BR112020017078A2 - Microrganismo que produz um aminoácido do tipo micosporina e método para produzir um aminoácido do tipo micosporina usando o mesmo - Google Patents
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Abstract
a presente revelação refere-se a um microrganismo que produz um aminoácido do tipo micosporina e a um método para produzir um aminoácido do tipo micosporina usando o microrganismo. visto que o microrganismo da presente revelação tem uma capacidade de produção de aminoácido do tipo micosporina aumentada, o mesmo pode ser usado de modo eficaz na produção de aminoácidos do tipo micosporina.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “MICRORGANISMO
[001] A presente revelação refere-se a um microrganismo que produz um aminoácido do tipo micosporina, e um método para produzir um aminoácido do tipo micosporina usando o microrganismo.
[002] Os raios ultravioleta (UV) emitidos pelo sol consistem em UVA (com um comprimento de onda de cerca de 320 nm a cerca de 400 nm), UVB (com um comprimento de onda de cerca de 290 nm a cerca de 320 nm), e UVC (com um comprimento de onda de cerca de 100 nm a cerca de 280 nm). Sabe-se que os Raios UVA penetram na camada dérmica, induzem principalmente à pigmentação e envelhecimento da pele, e estão envolvidos na ocorrência de doenças de pele fotossensíveis, enquanto os raios UVB são raios de alta energia que penetram na epiderme e a camada basal da derme e estão envolvidos em queimaduras solares, pigmentação, e ocorrência de câncer de pele.
[003] Para evitar esses efeitos colaterais dos raios UV, foram feitas tentativas para bloquear os raios UV. Os tipos de agentes de proteção solar incluem agentes químicos de proteção solar e agentes físicos de proteção solar. Os agentes químicos de proteção solar evitam a penetração de raios UV principalmente pela absorção dos raios UV, enquanto os agentes físicos de proteção solar evitam a penetração dos raios UV através de reflexão e espalhamento.
[004] Os componentes que são conhecidos por estarem contidos nos agentes químicos de proteção solar podem incluir aqueles que absorvem principalmente os raios UVB (por exemplo, PABA, ésteres de PABA (amil dimetil PABA, octil dimetil PABA), cinamatos (cinoxato), salicilatos (homomentil salicilato), cânfora, etc.); e aqueles que absorvem principalmente os raios UVA (por exemplo, benzofenonas (oxibenzona, dioxibenzona e suliso benzeno), dibenzoilmetano, antranilato, etc.). Embora esses agentes químicos de proteção solar possam fornecer efeitos de absorção e bloqueio de raios UV, sabe-se que alguns desses agentes químicos de proteção solar podem irritar a pele ou olhos, e em particular, PABA, ésteres de PABA, benzofenonas, e cinamatos, etc. podem causar dermatite de contato. Além disso, foi relatado que alguns outros desses agentes químicos de proteção solar causam uma reação fotossensível na pele, etc.
Consequentemente, em alguns países, o uso ou a quantidade de uso desses agentes químicos de proteção solar está sendo limitado.
[005] Os componentes que são conhecidos por estarem contidos nos agentes físicos de proteção solar podem incluir dióxido de titânio, talco (silicato de magnésio), óxido de magnésio, óxido de zinco, caulin, etc. Os agentes físicos de proteção solar têm vantagens por não causarem efeitos colaterais, como dermatite de contato e que não são facilmente removidos pela água. No entanto, eles têm desvantagens porque é difícil para eles manter um conteúdo eficaz enquanto realizam as formulações desejadas e que ocorre um molde branco, etc. quando são aplicados na pele.
[006] Os aminoácidos do tipo micosporinas (MAAs) são materiais presentes em organismos naturais e são conhecidos por absorver UVA e UVB eficazmente. Mais de 35 espécies de MAAs são conhecidas por estarem presentes na natureza (Mar. Biol., 1991, 108: 157 a 166; Planta Med., 2015, 81: 813 a 820). Recentemente, MAAs, aos quais vários tipos de açúcares estão ligados, foram relatados por existir em microalgas e eles têm uma excelente função antioxidante (Journal of Photochemistry e Photobiology, 2015, 142: 154 a 168). Além disso, MAAs são conhecidos por fornecer não apenas uma capacidade de bloquear os raios UV, mas também resistência à oxidação, osmose, estresse por calor, etc.
(Comp. Biochem. Physiol.C Toxicol. Pharmacol., 2007, 146: 60 a 78; J. Photochem. Photobiol. B., 2007, 89: 29 a 35).
[007] No entanto, a quantidade de MAAs produzida dentro das microalgas é muito baixa para estar no nível de vários microgramas, e as condições para separação, extração, e purificação de MAAs após o cultivo de microalgas são complicadas.
Portanto, é difícil produzir em massa o material MAAs.
[008] (Documento não patenteado 1) Comp. Biochem.
Physiol. B 1995, 112: 105 a 114.
[009] (Documento não patenteado 2) FEMS Microbiol Lett.
2007, 269: 1 a 10.
[010] (Documento não patenteado 3) Ann. Rev. Physiol.
2002, 64: 223 a 262.
[011] (Documento não patenteado 4) Mar. Biol. 1991, 108: 157 a 166.
[012] (Documento não patenteado 5) Journal of Photochemistry e Photobiology B: Biology. 2015, 142: 154 a 168
[013] (Documento não patenteado 6) Biol. Rev. 1999, 74: 311 a 345.
[014] (Documento não patenteado 7) Mol. Biol. Evol.
2006, 23: 1437 a 1443.
[015] (Documento não patenteado 8) Science, 2010, 329: 1653 a 1656.
[016] (Documento não patenteado 9) Genomics 2010, 95: 120-128.
[017] (Documento não patenteado 10) Geomicrobiol. J.
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[018] (Documento não patenteado 11) Comp. Biochem.
Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 2007. 146: 60 a 78.
[019] (Documento não patenteado 12) Can. J. Bot. 2003.
81: 131 a 138.
[020] (Documento não patenteado 13) J. Photochem.
Photobiol. B. 2007, 89: 29 a 35.
[021] (Documento não patenteado 14) J. Bacteriol. 2011.
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[022] (Documento não patenteado 15) Planta Med. 2015.
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[023] (Documento não patenteado 16) ACS Appl. Mater.
Interfaces. 2015. 7: 16558 a 16564
[024] (Documento não patenteado 17) Appl Environ Microbiol. 2016, 82(20): 6167 a 6173
[025] (Documento não patenteado 18) ChemBioChem. 2015, 16: 320 a 327
[026] (Documento não patenteado 19) Methods Mol Biol.
2013, 1073: 43 a 7
[027] (Documento não patenteado 20) Nature Review, 2011, 9: 791 a 802
[028] Os presentes inventores fizeram muitos esforços para aumentar a produção de MAAs em microrganismos. Como resultado, eles confirmaram que a produção de MAAs pode ser aumentada em microrganismos que produzem MAAs por meio de vários estudos associados com a intensidade da atividade de 2-desidro- 3-desoxifosfo-heptonato aldolase, fosfoenolpiruvato sintetase e proteínas de transcetolase em microrganismos, completando assim, a presente revelação.
[029] Um objetivo da presente revelação é fornecer um microrganismo que produz um aminoácido do tipo micosporina (MMA), em que uma atividade de pelo menos uma proteína selecionada a partir do grupo que consistem em 2-desidro-3- desoxifosfo-heptonato aldolase, fosfoenolpiruvato sintetase, e a transcetolase é intensificada.
[030] Outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para produzir um aminoácido do tipo micosporina, que inclui cultivar o microrganismo em um meio; e recuperar o aminoácido do tipo micosporina do microrganismo ou meio cultivado.
[031] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer o uso do microrganismo para produzir um aminoácido do tipo micosporina.
[032] Uma vez que o microrganismo da presente revelação tem uma capacidade aumentada de produção de aminoácidos do tipo micosporina (MMA), ele pode ser usado de modo eficaz na produção de aminoácidos do tipo micosporina.
[033] A presente revelação é descrita em detalhes a seguir. Enquanto isso, as respectivas descrições e modalidades reveladas na presente revelação também podem ser aplicadas a outras descrições e modalidades. Ou seja, todas as combinações de vários elementos revelados na presente revelação estão dentro do escopo da presente revelação. Além disso, o escopo da presente revelação não é limitado pela descrição específica abaixo. Além disso, um versado na técnica pode reconhecer ou identificar uma série de equivalentes em relação a determinados aspectos da presente revelação apenas por experimentação de rotina. Ademais, esses equivalentes devem ser incluídos na presente revelação.
[034] Para atingir os objetivos acima, um aspecto da presente revelação fornece um microrganismo que produz um aminoácido do tipo micosporina (MMA), no qual uma atividade de pelo menos uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste 2-desidro-3-desoxifosfo-heptonato aldolase, fosfoenolpiruvato sintetase, e a transcetolase é intensificada.
[035] Conforme usado no presente documento, o termo “2- desidro-3-desoxifosfo-heptonato aldolase” refere-se a uma enzima que catalisa a reação reversível do seguinte esquema de reação, e especificamente, pode se referir a uma enzima que sintetiza 3- desoxi-D-arabino-heptulosonato -7-fosfato (DAHP), mas não está limitada a isso.
ESQUEMA DE REAÇÃO fosfoenolpiruvato + D-eritrose-4-fosfato + H2O 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato + fosfato
[036] Na presente revelação, 2-desidro-3-desoxifosfo- heptonato aldolase pode ser usada de forma intercambiável com 3- desoxi-D-arabino-heptulosonato -7-fosfato (DAHP) sintase.
[037] Conforme usado no presente documento, o termo “fosfoenolpiruvato sintetase” refere-se a uma enzima que catalisa a reação reversível do seguinte esquema de reação, e especificamente, pode se referir a uma enzima que sintetiza fosfoenolpiruvato, mas não está limitada a ela.
ESQUEMA DE REAÇÃO ATP + piruvato + H2O AMP + fosfoenolpiruvato + fosfato
[038] Conforme usado no presente documento, o termo “transcetolase” refere-se a uma enzima que catalisa a reação reversível do seguinte esquema de reação.
ESQUEMA DE REAÇÃO sedoheptulose 7-fosfato + D-gliceraldeído 3-fosfato D-ribose 5-fosfato + D-xilulose 5-fosfato ou frutose 6-fosfato + D-gliceraldeído 3-fosfato eritrose 4-fosfato + D-xilulose 5-fosfato
[039] A informação genética da 2-desidro-3-desoxifosfo- heptonato aldolase, fosfoenolpiruvato sintetase, e a transcetolase pode ser obtida a partir de banco de dados conhecido (por exemplo, GenBank database of the National Center for Biotechnology Information (NCBI), etc.), mas não está limitado a isso.
[040] A 2-desidro-3-desoxifosfo-heptonato aldolase, fosfoenolpiruvato sintetase, e a transcetolase não estão limitadas às suas origens ou sequências porque há casos em que as proteínas que mostram as atividades diferem em suas sequências de sequências de aminoácidos dependendo da espécie de um microrganismo ou do próprio microrganismo.
[041] Especificamente, a 2-desidro-3-desoxifosfo- heptonato aldolase pode ser uma proteína que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 37, ou 124; a fosfoenolpiruvato sintetase pode ser uma proteína que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 ou 98; e a transcetolase pode ser uma proteína que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, 96, ou 123, mas as sequências de aminoácidos dessas proteínas não estão limitadas a elas. Conforme usado no presente documento, o termo “uma proteína que inclui uma sequência de aminoácidos” pode ser usado de forma intercambiável com a expressão de “uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos” ou “uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos”.
[042] Além disso, na presente revelação, essas enzimas podem incluir aquelas proteínas que têm as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS descritas acima, bem como 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais de homologia ou de identidade com as sequências de aminoácidos, desde que essas proteínas tenham uma atividade biológica idêntica ou correspondente a cada uma dessas enzimas.
[043] Além disso, é evidente que qualquer proteína que tem uma sequência de aminoácidos com deleção, modificação,
substituição, ou adição em parte da sequência também pode ser incluída no escopo da presente revelação, desde que a sequência de aminoácidos tenha uma homologia ou identidade com a SEQ ID NOS descrita acima e tenha uma atividade biológica substancialmente idêntica ou correspondente às proteínas enzimáticas da SEQ ID NOS descritas acima.
[044] Conforme usado no presente documento, o termo “homologia ou identidade” refere-se a um grau de correspondência entre as determinadas sequências de aminoácidos ou sequências de nucleotídeos e pode ser expresso por uma porcentagem. Na presente revelação, uma sequência homóloga que tem uma atividade idêntica ou semelhante a uma determinada sequência de aminoácidos ou nucleotídeos é representada como “% de homologia” ou “% de identidade”. Por exemplo, homologia pode ser confirmada usando software padrão, especificamente BLAST 2.0, para calcular parâmetros como pontuação, identidade, e similaridade ou por comparação de sequências por hibridização Southern sob condições rigorosas definidas. As condições de hibridização adequadas definidas podem estar dentro do escopo da técnica e ser determinadas por um método bem conhecido dos versados na técnica (por exemplo, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York). O termo “condições rigorosas” refere-se a condições que permitem a hibridização especifica entre polinucleotídeos. Por exemplo, tais condições são are especificamente reveladas na literatura (por exemplo, J. Sambrook et al., supra).
[045] A 2-desidro-3-desoxifosfo-heptonato aldolase, fosfoenolpiruvato sintetase, e a transcetolase da presente revelação podem incluir os polinucleotídeos que codificam proteínas que têm as sequências de aminoácidos da SEQ ID NOS descrita acima, ou 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais de homologia ou de identidade com as sequências de aminoácidos da SEQ ID NOS descrita acima, desde que esses polinucleotídeos tenham uma atividade biológica idêntica ou correspondente a cada uma dessas enzimas.
[046] Além disso, considerando os códons preferidos em um organismo, onde a proteína deve ser expressa, devido à degenerescência do códon, várias modificações podem ser realizadas na região de codificação da sequência de nucleotídeos dentro do escopo não alterando a sequência de aminoácidos da proteína a ser expressa a partir da região de codificação.
Portanto, qualquer polinucleotídeo que tem uma sequência que codifica cada uma das proteínas enzimáticas pode ser incluído sem limitação.
[047] Além disso, qualquer sequência que codifica uma proteína que tem uma atividade de 2-desidro-3-desoxifosfo-
heptonato aldolase, fosfoenolpiruvato sintetase, ou proteínas da enzima transcetolase por hibridização com qualquer sonda que pode ser preparada a partir de sequências de genes conhecidas (por exemplo, sequências complementares para todas ou parte da sequência de polinucleotídeos acima) sob condições rigorosas, podem ser incluídos com limitação.
[048] O termo “condições rigorosas” refere-se a condições que permitem a hibridização entre polinucleotídeos.
Essas condições são especificamente descritas em uma literatura (por exemplo, J Sambrook et al., supra). Por exemplo, a condição para uma hibridização entre genes que tem uma alta homologia ou identidade, uma homologia ou identidade de 40% ou mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente 95% ou mais, ainda mais especificamente 97% ou mais, e mais especificamente 99% ou mais, sem uma hibridização entre genes que tem uma homologia ou identidade inferior às homologias ou identidades descritas acima; ou condição de lavagem convencional para hibridização Southern, isto é, lavar uma vez, especificamente, duas ou três vezes a uma concentração de sal e temperatura correspondente a 60°C, 1×SSC, 0,1% SDS, especificamente 60°C, 0,1×SSC, 0,1% SDS, e mais especificamente 68°C, 0,1×SSC, 0,1% SDS, podem ser listados.
[049] A hibridização requer que dois polinucleotídeos tenham sequências complementares, embora incompatibilidade entre bases sejam possíveis dependendo do rigor da hibridização. O termo “complementar” é usado para descrever a relação entre as bases de nucleotídeos que podem hibridizar umas com as outras.
Por exemplo, em relação ao DNA, a adenosina é complementar à timina, e a citosina é complementar à guanina. Consequentemente, a presente revelação também pode incluir fragmentos polinucleotídicos isolados complementares à sequência inteira, bem como sequências polinucleotídicas substancialmente semelhantes.
[050] Especificamente, os polinucleotídeos com uma homologia ou identidade podem ser detectados usando condições de hibridização que incluem uma etapa de hibridização a um valor de Tm de 55°C e usando as condições descritas acima. Além disso, o valor de Tm pode ser de 60°C, 63°C, ou 65°C, mas a temperatura não é limitada aos mesmos e pode ser adequadamente ajustada por aqueles versados na técnica de acordo com o propósito.
[051] O rigor adequado para a hibridização de polinucleotídeos depende do comprimento e do grau de complementaridade dos polinucleotídeos, e as variáveis são bem conhecidas na técnica (consultar Sambrook et al., supra, 9.50 a
9.51 e 11.7 a 11.8). Conforme usado no presente documento, o termo “intensidade da atividade” significa que uma atividade de uma proteína enzimática é introduzida, ou a atividade é intensificada em comparação com sua atividade endógena ou a atividade antes de sua modificação na qual um microrganismo possui. A “introdução” de um atividade significa que um microrganismo exibe natural ou artificialmente a atividade de uma proteína particular que não era originalmente possuída no microrganismo. Especificamente, um microrganismo com uma atividade intensificada de uma proteína enzimática refere-se a um microrganismo no qual a atividade de uma proteína enzimática é intensificada em comparação com a de um microrganismo natural do tipo selvagem ou microrganismo não modificado. A intensidade de uma atividade pode incluir, por exemplo, tanto a intensidade de uma atividade através da introdução de uma 2-desidro-3- desoxifosfo-heptonato aldolase, fosfoenolpiruvato sintetase, e/ou transcetolase exógena em um microrganismo; ou a intensidade da atividade da 2-desidro-3-desoxifosfo-heptonato aldolase, fosfoenolpiruvato sintetase, e/ou transcetolase endógena.
[052] Especificamente, na presente revelação, o método para a intensidade de uma atividade pode incluir: (1) um método para aumentar o número de cópias dos polinucleotídeos que codificam as enzimas; (2) um método para modificar a sequência de controle de expressão para o aumento da expressão dos polinucleotídeos; (3) um método para modificar a sequência de polinucleotídeos no cromossomo para a intensidade das atividades das enzimas; ou (4) um método para modificar a intensidade por uma combinação dos métodos acima (1) a (3), etc., mas os métodos não estão limitados aos mesmos.
[053] O método (1) de aumento o número de cópias dos polinucleotídeos pode ser realizado em uma forma em que o polinucleotídeo está operacionalmente ligado a um vetor ou ao inserir o polinucleotídeo no cromossomo de uma célula hospedeira, mas o método não é particularmente limitado a ele.
Além disso, como uma alternativa, o número de cópias pode ser aumentado ao introduzir um polinucleotídeo exógeno exibindo a atividade de uma enzima ou um polinucleotídeo modificado com códon otimizado do polinucleotídeo acima em uma célula hospedeira. O polinucleotídeo exógeno pode ser usado sem limitação em sua origem ou sequência, desde que o polinucleotídeo exiba uma atividade idêntica ou semelhante à da enzima. A introdução pode ser realizada por aqueles versados na técnica selecionando apropriadamente um método de transformação conhecido, e a atividade da enzima pode ser intensificada de modo que o polinucleotídeo introduzido seja expresso na célula hospedeira, produzindo assim, a enzima.
[054] Em seguida, o método (2) para modificar a sequência de controle de expressão para o aumento da expressão dos polinucleotídeos pode ser realizado ao introduzir uma modificação na sequência por deleção, inserção, substituição não conservativa ou conservativa, ou uma combinação das mesmas, de modo a intensificar ainda mais a atividade da sequência de controle de expressão; ou ao substituir a sequência de ácido nucléico por uma sequência de ácido nucléico com uma atividade mais forte, mas o método não é particularmente limitada a isso.
A sequência de controle de expressão pode incluir um promotor, uma sequência de operador, uma sequência que codifica um local de ligação ao ribossomo, sequências que controlam a terminação da transcrição e tradução, etc., mas a sequência de controle de expressão não é particularmente limitada a eles.
[055] Especificamente, um promotor heterólogo forte em vez do promotor original pode ser ligado a montante da unidade de expressão de polinucleotídeo, e exemplos do promotor forte podem incluir um promotor CJ7, um promotor lysCP1, um promotor EF-Tu, um promotor groEL, um promotor aceA ou aceB, etc. Mais especificamente, a unidade de expressão de polinucleotídeo pode ser operacionalmente ligada a um promotor derivado de Corynebacterium, como o promotor lysCP1 (WO 2009/096689), um promotor CJ7 (WO 2006/065095), um SPL promotor (KR 10-1783170 B), ou um promotor o2 (KR 10-1632642 B) de modo a intensificar a taxa de expressão do polinucleotídeo que codifica a enzima, mas o método não está limitado aos mesmos.
[056] Além disso, o método (3) para modificar a sequência de polinucleotídeos no cromossomo pode ser realizado ao induzir uma modificação na sequência de controle de expressão por deleção, inserção, substituição não conservativa ou conservativa, ou uma combinação dos mesmos, de modo a intensificar ainda mais a atividade da sequência de polinucleotídeos; ou substituindo a sequência de ácido nucléico por uma sequência de polinucleotídeos intensificada com uma atividade mais forte, mas o método não é particularmente limitado a isso.
[057] Por último, o método (4) para modificar a intensidade por uma combinação dos métodos (1) a (3) pode ser realizado ao aplicar um ou mais métodos juntos entre os métodos: um método para aumentar o número de cópias dos polinucleotídeos que codificam as enzimas; um método para modificar a sequência de controle de expressão para o aumento da expressão; e um método para modificar as sequências de polinucleotídeos no cromossomo, ou um método para modificar os polinucleotídeos exógenos que exibem a atividade da enzima ou um polinucleotídeo modificado com códon otimizado do mesmo.
[058] Os polinucleotídeos podem ser descritos como genes quando eles são um conjunto de polinucleotídeos capazes de funcionar. Na presente revelação, os polinucleotídeos e genes podem ser usados de forma intercambiável, e sequências de polinucleotídeos e sequências de nucleotídeos podem ser usadas de forma intercambiável.
[059] Conforme usado no presente documento, o termo “vetor” se refere a uma construção de DNA que inclui uma sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo, na qual a proteína alvo está operacionalmente ligada a uma sequência de controle adequada, de modo que possa ser expressa em um hospedeiro apropriado. A sequência de controle pode incluir um promotor capaz de iniciar a transcrição, qualquer sequência de operador para controlar a transcrição, uma sequência que codifica um local de ligação ao ribossomo de mRNA apropriado, e sequências para controlar a terminação da transcrição e tradução. O vetor, após ser transformado em uma célula hospedeira adequada, pode ser replicado ou funcionar independentemente do genoma do hospedeiro, ou pode ser integrado no próprio genoma do hospedeiro.
[060] O vetor usado na presente revelação não é particularmente limitado, desde que o vetor possa ser replicado em uma célula hospedeira, e qualquer vetor conhecido na técnica possa ser usado. Os exemplos de vetores convencionais podem incluir um plasmídeo natural ou recombinante, cosmídeo, vírus, e bacteriófago. Por exemplo, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, e Charon21A, etc. podem ser usados como um vetor de fago ou vetor cosmídeo; e pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, e pET, etc. podem ser usados como um vetor plasmídeo. Especificamente, vetores como pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pSKH, pRS-413, pRS-414, e pRS-415, etc. podem ser usados, mas os vetores não são limitados a isso.
[061] Os vetores a serem usados na presente revelação não são particularmente limitados, mas qualquer vetor de expressão conhecido pode ser usado. Além disso, um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo no cromossomo pode ser inserido no cromossomo com um vetor para inserção cromossômica em uma célula. A inserção de um polinucleotídeo no cromossomo pode ser realizada usando qualquer método conhecido na técnica (por exemplo, por recombinação homóloga), mas o método de inserção não está limitado ao mesmo. Uma marcador de seleção para confirmar a inserção no cromossomo pode ser incluída posteriormente. O marcador de seleção é usado para a seleção de células transformadas com um vetor (isto é, para confirmar se uma molécula de ácido nucleico alvo foi inserida) e marcadores capazes de fornecer fenótipos selecionáveis (por exemplo, resistência a fármacos, auxotrofia, resistência a agentes citotóxicos, e expressão de proteínas de superfície) podem ser usados. Nas circunstâncias em que os agentes seletivos são tratados, apenas as células capazes de expressar os marcadores podem sobreviver ou expressar outras características fenotípicas e, assim, as células transformadas podem ser facilmente selecionadas.
[062] Conforme usado no presente documento, o termo “transformação” se refere à introdução de um vetor que inclui um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo em uma célula hospedeira de modo que a proteína codificada pelo polinucleotídeo possa ser expressa na célula hospedeira. O polinucleotídeo transformado pode não ser particularmente limitado, desde que possa ser expresso em uma célula hospedeira, independentemente de se o polinucleotídeo transformado é inserido no cromossomo da célula hospedeira para estar localizado no mesmo ou localizado fora do cromossomo.
Além disso,
o polinucleotídeo inclui DNA e RNA que codificam uma proteína alvo.
Desde que o polinucleotídeo possa ser introduzido em uma célula hospedeira e expresso na mesmas, não importa em que forma o polinucleotídeo é introduzido.
Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira na forma de uma cassete de expressão, que é uma construção de gene que inclui todos os elementos essenciais para a auto expressão.
O cassete de expressão pode incluir um promotor, que é convencionalmente operacionalmente ligado ao polinucleotídeo, um sinal de terminação da transcrição, um local de ligação ao ribossomo, e um sinal de terminação de tradução.
O cassete de expressão pode ser um vetor de expressão auto replicável.
Além disso, o polinucleotídeo pode ser aquele que é introduzido em uma célula hospedeira como um polinucleotídeo e ligado a uma sequência necessária para ser expressa em uma célula hospedeira, mas não está limitado a isso.
Os métodos para transformação incluem qualquer método para introduzir um ácido nucleico em uma célula,
e podem ser realizados ao selecionar uma técnica padrão adequada conhecida dependendo de uma célula hospedeira.
Por exemplo, os métodos de transformação incluem eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio (CaPO4), precipitação de cloreto de cálcio
(CaCl2), micro injeção, método de polietilenoglicol (PEG), método de EAE-dextrano, método de lipossoma catiônico, método de acetato de lítio-DMSO, etc., mas os métodos não estão limitados aos mesmos.
[063] Além disso, conforme usado no presente documento, o termo “operacionalmente ligado” significa uma ligação funcional entre uma sequência promotora que inicia e medeia a transcrição do polinucleotídeo que codifica a proteína alvo da presente revelação e a sequência de polinucleotídeos. Uma ligação operável pode ser preparada por uma recombinação genética conhecida na técnica, e a clivagem e ligação de DNA específicas do local podem ser preparadas usando uma enzima de restrição, uma ligase, etc., conhecida na técnica, sem estar limitado a ela.
[064] No microrganismo da presente revelação, a atividade da 3-desidroquinato desidratase pode ser adicionalmente inativada.
[065] Conforme usado no presente documento, o termo “3- desidroquinato desidratase” refere-se a uma enzima que catalisa a reação reversível no esquema de reação abaixo e, especificamente, pode converter 3-desidroquinato a 3- desidroquinimato, mas não está limitado a isso.
ESQUEMA DE REAÇÃO 3-desidroquinato 3-desidroquinimato + H2O
[066] A 3-desidroquinato desidratase não se limita à sua origem ou sequência, pois há casos em que as proteínas que mostram a atividade da 3-desidroquinato desidratase diferem em suas sequências de aminoácidos dependendo da espécie de um microrganismo ou do microrganismo. Especificamente, a 3- desidroquinato desidratase pode ser uma proteína incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90, mas não está limitada a ela. Além disso, a 3-desidroquinato desidratase pode incluir uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90 ou uma sequência de aminoácidos que tem uma homologia ou identidade de pelo menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% para SEQ ID NO: 90. Além disso, é evidente que qualquer sequência de aminoácidos com deleção, modificação, substituição, ou adição em parte da sequência também pode ser incluída dentro do escopo da presente revelação, desde que a sequência de aminoácidos tenha a homologia ou identidade descrita acima e tenha uma atividade biológica idêntica ou correspondente à proteína acima.
[067] Conforme usado no presente documento, o termo “inativação” refere-se a um caso em que a atividade de uma proteína enzimática é enfraquecida em comparação com a atividade endógena da proteína enzimática ou sua atividade antes da modificação originalmente possuída por um microrganismo; um caso em que a proteína não é expressa; ou um caso em que a proteína é expressa, mas não tem atividade. A inativação é um conceito que inclui: um caso onde a atividade de uma enzima é enfraquecida em comparação com sua atividade endógena possuída por um microrganismo devido à uma modificação do polinucleotídeo que codifica a enzima, etc. ou a atividade é removida; um caso onde o grau de atividade intracelular geral de uma enzima é menor em comparação com o do seu microrganismo do tipo selvagem ou a atividade é removida, devido à inibição da expressão ou tradução do gene que codifica a enzima, etc.; um caso em que toda ou parte do gene que codifica a enzima é deletada; e uma combinação dos mesmos, mas a inativação não está limitada aos mesmos. Ou seja, um microrganismo no qual a atividade de uma enzima é inativada refere-se a um microrganismo no qual a atividade de uma proteína enzimática é menor em comparação com a de seu microrganismo do tipo selvagem natural ou microrganismo modificado ou no qual a atividade é removida.
[068] A inativação da atividade de uma enzima pode ser alcançada pela aplicação de vários métodos conhecidos na técnica. Os exemplos dos métodos acima podem incluir: 1) um método de deleção de todo ou parte do gene que codifica a enzima no cromossomo; 2) um método para modificar a sequência de controle de expressão para reduzir a expressão do gene que codifica a proteína no cromossomo; 3) um método para modificar a sequência do gene que codifica a proteína no cromossomo de modo que a atividade da proteína seja removida ou enfraquecida; 4) um método para introduzir um oligonucleotídeo de antisense (por exemplo, RNA antisense), que se liga complementarmente a um transcrito do gene que codifica a proteína no cromossomo; 5) um método para tornar a ligação de um ribossomo impossível por uma estrutura secundária formada pela adição de uma sequência, que é complementar à sequência Shine-Dalgarno (SD), na extremidade frontal da sequência SD do gene que codifica a proteína no cromossomo; 6) um método de engenharia de transcrição reversa (RTE), em que um promotor que é transcrito reversamente é adicionado ao terminal 3' da estrutura de leitura aberta (ORF) da sequência de polinucleotídeos que codifica a proteína, etc.; e a inativação pode ser alcançada por uma combinação dos mesmos, mas os métodos não são particularmente limitados a ela.
[069] O método de deletar todo ou parte do gene que codifica a enzima no cromossomo pode ser realizado ao substituir o polinucleotídeo que codifica a proteína alvo endógena dentro do cromossomo com um polinucleotídeo ou gene marcador que tem uma sequência de nucleotídeos parcialmente deletada usando um vetor para inserção cromossômica. Como um do método para deletar todo ou parte de um polinucleotídeo, um método para deletar um polinucleotídeo por recombinação homóloga pode ser usado, mas o método não está limitado ao mesmo.
[070] O método para modificar a sequência de controle de expressão pode ser realizado induzindo a modificação da sequência de ácido nucléico na sequência de controle de expressão por meio de deleção, inserção, substituição conservativa ou não conservativa, ou uma combinação das mesmas, de modo a enfraquecer adicionalmente a atividade da sequência de controle de expressão; ou ao substituir a sequência de ácido nucléico com uma sequência de ácido nucléico com uma atividade mais fraca. A sequência de controle de expressão pode incluir um promotor, uma sequência de operador, uma sequência que codifica um local de ligação ao ribossomo, e uma sequência para regular a transcrição e tradução, mas não está limitado a isso.
[071] O método para modificar uma sequência de gene no cromossomo pode ser realizado ao induzir uma modificação na sequência de gene por meio de deleção, inserção, substituição conservativa ou não conservativa, ou uma combinação das mesmas, de modo a enfraquecer ainda mais a atividade da enzima; ou ao substituir a sequência de gene por uma sequência de gene modificada para ter uma atividade mais fraca ou uma sequência de gene modificada para não ter nenhuma atividade, mas o método não está limitado a isso.
[072] No acima, o termo “parte”, embora o que se refere possa variar dependendo dos tipos de polinucleotídeo, pode ser especificamente de 1 nucleotídeo a 300 nucleotídeos, mais especificamente de 1 nucleotídeo a 100 nucleotídeos, e ainda mais especificamente de 1 nucleotídeo a 50 nucleotídeos, mas não está particularmente limitado a isso.
[073] No microrganismo da presente revelação, a atividade da proteína 3-desidroquinato sintase pode ser adicionalmente fortalecida em comparação com a de um microrganismo não modificado.
[074] A 3-desidroquinato sintase refere-se a uma enzima que catalisa a reação reversível do seguinte esquema de reação, e especificamente pode sintetizar 3-desidroquinato (3-DHQ), mas não está limitado a ela.
ESQUEMA DE REAÇÃO 3-desoxi-arabino-heptulosonato-7-fosfato 3-desidroquinato + fosfato
[075] Conforme usado no presente documento, o termo “aminoácido do tipo micosporina (MAA)” refere-se a um composto cíclico que absorve raios ultravioleta (UV). Na presente revelação, o aminoácido do tipo micosporina não é limitado, desde que possa absorver os raios UV, e especificamente, pode ser um composto que tem o anel central de cicloexanona ou ciclohexenimina; ou pode ser um composto em que vários materiais (por exemplo, aminoácidos, etc.) estão ligados ao anel central, e mais especificamente, pode ser micosporina-2-glicina, palitinol, ácido palitênico, desoxigadusol, micosporina- metilamina-treonina, micosporina-glicina-valina, palitina, asterina-330, shinorina, porfira-334, euhalotece-362, micosporina-glicina, micosporina-ornitina, micosporina-lisina, micosporina-ácido glutâmico-glicina, micosporina-metil-serina taurina, micosporina-taurina, paliteno, palitina-serina, palitina-serina-sulfato, palitinol, usujirene, ou uma combinação dos mesmos.
[076] Na presente revelação, o termo aminoácido do tipo micosporina pode ser usado de forma intercambiável com MAA e MAAs.
[077] Conforme usado no presente documento, o termo
“microrganismo que produz um aminoácido do tipo micosporina (MAA)” pode referir-se a um microrganismo que inclui um gene de uma enzima envolvida na biossíntese de MAA ou um agrupamento desses genes, ou um microrganismo no qual o agrupamento é introduzido ou intensificado. Além disso, conforme usado no presente documento, o termo “agrupamento de gene da biossíntese de aminoácido do tipo micosporina (MAA)” pode se referir a um grupo de genes que codifica as enzimas envolvidas na biossíntese MAA, e especificamente, pode incluir um gene de biossíntese MAA, um gene de uma enzima que tem uma atividade de anexar um resíduo de aminoácido ao MAA, ou um agrupamento dos genes acima. O gene de biossíntese de MAA inclui tanto os genes exógenos e/ou genes endógenos de um microrganismo, desde que o microrganismo que inclui esse gene possa produzir MAA. Os genes exógenos podem ser homogêneos ou heterogêneos.
[078] As espécies dos microrganismos das quais o gene de biossíntese de MAA é derivado não são limitadas, desde que os microrganismos que incluem os mesmos possam produzir enzimas envolvidas na biossíntese de MAA e, consequentemente, possa produzir MAA. Especificamente, as espécies dos microrganismos dos quais o gene de biossíntese de MAA é derivado podem ser cianobactérias (por exemplo, Anabaena variabilis, Nostoc punctiforme, Nodularia spumigena, Cyanothece sp. PCC 7424, Lyngbya sp. PCC 8106, Microcystis aeruginosa, Microcoleus chthonoplastes, Cyanothece sp. ATCC 51142, Crocosphaera watsonii, Cyanothece sp. CCY 0110, Cylindrospermum stagnale sp.
PCC 7417, Aphanothece halophytica, ou Trichodesmium erythraeum); fungos (por exemplo, Magnaporthe orzyae, Pyrenophora tritici- repentis, Aspergillus clavatus, Nectria haematococca, Aspergillus nidulans, Gibberella zeae, Verticillium albo-atrum, Botryotinia fuckeliana, ou Phaeosphaeria nodorum); ou Nematostella vectensis; Heterocapsa triquetra, Oxyrrhis marina, Karlodinium micrum, Actinosynnema mirum, etc., mas não está limitado a eles.
[079] De acordo com uma modalidade, o microrganismo da presente revelação, que produz MAA, inclui um gene de biossíntese de MAA ou um agrupamento do mesmo. Especificamente, no microrganismo, um agrupamento de gene de biossíntese de MAA pode ser introduzido ou as atividades das proteínas codificadas pelos genes podem ser intensificadas em comparação com as atividades endógenas ou as atividades antes da modificação, mas o microrganismo não está limitado a elas.
[080] Além disso, embora o gene de biossíntese de MAA não esteja limitado em seus nomes de enzimas ou os microrganismos dos quais esses genes são derivados, desde que os microrganismos possam produzir MAA, o gene de biossíntese de MAA pode incluir um gene que codifica uma proteína enzimática com uma atividade idêntica e/ou semelhante a um ou mais, especificamente, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, ou todas as proteínas enzimáticas selecionadas a partir do grupo que consiste em 2-
desmetil 4-desoxigadusol sintase, O-metiltransferase e uma CN ligase.
[081] Por exemplo, o 2-desmetil 4-desoxigadusol sintase é uma enzima que converte sedo-heptulose-7-fosfato em 2-demetil- 4-desoxigadusol. O O-metiltransferase é uma enzima que converte 2-demetil-4-desoxigadusol em 4-desoxigadusol, e glicilação do 4- desoxigadusol é catalisada pela C-N ligase.
[082] Além disso, o microrganismo que produz MAAs pode incluir um gene de uma enzima, que tem uma atividade de anexar um aminoácido adicional residual ao MAA, ou um agrupamento dos genes. Embora o gene acima ou um agrupamento dos genes não sejam limitados em seus nomes das enzimas ou os microrganismos dos quais esses genes são derivados, desde que os microrganismos que produzem MAAs possam produzir MAAs aos quais dois ou mais resíduos de aminoácidos estão ligados. Os microrganismos que produzem MAAs podem incluir o gene que codifica a proteína enzimática que tem uma atividade idêntica e/ou semelhante a um ou mais, especificamente, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, ou todas as proteínas enzimáticas, selecionadas a partir do grupo que consiste em peptídeo sintetase não ribossomal (NRPS), uma enzima semelhante a peptídeo sintetase não ribossomal (enzima semelhante a NPRS), e D-alanina D-alanina ligase (D-Ala D-Ala ligase; DDL).
[083] Alguns dos MAAs incluem um segundo aminoácido residual em um micosporina-glicina. A uma ou mais enzimas, que são selecionadas a partir do grupo que consiste em peptídeo sintetase não ribossomal, uma enzima semelhante a peptídeo sintetase não ribossomal, e D-Ala D-Ala ligase, podem anexar um segundo aminoácido residual a uma micosporina-glicina.
[084] De acordo com uma modalidade, o microrganismo que produz MAAs pode incluir, sem limitação aos nomes de enzima ou às espécies dos microrganismos dos quais os genes de biossíntese de MAAs são derivados, enzimas desde que tenham uma atividade capaz de anexar um segundo aminoácido a uma micosporina-glicina, como no peptídeo sintetase não ribossomal, enzima semelhante a peptídeo sintetase não ribossomal, e D-Ala D-Ala ligase.
[085] Por exemplo, a enzima semelhante a peptídeo sintetase não ribossomal (Ava_3855) em Anabaena variabilis ou D- Ala D-Ala ligase (NpF5597) em Nostoc punctiforme pode anexar um resíduo de serina a micosporina-glicina para forma uma shinorina. Em outro exemplo, micosporina-2-glicina pode ser formada pela ligação de um segundo resíduo de glicina pelo homólogo de D-Ala D-Ala ligase (Ap_3855) em Aphanothece halophytica. Da mesma forma, em Actinosynnema mirum, serina ou alanina podem ser ligados por D-Ala D-Ala ligase e, assim, shinorina ou micosporina-glicina-alanina podem ser formados. O microrganismo de acordo com uma modalidade da presente revelação pode selecionar e incluir aquelas enzimas que são adequada para a produção de MAAs desejados entre as enzimas com atividades idênticas e/ou semelhantes às enzimas descritas acima.
[086] A 2-desmetil 4-desoxigadusol sintase, O-
metiltransferase, uma C-N ligase, peptídeo sintetase não ribossomal, enzima semelhante a peptídeo sintetase não ribossomal, e/ou D-Ala D-Ala ligase que pode ser usada na presente revelação não estão limitados às espécies de microrganismos dos quais essas enzimas são derivadas, desde que essas enzimas sejam conhecidas por serem capazes de desempenhar as funções e papéis idênticos e/ou semelhantes aos das enzimas descritas acima, e a faixa de homologia ou valores de identidade entre eles também não é limitado.
Por exemplo, MylA, MylB, MylD,
MylE, e MylC de C. stagnale PCC 7417 são homólogos com a 2-
desmetil 4-desoxigadusol sintase, O-metiltransferase, uma C-N ligase, e uma D-Ala D-Ala ligase derivada de Anabaena variabilis e Nostoc punctiforme, e o grau de similaridade entres eles está em uma faixa de cerca de 61% a cerca de 88% (Appl Environ
Microbiol, 2016, 82(20), 6167 a 6173; J Bacteriol, 2011, 193(21),
5923 a 5928). Ou seja, as enzimas que podem ser usadas na presente revelação não são significativamente limitadas nas espécies das quais as enzimas são derivadas, homologia de sequência, ou identidade de sequência, desde que sejam conhecidas por exibir funções e efeitos idênticos e/ou semelhantes.
Além disso, os documentos não relacionados a patentes descritos em Documentos da Técnica Anterior são incluídos em sua totalidade como uma referência à presente revelação como um todo.
[087] Além disso, o gene de biossíntese de MAA pode ser um polinucleotídeo que codifica a proteína que inclui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, ou 122, mas o gene de biossíntese de MAA não está limitado a ele.
[088] Além disso, o gene de biossíntese de MAA pode incluir uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína que inclui a sequência de aminoácidos que tem 50%, 60%, ou 70% ou mais, especificamente 80% ou mais, mais especificamente 90% ou mais, ainda mais especificamente 95% ou mais, e mais especificamente 99% ou mais de homologia ou de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, ou 122, e pode incluir sem limitação uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína que está fora da faixa da homologia ou identidade acima, desde que o microrganismo possa produzir MMA. Especificamente, o gene de biossíntese de MAA pode incluir uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, ou 109, mas não está limitado a ela.
[089] Além disso, é evidente que qualquer sequência de aminoácidos com deleção, modificação, substituição, ou adição em parte da sequência também pode ser incluída na presente revelação, desde que a sequência de aminoácidos tenha uma homologia ou identidade com as sequências acima e substancialmente tenha uma atividade biológica idêntica ou correspondente às proteínas da SEQ ID NOS descrita acima.
[090] Além disso, considerando os códons preferidos em um organismo, onde a proteína deve ser expressa, devido à degenerescência do códon, várias modificações podem ser realizadas na região de codificação da sequência de nucleotídeos dentro do escopo não alterando a sequência de aminoácidos da proteína a ser expressada a partir da região de codificação.
Portanto, no que diz respeito ao gene de biossíntese de MAA, qualquer sequência de nucleotídeos pode ser incluída na presente revelação sem limitação, desde que a sequência de nucleotídeos seja uma sequência de nucleotídeos, que codifica uma proteína envolvida na biossíntese de MAA.
[091] Alternativa, qualquer sequência que codifica uma proteína envolvida na biossíntese de MAA, por hibridização com qualquer sonda que pode ser preparada a partir de sequência de genes (por exemplo, complementares para toda ou parte da sequência de polinucleotídeos) sob condições rigorosas, pode ser incluída na presente revelação sem limitação.
[092] De acordo com uma modalidade, um microrganismo que produz MAA pode incluir genes de biossíntese de MAAs que têm origens diferentes.
[093] Na presente revelação, a intensidade da atividade de uma proteína e/ou a introdução de genes pode ser realizada em uma ordem simultânea, sequencial, e reversa, independentemente da ordem.
[094] O microrganismo que produz MAA pode produzir MAA incluindo um agrupamento de gene de biossíntese de MAA, e adicionalmente, pode ser um microrganismo no qual a capacidade de produção de MAA é aumentada intensificando a atividade de uma das proteínas selecionadas a partir do grupo que consiste em 2- desidro-3-desoxifosfo-heptonato aldolase, fosfoenolpiruvato sintetase, e a transcetolase. Além disso, o microrganismo da presente revelação não é limitado, desde que seja um microrganismo no qual a capacidade de produção de MAA é aumentada intensificando a atividade de uma ou mais proteínas selecionadas a partir do grupo que consiste em 2-desidro-3-desoxifosfo- heptonato aldolase, fosfoenolpiruvato sintetase.
Especificamente, o microrganismo da presente revelação pode ser um microrganismo do gênero Corynebacterium, um microrganismo do gênero Escherichia, ou uma levedura.
[095] O microrganismo do gênero Corynebacterium pode ser, especificamente, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, etc., e mais especificamente pode ser Corynebacterium glutamicum, mas o microrganismo não é limitado a ele.
[096] O microrganismo do gênero Escherichia pode ser, especificamente, Escherichia albertii, Escherichia coli, Escherichia fergusonii, Escherichia hermannii, Escherichia vulneris, etc., e mais especificamente pode ser Escherichia coli, mas o microrganismo não está limitado a ele.
[097] A levedura pode ser, especificamente, Saccharomycotina e Taphrinomycotina do filo Ascomycota, Agaricomycotina do filo Basidiomycota, um microrganismo pertencente ao filo Pucciniomycotina, etc., mais especificamente um microrganismo do gênero Saccharomyces, um microrganismo do gênero Schizosaccharomyces, um microrganismo do gênero Phaffia, um microrganismo do gênero Kluyveromyces, um microrganismo do gênero Pichia, e um microrganismo do gênero Candida, e mais especificamente Saccharomyces cerevisiae, mas o microrganismo não está limitado a eles.
[098] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método para a produção de um aminoácido do tipo micosporina, que inclui cultivar o microrganismo da presente revelação em um meio; e recuperar o aminoácido do tipo micosporina (MAA) do microrganismo ou meio de cultura.
[099] O “microrganismo” e “aminoácido do tipo micosporina (MAA)” são conforme descritos acima.
[0100] Conforme usado no presente documento, o termo “cultura” significa que o microrganismo é cultivado sob condições ambientais devidamente controladas. O processo de cultura da presente revelação pode ser realizado em um meio de cultura adequado e em condições de cultura conhecidas na técnica.
Esse processo de cultura pode ser facilmente ajustado para uso por aqueles versados na técnica de acordo com o microrganismo a ser selecionado.
A etapa de cultura do microrganismo pode ser realizada em cultura descontínua, cultura contínua, cultura descontínua alimentada, etc. conhecida na técnica, mas a etapa de cultivar o microrganismo não é particularmente limitada a isso.
O meio e outras condições de cultura usados para cultivar o microrganismo da presente revelação não são particularmente limitados, mas qualquer meio usado na cultura convencional para um microrganismo pode ser usado.
Especificamente, o microrganismo da presente revelação pode ser cultivado sob condições aeróbicas em um meio convencional que contém uma fonte de carbono apropriada, fonte de nitrogênio, fonte de fósforo,
composto inorgânico, aminoácido, e/ou vitamina, etc. enquanto ajusta a temperatura, pH, etc.
Especificamente, o pH pode ser ajustado usado um composto básico (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, ou amônia) ou um composto ácido
(por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico), de modo a obter um pH ideal (por exemplo, pH 5 ac9, especificamente pH 6 a 8, e mais especificamente pH 6,8), mas o método de ajuste de pH não está limitado aos mesmos.
Além disso, oxigênio ou gás que contém oxigênio pode ser injetado na cultura a fim de manter um estado aeróbio da cultura; ou nitrogênio, hidrogênio, ou gás dióxido de carbono podem ser injetados na cultura sem injeção de gás a fim de manter um estado anaeróbio ou micro aeróbio da cultura, mas o gás não está limitado a eles.
Além disso, a temperatura da cultura pode ser mantida em 20 °C a 45 °C, e especificamente 25 °C a 40 °C, e a cultura pode ser realizada por cerca de 10 horas a cerca de 160 horas, sem ser limitada a isso. Além disso, durante a cultura, um agente anti-espuma (por exemplo, éster de poliglicol de ácido graxo) pode ser adicionado para evitar a geração de espuma, mas não está limitado a ele.
[0101] Além disso, como uma fonte de carbono a ser usada no meio de cultura, sacarídeos e carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido, e celulose), óleos e gorduras (por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim, e óleo de coco), ácidos graxos (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico, e ácido linoleico), álcoois (por exemplo, glicerol e etanol), ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético), etc. podem ser usados sozinhos ou em combinação, mas a fonte de carbono não está limitada aos mesmos.
Como uma fonte de nitrogênio, um composto orgânico que contém nitrogênio (por exemplo, peptona, extrato de levedura, molho de carne, extrato de malte, licor de maceração de milho, farinha de feijão e ureia), e um composto inorgânico (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, e nitrato de amônio), etc. podem ser usados sozinhos ou em combinação, mas a fonte de nitrogênio não está limitada a eles. Como uma fonte de fósforo, di-hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato dipotássico, e sais que contém sódio correspondentes aos mesmos podem ser usados sozinhos ou em combinação, mas a fonte de fósforo não está limitada a eles.
Além disso, o meio pode incluir materiais promotores de crescimento essenciais, como um sal de metal (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro), aminoácidos, e vitaminas.
[0102] Os MAAs produzidos por cultura podem ser secretados no meio ou permanecer nas células.
[0103] Conforme usado no presente documento, o termo “meio” refere-se a um meio de cultura para cultivar o microrganismo da presente revelação e/ou um produto obtido após a cultura. O meio é um conceito, que inclui tanto uma forma em que o microrganismo é incluído e uma forma em que o microrganismo é removido da solução de cultura que contém o microrganismo por centrifugação, filtração, etc.
[0104] Na etapa de recuperação dos MAAs produzidos na etapa de cultura da presente revelação acima, os MAAs desejados podem ser coletados da solução de cultura usando um método apropriado conhecido na técnica de acordo com o método de cultura. Por exemplo, centrifugação, filtração, cromatografia de troca aniônica, cristalização, HPLC, etc. podem ser usados, e os MAAs desejados podem ser recuperados do microrganismo ou meio cultivado usando um método apropriado conhecido na técnica. A etapa de recuperação dos MAAs pode incluir ainda uma etapa de separação e/ou uma etapa de purificação.
[0105] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um uso do microrganismo da presente revelação para a produção de um aminoácido do tipo micosporina (MMA).
[0106] O “microrganismo” e “aminoácido do tipo micosporina” são conforme descritos acima.
[0107] Doravante no presente documento, a presente revelação será descrita em mais detalhes com referência aos seguintes Exemplos. No entanto, esses Exemplos são apenas para fins ilustrativos e o escopo da revelação não é limitado por esses Exemplos.
COLI QUE PRODUZEM MAAS E PRODUÇÃO DE MAAS USANDO OS MESMOS EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE CEPA EM QUE A ATIVIDADE DE 2- DESIDRO-3-DESOXOFOSFOHEPTONATO ALDOLASE É MELHORADA
[0108] Para aumentar a capacidade de produção de MAAs de um microrganismo, foram preparadas cepas de E. coli nas quais a atividade de 2-desidro-3-desoxifosfo-heptonato aldolase.
Especificamente, o gene aroG (2-desidro-3-desoxifosfo-heptonato aldolase; SEQ ID NOS: 1 e 2) foi adicionalmente introduzido com base em uma cepa W3110 E. coli. Os modelos e iniciadores usados para a preparação de plasmídeos são mostrados na Tabela 1 abaixo.
TABELA 1 Iniciadores Usados Produto de Modelo Usado (Direção direta, Direção
PCR reversa) DNA genômico fhuA braço 1 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 W3110 DNA genômico fhuA braço 2 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 W3110
DNA genômico Pn_aroG SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 W3110 Ptrc pECCG117 Ptrc_GFP SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 Pcj1 (KR10- pECCG117 Pcj1_GFP SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 620092B) DNA genômico aroG SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 8 W3110
[0109] Após amplificar fragmentos de genes por PCR usando os modelos e iniciadores acima, os fragmentos amplificados foram ligados a um vetor pSKH no qual os fragmentos dos genes fhuA braço 1 e fhuA braço 2 foram tratados com enzimas de restrição BamH1-SpeI, usando o In-FusionR HD kit de clonagem (Clontech), e o vetor preparado foi nomeado como pSKH-fhuA.
Devido à deleção do gene fhuA, a infecção por fago de E. coli é inibida.
[0110] Um fragmento do gene Pn_aroG foi ligado ao vetor pSKH-fhuA, que foi cortado com enzimas de restrição Spe1-EcoRV, usando o kit de clonagem In-FusionR HD (Clontech). Após digerir os fragmentos do gene Ptrc e Pcj1, que são conhecidos como promotores intensificados, com enzimas de restrição Spe1-Nde1 e digerir um fragmento do gene aroG com as enzimas de restrição Nde1-EcoRV, os fragmentos do gene Ptrc e aroG ou o Pcj1 (Patente Coreana No.10-620092) e fragmentos do gene aroG foram respectivamente ligados ao vetor pSKH-fhuA que foi cortado com enzimas de restrição Spe1-EcoRV, usando o kit de clonagem In- FusionR HD (Clontech). Os vetores preparados foram nomeados como pSKH-fhuA-Pn-aroG, pSKH-fhuA-Ptrc-aroG, e pSKH-fhuA-Pcj1-
aroG, respectivamente.
[0111] Os vetores acima foram confirmados por sequenciamento no que diz respeito ao sucesso da clonagem e sequência de gene em cada vetor, e em seguida, foram transformados em cada cepa W3110 E. coli do tipo selvagem por eletroporação. Cada gene transformado foi introduzido no cromossomo por recombinação primária (cruzamento), e a região do plasmídeo foi excisada do cromossomo por meio de recombinação secundária (cruzamento). Para cada uma das cepas de E. coli, nas quais a recombinação secundária é concluída, a introdução do gene aroG foi confirmada por PCR usando iniciadores de SEQ ID NOS: 14 (direção direta) e 8 (direção reversa).
EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE VETOR SUPEREXPRESSANDO GENE DE
[0112] Um agrupamento de genes com base em A. variabilis para a biossíntese de shinorina consiste em quatro genes (Ava_ABCD), que codificam 2-desmetil 4-desoxigadusol sintase, O- metiltransferase, uma C-N ligase, e peptídeo sintetase não ribossomal. O agrupamento de genes para a biossíntese de shinorina foi identificado usando o DNA genômico de A. variabilis ATCC29413. Um vetor que inclui um gene de biossíntese de shinorina derivado de A. variabilis ATCC29413 foi preparado usando o vetor pECCG117_Pcj1_GFP_terminator. O nome do vetor de expressão de biossíntese de shinorina e o respectivo modelo e iniciadores para a preparação do vetor são mostrados na TABELA
2 abaixo.
TABELA 2 Iniciadores Usados Produto de Modelo Usado (Direção direta, Direção
PCR reversa) DNA genômico de Ava_ABCD A. variabilis SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 ATCC29413
[0113] Os fragmentos de genes foram obtidos usando o modelo e indicadores acima, e cada fragmento de gene foi ligado a um vetor pECCG 117_Pcj1_GFP_terminator, que foi tratado com enzimas de restrição EcoRV-XbaI, usando o kit de clonagem In- FusionR HD (Clontech). O vetor preparado foi nomeado como pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD, e o sucesso da clonagem e a sequência de gene do vetor foi confirmada por sequenciamento. A sequência de nucleotídeos do gene Ava_ABCD gene é mostrada em SEQ ID NO: 17.
EXEMPLO 3: AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE SHINORINA DA CEPA EM QUE A ATIVIDADE DE 2-DEIDRO-3-DEOXIFOSFO-HEPTONATE
[0114] O plasmídeo pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD preparado no Exemplo 2 foi introduzido em cada uma das cepas preparadas no Exemplo 1, em que um gene aroG gene é intensificado, e uma cepa W3110 do tipo selvagem por eletroporação, e cada cepa transformada foi semeada em um meio sólido LB. As cepas foram cultivadas em uma incubadora de 37℃ durante a noite, e, em seguida, uma alça de platina das mesmas foi inoculada em um meio de titulação de 25 ml [composição do meio: glicose 40 g/l, KH2PO4
0,3 g/l, K2HPO4 0,6 g/l, (NH4)2SO4 15 g/l, MgSO4ㆍ7H2O 1 g/l, NaCl 2,5 g/l, citrato de sódio 1,2 g/l, extrato de levedura 2,5 g/l, carbonato de cálcio 40 g/l: pH 7,0], que foi incubada em uma incubadora de 37 ℃ a 200 rpm por 48 horas. As cepas resultantes foram analisadas por HPLC (Waters Corp.) e os resultados são mostrados na TABELA 3 abaixo.
TABELA 3 Conc. Shinorina Nome da Cepa OD (600 nm) (mg/l) W3110/pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD 19,4 348 W3110fhuA::Pn-aroG/ 19,6 418 pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD W3110fhuA::Ptrc-aroG/ 20,3 589 pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD W3110fhuA::Pcj1-aroG/ 20,5 674 pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD
[0115] Conforme mostrado na TABELA 3 acima, a concentração de shinorina produzida na cepa (W3110fhuA::Pn- aroG/pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD), onde o gene aroG é intensificado, foi aumentada por cerca de 20% em comparação ao do grupo de controle. Em particular, no caso das cepas onde o gene aroG é intensificado ao intensificar o promotor (isto é, W3110fhuA::Ptrc-aroG/pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD e W3110fhuA::Pcj1-aroG/pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD), a concentração de shinorina foi aumentada em 69% e 94%, respectivamente.
EXEMPLO 4: PREPARAÇÃO DA CEPA EM QUE A ATIVIDADE DA
[0116] Para aumentar a capacidade de produção das MAAs deum microrganismo, foram preparadas cepas de E. coli em que a atividade de fosfoenolpiruvato sintetase é intensificada.
Especificamente, o gene pps (fosfoenolpiruvato sintetase; SEQ ID NOS: 18 e 19) foi adicionalmente introduzido com base em uma cepa de E. coli W3110. O modelo e os iniciadores usados para a preparação do plasmídeo são mostrados na TABELA 4 abaixo.
TABELA 4 Iniciadores Usados Produto de Modelo Usado (Direção direta, Direção
PCR reversa) DNA genômico Pn-pps SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 W3110 DNA genômico pps SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 21 W3110
[0117] Após amplificar os fragmentos de gene usando o modelo e iniciadores acima, o fragmento de gene Pn_pps foi ligado ao vetor pSKH-fhuA, que foi cortado com enzimas de restrição Spe1-EcoRV, usando o kit de clonagem In-FusionR HD (Clontech).
Após digerir os fragmentos de gene Ptrc e Pcj1 preparados no Exemplo 1 com as enzimas de restrição Spe1-Nde1 e digerir os fragmentos de gene pps com as enzimas de restrição Nde1-EcoRV, os fragmentos de gene Ptrc e pps ou os fragmentos de gene Pcj1 e pps foram respectivamente ligados ao vetor pSKH-fhuA, que foi cortado com enzimas de restrição Spe1-EcoRV, usando o kit de clonagem In-FusionR HD (Clontech). Os vetores preparados foram nomeados como pSKH-fhuA-Pn-pps, pSKH-fhuA-Ptrc-pps, e pSKH- fhuA-Pcj1-pps, respectivamente.
[0118] Os vetores acima foram confirmados por sequenciamento no que diz respeito ao sucesso da clonagem e sequência de gene em cada vetor e, em seguida, transformados em cada cepa E. coli W3110 do tipo selvagem por eletroporação. Cada gene transformado foi introduzido no cromossomo por recombinação primária (cruzamento), e a região do plasmídeo foi excisada do cromossomo por meio de recombinação secundária (cruzamento).
Para cada uma das cepas transformadas E. coli, em que a recombinação secundária é concluída, a introdução dos genes pps foi confirmada por PCR usando os iniciadores de SEQ ID NOS: 14 (direção direta) e 21 (direção reversa).
[0119] EXEMPLO 5: AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE SHINORINA
[0120] O plasmídeo pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD preparado no Exemplo 2 foi introduzido em cada uma das cepas preparadas no Exemplo 4, em que um gene pps gene é introduzido, e uma cepa W3110 do tipo selvagem por eletroporação, e cada cepa transformada foi semeada em um meio sólido LB. As cepas foram cultivadas em uma incubadora de 37 ℃ durante a noite, e uma alça de platina das mesmas foi inoculado no meio da titulação de 25 ml do Exemplo 3, que foi então incubado em uma incubadora de 37 ℃ a 200 rpm por 48 horas. Os resultados são mostrados na TABELA 5 abaixo.
TABELA 5 Conc. Shinorina Nome da Cepa OD (600 nm) (mg/l) W3110/pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD 19,4 348 W3110fhuA::Pn-pps/ 21,3 494 pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD W3110fhuA::Ptrc-pps/ 20,8 511 pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD W3110fhuA::Pcj1-pps/ 21,4 556 pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD
[0121] Conforme mostrado na TABELA 5 acima, a concentração de shinorina produzida na cepa onde o gene pps gene é intensificado foi aumentada em 41%, e no caso onde sua atividade é intensificada pela substituição por um promotor forte, a concentração de shinorina foi aumentada até 60% em comparação ao do grupo de controle.
EXEMPLO 6: PREPARAÇÃO DA CEPA EM QUE A ATIVIDADE DA TRANSCETOLASE I/II É MELHORADA
[0122] Para aumentar a capacidade de produção de MAAs de um microrganismo, foram preparadas cepas de E. coli nas quais a atividade de transcetolase é intensificada. Especificamente, com base em uma cepa E. coli W3110, um gene tktA (transcetolase; SEQ ID NOS: 23 e 24) foi introduzido nele. O modelo e iniciadores usados na preparação de plasmídeos são mostrados na TABELA 6 abaixo.
TABELA 6 Iniciadores Usados Produto de Modelo Usado (Direção direta, Direção
PCR reversa) DNA genômico Pn-tktA SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 W3110 DNA genômico tktA SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 26 W3110
[0123] Após amplificar fragmentos de gene por PCR usando o modelo e iniciadores acima, um fragmento de gene Pn_tktA foi ligado ao vetor pSKH-fhuA, que foi cortado com as enzimas de restrição Spe1-EcoRV, usando o kit de clonagem In-FusionR HD (Clontech). Após digerir os fragmentos de gene Ptrc e Pcj1 preparados no Exemplo 1 com Spe1, as enzimas de restrição Nde1 e digerir um fragmento de gene tktA com as enzimas de restrição Nde1-EcoRV, os fragmentos de gene Ptrc e tktA ou os fragmentos de gene Pcj1 e tktA foram respectivamente ligados ao vetor pSKH- fhuA, que foi cortado com as enzimas de restrição Spe1-EcoRV, usando o kit de clonagem In-FusionR HD (Clontech). Os vetores preparados foram nomeados como pSKH-fhuA-Pn-tktA, pSKH-fhuA- Ptrc-tktA, e pSKH-fhuA-Pcj1-tktA, respectivamente.
[0124] Os vetores acima foram confirmados por sequenciamento no que diz respeito ao sucesso da clonagem e sequência de gene em cada vetor e, em seguida, transformados em cada cepa E. coli W3110 do tipo selvagem por eletroporação. Cada gene transformado foi introduzido no cromossomo por recombinação primária (cruzamento), e a região do plasmídeo foi excisada do cromossomo por meio de recombinação secundária (cruzamento).
Para cada uma das cepas transformadas E. coli, nas quais a recombinação secundária é concluída, a introdução do gene tktA foi confirmada por PCR usando iniciadores de SEQ ID NOS: 14 (direção direta) e 26 (direção reversa).
EXEMPLO 7: AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE SHINORINA
[0125] O plasmídeo pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD preparado no Exemplo 2 foi introduzido em cada uma das cepas preparadas no Exemplo 6, em que um gene tktA é introduzido, e uma cepa W3110 do tipo selvagem por eletroporação, e cada cepa transformada foi semeada em um meio sólido LB. As cepas foram cultivadas em uma incubadora de 37 ℃ durante a noite, e uma alça de platina da cultura durante a noite foi inoculada no meio de titulação de 25 ml do Exemplo 3, que foi então incubada em uma incubadora de 37 ℃ a 200 rpm por 48 horas. Os resultados são mostrados na TABELA 7 abaixo.
TABELA 7 Con. Shinorina Nome da Cepa OD (600 nm) (mg/l) W3110/pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD 19,4 348 W3110fhuA::Pn-tktA/ 19,5 364 pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD W3110fhuA::Ptrc-tktA/ 19,3 447 pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD
W3110fhuA::Pcj1-tktA/ 19,5 461 pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD
[0126] Conforme mostrado na TABELA 7 acima, a concentração de shinorina produzida na cepa onde o gene tktA é intensificado foi aumentada em 4,5%, e no caso em que sua atividade é intensificada pela substituição com um promotor forte, a concentração de shinorina foi aumentada até 32% em comparação a do grupo de controle.
EXEMPLO 8: PREPARAÇÃO DA CEPA NA QUAL AS ATIVIDADES DE 2- DESIDRO-3-DESOXIFOSFO-HEPTONATO ALDOLASE/FOSFOENOLPIRUVATO SINTETASE/TRANSCETOLASE SÃO AUMENTADAS
[0127] Para aumentar a capacidade de produção de MAAs de um microrganismo, foram preparadas cepas de E. coli nas quais a atividade de cada uma das 2-desidro-3-desoxifosfo-heptonato aldolase/fosfoenolpiruvato sintetase/transcetolase é aumentada.
Especificamente, com base em uma cepa de E. coli W3110, cada um de um gene aroG, um gene pps, e um gene tktA foi adicionalmente introduzido ali. Os modelos e iniciadores usados na preparação de plasmídeos são mostrados na TABELA 8 abaixo.
TABELA 8 Iniciadores Usados Produto de Modelo Usado (Direção direta, Direção
PCR reversa) pSKH-fhuA-Pcj1- Pcj1-aroG SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 28 aroG pSKH-fhuA-Pcj1- Pcj1-pps SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 pps pSKH-fhuA-Pcj1- Pcj1-tktA SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 26 tktA
[0128] Após amplificar fragmentos de genes usando os modelos e iniciadores acima, cada fragmento de gene dos mesmos foi ligado ao vetor pSKH-fhuA, que foi cortado com enzimas de restrição Spe1-EcoRV, usando o kit de clonagem In-FusionR HD (Clontech). O vetor preparado foi nomeado como pSKH-fhuA-Pcj1- aroG-Pcj1-ppsA-Pcj1-tktA.
[0129] O vetor acima foi confirmado por sequenciamento no que diz respeito ao sucesso da clonagem e sequência de genes no vetor e, em seguida, transformado em uma cepa E. coli W3110 do tipo selvagem por eletroporação. Os genes transformados foram introduzidos no cromossomo por recombinação primária (cruzamento), e a região do plasmídeo foi excisada do cromossomo por meio de recombinação secundária (cruzamento). Para as cepas transformadas E. coli, nas quais a recombinação secundária é concluída, a introdução dos genes aroG, pps, e tktA foi confirmada por PCR usando iniciadores de SEQ ID NOS: 14 (direção direta) e 26 (direção reversa).
EXEMPLO 9: AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE SHINORINA NA CEPA NA QUAL AS ATIVIDADES DE 2-DESIDRO-3-DESOXIFOSFO- HEPTONATO ALDOLASE/FOSFOENOLPIRUVATO SINTETASE/TRANSCETOLASE
[0130] O plasmídeo pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD preparado no Exemplo 2 foi introduzido em cada uma das cepas preparadas no Exemplo 8, em que os genes aroG, pps, e tktA são introduzidos, e uma cepa W3110 do tipo selvagem por eletroporação, e cada cepa transformada foi semeada em um meio sólido LB. As cepas foram cultivadas em uma incubadora de 37 ℃ durante a noite, e uma alça de platina da cultura durante a noite de cada cepa foi inoculada no meio de titulação de 25 ml do Exemplo 3, que foi incubado em uma incubadora de 37 ℃ a 200 rpm por 48 horas. Os resultados são mostrados na TABELA 9 abaixo.
TABELA 9 Con. Shinorina Nome da Cepa OD (600 nm) (mg/l) W3110/pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD 19,4 348 W3110fhuA::Pcj1-aroG-Pcj1-pps- 18,2 1,279 Pcj1-tktA/ pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD
[0131] Conforme mostrado na TABELA 9 acima, a concentração de shinorina produzida na cepa onde os três tipos de genes (isto é, aroG, pps, e tktA) são combinados e intensificados foi aumentada em 267% em comparação ao do grupo de controle. Esse é um resultado inesperado que mostra um aperfeiçoamento além das expectativas em comparação com a soma dos aumentos máximos obtidos pela substituição do promotor de cada gene com um promotor forte. Ou seja, foi confirmado que quando os três genes (isto é, aroG, pps, e tktA) são combinados,
é possível produzir shinorina em uma concentração mais alta.
EXEMPLO 10: PREPARAÇÃO DA CEPA EM QUE A ATIVIDADE DE 3-
[0132] Para aumentar a capacidade de produção de MAAs de um microrganismo, foram preparadas cepas de E. coli em que a atividade de 3-desidroquinato desidratase (aroD) é inativada.
[0133] Especificamente, um gene de resistência ao cloranfenicol de um plasmídeo pKD3 foi usado como um marcador, de inserção de um gene e um cassete de deleção de aroD, que inclui parte de um gene aroD e o gene de resistência ao cloranfenicol de um plasmídeo pKD3, foi preparado por PCR usando os iniciadores de SEQ ID NO: 32 (direção direta) e 33 (direção reversa). As células competentes foram preparadas ao transformar uma cepa E. coli W3110 do tipo selvagem e a cepa preparada no Exemplo 8, em que os genes aroG, pps, e tktA são introduzidos, com um plasmídeo pKD46 que inclui um gene recombinase vermelho lambda, seguido pela indução da expressão do gene correspondente usando arabinose. Após introduzir a cassete de deleção de aroD nas células competentes por eletroporação, as células competentes resultantes foram semeadas em um meio sólido LB que contém 30 mg/l de cloranfenicol. A cepa assim obtida foi submetida a PCR usando os iniciadores de SEQ ID NOS: 34 (direção direta) e 35 (direção reversa), e a deleção do gene aroD foi confirmada pela observação do fragmento amplificado 1.300 bp.
EXEMPLO 11: AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE SHINORINA
DA CEPA EM QUE 3-DESIDROQUINATO DESIDRATASE É INATIVADA
[0134] O plasmídeo pECCG117 Pcj1_Ava_ABCD preparado no Exemplo 2 foi introduzido na cepa preparada no Exemplo 10, em que um gene aroD é deletado, por eletroporação, e a cepa resultante foi semeada em um meio sólido LB. A cepa foi cultivada em uma incubadora de 37 ℃ durante a noite, e uma alça de platina da mesma foi inoculada no meio de titulação de 25 ml do Exemplo 3, que foi incubado em uma incubadora de 37 ℃ a 200 rpm por 48 horas. Os resultados são mostrados na TABELA 10 abaixo.
TABELA 10 Con.
OD Nome da Cepa Shinorina (600 nm) (mg/l) W3110fhuA::Pcj1-aroG-Pcj1-ppsA-Pcj1- 18,6 1.248 tktA/ pECCG117_PCJ1_Ava_ABCD W3110aroDfhuA::Pcj1-aroG-Pcj1-ppsA- 17,3 2.077 Pcj1-tktA/ pECCG117_PCJ1_Ava_ABCD
[0135] Conforme mostrado na TABELA 10 acima, a concentração de shinorina produzida na cepa, onde o gene aroD é adicionalmente deletado, foi aumentada em 66% em comparação com aquela da cepa que produz shinorina onde os genes aroG, pps, e tktA são intensificados. A cepa W3110fhuA::Pcj1-aroG-Pcj1-ppsA- Pcj1-tktA/pECCG117_PCJ1_Ava_ABCD, que é uma cepa em que os genes aroG, pps, e tktA são intensificados, foi nomeada como CB06- 0020, e depositada sob a cepa Tratado Budapeste em 14 de fevereiro de 2018, no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos
(KCCM) e recebeu o No. De Acesso KCCM12224P.
<PREPARAÇÃO DE MICRORGANISMOS RECOMBINANTES COM BASE EM
CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM QUE PRODUZEM MAAS E PRODUÇÃO DE MAAS USANDO OS MESMOS > EXEMPLO 12: PREPARAÇÃO DE VECTOR EM QUE A ATIVIDADE DE 2- DESIDRO-3-DESOXIFOSFO-HEPTONATO ALDOLASE É INTENSIFICADA E
[0136] Para aumentar a capacidade de produção de MAAs de um microrganismo, foram preparadas cepas de E. coli em que a atividade de 2-desidro-3-desoxifosfo-heptonato aldolase é intensificada. Especificamente, o gene aroG (2-desidro-3- desoxifosfo-heptonato aldolase; SEQ ID NOS: 36 e 37) foi adicionalmente introduzido com base em uma cepa Corynebacterium glutamicum ATCC13032. O modelo e iniciadores usados para a preparação do plasmídeo são mostrados na TABELA 11 abaixo.
TABELA 11 Iniciadores Usados Produto de Modelo Usado (Direção direta, Direção
PCR reversa) DNA genômico c.gl Pn-cgl aroG SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 13032 DNA genômico c.gl Pcj7-cgl aroG SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 13032
[0137] Após obter fragmentos de genes usando o modelo e iniciadores acima, cada fragmento de gene foi ligado aos vetores pECCG 117 e pECCG 117_Pcj7_GFP_terminator (Patente Coreana No.
10-620092, p117-cj7-gfp), que foram tratadas com as enzimas de restrição EcoRV/XbaI, usando o kit de clonagem In-FusionR HD (Clontech). Os vetores preparados foram nomeados como pECCG117_Pn_cgl aroG e pECCG117_Pcj7_cgl aroG, respectivamente.
Os vetores acima foram confirmados por sequenciamento no que diz respeito ao sucesso da clonagem e sequência do gene em cada vetor.
[0138] Em primeiro lugar, uma vez que um microrganismo do gênero Corynebacterium não pode produzir shinorina, foi preparada uma cepa na qual a via biossintética de shinorina é introduzida. Especificamente, o gene Ava_ABCD foi submetido a PCR usando o pECCG117_Ptrc_Ava_ABCD como um modelo juntamente com um par de iniciadores de SEQ ID NOS: 42 (direção direta) e 43 (direção reversa). O pDZTn_Ava_ABCD foi preparado ao ligar um fragmento de PCR de cerca de 7 kb ao vetor pDZTn (WO 2009- 125992A), que é tratado com uma enzima de restrição NdeI, usando o kit de clonagem In-FusionR HD (Clontech). Em seguida, um fragmento do promotor O2 (Patente KR No. 10-1632642) foi submetido a PCR usando um par de iniciadores de SEQ ID NOS: 44 (direção direta) e 45 (direção reversa), e ligado ao pDZTn_Ava_ABCD, que é tratado com uma enzima de restrição NdeI, usando o kit de clonagem In-FusionR HD (Clontech), preparando assim pDZTn_PO2_Ava_ABCD.
[0139] O plasmídeo recombinante foi transformado em ATCC13032 do tipo selvagem por eletroporação (van der Rest et al. 1999), e o plasmídeo foi introduzido no cromossomo por recombinação primária (cruzamento), e a região do plasmídeo foi excisada do cromossomo por meio de recombinação secundária (cruzamento).
[0140] Para cada uma das cepas transformadas de Corynebacterium glutamicum, nas quais a recombinação secundária é completada, a introdução do gene Ava_ABCD foi confirmada por PCR usando um par de iniciadores específico de gene SEQ ID NOS: 42 (direção direta) e 43 (direção reversa). A cepa preparada foi nomeada como Corynebacterium glutamicum 13032 N1021PO2_Ava_ABCD.
[0141] Os vetores pECCG117_Pn_cgl aroG e pECCG117_Pcj7_cgl aroG foram, cada um, transformados na cepa Corynebacterium glutamicum 13032 N1021_PO2_Ava_ABCD por eletroporação.
[0142] As cepas preparadas acima e o grupo de controle Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (c.gl 13032) foram cultivadas durante a noite em um meio sólido BHIS que contém canamicina, e uma alça de platina das mesmas foi inoculada em um meio de titulação de 25 ml [composição do meio: glicose 40 g/l, KH2PO4 1 g/l, (NH4)2SO4 10 g/l, MgSO47H2O 5g/l, NaCl 5 g/l, extrato de levedura 5 g/l, carbonato de cálcio 30 g/l: pH 7,0], que foi incubado em uma incubadora de 37 ℃ a 200 rpm por 48 horas. Os resultados são mostrados na TABELA 12 abaixo.
TABELA 12
Con. Shinorina Nome da Cepa OD (600 nm) (mg/l) c.gl 13032 72,1 - c.gl 71,5 180 13032N1021_PO2_Ava_ABCD c.gl 13032N1021_PO2_Ava_ABCD/ 69,6 250 pECCG117_Pn_cgl aroG c.gl 13032N1021_PO2_Ava_ABCD/ 71,9 324 pECCG117_Pcj7_cgl aroG
[0143] Conforme mostrado na TABELA 12 acima, quando o nível de expressão de aroG foi aumentado na cepa que contém o gene de biossíntese de shinorina, a concentração de shinorina foi aumentada em 39%. Em particular, quando o promotor foi intensificado, foi confirmado que a concentração de shinorina poderia ser melhorada em até 80%.
EXEMPLO 13: PREPARAÇÃO DE VETOR EM QUE AS ATIVIDADES DE FOSFOENOLPIRUVATO SINTETASE/TRANSCETOLASE SÃO INTENSIFICADAS E
[0144] Para aumentar a capacidade de produção de MAAs de um microrganismo, foram preparadas cepas de Corynebacterium glutamicum nas quais a atividade de tkt ou pps é intensificada.
Especificamente, o tkt (transcetolase; SEQ ID NO: 95 e 96) ou pps (fosfoenolpiruvato sintetase; SEQ ID NOS: 97 e 98) foi adicionalmente introduzido com base em uma cepa Corynebacterium glutamicum ATCC13032. O modelo e iniciadores usados para a preparação do plasmídeo são mostrados na TABELA 13 abaixo.
TABELA 13 Iniciadores Usados Produto de Modelo Usado (Direção direta, Direção
PCR reversa) DNA genômico c.gl Pn-cgl tkt SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 13032 DNA genômico c.gl Pcj7-cgl tkt SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 13032 DNA genômico c.gl Ptrc-cgl pps SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 13032 DNA genômico c.gl Pcj7-cgl pps SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 51 13032
[0145] Os vetores foram preparados ligando os fragmentos do gene, que foram obtidos através da tecnologia de PCR em que o modelo foi pareado com a combinação dos iniciadores, aos vetores pECCG117, pECCG117_Ptrc_GFP_terminator e pECCG 117_Pcj7_GFP_terminator, que foram tratados com as enzimas de restrição EcoRV/XbaI, usando o kit de clonagem In-FusionR HD (Clontech). Os vetores preparados foram nomeados como pECCG117- Pn-tkt/pECCG117-Pcj7-tkt e pECCG117-Ptrc-pps/pECCG117-Pcj7-pps, respectivamente. Os vetores acima foram confirmados por sequenciamento no que diz respeito ao sucesso da clonagem e sequência de gene em cada vetor e, em seguida, transformados em uma cepa Corynebacterium glutamicum 13032 N1021_PO2_Ava_ABCD por eletroporação. Cada cepa foi cultivada em um meio sólido BHIS que contém canamicina durante a noite e uma alça de platina da mesma foi inoculada no meio de titulação de 25 ml do Exemplo 12, que foi incubado em uma incubadora de 37 ℃ a 200 rpm por 48 horas. Os resultados são mostrados na TABELA 14 abaixo.
TABELA 14 Con. Shinorina Nome da Cepa OD (600 nm) (mg/l) c.gl 13032N1021_PO2_Ava_ABCD 73 175 c.gl 13032N1021_PO2_Ava_ABCD/ 72 211 pECCG117_Pn_cgl tkt c.gl 13032N1021_PO2_Ava_ABCD/ 71,5 275 pECCG117-Pcj7-cgl tkt c.gl 13032N1021_PO2_Ava_ABCD/ 70,9 298 pECCG117-Ptrc-cgl pps c.gl 13032N1021_PO2_Ava_ABCD/ 70,2 302 pECCG117-Pcj7-cgl pps
[0146] Conforme mostrado na TABELA 14 acima, foi confirmado que quando os genes tkt ou pps foram intensificados, a produção de shinorina foi melhorada em até 57% ou 72%, respectivamente.
EXEMPLO 14: PREPARAÇÃO DA CEPA EM QUE AS ATIVIDADES DE 2- DESIDRO-3-DESOXIFOSFO-HEPTONATO ALDOLASE/FOSFOENOLPIRUVATO SINTETASE/TRANSCETOLASE SÃO INTENSIFICADAS E AVALIAÇÃO DAS
[0147] A fim de aumentar a capacidade de produção de MAAs de um microrganismo, foram preparadas cepas de E. coli nas quais as atividades dos genes aroG, pps, e tkt são intensificadas, e para confirmar a presença de uma quantidade maior de produção de MAAs, a 3-desidroquinato desidratase (aroD) foi adicionalmente inativada. Especificamente, para intensificar os genes aroG, pps, e tkt, foi preparado um plasmídeo pDZ-aroD-Pcj7-aroG-Pcj7- pps-Pcj7-tktA. Os modelos e iniciadores usados para a preparação do plasmídeo pDZ-aroD-Pcj7-aroG-Pcj7-pps-Pcj7-tktA são mostrados na TABELA 15 abaixo.
TABELA 15 Iniciadores Usados Produto de Modelo Usado (Direção direta, Direção
PCR reversa) Pcj7-aroG pECCG117_Pcj7_cgl aroG SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 Pcj7-tkt pECCG117-Pcj7-cgl tkt SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 Pcj7-pps pECCG117-Pcj7-cgl pps SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58
[0148] Em primeiro lugar, a fim de preparar uma cepa na qual o gene aroD (SEQ ID NOS: 89 e 90) de Corynebacterium glutamicum é deletado, foi preparado um plasmídeo pDZ-ΔaroD no qual a estrutura de leitura aberta do gene aroD é deletada internamente. A deleção do gene interna do plasmídeo pDZ-ΔaroD foi alcançada através da realização de uma PCR cruzada usando o DNA genômico da cepa Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como um modelo juntamente com SEQ ID NOS: 91 e 92, e SEQ ID NOS: 93 e 94 como um par de iniciadores direto e reverso, seguidos pela introdução de fragmentos de genes resultantes no vetor pDZ.
[0149] Em seguida, cada fragmentos de gene dos genes aroG, pps, e tkt foi amplificado por meio de PCR usando os modelos e iniciadores mostrados na TABELA 15 acima, e foi então introduzido no vetor pDZ-ΔaroD, clivado com uma enzima de restrição SpeI, respectivamente. Os dois tipos de vetores foram confirmados pelo sequenciamento no que diz respeito ao sucesso da clonagem e sequência de gene em cada vetor e, em seguida, transformado em uma cepa Corynebacterium glutamicum 13032N1021 _PO2_Ava_ABCD por eletroporação. Cada cepa foi cultivada em um meio sólido BHIS que contém canamicina durante a noite e uma alça de platina durante a noite de cada cepa foi inoculada no meio de titulação de 25 ml do Exemplo 12, que foi incubada em uma incubadora de 37 ℃ a 200 rpm por 48 horas. Os resultados são mostrados na TABELA 16 abaixo.
TABELA 16 Con. Shinorina Nome da Cepa OD (600 nm) (mg/l) c.gl 73 425 13032N1021_PO2_Ava_ABCD_aroD c.gl 13032N1021_PO2_Ava_ABCD_aroD, 69 531 Pcj7_aroG, Pcj7_tkt, Pcj7_pps
[0150] Conforme mostrado na TABELA 16 acima, a concentração de shinorina produzida na cepa onde os três tipos de genes (aroG, pps, e tktA) são intensificados foi aumentada em cerca de 25%. Foi confirmado que mesmo na cepa, onde a capacidade de produção de shinorina foi aumentada através da deleção do gene aroD, a shinorina poderia ser produzida em uma alta concentração pela combinação dos três tipos de genes. Além disso, pode ser interpretado que quando o gene aroD é adicionalmente inativado na cepa onde os três tipos de genes são combinados, a shinorina pode ser produzida até mesmo em maior concentração.
<PREPARAÇÃO DE MICRORGANISMOS RECOMBINANTES COM BASE EM LEVEDURA QUE PRODUZEM MAAS E PRODUÇÃO DE MAAS USANDO OS MESMOS> EXEMPLO 15: PREPARAÇÃO DE CEPA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE (S. CEREVISIAE) PRODUTORA DE SHINORINA
[0151] A fim de usar uma cepa de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) como uma cepa que produz shinorina, um gene de biossíntese de shinorina derivado de A. variabilis ATCC29413 foi introduzido em um vetor para expressão de levedura. Os genes Ava_A e Ava_B foram inseridos no vetor pRS-413 usando o promotor GPD. Especificamente, as regiões pGPD-Ava_A e pGPD-Ava_B foram ligadas por PCR de sobreposição. Os vetores e produtos de PCR foram tratados com as enzimas de restrição BamHI e SalI e, em seguida, ligados usando ligase de T4 para preparar o vetor pRS- 413-pGPD-Ava_A-pGPD-Ava_B.
[0152] Em seguida, o genes Ava_A e Ava_B foram inseridos no vetor pRS-414 usando o promotor GPD. Especificamente, as regiões pGPD-Ava_C e pGPD-Ava_D foram ligadas por PCR de sobreposição e, em seguida, os vetores e produtos de PCR foram tratados com BamHI e SalI e ligados usando ligase de T4 para preparar o vetor pRS-414-pGPD-Ava_C-pGPD-Ava_D. Os iniciadores e DNAs modelo usados para a preparação do vetor são mostrados na TABELA 17 abaixo.
TABELA 17
SEQ ID NO Produto de PCR Modelo Usado (Direção direta, Direção reversa) SEQ ID NO: 59, pGPD S. cerevisiae gDNA SEQ ID NO: 60 A. variabilis ATCC29413 SEQ ID NO: 61, Ava_A gDNA SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 59, pGPD-Ava_A Produto de PCR SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 63, pGPD S. cerevisiae gDNA SEQ ID NO: 64 A. variabilis ATCC29413 SEQ ID NO: 65, Ava_B gDNA SEQ ID NO: 66 SEQ ID NO: 63, pGPD-Ava_B Produto de PCR SEQ ID NO: 66 SEQ ID NO: 59, pGPD-Ava_A-pGPD-Ava_B Produto de PCR SEQ ID NO: 66 SEQ ID NO: 67, pGPD S. cerevisiae gDNA SEQ ID NO: 68 A. variabilis ATCC29413 SEQ ID NO: 69, Ava_C gDNA SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 67, pGPD-Ava_C Produto de PCR SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 71, pGPD S. cerevisiae gDNA SEQ ID NO: 72 A. variabilis ATCC29413 SEQ ID NO: 73, Ava_D gDNA SEQ ID NO: 74
SEQ ID NO: 71, pGPD-Ava_D Produto de PCR SEQ ID NO: 74 SEQ ID NO: 67, pGPD-Ava_C-pGPD-Ava_D Produto de PCR SEQ ID NO: 74
[0153] O vetor pRS-413-pGPD-Ava_A-pGPD-Ava_B e o vetor pRS-414-pGPD-Ava_C-pGPD-Ava_D foram introduzidos na cepa de Saccharomyces cerevisiae CEN.PK-1D (S. cerevisiae CEN.PK-1D) através da transformação de acetato de lítio e, em seguida, a presença de produção de shinorina foi confirmada. A cepa foi semeada em um meio sólido sintético completo (SC), no qual Trp e His (isto é, marcadores auxotróficos) são excluídos e cultivados durante a noite em uma incubadora de 30 ℃. Uma alça de platina da cepa cultivada durante a noite no meio sólido sintético completo (SC), em que Trp e His são excluídos, foi inoculada no meio de titulação de 25 ml da TABELA 18 e, em seguida, foi cultivada em uma incubadora de 30 ℃ a 150 rpm por 24 horas. Os resultados são mostrados na TABELA 19 abaixo.
TABELA 18 Composição Conc. Usada (g/l) Base de Nitrogênio de Levedura (YNB) sem 6,7 Aminoácidos Misturas de Aminoácidos (sem Leucina, 2 Triptofano, histidina e uracil) Glicose 20 TABELA 19 24 Horas Con. Nome da Cepa OD Sacarídeo Shinorina (600nm) residual (mg/l)
CEN.PK-1D WT + pRS413-pGPD-Ava_A- pGPD-Ava_B + pRS414-pGPD-Ava_C- 11,2 0 331 pGPD-Ava_D
[0154] Como resultado do experimento, foi confirmado que a cepa de Saccharomyces cerevisiae do tipo selvagem, que não produz shinorina, produziu 331 mg/l de shinorina devido à introdução do gene de biossíntese de shinorina.
EXEMPLO 16: AUMENTO DS QUANTIDADE DE PRODUÇÃO DE SHINORINA ATRAVÉS DO AUMENTO DE TKL1 (TRANSCETOLASE) DE SACCHAROMYCES
[0155] A fim de aumentar a capacidade de produção de MAAs, foi preparada uma cepa de Saccharomyces cerevisiae na qual a atividade de TKL1 é intensificada. Para este propósito, a expressão do gene TKL1 foi intensificada pela clonagem do gene TKL1 (SEQ ID NOS: 110 e 123) em vetores pRS-415-pGPD, pRS-415- pADH, e pRS-415-pTEF
[0156] O promotor GPD incluído no vetor pRS-415-pGPD é o promotor dos genes gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e isozima 3 (TDH3), e inclui uma sequência de -674 bp a -1 bp a partir do códon de iniciação do ORF do gene THD3.
[0157] O promotor ADH incluído no vetor pRS-415-pADH é o promotor do gene da álcool desidrogenase (ADH1), e inclui uma sequência de -1,500 bp a -1 bp do códon de iniciação do gene da ORF do ADH1gene.
[0158] O promotor TEF incluído no vetor pRS-415-pTEF é o promotor do gene do fator de alongamento de tradução EF-1 alpha
(TEF1), e inclui uma sequência de -500 bp a -1 bp a partir do códon de iniciação do ORF do gene TEF1.
[0159] Especificamente, o gene TEF1 foi submetido a PCR usando os iniciadores da TABELA 20 abaixo, e os produtos de PCR e os vetores pRS-415-pGPD, pRS-415-pADH, e pRS-415-pTEF foram tratados com enzimas de restrição BamHI e SalI, e, em seguida, ligada usando uma ligase de T4 para preparar os vetores pRS-415- pGPD-TKL1, pRS-415-pADH-TKL1, e pRS-415-pTEF-TKL1.
TABELA 20
SEQ ID NO Produto de PCR Modelo Usado (Direção direta, Direção reversa) S. cerevisiae TKL1 SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76 gDNA
[0160] Em seguida, o plasmídeo para biossíntese de shinorina preparado no Exemplo 15 foi introduzido na cepa de Saccharomyces cerevisiae CEN.PK-1D juntamente com o pRS-415- pGPD-TKL1, pRS-415-pADH-TKL1, e pRS-415-pTEF-TKL1, e cada cepa resultante foi semeada em um meio sólido sintético completo (SC), no qual Trp, Ura, e His são excluídos, e cultivados durante a noite em uma incubadora de 30 ℃. Uma alça de platina da cepa cultivada durante a noite no meio sólido sintético completo (SC), no qual Trp, Ura, e His são excluídos, foi inoculado no meio de titulação de 25 ml e, em seguida, foi cultivada em uma incubadora de 30 ℃ a 150 rpm por 24 horas. Os resultados são mostrados na
TABELA 21 abaixo.
TABELA 21 24 Horas Con. Nome da Cepa OD Sacarídeo Shinorina (600 nm) Residual (mg/l) CEN.PK-1D WT + pRS413-pGPD-Ava_A-pGPD-Ava_B, 11,2 0 327 pRS414-pGPD-Ava_C-pGPD-Ava_D CEN.PK-1D(pADH-TKL1) + pRS413-pGPD- Ava_A-pGPD-Ava_B, pRS414-pGPD-Ava_C- 13 0 370 pGPD-Ava_D CEN.PK-1D(pTEF-TKL1) + pRS413-pGPD- Ava_A-pGPD-Ava_B, pRS414-pGPD-Ava_C- 12,1 0 420 pGPD-Ava_D CEN.PK-1D(pGPD-TKL1) + pRS413-pGPD- Ava_A-pGPD-Ava_B, pRS414-pGPD-Ava_C- 12,5 0 610 pGPD-Ava_D
[0161] Conforme mostrado na TABELA 21 acima, foi confirmado que a quantidade de produção de shinorina foi aumentada na cepa, na qual o gene de expressão TKL1 é intensificado usando o promotor GPD, em comparação àquele da cepa WT. Além disso, foi adicionalmente confirmado que à medida que a força do promotor aumenta (isto é, pGPD> pTEF> pADH), a quantidade de produção de shinorina foi aumentada.
EXEMPLO 17: AUMENTO DA QUANTIDADE DE PRODUÇÃO DE SHINORINA ATRAVÉS DA INTENSIFICAÇÃO DE ARO4 (3-DESOXI-D-ARABINO- HEPTULOSONATO-7-FOSFATO (DAHP) SINTASE) DE SACCHAROMYCES
[0162] A fim de aumentar a capacidade de produção de MAAs, foram preparadas cepas de Saccharomyces cerevisiae nas quais a atividade de ARO4 é intensificada. Para este propósito, foi empregada uma estratégia na qual a expressão do gene ARO4 foi intensificada pela clonagem do gene ARO4 (SEQ ID NOS: 111 e 124) em vetores pRS-415-pGPD, pRS-415-pADH, e pRS-415-pTEF.
Especificamente, o gene ARO4 foi submetido a PCR usando os iniciadores da TABELA 22 abaixo, e os produtos de PCR de ARO4 e pRS-415-pGPD, pRS-415-pADH, e pRS-415-pTEF foram tratados com enzimas de restrição BamHI e SalI e, em seguida, ligados usando ligase de T4 para preparar os vetores pRS-415-pGPD-ARO4, pRS- 415-pADH-ARO4, e pRS-415-pTEF-ARO4.
TABELA 22
SEQ ID NO Produto de PCR Modelo Usado (Direção direta, Direção reversa) S. cerevisiae ARO4 SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78 gDNA
[0163] Em seguida, o plasmídeo para biossíntese de shinorina preparado no Exemplo 15 foi introduzido na cepa de Saccharomyces cerevisiae CEN.PK-1D juntamente com o pRS-415- pGPD-ARO4, pRS-415-pADH-ARO4, e pRS-415-pTEF-ARO4, e cada cepa resultante foi semeada em um meio sólido sintético completo (SC), no qual Trp, Ura, e His são excluídos, e cultivados durante a noite em uma incubadora de 30 ℃. Uma alça de platina da cepa cultivada durante a noite no meio sólido sintético completo (SC),
no qual Trp, Ura, e His são excluídos, foi inoculada em um meio de titulação de 25 ml e, em seguida, foi cultivado em uma incubadora de 30 ℃ a 150 rpm por 24 horas. Os resultados são mostrados na TABELA 23 abaixo.
TABELA 23 24 Horas Con. Sacaríde Nome da Cepa OD Shinorina o (600nm) (mg/l) Residual CEN.PK-1D WT + pRS413-pGPD-Ava_A- pGPD-Ava_B, pRS414-pGPD-Ava_C- 11,2 0 310 pGPD-Ava_D CEN.PK-1D(pADH-ARO4) + pRS413- pGPD-Ava_A-pGPD-Ava_B, pRS414- 13 0 415 pGPD-Ava_C-pGPD-Ava_D CEN.PK-1D(pTEF-ARO4) + pRS413- pGPD-Ava_A-pGPD-Ava_B, pRS414- 12,1 0 610 pGPD-Ava_C-pGPD-Ava_D CEN.PK-1D(pGPD-ARO4) + pRS413- pGPD-Ava_A-pGPD-Ava_B, pRS414- 12,5 0 890 pGPD-Ava_C-pGPD-Ava_D
[0164] Conforme mostrado na TABELA 23 acima, foi confirmado que a quantidade de produção de shinorina foi aumentada em 187% na cepa, em que o gene de expressão ARO4 é intensificado usando o promotor GPD, em comparação ao da cepa WT.
EXEMPLO 18: AUMENTO DA QUANTIDADE DE PRODUÇÃO DE SHINORINA ATRAVÉS DA INTENSIFICAÇÃO DA FOSFOENOLPIRUVATO SINTETASE (PPS)
[0165] A fim de aumentar a capacidade de produção de MAAs, foram preparadas cepas de Saccharomyces cerevisiae nas quais a atividade de pps é intensificada. Para este propósito, foi empregada uma estratégia na qual a expressão do gene pps foi intensificada pela clonagem do gene pps nos vetores pRS-415- pGPD, pRS-415-pADH, e pRS-415-pTEF e a expressão do gene pps foi intensificada.
[0166] Especificamente, o gene pps foi submetido ao PCR usando os iniciadores da TABELA 24 abaixo, e os produtos de PCR de vetores pps e pRS-415-pGPD, pRS-415-pADH, e pRS-415-pTEF foram tratados com enzimas de restrição BamHI e SalI e, em seguida, ligados usando ligase de T4 para preparar os vetores pRS-415-pGPD-pps, pRS-415-pADH-pps, e pRS-415-pTEF-pps.
TABELA 24
SEQ ID NO Produto de Modelo Usado (Direção direta, Direção
PCR reversa) pps E. coli MG1655 gDNA SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80
[0167] Em seguida, o plasmídeo para biossíntese de shinorina preparado no Exemplo 15 foi introduzido na cepa de Saccharomyces cerevisiae CEN.PK-1D juntamente com o pRS-415- pGPD-pps, pRS-415-pADH-pps, e pRS-415-pTEF-pps, e cada cepa resultante foi semeada em um meio sólido sintético completo (SC), no qual Trp, Ura, e His são excluídos, e cultivados durante a noite em uma incubadora de 30 ℃. Uma alça de platina da cepa cultivada durante a noite no meio sólido sintético completo (SC), no qual Trp, Ura, e His são excluídos, foi inoculado em um meio de titulação de 25 ml e, em seguida, foi cultivado em uma incubadora de 30 ℃ a 150 rpm por 24 horas. Os resultados são mostrados na TABELA 25 abaixo.
TABELA 25 24 Horas Con. Nome da Cepa OD Sacarídeo Shinorina (600nm) Residual (mg/l) CEN.PK-1D WT + pRS413-pGPD- Ava_A-pGPD-Ava_B, pRS414-pGPD- 11,2 0 340 Ava_C-pGPD-Ava_D CEN.PK-1D(pADH-pps) + pRS413- pGPD-Ava_A-pGPD-Ava_B, pRS414- 13 0 375 pGPD-Ava_C-pGPD-Ava_D CEN.PK-1D(pTEF-pps) + pRS413- pGPD-Ava_A-pGPD-Ava_B, pRS414- 12,1 0 410 pGPD-Ava_C-pGPD-Ava_D CEN.PK-1D(pGPD-pps) + pRS413- pGPD-Ava_A-pGPD-Ava_B, pRS414- 12,5 0 580 pGPD-Ava_C-pGPD-Ava_D
[0168] Conforme mostrado na TABELA 25 acima, foi confirmado que a quantidade de produção de shinorina foi aumentada em 70% na cepa, na qual o gene pps é superexpresso, em comparação com a cepa WT. Além disso, foi adicionalmente confirmado que à medida que a força do promotor aumentava (isto é, pGPD> pTEF> pADH), a quantidade de produção de shinorina foi aumentada.
EXEMPLO 19: AUMENTO DA QUANTIDADE DE PRODUÇÃO DE SHINORINA ATRAVÉS DA INTENSIFICAÇÃO DE TKL1, INTENSIFICAÇÃO DE ARO4, E
[0169] Com base nos resultados dos Exemplos 16, 17, e 18, TKL1, ARO4, e genes pps (E. coli) foram selecionados como fatores eficazes que têm uma influência na biossíntese de shinorina em Saccharomyces cerevisiae, e foi feita uma tentativa para aumentar a biossíntese de shinorina através da intensificação simultânea desses três tipos de genes. Para a introdução desses três tipos de genes, os vetores pRS-415-pGPD- TKL1-pGPD-ARO4, e pRS-416-pGPD-pps foram preparados.
Especificamente, após as regiões de pGPD-TKL1 e pGPD-ARO4 serem conectadas por PCR de sobreposição, os vetores e produtos de PCR foram tratados com enzimas de restrição BamHI e SalI e, em seguida, ligados usando ligase de T4 para preparar o vetor pRS- 415-pGPD-TKL1-pGPD-ARO4.
[0170] Em seguida, o gene pps derivado de E. coli foi submetida ao PCR. Os produtos de PCR do gene pps e o vetor pRS- 416-pGPD foram tratados com enzimas de restrição BamHI e SalI e, em seguida, ligados usando ligase de T4 para preparar o vetor pRS-416-pGPD-pps. Os iniciadores e DNAs modelo usados para a preparação dos vetores são mostrados na TABELA 26 abaixo.
TABELA 26
SEQ ID NO Produto de PCR Modelo Usado (Direção direta, Direção reversa) SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: pGPD S. cerevisiae gDNA 82 SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: TKL1 S. cerevisiae gDNA 84 SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: pGPD-TKL1 S. cerevisiae gDNA 84 SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: pGPD S. cerevisiae gDNA 86 SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: ARO4 S. cerevisiae gDNA 88 SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: pGPD-ARO4 S. cerevisiae gDNA 88 SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: pGPD-TKL1-pGPD-ARO4 S. cerevisiae gDNA 88 SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: ppsA E.coli MG1655 gDNA 80
[0171] Em seguida, o plasmídeo para biossíntese de shinorina preparado no Exemplo 15 foi introduzido na cepa de Saccharomyces cerevisiae CEN.PK-1D juntamente com os vetores pRS-415-pGPD-TKL1-pGPD-ARO4 e pRS-416-pGPD-pps, e cada cepa resultante foi semeada em um meio sólido sintético completo (SC), no qual Leu, Trp, Ura, e His são excluídos, e cultivados durante a noite em uma incubadora de 30 ℃. Uma alça de platina da cepa cultivada durante a noite no meio sólido sintético completo (SC), no qual Leu, Trp, Ura, e His são excluídos, foi inoculada em um meio de titulação de 25 ml e, em seguida, foi cultivada em uma incubadora de 30 ℃ a 150 rpm por 24 horas. Os resultados são mostrados na TABELA 27 abaixo.
TABELA 27 24 Horas Sacaríd Con. Nome da Cepa eo Shinorina OD (600nm) Residua (mg/l) l CEN.PK-1D WT + pRS413-pGPD- Ava_A-pGPD-Ava_B, pRS414-pGPD- 11,2 0 333 Ava_C-pGPD-Ava_D CEN.PK-1D WT+ pRS413-pGPD- Ava_A-pGPD-Ava_B, pRS414-pGPD- 13,3 0 1.100 Ava_C-pGPD-Ava_D, p415-pGPD- TKL1-pGPD-ARO4, p416-pGPD-pps
[0172] Conforme mostrado na TABELA 27 acima, foi confirmado que a quantidade de produção de shinorina foi significativamente aumentada em 230% na cepa, na qual os três tipos de genes eficazes (isto é, pps, TKL1, e ARO4) são superexpressados, em comparação ao da cepa WT.
[0173] Neste relatório descritivo, foram omitidas as descrições detalhadas dos conteúdos podem ser totalmente reconhecidos e inferidos por um versado na técnica da presente revelação. Além disso, para as modalidades específicas descritas neste relatório descritivo, várias modificações são possíveis sem alterar o espírito técnico ou as constituições essenciais da presente revelação. Portanto, a presente revelação pode ser implementada de uma maneira diferente daquelas especificamente descritas e exemplificadas neste relatório descritivo, que pode ser entendido por aqueles versados na técnica.
Claims (7)
1. Microrganismo caracterizado por produzir um aminoácido do tipo micosporina, em que a atividade de pelo menos uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em 2-desidro- 3-desoxifosfo-heptonato aldolase, fosfoenolpuvirato sintetase e transcetolase é aprimorada.
2. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o microrganismo é caracterizado por compreender adicionalmente um aglomerado de gene para biossíntese de aminoácido do tipo micosporina.
3. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o aglomerado de gene para biossíntese de aminoácido do tipo micosporina compreender um gene que codifica pelo menos uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em 2-desmetil 4-desoxigadusol sintase, O- metiltransferase e uma C-N ligase.
4. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o aglomerado de gene para biossíntese de aminoácido do tipo micosporina compreender um gene que codifica pelo menos uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em peptídeo sintetase não ribossomal, enzima do tipo peptídeo sintetase não ribossomal (enzima do tipo NRPS) e D- alanina D-alanina ligase (D-Ala D-Ala ligase).
5. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o microrganismo é caracterizado por ser um microrganismo do gênero Corynebacterium ou um microrganismo do gênero Escherichia ou levedura.
6. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o aminoácido do tipo micosporina ser pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em micosporina-2- glicina, palitinol, ácido palitênico, desoxigadusol, micosporina-metilamina-treonina, micosporina-glicina-valina, palitina, asterina-330, shinorina, porfira-334, euhalotece-362, micosporina-glicina, micosporina-ornitina, micosporina-lisina, micosporina-ácido glutâmico-glicina, micosporina-metilamina- serina, micosporina-taurina, paliteno, palitina-serina, palitina-serina-sulfato, palitinol e usujireno.
7. Método para produzir um aminoácido do tipo micosporina caracterizado por compreender: cultivar o microrganismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em um meio; e recuperar o aminoácido do tipo micosporina do meio ou microrganismo cultivado.
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