KR101833895B1 - 미코스포린―유사 아미노산을 함유한 창상 치유용 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents
미코스포린―유사 아미노산을 함유한 창상 치유용 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acid)을 함유한 창상 치유용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acid)을 유효성분으로 함유하는 창상 치유용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 미코스포린-유사 아미노산은 피부 세포에 독성이 없으면서도 상처 치유에 탁월한 효능이 있어, 창상 치료 또는 피부 재생, 또는 피부 손상 회복에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 미코스포린-유사 아미노산은 피부 세포에 독성이 없으면서도 상처 치유에 탁월한 효능이 있어, 창상 치료 또는 피부 재생, 또는 피부 손상 회복에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acid)을 함유한 창상 치유용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acid)을 유효성분으로 함유하는 창상 치유용 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
인간이 살아가는데 있어서, 창상은 필수불가결하게 일어나기에 창상의 빠른 치유를 위한 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 창상의 치료를 위한 2012년 전체 창상 치료제 시장은 연간 125억 달러에 달할 것으로 예측할 정도로 시장성 또한 크다(The Global Market for Advanced Wound Care Products 2008; Espicom Business Intelligence).
창상 치유는 손상에 대한 조직의 반응이며, 조직 회복의 과정으로, 주화성(chemotaxis), 세포의 분화 및 복제 (differentiation and replication), 기질단백질(matrix protein)의 합성, 혈관의 신생, 창상의 재구성 등을 포함하는 복잡한 생물학적 과정이다(Steed, et al., Clin. Plast. Surg. 25: 397-405, 1998). 이러한 창상 치유 과정의 초기에 나타나 이후 과정을 조절하는 대표적인 물질 중의 하나로 성장인자를 들 수 있는데, 이들은 창상 치유 과정 전반에 걸쳐 강력한 영향을 미치면서 세포의 성장, 분화, 대사 등을 조절하고, 창상 주변 환경 또한 조절하므로, 이를 이용한 치료의 개발이 꾸준히 진행되고 있다. 특히, 창상에 있어서 그동안 피부 독성이 없으면서도 피부의 재생을 효과적으로 촉진시키는 약제의 개발이 끊임없이 요구되어 왔다.
한편, 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acid)에 관하여서는 자외선 차단 효능에 관하여 언급된 문헌(특허문헌 1)은 있으나, 그 외의 용도에 대해서는 많이 연구되어 있지 않다.
본 발명자들은 미코스포린-유사 아미노산이 세포 독성이 없으면서도 창상 치유 또는 개선, 피부 재생, 피부상처 회복에 탁월함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 우수한 상처 치유 효능을 가지는 미코스포린-유사 아미노산(MAA)을 유효성분으로 함유하는 창상 치유용, 피부 재생용 또는 피부 손상회복용 피부 외용제 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 미코스포린-유사 아미노산(MAA)을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명은 인체에 안전하면서도 상처 치유 효능이 우수한 미코스포린-유사 아미노산 함유 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 피부 상처 회복 효능을 가지는 미코스포린-유사 아미노산(MAA)을 함유하는 것을 특징으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 미코스포린-유사 아미노산(MAA)을 제조하여 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 미코스포린-유사 아미노산(MAA) 자체 또는 분말화하여 정제수에 혼합시켜 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 미코스포린-유사 아미노산(MAA) 자체 또는 분말화하여 정제수에 혼합시킨 다음, 초음파 추출 또는 열수 추출하여 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 미코스포린-유사 아미노산(MAA)을 이용한 창상 치유, 피부 재생 또는 피부 손상 회복 방법에 관한 것으로, 구체적으로는, 상기 미코스포린-유사 아미노산(MAA)을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 방법이다. 여기서의 대상은, 인간을 포함하는 동물, 식물, 미생물 등에 해당하는 것으로, 투여는 in vivo, 또는 in vitro로 수행될 수 있으며, 종래에 알려져 있는 다양한 투여 방법, 투여 형태 등을 이용하여 적절하게 수행될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 미코스포린-유사 아미노산을 함유하는 창상 치유용, 창상 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
미세조류를 비롯한 남조류, 균류 및 해조류 등 광합성 생물은 단기적 및 장기적으로 자외선에 노출되는 환경에서 서식하기 때문에 자외선에 의한 세포 및 조직의 손상을 극복할 수 있는 다양한 기작을 진화시켜 왔다. 자외선에 의해 유도되는 DNA 손상의 회복. 해독효소. 카로티노이드 축적, 라디칼 소거자, 항산화제 및 자외선 흡수/차단 화합물의 합성 등을 통하여 자외선에 의한 손상을 감소시킨다. 자외선 흡수/차단 화합물 중 MAAs는 자외선 광차단 유기능이 알려지면서 주목을 받고 있다. 본 발명에 있어서, MAAs는 남조류, 균류, 미세조류 및 해조류 등 대부분의 광합성 식물에서 합성되는 자외선 흡수물질이다. 약 20여종의 MAAs가 존재하는 것으로 알려져 있으며 최대흡수 파장은 310-360 nm이다.
예시적인 MAA로는 미코스포린-타우린, 미코스포린-글리신, 팔리틴, 팔리틴-세린-설페이트, 팔리틴-세린, 미코스포린-메틸아민-세린, 미코스포린-메틸아민-트레오닌, 아스테리나-330, 미코스포린-글루탐산-글리신, 팔리티놀, 미코스포린-2-글리신, 시노린, 포르피라-334, 미코스포린-글리신-발린, 팔리테닉산, 우수지렌, 팔리텐, 또는 유할로테세-362 등이 있다.
본 발명에 있어서, MAA는 일반적으로 상기와 같은 조류로부터 추출하여 사용한다. 예를 들어, 한국해양과학기술원(Korea Institute of Ocean Science and Technology, kiost)로부터 조류 클라미도모나스 헤들레이이(Chlamydomonas hedleyi) 와 포르피라 예조엔시스(Porhyra yezoensis)를 제공받아 대량배양하고, 이로부터 메탄올로 추출하여 획득할 수 있다.
일 관점에서, 본 발명은 미코스포린-유사 아미노산을 유효성분으로 함유하는 창상 치유용 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 미코스포린-유사 아미노산(MAA)은 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량%로 함유할 수 있다. 이러한 비율은 단지 바람직한 범위일 뿐이며, 예컨대, 하기 실시예에서는 1 중량%,또는 2.5중량%, 5중량%, 10중량% 등의 경우를 실험한 결과를 포함하고 있으나, 이 이외에 1%, 0.5% 이하, 20%, 30% 이상 경우도, 우수한 창상 치유, 개선, 피부 재생, 피부손상 회복 효능 등을 가짐은 당업자에게 자명하다. 아울러, 이러한 MAA가 얻어지는 미세조류 배양액을 포함하여도, 상기와 같은 창상 치유효과가 나타나므로, 이러한 미세조류 배양액을 함유한 창상 치유용 조성물 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명은 미코스포린-유사 아미노산(MAA)을 함유한 피부외용제 조성물의 제조방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 미코스포린-유사 아미노산(MAA)을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 미코스포린-유사 아미노산(MAA)을 함유하는 조성물을 제조하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계는 미코스포린-유사 아미노산들의 혼합물 형태로 얻어질 수 있다. 경우에 따라, 상기 미코스포린-유사 아미노산들의 혼합물로부터 분리된 특정 미코스포린-유사 아미노산일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계에서 얻어지는 미코스포린-유사 아미노산은 시노린, 포피라, 또는 마이코스포린 글라이신 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계는, 미세조류로부터 MAA를 수득하는 단계로, 구체적으로, MAA를 생산하는 것으로 알려져 있는 미세조류, 예를 들어 클라미도모나스 Chlamydomonas hedleyi), 포피라 예조엔시스 (Porhyra yezoensis), 레마네 플루비아틸리스(Lemanea fluviatilis), 포피라 엔디비폴리움(Porphyra endiviifolium), 김노곤그루스 터퀘티(Gymnogongrus turquetti), 포피라 움빌리칼리스(Porphyra umbilicalis), 마스토카퍼스 스텔라터스(Mastocarpus stellatus), 세라미움 루브룸(Ceramium rubrum), 그라실라리아 코르니아(Gracilaria cornea) 등으로부터 직접 또는 배양한 후(약 3일 내지 10일 동안 배양후) MAA를 수득할 수 있다.
상기와 같은 미세조류를 K2HPO4, 0.0972~0.1188; KH2PO4, 0.0504~0.0616; MgSO4·7H2O, 0.09~0.11; CaCl2·2H2O, 0.045~0.055; C4H11NO3, 2.1798~2.6642; C10H16N2O8, 0.045~0.055; BO3H3, 0.01026~0.01254; ZnSO4·7H2O, 0.0198~0.0242; MnCl2·4H2O, 0.004554~0.005566; FeSO4·7H2O, 0.004491~0.005489; CoCl2·6H2O, 0.001449~0.001771; CuSO4·5H2O, 0.001503~0.001837; MO7O24(NH4)6·4H2O, 0.00099~0.00121; Glucose 2~25, 바람직하게는, 5~15, 2~10, NH4Cl 50~600 μΜ 바람직하게는, 100~500 μΜ를 포함하는 배지, 더 자세히는 K2HPO4, KH2PO4, MgSO4·7H2O, CaCl2·2H2O, CuSO4·5H2O를 포함하며, 트레이스 금속(tract metals)인 ZnSO4·7H2O, MnCl2·4H2O, pH 버퍼로써 FeSO4·7H2O (Acidified Iron Solution)를 포함하는 배지에서 배양한 후 수확하여 건조하고, 건조된 미세조류를 알코올 (예를 들어, 메탄올)로 추출하여 추출액을 얻는다. 예를 들어, 20mg의 건조된 조류를 20 % 메탄올에 45℃에서 2시간 추출하고, 실온에서 10분간 원심분리 후, 상층액은 버린다. 100 ul의 클로로포름을 넣고 잘 섞은 후에 정제수 500 ul를 넣고 침전시키고 다시 원심분리하면 상층액이 미코스포린-유사 아미노산들(total MAA)이다.
이러한 상층액에는 다양한 종류의 미코스포린-유사 아미노산들이 포함되어 있으며, 복수 종의 미코스포린-유사 아미노산들이 혼합된 형태의 경우에는 앞서 설명한 각 미코스포린-유사 아미노산이 가지는 고유의 흡수최대파장과 머무름 시간을 가지고 시간에 따라 분리할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계에서 얻어지는 미코스포린-유사 아미노산을 (b)단계에서는 본 발명이 속한 기술분야에 공지된 방법으로 피부외용제 조성물을 제조하는 것을 포함한다.
여기서, 미코스포린-유사 아미노산(MAA) 건조물 자체 또는 분말화하여 정제수에 혼합시킨 다음, 냉수 추출, 열수 추출 또는 에탄올 추출하여 조성물을 제조하는 과정을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, "추출물"은 상기 미코스포린-유사 아미노산(MAA)를 건조하거나, 건조물을 분말화하거나, 냉수추출법, 열수추출법, 에탄올 추출법 등 종래 알려진 다양한 추출법에 의해 수득한 추출물을 의미한다.
본 발명에서 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 추출, 열수 추출 등이 있다. 여기서, 열수추출의 경우, 열탕증류기에서 8~48시간동안, 80~100℃ 로 가열하여 열수 추출물을 얻는다.
냉수 추출의 경우, 예컨대, 냉수 (15-25℃)에 상기 미코스포린-유사 아미노산 건조 분말을 혼합하여 3일동안 추출하여 냉수추출물을 얻는다.
또는, 물, 유기 용매, 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출하는 방법으로 제조될 수 있다. 추출한 액은 바로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 생약의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 약제의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 예컨대, 에탄올 추출물의 경우, 바람직하게는 20-50% 에탄올 추출물, 일 구체예로써 50% 에탄올에 섞은 후 3일동안 교반하여 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 추출물은 농축, 또는 희석하여 사용할 수 있고, 추출물의 증류액을 사용할 수도 있다.
본 발명에 있어서, "유효성분으로 함유하는"의 의미는, 피부 외용제 조성물로써 피부 손상 회복, 피부 재생, 창상 치유, 창상 개선에 따른 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물일 수 있다.
상기 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.
상기 담체는 본 발명의 피부 외용제 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 피부 외용제 조성물이 제조되는 후술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로써, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 상기 미코스포린-유사 아미노산(MAA) 이외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글키롤, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 항료, 착색료, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은, 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 화장수, 에센스, 젤, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀 (소프트 캅셀, 하드 캅셀) 제형 등의 형태로 제조될 수 있다.
본 발명에 있어서의 피부는 얼굴 뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 피부 외용제 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 미코스포린-유사 아미노산(MAA)을 함유 피부 외용제 조성물의 제조방법은 전술한 제조방법에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 제조방법을 일부 변형시킨 방법으로도 본 발명에 따른 미코스포린-유사 아미노산(MAA)을 함유 피부 외용제 조성물을 제조할 수 있다.
특히, 상기 피부 외용제 조성물은 본 발명에 특별히 개시된 제조방법 이외에도, 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다.
화장료 조성물로 제조될 경우, 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.
또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일,염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
이러한, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 콜라겐 합성 증진능에 따른 주름 개선, 피부 보습, 피부 미백, 피부 진정, 항산화 등을 할 수 있는 등 항노화의 기능성 화장품의 형태를 포함한다.
본 발명에 있어서, 약제학적 조성물의 경우, 하기 실시예에서 제시하는 피부 상태 개선을 위한 약제학적 조성물로써 기능할 수 있다.
이러한 약제학적 조성물은 유효성분인 미코스포린-유사 아미노산(MAA) 외에, "약학적으로 허용가능한 담체"를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제 및 방부제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 약학 조성물은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 상기 첨가제로 향료, 비타민, 및 항산화제가 포함될 수 있다. 상기 담체로 약제학적으로 허용 가능한 담체는 모두 가능하며, 예를 들면, 희석제로는 유당, 덱스트린, 타피오카(tapioca) 녹말, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스일 수 있다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈, 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 또는 잔탄검, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨일 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 경구 투여제제, 주사제, 좌제, 경피 투여제제, 및 경비 투여제제의 제형으로 제제화되어 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 제형은 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 또는 엑스제와 같은 경구 투여용 제형일 수 있다.
본 발명에 따른 미코스포린-유사 아미노산은 피부 세포에 독성이 없으면서도 상처 치유에 탁월한 효능이 있어, 창상 치료 또는 피부 재생, 또는 피부 손상 회복에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 MAAs의 특성을 분석한 결과이다. (A. SH, P334와 M-Gly의 HPLC-DAD(330nm) chromatograms ; B. SH, P334와 M-Gly의 Triplequadruple ESI-MS/MS spectra)
도 2는 MTT assay를 통한 세포 독성(안정성) 시험 결과이다 (A. M-Gly ; B. P334 ; C. SH)
도 3 및 도 4는 인간 피부각질세포에 인위적인 상처를 가한 후 MAAs의 처리에 의한 상처치유효과를 비교한 실험이다. 도 3의 a는 상처를 가한 직후 (t=0)를 나타내며, b-f는 상처를 가하고 난 후 24시간이 지나 상처치유가 된 모습을 나타낸다. b는 대조군 (MAAs를 처리하지 않은)이며, c는 positive control로 이미 상처치유효과가 입증된 epidermal growth factor (EGF) 처리군이다. d, e, f 순서로 M-Gly, P334, SH 처리군을 나타낸다. 도 4는 도 3의 결과를 대조군 (b, t=24)과 비교하여 수치화 (%) 시킨 그래프이다.
도 5는 MAAs에 의한 FAK, ERK, JNK의 활성 시험 결과이다 (A. MAAs에 의한 FAK, ERK, JNK의 활성 ; B. 각 band의 intensity 측정 및 GAPDH의 normalization ; C. FAK, ERK 저해제의 효과 ; D. JNK 저해제의 효과).
도 6은 ERK와 JNK 저해제에 의한 MAAs의 상처치유 효과를 확인한 결과이다 (A-B. ERK 저해제에 의한 MAAs의 상처치유 효과 감소 ; C-D. JNK 저해제에 의한 MAAs의 상처치유 효과 저해).
도 2는 MTT assay를 통한 세포 독성(안정성) 시험 결과이다 (A. M-Gly ; B. P334 ; C. SH)
도 3 및 도 4는 인간 피부각질세포에 인위적인 상처를 가한 후 MAAs의 처리에 의한 상처치유효과를 비교한 실험이다. 도 3의 a는 상처를 가한 직후 (t=0)를 나타내며, b-f는 상처를 가하고 난 후 24시간이 지나 상처치유가 된 모습을 나타낸다. b는 대조군 (MAAs를 처리하지 않은)이며, c는 positive control로 이미 상처치유효과가 입증된 epidermal growth factor (EGF) 처리군이다. d, e, f 순서로 M-Gly, P334, SH 처리군을 나타낸다. 도 4는 도 3의 결과를 대조군 (b, t=24)과 비교하여 수치화 (%) 시킨 그래프이다.
도 5는 MAAs에 의한 FAK, ERK, JNK의 활성 시험 결과이다 (A. MAAs에 의한 FAK, ERK, JNK의 활성 ; B. 각 band의 intensity 측정 및 GAPDH의 normalization ; C. FAK, ERK 저해제의 효과 ; D. JNK 저해제의 효과).
도 6은 ERK와 JNK 저해제에 의한 MAAs의 상처치유 효과를 확인한 결과이다 (A-B. ERK 저해제에 의한 MAAs의 상처치유 효과 감소 ; C-D. JNK 저해제에 의한 MAAs의 상처치유 효과 저해).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
MAA
수득 및 특성 분석
1. 1 MAAs 배양
세 종류의 MAAs(포피라-334(P334), 시노린(SH), 마이코스포린-글라이신(M-Gly))은 한국해양과학기술원에서 받은 클라미도모나스와 포피라 예조엔시스(Porphyra Yesoansis)로부터 추출하였다. 500ml 플라스크에 250ml의 Guillard's f/2 medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 넣고 초기 세포 접종양은 5 X 104cells/mL로 클라미도모나스, 포피라 예조엔시스를 각각 접종하고 온도조절 수족관에서 23-25 ℃에서 배양하였다. 배양액의 pH는 8에서 9로 유지하고 CO2의 농도는 1%로 유지하여 배양하였다. 세포 배양 7일 후, 세포를 수확하고 동결건조기로 건조하였다. 이 배양 시스템에서 대략적인 MAAs의 양과 건조중량(DW)은 각 ~3.72g/L, ~0.01mg/g DW이다.
1.2. MAAs의 분석 및 동정
건조한 조류(건조중량 20mg)는 20% 메탄올(v/v)로 45℃에서 2시간 동안 추출하였다. 실온에서 5000 X g로 10분동안 원심분리하고, 상층액을 취하여 45℃에서 진공장치(Jouan evaporator centrifuge RC 10.09, Cedex, France)를 이용하여 건조하였다. 진공 건조 후, 침전물질을 500㎕의 정제수로 녹이고 100㎕ 클로로폼 용액을 넣어 잘 섞어주고, 이 용액을 10,000 X g에서 5분동안 원심분리를 하여 상층액을 조심스럽게 새 마이크로센트리퓨즈 튜브에 옮겨 용매를 증발시키고 50% 메탄올로 녹였다.
이렇게 얻은 시료는 diode array detection(DAD)-SPD M20A 검출기(Quantum Northwest, Seattle, WA, USA)가 있는 high-pressure reverse-phase liquid chromatography (HPLC) (Shimadzu-LC20A, Seattle, WA, USA)를 이용하여 정량분석 하였다. 시료를 30-60㎕로 분주하여 100% HPLC용 메탄올로 최종 볼륨이 0.5ml이 되도록 희석해서 진공 회전농축기로 건조하였다. 건조된 시료를 다시 600㎕을 정제수로 녹이고 수산화암모늄과 0.2% 트리플루오로아세트산(pH 3.0) 용액 10배 희석하였다. 희석한 용액은 0.45 uM 필터로 필터하여 불용성 물질이나 입자가 큰 물질을 제거하였다. 필터 후 얻어진 용액을 10㎕를 1ml/min 유량으로 설정한 HPLC 시스템에 주입하였으며, HPLC를 통해 얻어진 결과는 Class-VP software (Quantum Northwest, Seattle,WA, USA)로 분석하였다. 결과는 스페인 말라가대학교의 F. Figueroa에게 받은 P334, SH, M-Gly의 표준물질을 high-resolution reverse-phase liquid chromatography/mass spectrometry(HPLC/MS)로 분석하였고, 검정에 따른 각 MAAs의 흡수최대파장과 머무름 시간으로 MAAs를 식별하였다.
예시-HPLC를 이용한 SH 분리정제
Waters 1525μ Binary HPLC pump, Waters 996 photodiode array detector를 사용하였고 분리 정제를 위해 Gemini 5μ C18 110 A(5μm, 4.6 × 250nm, Phenomenex) column을사용하였다. 분석을 위한 용매는 0.1% trifluoroacetic acid(TFA)를 포함한 water(용매 A)와 acetonitrile(용매)를 사용하였고 1ml/min의 유속으로 332nm(Porphyra의 경우 334nm, M-Gly의 경우 332nm) 파장에서 검출하였다.
1.3. MS/MS 분석
건조한 MAAs 추출물은 정제수(1mg/ml)로 녹이고 최종 농도가 100ppm이 되도록 0.1% 포름산이 포함된 50% 메탄올로 희석하여 0.45-μm 멤브레인 필터로 필터하였다. MAAs 분석은 AB SCIEX 3200 QTRAP MS/MS (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)와 ESI source (TurbolonSpray, Applied Biosystem/MDS SCIEX, Concord, Canada)로 구성된 ESI-MS/MS 시스템(Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)으로 수행하였다. 결과는 AB SCIEX Analyst 1.5 software (AB SCIEX Korea Limited Company, Seoul, Korea)로 분석하였고, MAAs는 positive mode인 Product Ion (MS2) mode에서 정량하였다. 실린지 펌프 방법의 특징(Tune control)은 실린지 직경이 4.6mm이며, 유량은 10.00㎕/min이며, 최적의 ESI 소스의 상태는 turbo heater temperature (TEM) 300℃, 아이온 스프레이 전압 5500V, 커튼 가스 10 psi, 분무 가스(가스1) 15 psi, 가열된 가스(가스2) 40 psi이다. Collision energy(CE)와 entrance potential(EP)는 각각 35V와 4.5V로 하였고, MAAs의 질량 전이시, 최적의 declustering potential(DP)는 51V, collision cell exit potential (CXP)는 4V로 설정하였다.
상기와 같은 실험에 따라, MAAs는 DAD로부터 얻어진 UV 흡수 스펙트럼과 HPLC의 머무름 시간에 기초하여 분류하였다. SH, M-Gly과 P334의 머무름 시간은 각각 4.395, 5.356, 6.252분이었다. DAD의 UV-VIS 흡수 스펙트럼의 빠른 수집에도 불구하고, MAAs는 최대 흡수 파장이 거의 몇 nm밖에 차이가 나질 않아 각각의 흡수 스펙트럼은 잘 구별하기가 어려웠다. 이를 극복하기 위해 HPLC/MS를 사용하였고, electrospray ionization(ESI) 질량 스펙트럼의 조각 패턴으로 각각 SH, M-Gly과 P334의 특성을 구분하였다.(도 1)
MAAs의 세포독성(cell viability) 시험
MAAs의 상처치유능을 실험하기 전에 인간 각질 세포(HaCaT)를 이용해 MAAs의 세포독성을 시험하였다. MTT assay (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)는 세포 생존력을 측정하는 방법이다.
본 실험에 사용된 세포는 인간 각질 세포(HaCaT)로 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. HaCaT 세포를 10% 소태아혈청(FBS)와 2mM L-글루타민, 100U·m- 1페니실린-스트렙토마이신이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Hyclone, Logan, UT, USA)으로 96-웰 마이크로플레이트에서 접종하여 가습적인 환경에서 배양하였다. 배양 24시간 후, 세포에 실시예 1에서 얻어진 M-Gly, SH, P334를 각 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1mg/ml로 처리하여 24시간동안 추가 배양하였다. 그 후, 배양액에 100㎕ MTT 용액(세포 배양 배지의 0.5mg/ml)을 처리하고 37℃에서 4시간동안 배양하고, 배지를 제거한 후 100㎕ 디메틸술폭시드(DMSO)를 넣어 MTT formazan을 녹이고 분광광도계로 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, M-Gly와 P334를 처리한 경우 고농도(0.5~1mg/ml)에서 세포독성이 증가함을 관찰하였다. 반면에 0.01~0.1mg/ml의 저농도에서는 안정적이었다. SH의 경우에도 마찬가지로 저농도(0.01~0.05mg/ml)에서 세포독성이 최소로 관찰되었다. 상기의 결과를 통해 M-Gly, P334와 SH의 적은 농도에서 HaCaT 세포 독성이 없음을 확인하였다.(도 2)
MAAs의 상처치유 효과
MAAs의 UV 보호능과 ROS 소거능과 같은 다양하고 우수한 효능이 연구되고 있지만, 아직 MAAs의 피부세포의 상처치유능에 대한 보고되지 않았다. 상처치유 과정은 염증, 새로운 조직 형성 및 리모델링에 포함되는 중요한 과정으로, 피부세포의 이동은 상처치유에 필수적이다. M-Gly, SH와 P334이 사람 피부세포에서 상처치유에 어떠한 영향을 미치는지를 시험하기 위해, HaCaT 세포에 각각의 MAA를 처리하고 상처가 치유되는 정도를 측정하였다. 양성 대조군으로 상처치유에 효과적이라고 알려진 EGF를 사용하였다.
구체적으로, 각질세포(HaCaT)를 6-웰 디쉬에 접종하고 디쉬 표면에 100%로 세포가 찰 때까지 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 배양 후 100㎕ 파이펫의 팁으로 세포 표면에 스크래치를 내어 상처를 만들어주고, 새로운 배양액으로 한번 헹궈 주고 vehicle, EGF (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 실시예 1에서 얻어진 MAAs (M-Gly, P334, SH)를 각각 함유한 배양액(2ml)을 넣고 배양하였다. 처리시, 배양액 2 ml내에 EGF 100 ng/ml, M-Gly 0.1mg/ml, P334 0.05 mg/ml, SH 0.05 mg/ml의 농도가 되도록 하였다. 일정한 배양시간이 지난 후 AxioObserver FL 현미경 (Advanced Microscopy Group, Bothell, WA, USA)을 사용하여 10배율로 세포 이미지를 측정하였다. 상처 부분에 세포 이미지는 세 부분이상 측정하였고, 상처의 봉합되는 정도의 퍼센트는 ImageJ software (http://imagej.nih.gov/ij/index.html)를 사용하여 계산하였다. 모든 실험은 세 번 반복 수행하였다.
도 3a는 상처를 가한 직후 (t=0)를 나타내며, b는 대조군 (MAAs를 처리하지 않은)으로 상처 후 24시간이 지난 뒤 상태를 나타낸다. 그 결과, MAAs는 사람 피부세포에서 상처 치유 기전을 자극하여 상처치유를 촉진함을 확인하였다.(도 3 및 도 4)
FAK
-MAP
kinase의
활성을 통한
MAAs에
유도된 상처치유 기전 확인
M-Gly, SH와 P334에 의해 조절되는 상처치유 메커니즘을 확인하기 위해 관련 기전에 해당되는 단백질의 발현을 확인하였다. 세포 이동의 과정에서는 다양한 시그널링 단백질의 변화가 일어나게 되는데, 그 중 focal adhesion kinase(FAK)와 non-receptor protein tyrosine kinase(PTK)가 세포 이동에 결정적인 조절인자로 알려져 있다. FAK의 활성은 세포이동과 상처치유를 촉진한다고 보고되고 있다. 따라서 MAAs에 의한 상처치유가 FAK 활성에 따른 것인지 시험하였다.
Western blot 분석을 위해, 배양한 인간 피부각질세포를 1X PBS로 헹궈주고, 프로테이즈와 포스파테이즈 저해제(Roche)가 함유된 RIPA 버퍼(150mM NaCl, 50nM Tris, 1% Triton-X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)로 세포를 용해하였다. 이 세포 용해액은 12,000 X g에서 1분간 원심분리하여 세포 추출물을 얻었다. Bio-Rad Protein Assay reagent (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 세포 추출물의 단백질을 정량하였다. 동일한 양의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel에 로딩하여 전기영동 하였고, 전기영동 후에, 나이트로셀룰로스 멤브래인으로 단백질을 이동시켰다. 그 후 멤브래인을 5% 탈지유 용액(0.1% Tween 20이 포함된 Tris-buffered saline)에 담가 실온에서 1사간 동안 blocking 하였다. Blocking 후, 1차 항체 용액을 멤브래인에 넣고 4℃에서 밤새도록 반응시키고, 그 다음에 horseradish peroxidase가 달려있는 2차 항체를 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, Chemiluminescence Western Blot Detection System(BioSpectrumr 600 Imaging System, Upland, CA, USA)를 사용하여 블랏을 이미지를 얻었다. 1차 항체는 pFAK (pY397, BD biosciences, San Jose, CA, USA), pErk (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), pAkt(Cell Signaling, Danvers, MA, USA), pJNK (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 사용하였다. 저해제는 PD98059 (ERK inhibitor, Cell signaling, Danvers, MA, USA), FAK14 (FAK inhibitor, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), SP600125 (JNK inhibitor, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 사용하였다.
그 결과, 도 5A에서 볼 수 있듯이, M-Gly, SH와 P334를 처리하였을 때 FAK의 Y397 부분에 인산화가 증가하는 것을 확인하였다. 또한, MAAs를 처리한 경우 인산화된 FAK가 조절할 수 있는 MAPKs extracellular signal-regulated kinase(ERK)의 활성도 관찰하였다. MAAs에 의한 FAK, ERK, JNK1/2의 활성증가를 도 5A의 결과를 수치화하여, B와 같이 각각의 단백질 활성도를 그래프로 나타내었다. 이러한 결과로 MAAs에 의한 FAK와 ERK의 활성을 통해 피부세포의 상처치유가 이루어짐을 알 수 있다. 또한 JNK는 초파리모델, 물고기 피부세포 등에서 세포이동에 활성을 보이는 단백질로 최근 연구되고 있으며, JNK1의 활성이 상처치유에 기전에 포함될 수 있음을 보여준다. 따라서 본 시험에서 MAAs가 JNK 활성에 미치는 영향을 시험하였고, 그 결과 MAAs를 처리한 경우 JNK1의 활성이 유도되었고, 이는 M-Gly, SH와 P334에 의해 상처치유 효과가 있음을 보여주었다. 도 5C 및 D 실험을 통해 FAK, ERK, JNK의 활성을 저해하는 각각의 저해제 (DMSO; 저해제를 녹이는 용매, 저해제를 미포함한 대조군, PD98059; ERK 저해제, FAK14; FAK 저해제, SP600125; JNK 저해제)를 처리하고 MAAs를 처리하였을 때 현저하게 각각의 활성이 감소함을 확인하였다. 또한, FAK의 활성 저해는 ERK와 JNK1의 활성도 저해함을 관찰하였고, 이를 통해 FAK의 활성이 ERK와 JNK1의 활성에 상위단계의 기전임을 확인할 수 있었다.(도 5)
MAAs에
의한 상처치유에서
ERK와
JNK의
활성
MAAs에 의해 유도된 피부세포의 상처치유에서 ERK와 JNK 활성의 중요성을 시험하고자 피부세포에 ERK와 JNK 저해제를 미리 처리하여 상처치유 실험을 수행하였다.
인간 피부각질세포(HaCaT)를 6-웰 디쉬에 접종하고 디쉬 표면에 100%로 세포가 찰 때까지 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 한번 헹군 후 PD98059(ERK 저해제, 도 6A의 f-h) 또는 SP600125(JNK 저해제, 도 6C의 f-h)를 함유, 미함유(도 6A와 6C의 c-e)한 배양액(2ml)을 넣고 30분간 전처리하였다. 30분 후 vehicle 및 MAAs (M-Gly, P334, SH)를 각각 처리하고 100㎕ 파이펫의 팁으로 세포 표면에 스크래치를 내어 상처를 만들었다. 일정시간이 지난 후 AxioObserver FL 현미경 (Advanced Microscopy Group, Bothell, WA, USA)을 사용하여 10배율로 세포 이미지를 측정하였다. 상처 부분에 세포 이미지는 세 부분이상 측정하였고, 상처의 봉합되는 정도의 퍼센트는 ImageJ software (http://imagej.nih.gov/ij/index.html)를 사용하여 계산하였다. 모든 실험은 세 번 반복 수행하였다.
도 6A는 ERK 저해제 (PD98059)를 처리한 군 (f-h)와 처리하지 않은 군(DMSO, c-e)의 상처치유효과를 비교한 실험이다. 도 6C는 JNK 저해제 (SP600125)를 처리한 군 (f-h), 처리하지 않은 군 (DMSO, c-e)의 상처치유효과를 비교한 실험이다. 인간 피부각질 세포에 MAAs를 처치하기 전, ERK 저해제 (도 6Af-h) 또는 JNK 저해제 (도 6Cf-h)를 전처리하여 반응시킨다. 이 후 M-Gly (도 6Ac와 e, 6Cc와 e), P334 (도 6Ad와 g, 6Cd와 g), SH (도 6Ae와 h, 6Ce와 h)를 처리한다. 인위적으로 마이크로팁을 이용하여 상처를 가하고, 시간이 지남에 따라 상처가 치유되는 정도를 비교하였다. 도 6A 및 6C의 a는 상처를 가한 직 후의 모습을 나타내며, 6A 및 6C의 b는 위 실험의 대조군으로서, 상처를 가한 후 24시간이 경과한 모습을 나타낸다. 도 6B는 6A의 결과를 수치화 (%) 시킨 그래프이며, 6D는 6C의 결과를 수치화 (%) 시킨 그래프이다.
그 결과, ERK 저해제(PD98059)를 처리한 경우 상처치유 된 정도가 15%까지 감소하는 것을 확인할 수 있었고, JNK 저해제의 경우에는 MAAs에 의한 상처치유를 완전히 저해하는 것을 관찰하였다. 이러한 결과를 통해, MAAs에 의한 상처치유를 ERK와 JNK의 활성에 의해 촉진함을 알 수 있었고, 특히 JNK가 MAAs에 의해 유도되는 피부세포의 상처치유에 주요한 역할을 함을 확인하였다.(도 6)
상기의 결과를 통해 세가지 MAAs의 상처치유 효과를 확인할 수 있었고, 또한 세포 증식 및 이동, 상처치유에 주요하게 관여하는 FAK, ERK, JNK의 활성을 유도함을 관찰하였다. 따라서 MAAs는 기존에 알려진 UV로부터 피부를 보호하는 역할 뿐 아니라 상처치유과정을 촉진하는 효과가 있음을 확인하였고, 상처치유를 위한 화장품 및 의약품 소재로서의 가능성을 확인하였다
화장료 조성물의 제조
본 발명의 실시예 1의 미코스포린 유사 아미노산을 유효성분으로 함유하는 화장품으로 영양화장수, 크림, 에센스 등의 유화 제형의 화장품 및 유연화장수 등의 가용화 제형의 화장품을 제조하였다.
제조예 6-1: 화장수
다음 처방에 따라 통상의 화장수 제조 방법에 따라 제조하였다.
원 료 명 | 중량 %(w/w) |
글리세린 | 5.0 |
디프로필렌글리콜 | 3.0 |
히아루론산 | 0.5 |
폴리옥시에틸렌 경화피마자유 | 0.1 |
폴리에틸렌 올레일에틸 | 0.1 |
에탄올 | 5.0 |
방부제 | 0.15 |
항료 | 적량 |
착색료 | 적량 |
실시예 1의 미코스포린 유사 아미노산 | 2.0 |
정제수 | to 100 |
제조예 6-2: 에센스
다음 처방에 따라 통상의 에센스 제조 방법에 따라 제조하였다.
원 료 명 | 중량 %(w/w) |
세토스테아릴알코올 | 1.0 |
자기유화형모노스테아린산 | 1.0 |
밀납 | 0.5 |
스쿠알란 | 5.0 |
이소세틸옥타노에이트 | 3.0 |
디메틸실록산 | 0.3 |
모노스테아린산소르비탄 | 0.5 |
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜 | 8.0 |
글리세린 | 4.0 |
프로필렌글리콜 | 0.2 |
카르복시폴리머 | 0.22 |
트리에탄올아민 | 0.25 |
방부제 | 적량 |
향료 | 적량 |
착색료 | 적량 |
실시예 1의 미코스포린 유사 아미노산 | 7.0 |
정제수 | to 100 |
제조예 6-3: 로션
다음 처방에 따라 통상의 로션 제조 방법에 따라 제조하였다.
원료명 | 중량 %(w/w) |
세토스테아릴알코올 | 0.8 |
자기유화형모노스테아린산 | 1.0 |
밀납 | 0.5 |
스테아린산 | 0.5 |
유동파라핀 | 7.0 |
스쿠알란 | 5.0 |
마카데미아오일 | 3.0 |
이소세틸옥타노에이트 | 2.0 |
디메틸실록산 | 0.3 |
모노스테아린산소르비탄 | 0.5 |
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜 | 1.2 |
글리세린 | 4.0 |
프로필렌글리콜 | 4.0 |
베타인 | 4.0 |
카르복시폴리머 | 0.12 |
트리에탄올아민 | 0.15 |
방부제 | 0.25 |
향료 | 적량 |
착색료 | 적량 |
실시예 1의 미코스포린 유사 아미노산 | 5.0 |
정제수 | to 100 |
제조예 6-4: 크림
다음 처방에 따라 통상의 크림 제조 방법에 따라 제조하였다.
원 료 명 | 중량 %(w/w) |
세토스테아릴알코올 | 3.0 |
자기유화형모노스테아린산 | 1.5 |
친유형모노스테아린산 | 1.5 |
밀납 | 0.5 |
유동파라핀 | 8.0 |
스쿠알란 | 7.0 |
이소세틸옥타노에이트 | 4.0 |
정제호호바유 | 4.0 |
디메틸실록산 | 0.3 |
모노스테아린산소르비탄 | 1.0 |
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜 | 1.2 |
글리세린 | 6.0 |
프로필렌글리콜 | 4.0 |
베타인 | 4.0 |
산탄검 | 0.06 |
트리에탄올아민 | 0.10 |
방부제 | 0.25 |
향료 | 적량 |
착색료 | 적량 |
실시예 1의 미코스포린 유사 아미노산 | 7.0 |
정제수 | to 100 |
제조예 6-5: 젤
다음 처방에 따라 통상의 젤 제조 방법에 따라 제조하였다.
원료명 | 중량 %(w/w) |
글리세린 | 4.0 |
프로필렌글리콜 | 4.0 |
에탄올 | 10 |
폴리옥시에틸렌경화피마자유 | 0.1 |
카르복시폴리머 | 0.30 |
트리에탄올아민 | 0.30 |
방부제 | 적량 |
향료 | 적량 |
착색료 | 적량 |
실시예 1의 미코스포린 유사 아미노산 | 1.0 |
정제수 | to 100 |
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (7)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 다음의 단계를 포함하는, 자외선에 의한 손상이 아닌 상처 치유용 피부 외용제 조성물의 제조방법:
(a) 미코스포린-유사 아미노산(MAA)을 미세조류로부터 수득하는 단계; 및
(b) 상기 (a)단계에서 얻어진 미코스포린-유사 아미노산(MAA)을 함유하며,
상기 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acid)은 미코스포린-글리신, 시노린, 또는 포르피라-334인 것을 특징으로 하는 조성물의 제조하는 단계이고, 상기 (a) 단계는,
1) 20% 메탄올(v/v)으로 클라미도모나스(Clamydomonas) 또는 포피라 예조엔시스(Pophyra Yesoansis)를 추출하는 단계;
2) 상기 1) 단계의 추출물을 원심분리 한 뒤, 상층액을 건조하는 단계; 및
3) 건조된 침전물을 녹이고, HPLC를 통해 미코스포린-글리신, 시노린, 또는 포피라-334를 분리하는 단계를 포함하는, 자외선에 의한 손상이 아닌 상처 치유용 피부 외용제 조성물의 제조방법.
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