KR101458927B1 - 연두털말 추출물을 함유하는 피부외용제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명에 따른 연두털말 추출물 함유 피부 외용제 조성물은 피부 세포에 독성이 없으면서도, 티로시나아제 활성 억제, L-DOPA 산화 억제, 멜라닌 합성 저해능을 가지고 있어 피부 미백에 탁월하며, 항산화능, 주름방지 또는 개선, 항노화, 자외선으로부터의 피부 노화 방지, 손상된 피부 회복에 효과적이다.

Description

연두털말 추출물을 함유하는 피부외용제 조성물 {Composition for Skin External Application Comprising Extract of Papenfussiella kuromo}

본 발명은 연두털말(Papenfussiella kuromo) 추출물을 함유하는 피부외용제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 항산화능, 항노화, 미백 기능을 가지는 연두털말 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

화장품 산업은 기술적 측면에서 화학, 생물학, 생리학, 약학등의 기초과학과 응용기술이 복합적으로 적용되는 분야로, 기술집약적이고 고부가가치 산업이다. 오늘날 화장품은 사람의 피부에 직접 사용하는 제품으로써 피부에 대한 안전성, 효능, 사용편의성등을 갖추어야 하며, 아름다움을 가꾸는 미적 기능 뿐 아니라, 피부를 보호, 청결, 보습, 유연 및 피부 생리적 기능을 유지하는 생물학적 기능 또한 갖추어야 한다. 특히 화장품 산업은 급속한 산업화가 진행되고 고령화 현상이 심화됨에 따라, 환경 및 건강에 대한 중요성이 부각되어 웰빙 문화가 현대 사회의 메가트렌드로 자리잡았다. 이러한 고도산업의 발달에 따라 환경변화에 기인한 각종 피부 질환이 증가하고 있으며, 바이오벤처 및 화장품, 생명공학 업계에서는 천연소재의 고기능성을 활용한 미백 및 항노화 연구가 활발히 진행되고 있다.

특히 최근 기능성이 높은 바이오소재들이 접목되어 생물학적인 유효성이 높은 제품들을 개발하고자 하는 시도들이 화장품 업계와 바이오기업들을 중심으로 활발히 진행되고 있다. 기존 화장품 소재들은 식물이나 한방 추출물의 민간요법 또는 동의보감에 의한 정보를 바탕으로 한 크루드(crude)한 추출물이 화장품에 쓰였다. 반면 현재는 생물학적인 기반으로 유효성이 확인된 추출물이나 추출법이 적용되어 피부에 대한 기능성이 탁월하고 효과 및 안전성이 우수한 기능성 화장품 소재에 대한 니즈가 증가되고 있는 추세이다. 특히 우리나라는 삼면이 바다로 해양자원이 풍부한데 비하여, 해조류에 대한 생물학적인 연구가 미흡하여 해조류를 화장품에 적용한 사례가 많지 않다.

종래에 해조류를 이용한 화장료 조성물 특허로는, 대한민국등록특허 제10-1040393호 (발명의 명칭: 해조류 섬유를 함유하는 화장료 조성물)가 있으며, 구체적으로 상기 특허는 우뭇가사리 유래 섬유를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 그러나, 종래에 연두털말을 이용하여 화장품에 적용한 사례는 아직까지 없었다.

본 발명자들은 해조류 유래의 기능성 피부 외용제 조성물을 제조하기 위해 노력하던 중, 연두털말 추출물이 미백, 피부노화방지, 항산화능 효과를 가지고 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 미백, 피부 노화방지, 항산화능을 가지는 연두털말 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 연두털말 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부외용제 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 연두털말의 동결 건조 분말, 유기용매 추출물, 초음파 추출물, 또는 열수 추출물일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 피부 노화 방지용인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 피부 주름 개선용인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 자외선에 의한 피부 손상 회복용 또는 피부 보호용인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 미백용인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 항산화용인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 연두털말 추출물 함유 피부 외용제 조성물은 피부 세포에 독성이 없으면서도, 티로시나아제 활성 억제, L-DOPA 산화 억제, 멜라닌 합성 저해능을 가지고 있어 피부 미백에 탁월하며, 항산화능, 주름방지 또는 개선, 항노화, 자외선으로부터의 피부 노화 방지, 손상된 피부 회복에 효과적이다.

도 1은 본 발명에 따른 연두털말 추출물의 인간각질형성세포주에 대한 세포안정성 시험결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 연두털말 추출물의 인간섬유아세포주에 대한 세포안정성 시험결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 연두털말 추출물의 티로시나아제 활성 억제 효과 시험결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 연두털말 추출물의 L-DOPA 산화 억제 효과 시험결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 연두털말 추출물의 멜라닌 합성 저해 효과 시험결과를 나타낸 그래프(A) 및 사진(B)이다.
도 6은 본 발명에 따른 연두털말 추출물의 항산화 효능 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 연두털말 추출물의 인간각질형성세포주에서의 UV 세포손상에 대한 보호효과를 시험한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 연두털말 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

연두털말(Papenfussiella kuromo)은 남해안 및 동해안에 주로 분포하는 갈조 식물로써 갈색의 굵은 실과 같은 모양으로 자라며, 암반이나 다른 해조류에 부착하여 약 30-50cm까지 자라는 해조류이다. 주로 봄철에서 이른 여름철(2월~7월)에 서식한다.

본 발명은 일 관점에서, 연두털말 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는, 상기 연두털말 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%으로 함유할 수 있다.

이러한 비율은 단지 바람직한 범위일 뿐이며, 예컨대, 하기 실시예에서는 0.001 내지 0.1중량%의 경우를 실험하였으나, 0.001,0.005, 0.01,0.05,0.1,0.5,1,5,10중량%까지, 또는 그 이상의 20%, 30% 이상 경우도, 우수한 항산화능, 미백, 주름개선 기능을 가짐은 당업자에게 자명하다.

본 발명에 있어서, 상기 연두털말 "추출물"은 상기 연두털말 자체를 동결 건조하여 분말화하거나, 냉수추출법, 열수추출법, 에탄올 추출법, 초음파 추출법 등 종래 알려진 다양한 추출법에 의해 수득한 추출물을 의미한다.

본 발명에서 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 추출, 열수 추출 등이 있다. 여기서, 열수추출의 경우, 열탕증류기에서 6∼ 8시간동안, 55∼75℃로 가열하여 열수 추출물을 얻는다. 초음파 추출의 경우, 1시간동안 Sonics VC 750을 이용하여 추출할 수 있으며, 초음파 기기 Sonics VC 750에 설정된 프로그램으로 3초간 초음파처리, 5초간 정지상태를 반복하여 1시간 정도 처리할 수 있다. 냉수 추출의 경우, 예컨대, 냉수 (15-25℃)에 상기 연두털말 추출물 자체 또는 그것의 건조된 분말을 혼합하여 3일동안 추출하여 냉수추출물을 얻는다.

또는, 물, 유기 용매, 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출하는 방법으로 제조될 수 있다. 추출한 액은 바로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 생약의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 약제의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 특히, 본 발명에 있어서는 에탄올 추출물, 바람직하게는 30-100% 에탄올 추출물, 일 구체예로써 100% 에탄올 추출물이 바람직하며, 추출방법은 실시예에 기재된 바와 같이, 100% 에탄올에 섞은 후 1주일간 진탕하여 얻는다. 하지만, 반드시 1주일 진탕해야하는 것은 아니며, 5시간 내지 8시간 동안 추출하면 충분하다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 농축, 또는 희석하여 사용할 수 있고, 추출물의 증류액을 사용할 수도 있다. 구체적으로, 일 실시예에서, 감압농축기를 이용하여 농축할 수 있다.

본 발명에 있어서, 피부개선용이란, 피부 보호 및 피부 상태 개선, 자외선으로부터의 피부 손상 방지, 피부 미백, 피부 노화 및 주름의 예방 또는 개선, 피부 보호 및 피부의 염증 반응의 완화, 면역질환 개선능, 또는 피부 장벽 기능 개선, 피부자극 완화, 피부 세포 증식 및 재생능, 항산화능, 콜라겐 합성 증진능 등을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명에 있어서, "유효성분으로 함유하는"의 의미는, 피부 외용제 조성물로써 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는, 예컨대, 피부 외용제 조성물로써 UV 세포 손상 방지를 통한 피부세포 노화방지, 티로시나제 활성 억제를 통한 미백능, L-DOPA 산화 저해를 통한 미백능, 멜라닌 합성 억제능, 항산화능을 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미한다.

따라서, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은, 특히, 피부 노화 방지, 피부 주름 개선/방지용, 미백용, 항산화용으로 적용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 연두털말 추출물은 자외선에 의한 피부 손상(광노화) 방지, 경감, 치유에도 효능이 있는 것으로 나타나, 자외선으로부터의 피부 손상 방지, 피부보호용으로도 적용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물일 수 있다.

상기 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 피부 외용제 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 피부 외용제 조성물이 제조되는 후술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로써, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 상기 연두털말추출물 이외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글키롤, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 항료, 착색료, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은, 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 화장수, 에센스, 젤, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀 (소프트 캅셀, 하드 캅셀) 제형 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서의 피부는 얼굴 뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 피부 외용제 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 연두털말 추출물을 함유 피부 외용제 조성물의 제조방법은 전술한 제조방법에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 제조방법을 일부 변형시킨 방법으로도 본 발명에 따른 연두털말 추출물을 함유 피부 외용제 조성물을 제조할 수 있다.

특히, 상기 피부 외용제 조성물은 본 발명에 특별히 개시된 제조방법 이외에도, 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다.

화장료 조성물로 제조될 경우, 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일,염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

이러한, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 콜라겐 합성 증진능에 따른 피부 주름 개선, 노화된 피부 세포 활성화능에 기반한 피부 노화 방지의 기능을 할 수 있는 기능성 화장품의 형태를 포함한다.

이러한 약제학적 조성물은 유효성분인 연두털말 추출물 외에, "약학적으로 허용가능한 담체"를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제 및 방부제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 약학 조성물은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 상기 첨가제로 향료, 비타민, 및 항산화제가 포함될 수 있다. 상기 담체로 약제학적으로 허용 가능한 담체는 모두 가능하며, 예를 들면, 희석제로는 유당, 덱스트린, 타피오카(tapioca) 녹말, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스일 수 있다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈, 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 또는 잔탄검, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨일 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 경구 투여제제, 주사제, 좌제, 경피 투여제제, 및 경비 투여제제의 제형으로 제제화되어 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 제형은 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 또는 엑스제와 같은 경구 투여용 제형일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

연두털말 추출물 제조

전라남도 보길도 해안에서 연두털말을 채집하여 여러 차례의 수세과정을 통하여 염분을 제거하고, 100% 에탄올에 1주일 동안 담구어 세포내용물이 충분히 추출되도록 한 후 1L를 감압농축기로 30℃ 3시간 동안 농축하여 10분의 1 부피로 농축하였다. 이렇게 농축된 결과물을 동결건조 한 후, 분쇄하여 분말화하여 실험에 사용하였다.

실험예 1: 본 발명에 따른 연두털말 추출물의 세포 독성 시험

(1) 세포배양

인간 피부세포주인 각질형성세포주(Keratinocyte, HaCaT)와 섬유아세포주(fibroblast CCD986-sk)는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% fetal bovine serum(FBS), antibiotic-antimycotic (GIBCO, Cat No. 15240-062)과 함께 75 Cm² flask에서 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하였다. 이 세포가 80%이상 confluence할 때 계대배양을 하였다.

(2) 시험방법

피부를 구성하는 세포종들(keratinocyte, fibroblast)에서 세포독성을 나타내지 않는 농도범위를 알기 위해, 실제 상기 세포들을 배양하면서 다양한 농도의 시험물질을 세포 배양에 처리 한 후 세포의 성장 및 증식, 혹은 독성에 미치는 영향을 조사하는 방법으로 MTT 시험법이 사용하였다. 이 방법은 세포의 미토콘드리아 탈수화 효소에 특이적으로 반응하는 MTT(3-(4,5-dimethyl thiazol-2yl)-2,5 diphenyl-2H-tetrazolium bromide)를 이용한 분석법으로 더욱 신뢰할 만한 세포 안정성에 관한 영향을 시험할 수 있다.

구체적으로, 세포를 24well에 1×10⁴cells/well 혹은 1×10⁵cells/well로 분주 한 후 세포배양 조건에서 confluence가 50~60%에 도달할 때까지 배양하였다. 배지를 버리고 PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 다음 10% FBS를 포함하지 않는 새로운 배지를 넣고 일정농도의 시험물질을 처리하여 24시간 추가 배양하였다. 이 후 MTT 용액(6.6mg/ml, 3-(4,5-dimethyl thiazol-2yl)-2,5 diphenyl-2H-tetrazolium bromide액)을 각 well에 50ul씩 넣고 3시간 추가 배양한다. 배양액을 제거한 다음 dimethylsulfoxide(DMSO, Amresco, 0231-500ML)를 200ul씩 넣고 10분간 흔들어 준 다음 100ul씩 96well에 취하여 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

세포안전성(%) = (시험군의 흡광도/대조군의 흡광도)x100

(3) 인간각질형성세포주 (HaCaT)에 대한 세포안정성

인간각질형성세포주인 HaCaT에서의 연두털말 추출물의 세포 안정성을 평가하였다. 인간각질형성세포주인 HaCaT는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 분주 받아서 배양하였다.

대조군으로는 정제수를 사용하였으며, 연두털말 추출물의 농도는 최고 농도 200ug/ml에서 2배씩 serial하게 dilution하여 최하 12.5ug/ml 농도까지 총 5개의 농도 범위에서 시험하였다. 그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 200ug/ml 까지 세포독성이 없었으며, 약 60%정도(1.5배) 세포 증식능을 보였다.

(4) 인간섬유아세포주 (CCD986-SK)에 대한 세포안정성

인간섬유아세포주인 CCD986-SK에서의 연두털말 추출물의 세포 안정성을 평가하였다. 인간섬유아세포주인 CCD986-SK는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 분주 받아서 배양하였다.

대조군으로는 정제수를 사용하였으며, 연두털말 추출물의 농도는 최고 농도 200ug/ml에서 2배씩 serial하게 dilution하여 최하 12.5ug/ml 농도까지 총 5개의 농도 범위에서 시험하였다. 그 결과 200ug/ml 까지 세포독성이 나타나지 않았다.

실험예 2: 미백 효능 시험

본 발명에 따른 연투털말 추출물의 미백기능을 확인하기 위해, 피부 멜라닌 생성에 있어 매우 중요한 역할을 티로시나아제 활성 여부 및 L-DOPA 산화 저해에 대한 시험을 하였다. 티로시나아제는 구체적으로, 피부의 색소를 생성하는 세포인 색소생성세포(멜라노사이트)의 색소형성기관(멜라노좀)에서 티로신을 산화시켜 dopa를 만들고, 다시 dopa를 산화시켜 dopachrome을 만드는 일련의 과정을 촉매하는 것으로 알려져있다.

(1) 티로시나아제 활성 억제 시험

본 시험에서는 연두털말 추출물이 티로시나아제 활성을 억제함으로써 세포 내 멜라닌 합성 저해능이 있는지 여부를 확인하였다.

적정농도(1mg/ml, 500ug/ml, 250ug/ml, 125ug/ml, 62.5ug/ml)의 시료 30ul를 0.1M 인산염완충액 (pH 6.5) 210ul, mushroom tyrosinase (1500 U/ml - 2000 U/ml, Fulka Cat. No. 93898) 20ul와 순서적으로 혼합하였다. 이 용액에 1.5 mM tyrosine 액 40ul를 넣고 37℃에서 10 - 15분 동안 반응 시켰다. 이것을 ELISA reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시료액으로 시료액 대신 0.1M 인산염완충액 (pH 6.5)을 넣어 분석에 사용하였다. 양성대조군으로는 Arbutin 0.1%를 사용하였다.

tyrosinase 활성 저해율 (%) = 100 - [(b-b')/(a-a') X 100]

a: 공시료액의 반응 후의 흡광도

b: 시료액의 반응 후의 흡광도

a', b': tyrosinase 대신 완충액으로 대체하여 측정한 흡광도

연두털말 추출물을 최고농도 1mg/ml에서 두배씩 희석하여 최저 62.5ug/ml까지 처리하여 확인하였다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, arbutin 0.1%(1mg/ml)에서 약 42%정도 Tyrosinase 활성 저해율을 보인 반면 연두털말 추출물 1mg/ml에서는 약 46% Tyrosinase 저해 효과가 있었으며, 알부틴 1% 처리와 비슷한 미백효과가 있음을 확인하였다 (대조군: 0.1M 인산염 완충액).

(2) L-DOPA 산화 저해 시험

시험관에 0.1M 인산염완충액(pH 7.0) 850ul와 적정 농도(1mg/ml, 500ug/ml, 250ug/ml, 125ug/ml, 62.5ug/ml)로 희석된 연두털말추출물 50ul 그리고 머쉬룸 타이로시나제(1,500-2,000U/ml, Fulka Cat. No. 93898)액 50ul를 순서대로 넣고 37℃에서 6분동안 반응시켰다. 이 용액에 0.06mM L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine, Sigma D9628-25G)액 50ul를 넣은 다음 37℃에서 1분 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후 ELISA reader(BioTek-MQX200R)를 이용하여 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시료액으로는 시료액 대신 0.1M 인산염완충액(pH7.0)을 넣었고, 양성대조군으로 arbutin 0.1%를 사용하였다.

DOPA산화활성저해율(%) = 100-(각시료액의반응흡광도/공시료액의반응흡광도)

연두털말 추출물을 최고농도 1mg/ml에서 두배씩 희석하여 최저 62.5ug/ml 까지 처리하여 확인한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, arbutin 0.1%(1mg/ml)에서 약 30%정도 L-DOPA 산화활성저해율을 보였으며, 연두털말 추출물 1mg/ml에서 약 33%정도 L-DOPA 산화활성저해를 보였다. 따라서 연두털말 추출물은 미백효과가 잘 알려진 알부틴과 동등 이상의 미백효과를 보이는 것으로 확인되었다.

(3) 세포 내 멜라노사이트 유래 멜라닌 합성 저해 시험

본 시험을 위해 Murine Melanoma(B16F10)을 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% fetal bovine serum(FBS), Antibiotic-antimycotic (GIBCO, Cat No. 15240-062)과 함께 75 Cm² flask에서 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하였다. 이 세포의 confluence가 80%정도 도달할 때 계대 배양하여 6well plate에 1×10⁵ cells/well로 분주한 후 5% CO₂, 37℃에서 세포가 약 70~80% 이상 도달 될 때 까지 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 이 세포에 멜라닌 생합성을 유도하기 위하여 IBMX(3-Isobutyl-1-methylxanthine, Sigma, Cat.No:17018) 0.2mM과 a-MSH(a-Melanocyte stimulating hormone, Sigma, Cat.No:M4135) 10uM로 처리하여 세포내 멜라닌 생합성을 유도 하였다. 그 후 일정농도(1mg/ml, 500ug/ml, 250ug/ml, 125ug/ml, 62.5ug/ml)로 희석된 연두털말 추출물이 포함된 새 배지로 교환 한 후 48시간 추가 배양하였다. 배지를 제거 한 후 PBS(phosphated buffer saline,GIBCO)로 세척하고 이를 0.05% trypsin-EDTA(GIBCO)를 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 hematocytometer를 이용하여 세포수를 측정한 후 5,000~10,000rpm으로 10분간 원심분리 한 다음 상등액을 제거하고 pellet을 얻었다. 이 세포 pellet를 60에서 건조한 후 10% dimethylsulfoxide(DMSO, Amresco, 0231-500ML)가 함유된 1M 수산화나트륨액(SAMCHUN Chemicals) 100ul를 넣어 60℃ 항온조에서 세포내 멜라닌을 얻었다. 이 액을 ELISA reader(BioTek-MQX200R)에서 490nm로 흡광도를 측정하여, 세포 일정수 당 멜라닌 양을 구하였다. 멜라닌 합성저해 정도는 순수한 물을 사용한 대조군(무처리세포)의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

멜라닌합성저해율(%) = 100-(각시료액의반응흡광도/음성대조군의반응흡광도)

최고농도 1mg/ml에서 두배씩 희석하여 최저 62.5ug/ml까지 연두털말 추출물을 처리한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, IBMX 0.2uM과 10uM의 α-MSH(melanocyte stimulating hormone)로 멜라닌 생합성을 유도했을때, 유도하지 않은 대조군과 비교하여 약 1.5배 멜라닌 생합성을 유도했다. 여기에 연두털말 추출물 1mg/ml을 처리를 하였을 때 멜라닌 생합성이 약 1.5배 저해되는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3: 연두털말 유래 추출물의 항산화 시험

연두털말 추출물의 항산화능을 확인하기 위해, DPPH 자유라디컬 소거능을 확인하였다. 이 방법은 에탄올상에서 1,1-Diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH, Sigma D9132-1G)가 발생시키는 free radicals에 대한 소거능을 시험함으로써 항산화 효과의 직접적인 작용 정도를 파악할 수 있는 시험법이다. 화합물 1,1-Diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH, Sigma D9132-1G)는 에탄올 내에서 자유라디칼을 발생하는데, 이에 일정 농도(1mg/ml, 500ug/ml, 250ug/ml, 125ug/ml, 62.5ug/ml)의 연두털말 추출물과 혼합하여 자유라디칼의 양이 어느 정도 감소하는지 확인하였다.

구체적으로는 에탄올 0.4ml에 0.1mM의 DPPH용액 0.5ml, 그리고 일정농도(1mg/ml, 500ug/ml, 250ug/ml, 125ug/ml, 62.5ug/ml)로 희석된 연두털말추출물 0.1ml를 첨가하였고, 10초간 강하게 vortexing 후 냉암소에서 30분간 반응시켰다. ELISA를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하며, 항산화능의 정도는 에탄올을 사용한 대조군의 흡광강도를 기준으로 백분율로 표시하였으며, 양성대조군으로 Vitamin C(AA-2G, Ascorbic Acid 2 - Glucoside, DAMY chemical)를 사용하였다.

Free radical 활성 저해율(%) = 100-(각시료액의 반응흡광도/공시료액의 반응흡광도)X100

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 1mg/ml에서 대조군 대비 약 30%정도의 항산화 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 4: UV 세포손상 보호능 시험

인간각질형성세포주인 HaCaT에 UV-B로 세포손상을 유발한 후 본 발명의 연두털말 추출물을 처리 하였을때 UV-B에 의해 유도된 세포 독성을 연두털말 추출물이 얼마나 회복시키는지에 대한 영향을 시험하였다. 구체적인 시험 방법으로는 인간 피부세포의 일종인 섬유아세포 세포주인 CCD-986sk와 인간각질형성세포주인 HaCaT 세포를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% fetal bovine serum(FBS), 1% Antibiotic-antimycotic (GIBCO, Cat No. 15240-062)과 함께 75 Cm² flask에서 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하였다. 이 세포가 80%이상 confluence 일 때 계대배양 하여 6well에 1×10⁴로 분주 한 후 세포배양 조건에서 confluence가 80%이상 도달 될 때 까지 배양 하였다. 배지를 버린후 UV-B 로 50mJ로 UV를 조사하였다. 그 다음 실시예 1의 연두털말 추출물을 처리한 후 48시간 추가 배양하였다. 이후 MTT 용액(6.6mg/ml, 3-(4,5-dimethyl thiazol-2yl)-2,5 diphenyl-2H-tetrazolium bromide액)을 각 well에 50ul씩 넣고 3시간 추가 배양하였다. 배양액을 제거한 다음 dimethylsulfoxide(DMSO, Amresco, 0231-500ML)를 200ul씩 넣고 10분간 흔들어 준 다음 100ul씩 96well에 취하여 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

세포안정성(%) = (시험군의 흡광도/대조군의 흡광도)x100

실험 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 세포에 UV-B를 처리했을 때 처리하지 않은 대조군에 비하여 약 40%정도 세포 손상을 입었다. 여기에 연두털말 추출물을 1mg/ml에서부터 62.5ug/ml까지 처리한 결과 대부분의 농도에서 UV에 의한 세포손상을 회복시켰으며, 1mg/ml 처리군에서는 세포손상이 완전히 회복되었으며, UV를 손상시키지 않을때 보다 약 15%정도 세포증식능을 보였다.

화장료 조성물의 제조

본 발명의 연두털말 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장품으로 영양화장수, 크림, 에센스 등의 유화 제형의 화장품 및 유연화장수 등의 가용화 제형의 화장품을 제조하였다.

제조예 2-1: 화장수

다음 처방에 따라 통상의 화장수 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
글리세린	5.0
디프로필렌글리콜	3.0
히아루론산	0.5
폴리옥시에틸렌 경화피마자유	0.1
폴리에틸렌 올레일에틸	0.1
에탄올	5.0
방부제	0.15
항료	적량
착색료	적량
연두털말 추출물	2.0
정제수	to 100

제조예 2-2: 에센스

다음 처방에 따라 통상의 에센스 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	1.0
자기유화형모노스테아린산	1.0
밀납	0.5
스쿠알란	5.0
이소세틸옥타노에이트	3.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	0.5
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	8.0
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	0.2
카르복시폴리머	0.22
트리에탄올아민	0.25
방부제	적량
향료	적량
착색료	적량
연두털말 추출물	7.0
정제수	to 100

제조예 2-3: 로션

다음 처방에 따라 통상의 로션 제조 방법에 따라 제조하였다.

원료명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	0.8
자기유화형모노스테아린산	1.0
밀납	0.5
스테아린산	0.5
유동파라핀	7.0
스쿠알란	5.0
마카데미아오일	3.0
이소세틸옥타노에이트	2.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	0.5
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	1.2
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	4.0
베타인	4.0
카르복시폴리머	0.12
트리에탄올아민	0.15
방부제	0.25
향료	적량
착색료	적량
연두털말 추출물	5.0
정제수	to 100

제조예 2-4: 크림

다음 처방에 따라 통상의 크림 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	3.0
자기유화형모노스테아린산	1.5
친유형모노스테아린산	1.5
밀납	0.5
유동파라핀	8.0
스쿠알란	7.0
이소세틸옥타노에이트	4.0
정제호호바유	4.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	1.0
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	1.2
글리세린	6.0
프로필렌글리콜	4.0
베타인	4.0
산탄검	0.06
트리에탄올아민	0.10
방부제	0.25
향료	적량
착색료	적량
연두털말 추출물	7.0
정제수	to 100

제조예 2-5: 젤

다음 처방에 따라 통상의 젤 제조 방법에 따라 제조하였다.

원료명	중량 %(w/w)
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	4.0
에탄올	10
폴리옥시에틸렌경화피마자유	0.1
카르복시폴리머	0.30
트리에탄올아민	0.30
방부제	적량
향료	적량
착색료	적량
연두털말 추출물	1.0
정제수	to 100

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

1. 연두털말(Papenfussiella kuromo) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 또는 자외선(UV)에 의한 피부 손상의 회복용 피부 외용제 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 연두털말의 에탄올 추출물, 열수추출물 또는, 초음파추출물인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
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