgg ttacgtacta caagatgttg ctaacccaga tattatttta 1260 gtggctactg gttccgaagt gtctttgagt gttgaagctg ctaagacttt ggccgcaaag 1320 aacatcaagg ctcgtgttgt ttctctacca gatttcttca cttttgacaa acaaccccta 1380 gaatacagac tatcagtctt accagacaac gttccaatca tgtctgttga agttttggct 1440 accacatgtt ggggcaaata cgctcatcaa tccttcggta ttgacagatt tggtgcctcc 1500 ggtaaggcac cagaagtctt caagttcttc ggtttcaccc cagaaggtgt tgctgaaaga 1560 gctcaaaaga ccattgcatt ctataagggt gacaagctaa tttctccttt gaaaaaagct 1620 ttctaa 1626 <210> 111 <211> 1113 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae CEN.PK-1D <400> 111 atgagtgaat ctccaatgtt cgctgccaac ggcatgccaa aggtaaatca aggtgctgaa 60 gaagatgtca gaattttagg ttacgaccca ttagcttctc cagctctcct tcaagtgcaa 120 atcccagcca caccaacttc tttggaaact gccaagagag gtagaagaga agctatagat 180 attattaccg gtaaagacga cagagttctt gtcattgtcg gtccttgttc catccatgat 240 ctagaagccg ctcaagaata cgctttgaga ttaaagaaat tgtcagatga attaaaaggt 300 gatttatcca tcattatgag agcatacttg gagaagccaa gaacaaccgt cggctggaaa 360 ggtctaatta atgaccctga tgttaacaac actttcaaca tcaacaaggg tttgcaatcc 420 gctagacaat tgtttgtcaa cttgacaaat atcggtttgc caattggttc tgaaatgctt 480 gataccattt ctcctcaata cttggctgat ttggtctcct tcggtgccat tggtgccaga 540 accaccgaat ctcaactgca cagagaattg gcctccggtt tgtctttccc agttggtttc 600 aagaacggta ccgatggtac cttaaatgtt gctgtggatg cttgtcaagc cgctgctcat 660 tctcaccatt tcatgggtgt tactaagcat ggtgttgctg ctatcaccac tactaagggt 720 aacgaacact gcttcgttat tctaagaggt ggtaaaaagg gtaccaacta cgacgctaag 780 tccgttgcag aagctaaggc tcaattgcct gccggttcca acggtctaat gattgactac 840 tctcacggta actccaataa ggatttcaga aaccaaccaa aggtcaatga cgttgtttgt 900 gagcaaatcg ctaacggtga aaacgccatt accggtgtca tgattgaatc aaacatcaac 960 gaaggtaacc aaggcatccc agccgaaggt aaagccggct tgaaatatgg tgtttccatc 1020 actgatgctt gtataggttg ggaaactact gaagacgtct tgaggaaatt ggctgctgct 1080 gtcagacaaa gaagagaagt taacaagaaa tag 1113 <210> 112 <211> 1588 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 112 Met Val Gln Leu Ala Lys Val Pro Ile Leu Gly Asn Asp Ile Ile His 1 5 10 15 Val Gly Tyr Asn Ile His Asp His Leu Val Glu Thr Ile Ile Lys His 20 25 30 Cys Pro Ser Ser Thr Tyr Val Ile Cys Asn Asp Thr Asn Leu Ser Lys 35 40 45 Val Pro Tyr Tyr Gln Gln Leu Val Leu Glu Phe Lys Ala Ser Leu Pro 50 55 60 Glu Gly Ser Arg Leu Leu Thr Tyr Val Val Lys Pro Gly Glu Thr Ser 65 70 75 80 Lys Ser Arg Glu Thr Lys Ala Gln Leu Glu Asp Tyr Leu Leu Val Glu 85 90 95 Gly Cys Thr Arg Asp Thr Val Met Val Ala Ile Gly Gly Gly Val Ile 100 105 110 Gly Asp Met Ile Gly Phe Val Ala Ser Thr Phe Met Arg Gly Val Arg 115 120 125 Val Val Gln Val Pro Thr Ser Leu Leu Ala Met Val Asp Ser Ser Ile 130 135 140 Gly Gly Lys Thr Ala Ile Asp Thr Pro Leu Gly Lys Asn Phe Ile Gly 145 150 155 160 Ala Phe Trp Gln Pro Lys Phe Val Leu 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Trp Val Gln His Phe Val Lys Ser Leu Arg Leu 305 310 315 320 Thr Gly Gln Ile Ser Leu Asp Phe Ile Gln Ala Glu Asp Gly Thr Ala 325 330 335 Tyr Ala Ile Glu Cys Asn Pro Arg Thr His Ser Ala Ile Thr Met Phe 340 345 350 Tyr Asn His Pro Gly Val Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Lys Thr Pro Leu 355 360 365 Ala Ala Pro Leu Glu Pro Leu Ala Asp Ser Lys Pro Thr Tyr Trp Ile 370 375 380 Tyr His Glu Ile Trp Arg Leu Thr Gly Ile Arg Ser Gly Gln Gln Leu 385 390 395 400 Gln Thr Trp Phe Gly Arg Leu Val Arg Gly Thr Asp Ala Ile Tyr Arg 405 410 415 Leu Asp Asp Pro Ile Pro Phe Leu Thr Leu His His Trp Gln Ile Thr 420 425 430 Leu Leu Leu Leu Gln Asn Leu Gln Arg Leu Lys Gly Trp Val Lys Ile 435 440 445 Asp Phe Asn Ile Gly Lys Leu Val Glu Leu Gly Gly Asp 450 455 460 <210> 122 <211> 348 <212> PRT <213> Nostoc punctiforme ATCC 29133 <400> 122 Met Pro Val Leu Asn Ile Leu His Leu Val Gly Ser Ala His Asp Lys 1 5 10 15 Phe Tyr Cys Asp Leu Ser Arg Leu Tyr Ala Gln Asp Cys Leu Ala Ala 20 25 30 Thr Ala Asp Pro Ser Leu Tyr Asn Phe Gln Ile Ala Tyr Ile Thr Pro 35 40 45 Asp Arg Gln Trp Arg Phe Pro Asp Ser Leu Ser Arg Glu Asp Ile Ala 50 55 60 Leu Thr Lys Pro Ile Pro Val Phe Asp Ala Ile Gln Phe Leu Thr Gly 65 70 75 80 Gln Asn Ile Asp Met Met Leu Pro Gln Met Phe Cys Ile Pro Gly Met 85 90 95 Thr Gln Tyr Arg Ala Leu Phe Asp Leu Leu Lys Ile Pro Tyr Ile Gly 100 105 110 Asn Thr Pro Asp Ile Met Ala Ile Ala Ala His Lys Ala Arg Ala Lys 115 120 125 Ala Ile Val Glu Ala Ala Gly Val Lys Val Pro Arg Gly Glu Leu Leu 130 135 140 Arg Gln Gly Asp Ile Pro Thr Ile Thr Pro Pro Ala Val Val Lys Pro 145 150 155 160 Val Ser Ser Asp Asn Ser Leu Gly Val Val Leu Val Lys Asp Val Thr 165 170 175 Glu Tyr Asp Ala Ala Leu Lys Lys Ala Phe Glu Tyr Ala Ser Glu Val 180 185 190 Ile Val Glu Ala Phe Ile Glu Leu Gly Arg Glu Val Arg Cys Gly Ile 195 200 205 Ile Val Lys Asp Gly Glu Leu Ile Gly Leu Pro Leu Glu Glu Tyr Leu 210 215 220 Val Asp Pro His Asp Lys Pro Ile Arg Asn Tyr Ala Asp Lys Leu Gln 225 230 235 240 Gln Thr Asp Asp Gly Asp Leu His Leu Thr Ala Lys Asp Asn Ile Lys 245 250 255 Ala Trp Ile Leu Asp Pro Asn Asp Pro Ile Thr Gln Lys Val Gln Gln 260 265 270 Val Ala Lys Arg Cys His Gln Ala Leu Gly Cys Arg His Tyr Ser Leu 275 280 285 Phe Asp Phe Arg Ile Asp Pro Lys Gly Gln Pro Trp Phe Leu Glu Ala 290 295 300 Gly Leu Tyr Cys Ser Phe Ala Pro Lys Ser Val Ile Ser Ser Met Ala 305 310 315 320 Lys Ala Ala Gly Ile Pro Leu Asn Asp Leu Leu Ile Thr Ala Ile Asn 325 330 335 Glu Thr Leu Gly Ser Asn Lys Lys Val Leu Gln Asn 340 345 <210> 123 <211> 680 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae CEN.PK-1D <400> 123 Met Thr Gln Phe Thr Asp Ile Asp Lys Leu Ala Val Ser Thr Ile Arg 1 5 10 15 Ile Leu Ala Val Asp Thr Val Ser Lys Ala Asn Ser Gly His Pro Gly 20 25 30 Ala Pro Leu Gly Met Ala Pro Ala Ala His Val Leu Trp Ser Gln Met 35 40 45 Arg Met Asn Pro Thr Asn Pro Asp Trp Ile Asn Arg Asp Arg Phe Val 50 55 60 Leu Ser Asn Gly His Ala Val Ala Leu Leu Tyr Ser Met Leu His Leu 65 70 75 80 Thr Gly Tyr Asp Leu Ser Ile Glu Asp Leu Lys Gln Phe Arg Gln Leu 85 90 95 Gly Ser Arg Thr Pro Gly His Pro Glu Phe Glu Leu Pro Gly Val Glu 100 105 110 Val Thr Thr Gly Pro Leu Gly Gln Gly Ile Ser Asn Ala Val Gly Met 115 120 125 Ala Met Ala Gln Ala Asn Leu Ala Ala Thr Tyr Asn Lys Pro Gly Phe 130 135 140 Thr Leu Ser Asp Asn Tyr Thr Tyr Val Phe Leu Gly Asp Gly Cys Leu 145 150 155 160 Gln Glu Gly Ile Ser Ser Glu Ala Ser Ser Leu Ala Gly His Leu Lys 165 170 175 Leu Gly Asn Leu Ile Ala Ile Tyr Asp Asp Asn Lys Ile Thr Ile Asp 180 185 190 Gly Ala Thr Ser Ile Ser Phe Asp Glu Asp Val Ala Lys Arg Tyr Glu 195 200 205 Ala Tyr Gly Trp Glu Val Leu Tyr Val Glu Asn Gly Asn Glu Asp Leu 210 215 220 Ala Gly Ile Ala Lys Ala Ile Ala Gln Ala Lys Leu Ser Lys Asp Lys 225 230 235 240 Pro Thr Leu Ile Lys Met Thr Thr Thr Ile Gly Tyr Gly Ser Leu His 245 250 255 Ala Gly Ser His Ser Val His Gly Ala Pro Leu Lys Ala Asp Asp Val 260 265 270 Lys Gln Leu Lys Ser Lys Phe Gly Phe Asn Pro Asp Lys Ser Phe Val 275 280 285 Val Pro Gln Glu Val Tyr Asp His Tyr Gln Lys Thr Ile Leu Lys Pro 290 295 300 Gly Val Glu Ala Asn Asn Lys Trp Asn Lys Leu Phe Ser Glu Tyr Gln 305 310 315 320 Lys Lys Phe Pro Glu Leu Gly Ala Glu Leu Ala Arg Arg Leu Ser Gly 325 330 335 Gln Leu Pro Ala Asn Trp Glu Ser Lys Leu Pro Thr Tyr Thr Ala Lys 340 345 350 Asp Ser Ala Val Ala Thr Arg Lys Leu Ser Glu Thr Val Leu Glu Asp 355 360 365 Val Tyr Asn Gln Leu Pro Glu Leu Ile Gly Gly Ser Ala Asp Leu Thr 370 375 380 Pro Ser Asn Leu Thr Arg Trp Lys Glu Ala Leu Asp Phe Gln Pro Pro 385 390 395 400 Ser Ser Gly Ser Gly Asn Tyr Ser Gly Arg Tyr Ile Arg Tyr Gly Ile 405 410 415 Arg Glu His Ala Met Gly Ala Ile Met Asn Gly Ile Ser Ala Phe Gly 420 425 430 Ala Asn Tyr Lys Pro Tyr Gly Gly Thr Phe Leu Asn Phe Val Ser Tyr 435 440 445 Ala Ala Gly Ala Val Arg Leu Ser Ala Leu Ser Gly His Pro Val Ile 450 455 460 Trp Val Ala Thr His Asp Ser Ile Gly Val Gly Glu Asp Gly Pro Thr 465 470 475 480 His Gln Pro Ile Glu Thr Leu Ala His Phe Arg Ser Leu Pro Asn Ile 485 490 495 Gln Val Trp Arg Pro Ala Asp Gly Asn Glu Val Ser Ala Ala Tyr Lys 500 505 510 Asn Ser Leu Glu Ser Lys His Thr Pro Ser Ile Ile Ala Leu Ser Arg 515 520 525 Gln Asn Leu Pro Gln Leu Glu Gly Ser Ser Ile Glu Ser Ala Ser Lys 530 535 540 Gly Gly Tyr Val Leu Gln Asp Val Ala Asn Pro Asp Ile Ile Leu Val 545 550 555 560 Ala Thr Gly Ser Glu Val Ser Leu Ser Val Glu Ala Ala Lys Thr Leu 565 570 575 Ala Ala Lys Asn Ile Lys Ala Arg Val Val Ser Leu Pro Asp Phe Phe 580 585 590 Thr Phe Asp Lys Gln Pro Leu Glu Tyr Arg Leu Ser Val Leu Pro Asp 595 600 605 Asn Val Pro Ile Met Ser Val Glu Val Leu Ala Thr Thr Cys Trp Gly 610 615 620 Lys Tyr Ala His Gln Ser Phe Gly Ile Asp Arg Phe Gly Ala Ser Gly 625 630 635 640 Lys Ala Pro Glu Val Phe Lys Phe Phe Gly Phe Thr Pro Glu Gly Val 645 650 655 Ala Glu Arg Ala Gln Lys Thr Ile Ala Phe Tyr Lys Gly Asp Lys Leu 660 665 670 Ile Ser Pro Leu Lys Lys Ala Phe 675 680 <210> 124 <211> 370 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae CEN.PK-1D <400> 124 Met Ser Glu Ser Pro Met Phe Ala Ala Asn Gly Met Pro Lys Val Asn 1 5 10 15 Gln Gly Ala Glu Glu Asp Val Arg Ile Leu Gly Tyr Asp Pro Leu Ala 20 25 30 Ser Pro Ala Leu Leu Gln Val Gln Ile Pro Ala Thr Pro Thr Ser Leu 35 40 45 Glu Thr Ala Lys Arg Gly Arg Arg Glu Ala Ile Asp Ile Ile Thr Gly 50 55 60 Lys Asp Asp Arg Val Leu Val Ile Val Gly Pro Cys Ser Ile His Asp 65 70 75 80 Leu Glu Ala Ala Gln Glu Tyr Ala Leu Arg Leu Lys Lys Leu Ser Asp 85 90 95 Glu Leu Lys Gly Asp Leu Ser Ile Ile Met Arg Ala Tyr Leu Glu Lys 100 105 110 Pro Arg Thr Thr Val Gly Trp Lys Gly Leu Ile Asn Asp Pro Asp Val 115 120 125 Asn Asn Thr Phe Asn Ile Asn Lys Gly Leu Gln Ser Ala Arg Gln Leu 130 135 140 Phe Val Asn Leu Thr Asn Ile Gly Leu Pro Ile Gly Ser Glu Met Leu 145 150 155 160 Asp Thr Ile Ser Pro Gln Tyr Leu Ala Asp Leu Val Ser Phe Gly Ala 165 170 175 Ile Gly Ala Arg Thr Thr Glu Ser Gln Leu His Arg Glu Leu Ala Ser 180 185 190 Gly Leu Ser Phe Pro Val Gly Phe Lys Asn Gly Thr Asp Gly Thr Leu 195 200 205 Asn Val Ala Val Asp Ala Cys Gln Ala Ala Ala His Ser His His Phe 210 215 220 Met Gly Val Thr Lys His Gly Val Ala Ala Ile Thr Thr Thr Lys Gly 225 230 235 240 Asn Glu His Cys Phe Val Ile Leu Arg Gly Gly Lys Lys Gly Thr Asn 245 250 255 Tyr Asp Ala Lys Ser Val Ala Glu Ala Lys Ala Gln Leu Pro Ala Gly 260 265 270 Ser Asn Gly Leu Met Ile Asp Tyr Ser His Gly Asn Ser Asn Lys Asp 275 280 285 Phe Arg Asn Gln Pro Lys Val Asn Asp Val Val Cys Glu Gln Ile Ala 290 295 300 Asn Gly Glu Asn Ala Ile Thr Gly Val Met Ile Glu Ser Asn Ile Asn 305 310 315 320 Glu Gly Asn Gln Gly Ile Pro Ala Glu Gly Lys Ala Gly Leu Lys Tyr 325 330 335 Gly Val Ser Ile Thr Asp Ala Cys Ile Gly Trp Glu Thr Thr Glu Asp 340 345 350 Val Leu Arg Lys Leu Ala Ala Ala Val Arg Gln Arg Arg Glu Val Asn 355 360 365 Lys Lys 370

Claims (7)

  1. 2-디하이드로-3-데옥시포스포헵토네이트 알돌라제 (2-dehydro-3-deoxyphosphoheptonate aldolase), 포스포에놀피루베이트 신테타제 (phosphoenolpyruvate synthetase) 및 트랜스케톨라제 (transketolase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 활성이 강화된, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물로서,
    상기 미생물은 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자 클러스터를 추가적으로 포함하고,
    상기 마이코스포린 유사 아미노산은 사이클로헥세논(cyclohexanone) 또는 사이클로헥센이민(cyclohexenimine)의 중심 링을 가지는 화합물인, 미생물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자 클러스터는 2-디메틸 4-데옥시가두솔 신타제 (2-demetyl 4-deoxygadusol synthase), O-메틸트랜스퍼라제 (O-methyltransferase) 및 C-N 리가제 (C-N ligase)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자 클러스터는 논-리보좀 펩티드 신테타제 (non-ribosomal peptide synthetase), 논-리보좀 펩티드 신테타제 유사 효소 (non-ribosomal peptide synthetase-like enzyme: NRPS-like enzyme) 및 D-알라닌 D-알라닌 리가제 (D-Ala D-Ala ligase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 미생물은, 코리네박테리움 속 미생물, 에스케리키아 속 미생물 또는 효모인, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 마이코스포린 유사 아미노산은, 마이코스포린-2-글라이신 (Mycosporine-2-glycine), 팰라이티놀 (Palythinol), 팰라이텐산 (Palythenic acid), 데옥시가두솔 (deoxygadusol), 마이코스포린-메틸아민-트레오닌 (Mycosporine-methylamine-threonine), 마이코스포린-글라이신-발린 (Mycosporine-glycine-valine), 팰라이틴 (Palythine), 아스테리나-330 (Asterina-330), 시노린 (Shinorine), 포르피라-334 (Porphyra-334), 유하로테스-362 (Euhalothece-362), 마이코스포린-글라이신 (Mycosporine-glycine), 마이코스포린-오르니틴 (Mycosporine-ornithine), 마이코스포린-라이신 (Mycosporine-lysine), 마이코스포린-글루탐산-글라이신 (Mycosporine-glutamic acid-glycine), 마이코스포린-메틸아민-세린 (Mycosporine-methylamine-serine), 마이코스포린-타우린 (Mycosporine-taurine), 팰라이텐 (Palythene), 팰라이텐-세린 (Palythine-serine), 팰라이텐-세린-설페이트 (Palythine-serine-sulfate), 팰라이티놀(Palythinol), 및 우수지렌 (Usujirene)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물.
  7. 제1항, 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 마이코스포린 유사 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, 마이코스포린 유사 아미노산의 생산방법.
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